ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

MAESTRIA EN CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

 BIOQUIMICA BASICA
DRA. MARIA GUADALUPE GUERRA SANCHEZ
clasebioquimicabb@yahoo.com
TAREAS

EST. ZORAIDA SILVA SÁNCHEZ

CIUDAD DE MÉXICO 2016

Maestría en Ciencias Quimicobiologicas. Dra. María Guadalupe Guerra Sánchez.
Materia: Bioquímica Básica Alumna: Zoraida Silva Sánchez.
Determinación de coeficiente de sedimentación
La bioquímica es una disciplina experimental que tiene por objetivo estudiar los
procesos que ocurren en el interior de la célula en diferentes condiciones, así
también estudia la su conformación estructural, por lo que en la investigación, en la
mayoría de los ensayos o experimentos que se realizan, es necesario utilizar
métodos que nos permitan separar o aislar la estructura o componente celular que
queremos estudiar. La centrifuga es un instrumento que nos realizar estas
funciones, ya que podemos separar células, orgánulos o biomoleculas, basándose
en diferentes propiedades como; diferencia de densidad de las moléculas
(Centrifugación diferencial), separación de partículas con la misma densidad,
separación por gradientes de densidad con la utilización de CsCl (Centrifugación
isopícnica), separación por diferencia de masa, separación por gradientes
preformados con sacarosa y glicerol (Centrifugación zonal), separación basado en
el tamaño y la forma, separación por fuerza centrífuga aumentada
(ultracentrifugación)
La centrifuga que utilizo para realizar mis experimentos es la Heraeus Biofuge Pico,
cuenta con un frenado y aceleración rápida, tiene una tapa hermética Aerosol
"Easy-Twist-On" su capacidad de volumen es de 24 x 1,5 / 2 ml por tubo, su
velocidad máxima es de 13.000 rpm, su máxima fuerza centrífuga relativa es de
16.060 x g. basándonos en la clasificación de procedimientos de centrifugación es
una centrifuga preventiva, ya que nos permite separar las moléculas conforme su
tamaño, forma y densidad de alta velocidad, que alcanzan hasta 23 000rpm. En los
experimentos me permite hacer extracción de proteínas.

El radio de distancia de esta centrifuga es de 5 cm la velocidad a la que centrifugo es de 13 000

rpm, por lo que la fuerza centrífuga relativa es de
Y los G a los que se trabaja es de G = 9447.1 G
G = 0.000001118 x R x RPM2
G = 0.000001118 x 50 mm x (13,000 RPM)2
G = 9447.1 G
Maestría en Ciencias Quimicobiologicas. Dra. María Guadalupe Guerra Sánchez.

Materia: Bioquímica Básica Alumna: Zoraida Silva Sánchez.

Soluciones acuosas

1. Se disuelven 90 mg de glucosa (PM: 180) en 100 ml de agua. Cual esla moralidad de la

glucosa en solución

2. ¿Como se puede hacer 20 ml de una solución de 25 mM de glucosa?

3. De la solución anterior (25mM) haga una dilucion para hacer 2 ml de una solución 5mM

4. Cuantos moles y µmol de glucosa esta presentes en 9 mg de glucosa?

5. Si se disuelven 9 mg de glucosa en 5ml de agua cual es la concentración de glucosa en mM

y µM

6. Si se toman 2 ml de la solución anterior y se diluyen a 50 ml, cual es la concentracioin de la

glucosa en la solución resultante?
7. Cuantos nM de glucosa están presentes en 2 ml de la solución de diluida anterior?

8. Calcula la fuerza ionica de una solución de acido butitico 0.1 M ka =1.5X10-5. Utilice la
formula de la Ka. H+ Butirato / ac. Butírico.

9. Construya una curva de titulación para 500 ml de un acido débil 0.1 M de HA con 0.1M de
KOH. Ka=10-5(pka =5.0). Que pH tendrá la solución titulable cuando se hayan adicionado
250 ml de 0.1M de KOH.

12
10
8
pH

6
4
2
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
eq KOH

10. Cual será la concentración de HO Ac y O Ac- en un regulador de acetatos de 0.2 M a pH

5.0. La Ka para el ac. Acético es 1.7x10-5 (pka=4.77)
1.-

2. pH = 2.0 pka = 2.97

pH = pka + log [S]/ [A]

2 = 2.97 + log [S]/ [A]
-0.97 = log [S]/ [A]
[S]/ [A]= 10-0.97 = 0.107

a) 0.107X100= 10.7 % no protonado , 89.2 % protonado

pH = pka + log [S]/ [A]

8.5 = 2.97 + log [S]/ [A]

5.53 = [S]/ [A]105.53

b) Todo está sin protonar.

3. CO2 (g) + H2O(l) = H2CO3

H2CO3 = HCO3- + H+

CO2 + H2O H2CO3 HCO3- + H+

H2CO3 / HCO3- si sirve como un buffer, Como producto del metabolismo se produce CO2 que
al reaccionar con las moléculas de agua produce ácido carbónico, un compuesto inestable que
se disocia parcialmente y pasa a ser bicarbonato, el bicarbonato resultante se combina con los
cationes libres presentes en la célula, como el sodio, formando así bicarbonato
sódico (NaHCO3), que actua como tampón ácido.

4. AS = AS- + H+

CO2(g) + H2O(l) = HCO3- + H+

El sistema de buffer de carbonatos intenta eliminar todos los protones posibles, elevando la
concentración de |HCO3-|. El problema es que la concentración de ácido salicílico es tanta, que la
eliminación de protones no es suficiente para equilibrar la reacción y que se eliminen los suficientes
salicilatos, lo que genera los daños observados de desorientación y problemas de habla. Esto
además se observa en los valores de salicilato en sangre. La presión de CO2 en las células disminuye
al requerirse para el sistema de buffer de carbonatos en el intento de equilibrar el pH en sangre,
mientras que la presión de O2 aumenta por la hiperventilación.

5. |HCO3-| / |H2CO3| = X
A pH = 7.55 -> 7.55 = 6.4 + log [HCO3-] / [H2CO3]

[HCO3-] / [H2CO3]= 10(7.55-6.4) = 14

A pH = 7.4 (valores normales) -> 7.4 = 6.4 + log [HCO3-] / [H2CO3]

[HCO3-] / [H2CO3]= 10(7.4-6.4) = 10

A las 10 horas podemos ver que se encuentran 14 moleculas de HCO3 y una de H2CO3. Mientras
que en condiciones normales hay 10 moleculas ionizadas por una protonada

6. a las 60 horas el organismo regreso a la normalidad, ya que los tampones son los primeros
responsables de mantener estos niveles de pH constantes aunque en el organismo se
produzcan un desequilibrio. Así, los tampones son el primer nivel de defensa contra los
cambios de pH. Y esto ocurre porque el bicarbonato (HCO3-) neutralizo el acido

7. Existen otros tampones de gran importancia en el organismo:

Inorgánicos:
Tampón bicarbonato:

CO2 + H2O H2CO3 HCO3 - + H+

Tampón fosfatico:

H2PO4- HPO42- + H+
Orgánicos:
Tampón hemoglobina:

HHbO2 HbO2- / HbH Hb- + H+

Aminoácidos y proteínas
Tarea 2

Una reacción catalizada por enzimas se llevó a cabo en solución con regulador de Tris 0.2M a pH 7.8,
se produjeron 0.03 mol/L de protones.

a) ¿Cuál es la relación Tris+ /Tris0?

b) ¿Cuál es la concentración de Tris+ y Tris0 al inicio de la reacción?
Tris = Tris+ + H+

pH = 8.1 + log Tris0

Tris+

7.8 = 8.1 + log (Tris0 / 0.2 M) Relación Tris0 / Tris+ = 0.1 / 0.2 = 1 / 2.

10-0.3 = Tris0 / 0.2M a) Relación Tris + / Tris0 = 2

Tris0 = 10-0.3 x 0.2 M b) Tris0 = 0.1 M , Tris+= 0.2 M

Tris0 = 0.1 M

9. HA = A- + H+ ka = |H+| |A-| / |HA| |H+| = |A-|

10-5 = |A-|2 / 0.1 √ 10-6 = |A-| |H+| = |A-| = 10-3

pH = pka + log (A- / HA)

eq
HA KOH A- pH 12
10
0.1 0 0.001 3
8
0.09 0.1 0.01 4.045757491

pH
6

0.08 0.2 0.02 4.397940009 4

2
0.07 0.3 0.03 4.632023215
0
0.06 0.4 0.04 4.823908741 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
eq KOH
0.05 0.5 0.05 5

0.04 0.6 0.06 5.176091259

0.03 0.7 0.07 5.367976785

0.02 0.8 0.08 5.602059991

0.01 0.9 0.09 5.954242509

- 1 0.1 13

Para 250 mL de 0.1M de KOH, se agregan 0.025 moles, siendo el equivalente a 0.25 equivalentes de
KOH.

pH = 5 + log (0.025 / 0.085) = 4.4685.

Tarea 4

Preparar 10 L de 0.045 M de regulador de fosfatos a pH 7.5. ¿Cuánto necesito de para convertir

0.45 moles en 0.3 y 0.15?

Se preparará con KH2PO4 y K2HPO4.

Para el pH requerido, se usará esta pka= |HPO42-| / |H2PO4-| = 7.2

(0.045 M) (10 L) = n

Se necesitan n = 0.45 moles de fosfatos.

7.5 = 7.2 + log |HPO42-| / |HPO4-| Por 2 |HPO42-| hay 1 |H2PO4-|

0.3 = log |HPO42-| / |HPO4-| 0.45 * 2/3 |HPO4-| = 0.3 moles

|HPO42-| / |H2PO4-| = 2 0.45 * 1/3 |H2PO42-| = 0.15 moles

El peso molecular de K2HPO4 es 136 y el de K2HPO4 es 174.18 g, por lo que considerando los
moles, se necesita disolver 20.4 g de KH2PO4 y 52.254 g de K2HPO4 en 10 L.

Tarea 5

Tarea 6

V
[S] M 1/[S] 1/V [S]/V V/[S]
(M/s)

8.33X10-6 13.8 120048.0192 0.072463768 6.03623E-07 1656662.665

1.0X10-5 16 100000 0.0625 0.000000625 1600000

1.25X10-5 19 80000 0.052631579 6.57895E-07 1520000

1.67X10-5 23.6 59880.2395 0.042372881 7.07627E-07 1413173.653

2.0X10-5 26.7 50000 0.037453184 7.49064E-07 1335000

2.5X10-5 30.8 40000 0.032467532 8.11688E-07 1232000

3.33X10-5 36.3 30030.0300 0.027548209 9.17355E-07 1090090.09

4.0X10-5 40 25000 0.025 0.000001 1000000

5.0X10-5 44.4 20000 0.022522523 1.12613E-06 888000

6.0X10-5 48.0 16666.6666 0.020833333 0.00000125 800000

8.0X10-5 53.4 12500 0.018832392 1.50659E-06 663750

1.0X10-4 57.1 10000 0.017513135 1.75131E-06 571000

2.0X10-4 66.7 5000 0.014992504 2.9985E-06 333500

 [S] vs V
80
70
60
50
V (M/S) 40
30
20
10
0
0 0.00005 0.0001 0.00015 0.0002 0.00025
[S] (M)

Lineweaver-Burke - 1/[S] vs 1/V

y = 4E-07x + 0.0189
0.08
0.07
0.06
1/V (S/M)

0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000
1/[S] (1/M)

Hanes-Woolf - [S] vs [S]/V

y = 0.0125x + 5E-07
0.0000035
0.000003
0.0000025
[S]/V (S)

0.000002
0.0000015
0.000001
0.0000005
0
0 0.00005 0.0001 0.00015 0.0002 0.00025
[S] (M)
 Eadie-Hofstee - V/[S] vs V
y = -4E-05x + 79.872
80
70
60
50
V (M/S)

40
30
20
10
0
0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 1400000 1600000 1800000
V/[S] (1/S)

Lineweaver-Burke

1/V = (km/Vmax)*(1/[S]) + 1/Vmax

Y = (km/Vmax)*X + 1/Vmax

m = km/Vmax km = 3.99175E-05

b = 1/Vmax Vmax = 79.88268309

m
= 4.99701E-07

b= 0.012518358

Hanes-Woolf

[S]/V = [S]*(1/Vmax) + (km/Vmax)

Y = (1/Vmax)*X + (km/Vmax)

m = 1/Vmax km = 4.00292E-05

b = km/Vmax Vmax = 79.9882503

m
= 0.012501836

b= 5.00439E-07

Eadie-Hofstee

V = -km*(V/[S]) + Vmax

Y = -km*X + Vmax
 m = -km km = 3.99084E-05

b = Vmax Vmax = 79.87199198

m
= -3.99084E-05

b= 79.87199198

Tarea 7

1.

a) Calculando en el programa GraphPad:

[S] (M) V (nmoles x lt-1xmin-1) Michaelis-Menten

6.25e-006 15 Best-fit values

7.5e-005 56.25 Vmax 75.88

1e-004 60 Km 2.595e-005

1e-003 74.9 Std. Error

1e-002 75 Vmax 0.5074

Km 1.039e-006

Data 1
80
V (nmoles x lt-1xmin-1)

60

40

20

0
0.000 0.005 0.010 0.015
[S] (M)
b) Calcular V con [S] = 2.5x10-5 M y a [S] = 5x10-5.

V = Vmax [S] / km + [S]

V = 37.23 nmoles x lt-1 x min-1 ; V = 49. 95 nmoles x lt-1 x min-1

c) La V sería la misma, ya que para Michaelis Menten, se considera un exceso de enzima; es decir
que los valores de la enzima no afectan la velocidad. Lo único que la afecta es la cantidad de
sutrato.

d) El valor teórico de la velocidad instantánea sería:

Vo = Vmax [S] / km, ya que [S] <<< km, cuando se tiene la velocidad inicial.

Considerando el valor de [S] de 6.25 x 10-6, la velocidad inicial que se obtiene es de 18.27, que
se acerca bastante a lo obtenido experimentalmente, que es 15, lo que verifica que la
información calculada es correcta.

2.

v (nmol x
[S] (M) litro-1 x min- 1/S 1/V [S]/V V/[S]
1)

8.33E-06 13.8 120048.0192 0.072463768 6.03623E-07 1656662.665

1.00E-05 16 100000 0.0625 0.000000625 1600000

1.25E-05 19 80000 0.052631579 6.57895E-07 1520000

 1.67E-05 23.6 59880.23952 0.042372881 7.07627E-07 1413173.653

2.00E-05 26.7 50000 0.037453184 7.49064E-07 1335000

2.50E-05 30.8 40000 0.032467532 8.11688E-07 1232000

3.33E-05 36.3 30030.03003 0.027548209 9.17355E-07 1090090.09

4.00E-05 40 25000 0.025 0.000001 1000000

5.00E-05 44.4 20000 0.022522523 1.12613E-06 888000

6.00E-05 48 16666.66667 0.020833333 0.00000125 800000

8.00E-05 53.4 12500 0.018726592 1.49813E-06 667500

1.00E-04 57.1 10000 0.017513135 1.75131E-06 571000

2.00E-04 66.7 5000 0.014992504 2.9985E-06 333500

[S] vs V
80
70
60
50
V (M/s)

40
30
20
10
0
0.00E+00 5.00E-05 1.00E-04 1.50E-04 2.00E-04 2.50E-04
[S] (M)

Lineweaver-Burke - 1/[S] vs 1/V

y = 4E-07x + 0.0189
0.08

0.06
1/V

0.04

0.02

0
0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000
1/[S]
 Hanes-Woolf - [S] vs [S]/V
0.000004 y = 0.0125x + 5E-07
0.000003
[S]/V

0.000002

0.000001

0
0.00E+00 5.00E-05 1.00E-04 1.50E-04 2.00E-04 2.50E-04
[S]

Eadie-Hofstee - V/[S] vs V
y = -25000x + 2E+06
2000000

1500000

1000000
V

500000

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
V/[S]

Lineweaver-Burke

1/V = (km/Vmax)*(1/[S]) + 1/Vmax

Y = (km/Vmax)*X + 1/Vmax

m = km/Vmax km = 3.99887E-05

b = 1/Vmax Vmax = 79.99230562

m= 4.99907E-07

b= 0.012501202

Hanes-Woolf

[S]/V = [S]*(1/Vmax) + (km/Vmax)

Y = (1/Vmax)*X + (km/Vmax)

m = 1/Vmax km = 4.00308E-05
 b = km/Vmax Vmax = 80.0356915

m= 0.012494426

b= 5.00162E-07

Eadie-Hofstee

V = -km*(V/[S]) + Vmax

Y = -km*X + Vmax

m = -km km = 3.99982E-05

b = Vmax Vmax = 80.0040045

m= -3.99982E-05

b= 80.0040045

3. a) Con inhibidor competitivo –

V = Vmax [S] / α km + [S] = 13.52 μmoles x lt x min

b) Con inhibidor no competitivo -

V = (Vmax / α) [S] / (km/ α) + [S] = 7.58 μmoles x lt x min

c) Con inhibidor mixto -

V = (Vmax / α) [S] / km + [S] = 6.68 μmoles x lt x min

d) El grado de inhibición en todos los casos sigue la fórmula α = 1 + ([I] / kI) = 2.667

4.

v (micromol
[S] (M) x litro-1 x 1/S 1/V
min-1)

0.000625 1.54 1600 0.649350649

0.00125 5.88 800 0.170068027

0.0025 20 400 0.05

0.005 50 200 0.02

0.01 80 100 0.0125

 0.02 94.12 50 0.010624734

0.04 98.46 25 0.010156409

0.08 99.61 12.5 0.010039153

[S] vs V
120
100
80
V (M/s)

60
40
20
0
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09
[S] (M)

Lineweaver-Burke - 1/[S] vs 1/V

y = 0.0004x - 0.0376
0.7
0.6
0.5
0.4
1/V

0.3
0.2
0.1
0
-0.1 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
1/[S]

Por Lineweaver-Burke, vemos claramente que la enzima no obedece una cinética hiperbólica, por
lo que en GraphPad se realizó el cálculo para una cinética sigmoidal. La R2 para la ecuación fue 1.

Sigmoide alostérica

Mejores valores

Vmax 100

napp 2
Km 0.005

Kprima 2.499e-005

(S)0.5 = √km 0.0707

Error Estándar

Vmax 0.001203

H 0.0001009

Km 1.497e-007

Kprima 1.392e-008
Tarea 8

1. La gráfica que mejor representa una velocidad de reacción frente a la concentración de

sustrato para una enzima alosterica es la numero 1 porque tiene un comportamiento
sigmoide, dado a que requieren una mayor concentración de sustrato comparado con un
comportamiento cinético de Michaelis-Menten. Podemos ver que esta curva sigmoide tiene
un cambio de conformación entre un estado de baja actividad, baja afinidad, tenso o “T” a
un estado de alta actividad, alta afinidad, relajado o “R”, lo que representa esta curva.
 También podemos ver diferencias entre estas dos curvas en el caso de la gráfica azul no se
cuenta con la presencia de un inhibidor por lo que no se requiere de tanta concentración
de sustrato comparado con la roja, mientras que la curva roja representa a presencia de un
inhibidor, ya que se requiere mayor concentración de sustrato.

2.

a)
Data 6
4
Nativa

3
60C, 4min
0.1mM CTP
2 0.1mM CTP, 60C,4min
Data 6 ATP 2mM
1 4
Nativa

3
60C, 4min

0 0.1mM CTP
0 5 2 10 15 20 25 0.1mM CTP, 60C,4min
ATP 2mM
Sustrato mM
1

b)Observamos que la0 enzima nativa CTP presenta un comportamiento alostérico inhibidor sobre la
0 mayor
molécula, y necesita de 5 cantidad
10 15 sustrato
de 20 25 alcanzar la velocidad máxima, mientras
para
Sustrato mM
que el ATP, por su curva vemos que con menor cantidad de sustrato se alcanza una velocidad mayor
más rápidamente

c) La curva del ATP y la del calentamiento a 60° C tienen un comportamiento similar, por lo que
pueden estar actuando como activadores alostericos, recordemos que la temperatura es un factor
muy importante de tomar en cuenta cuando trabajamos con enzimas, ya que cada enzima tienen
su temperatura optima la cual a le van a permitir actuar adecuadamente. Por lo que esta
temperatura a la que se encuentra expuesta la enzima, muy probablemente este influyendo sobre
su estructura permitiendo convertir a su sustrato de manera más rápida y eficiente. Por lo que este
calentamiento le permite a la enzima encontrarse de manera relajada aun en presencia de algún
inhibidor, esto lo podríamos comprobar experimentalmente utilizando difracción de rayos X
(Sincrotón)

Tarea 9

Se intenta determinar km midiendo V a diferentes concentraciones de [S], pero se observa que el

sustrato tiende a precipitar en las condiciones experimentales elegidas. ¿Cómo afecta esto la
medición de km?
Este efecto enmascararía la velocidad máxima y la km, ya que aunque se estuviera agregando más
sustrato, la velocidad no aumentaría lo que debiera, además pareciendo que se necesita mucho
sustrato para aumentar la velocidad. Este enmascaramiento estaría dado por la concentración de
sustrato que se precipita. Probablemente llegaría un punto en el que por más sustrato que se
agregara, todo se estaría simplemente precipitando.
 Tarea 10

tub B1/F B B1/F1

o V cpmB1 cpmB2 N T B1 B2 F1 F2 1 B2/F2 prom prom

0 0 12 5 0.0 0 0.66 0.27 -0.66 -0.27 -1.00 -1.00 0.46 -1.00

1 1 9982 13865 0.2 800 545 757 254 42 2.14 17.71 651 9.92

2 3 36014 30645 0.6 2400 1966 1673 433 726 4.54 2.30 1820 3.42

3 6 55024 65138 1.2 4800 3005 3557 1794 1242 1.67 2.86 3281 2.27

4 10 111258 100357 2.0 8000 6076 5480 1923 2519 3.16 2.18 5778 2.67

1200
5 15 153035 149604 3.0 0 8358 8170 3642 3829 2.29 2.13 8264 2.21

1600
6 20 179254 164925 4.0 0 9789 9007 6210 6992 1.58 1.29 9398 1.43

2400 1312 1291 1108 1301

7 30 240235 236485 6.0 0 0 5 10879 4 1.21 1.17 8 1.19

4000 1661 1543 2456 1602

8 50 304254 282654 10.0 0 6 7 23383 2 0.71 0.63 6 0.67

Curva de saturación

TvB
20000

15000

10000
B1

5000

0
10000 20000 30000 40000 50000
-5000 T

Gráfico de Scátchard
 Scatchard
4

B/F 2

0
0 5000 10000 15000 20000
B