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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD

ESCUELA DE CIENCIAS PECUARIAS AGROPECUARIAS Y DE MEDIO AMBIENTE


ECAPMA

TOXICOLOGÍA AMBIENTAL

PRESENTADO POR: MAIRA JUDITH ALEJO BELTRAN

CÓDIGO:1119891462

GRUPO: 358027_7

TUTOR(A): BILMA ADELA FLORIDO

CUMARAL META

2018
ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA CON SEMILLAS DE LECHUGA
(LACTUCA SATIVA)

. 1. Principio de la prueba:

El bioensayo de toxicidad con semillas de lechuga (Lactuca sativa) es una prueba estática
de toxicidad aguda, en el que se pueden evaluar los efectos fitotóxicos de compuestos
puros o de mezclas complejas sobre el proceso de germinación de las semillas y en el
desarrollo de las plántulas durante los primeros días de crecimiento. Como puntos finales
para la evaluación de los efectos fitotóxicos, se determina la inhibición de la germinación,
la elongación de la radícula y el hipocotilo.

Morfología de la semilla y la plántula de lechuga Lactuca sativa L. Es importante destacar


que durante el período de germinación y los primeros días de desarrollo de la plántula,
ocurren numerosos procesos fisiológicos en los que la presencia de una sustancia tóxica
puede interferir alterando la supervivencia y el desarrollo normal de la planta, siendo por
lo tanto una etapa de gran sensibilidad frente a factores externos adversos. Por otra parte,
muchas de las reacciones y procesos involucrados son generales para la gran mayoría de
las semillas, por lo que la respuesta de esta especie y los datos obtenidos a partir de la
aplicación de esta prueba, son en gran medida representativos de los efectos en semillas
o plántulas en general. El éxito o aptitud de una plántula para establecerse en un ambiente
determinado es de gran importancia para garantizar la supervivencia de la especie. La
evaluación del desarrollo de la radícula y el hipocotilo constituye indicadores
representativos para determinar la capacidad de establecimiento y desarrollo de la planta.
A diferencia de la prueba tradicional de germinación de semillas, la evaluación del efecto
en la elongación de la radícula y el hipocotilo de las plántulas, permite observar el efecto
tóxico de compuestos solubles presentes en niveles de concentración tan bajos, que no
son suficientes para inhibir la germinación. Sin embargo, pueden retardar o inhibir
completamente los procesos de elongación de la radícula o el hipocotilo, dependiendo ello
del modo y sitio de acción del compuesto. De esta manera, la inhibición de la elongación
en la radícula e hipocotilo, constituyen indicadores subletales muy sensibles para la
evaluación de efectos biológicos en vegetales, aportando información complementaria a la
proporcionada al estudiar el efecto en la germinación. Este ensayo puede ser aplicado para
la evaluación de la toxicidad de compuestos puros solubles, de aguas superficiales (lagos,
ríos), aguas subterráneas, aguas para consumo humano, aguas residuales domésticas e
industriales, además de lixiviados de suelos, sedimentos, lodos u otras matrices sólidas.A
diferencia de otras pruebas en las que se consideran algas o plantas acuáticas sumergidas
como organismo de diagnóstico, el bioensayo con semillas permite evaluar la fitotoxicidad
de muestras coloreadas o con elevada turbiedad de manera directa y sin necesidad de
filtración previa, reduciéndose así las interferencias debidas al pretratamiento y
simplificando el procedimiento de prueba. Si bien L. sativa no es una especie representativa
de ecosistemas acuáticos, la información generada a partir de esta prueba de toxicidad
proporciona datos acerca del posible efecto de los contaminantes sobre las comunidades
vegetales cercanas a las márgenes de cuerpos de agua contaminados, siendo también una
especie interesante de considerar por su importancia desde el punto de vista hortícola. Por
otra parte, L. sativa es de fácil y rápida germinación por lo que es posible desarrollar la
prueba en pocos días

2 Preparar los reactivos y materiales

- Material biológico: 1 sobre de semillas de lechuga (Lactuca sativa L.), de máximo


un año de antigüedad (ver fecha de lote).
- 1 Litro de muestra de agua a evaluar, mínimo 500mL.
- 1 L de agua destilada o potable (agua purificada, no de la llave)
- 21 cajas de Petri (de vidrio o plástico, de 100 mm de diámetro, leer más adelante
otras opciones de recipientes)
- Papel de filtro Whatman No. 3 de 90mm de diámetro, deben ajustar bien en las
cajas de Petri (puede reemplazarse por papel absorbente de cocina)
- 3 Goteros o jeringas de 5mL que permitan medir 4mL.
- 1 Probeta de 250mL o un recipiente que este graduado cada 100mL o 50mL (ver
página 9 del presente documento con indicaciones de cómo crearlo usted mismo).
- Pinzas o algo similar para coger las semillas.
- Sal de cocina.
- 1 recipiente o botella de 1,5 L limpia.
- Papel aluminio (el suficiente para envolver sus 5 cajas de Petri).
- Cinta de enmascarar.
- Libreta de apuntes, formato para la toma de datos diseñado por usted mismo.
- Regla.
- Guantes de látex.
- Bolsas Ziploc tamaño Sandwich.
Materiales para la toma de muestra de agua.

3. Organismo de prueba: Semillas de lechuga de la especie L. sativa variedad


mantecosa.

4. Procedimiento de la prueba: Para llevar a cabo la prueba se deben realizar los


siguientes pasos:

a. Colocar en cada caja de Petri un disco de papel de filtro

b. Rotular correctamente cada caja con la dilución correspondiente a cada muestra a


ensayar, indicando fecha y hora de inicio del bioensayo.

c. Saturar el papel de filtro con 4 o 5 ml de la dilución correspondiente, evitando que se


formen bolsas de aire.

d. Con la ayuda de una pinza, colocar cuidadosamente 10 semillas, dejando espacio


suficiente para permitir la elongación de las raíces.

e. Tapar las cajas y colocarlas en las bolsas plásticas para evitar la pérdida de humedad.

f. Dado que algunas variedades de semillas de lechuga requieren oscuridad para que se
produzca la germinación, las cajas de Petri deben protegerse de la luz inmediatamente
después de colocar las semillas en su interior y durante el período de ensayo.

g. Incubar por 7 días a 22ºC. h. Realizar 2 repeticiones para cada dilución.

Caja 1 Caja 2 (C+) Caja 3 (C+) Caja 4 Caja 5 Caja 6 Caja 7


Control (C+)
Negativo

5 ml de 4 ml de 3 ml de agua 1 ml de 5 ml de 1 ml de 3 ml de
agua mineral agua + 1 ml + 2 ml de Sc agua + 4 muestra agua + 4 agua + 2
de Sc de de Metal ml de Sc del caño ml de ml de
Meta de Metal (mayuga) muestra muestra
del caño del caño
(mayuga) (mayuga)

5. Muestras a ensayar: Se evaluarán dos muestras de agua, en distintas


concentraciones. Una de ellas, el control positivo, es una solución de un metal pesado y
la otra es una muestra de agua tomada del caño mayuga (cumaral meta) Las diluciones
se llevarán a cabo de acuerdo al siguiente esquema.

Esquema general del procedimiento de prueba de toxicidad con semillas de lechuga


Lactuca sativa L.
6. Medidas de los puntos finales de la evaluación de la fitotoxicidad:

Cada punto final se evalúa comparando el efecto generado en los organismos expuestos
a la muestra con respecto a la respuesta en los organismos del control negativo, sujetos
a las mismas condiciones de ensayo, excepto por la ausencia de muestra. Terminado el
período de exposición, se procede a cuantificar el efecto en la germinación y en la
elongación de la radícula y del hipocotilo.
7. Efecto de la germinación:

Registrar el número de semillas que germinaron normalmente, considerando como


criterio de germinación la aparición visible de la radícula.

8. Efecto en la elongación de la radícula e hipocotilo: Utilizando una regla, medir


cuidadosamente la longitud de la radícula y del hipocotilo de la cada una de las plántulas,
correspondientes a cada concentración del compuesto tóxico o dilución de muestra y a
los controles. La medida de elongación de la radícula se considera desde el nudo (región
más engrosada de transición entre la radícula y el hipocotilo) hasta el ápice radicular. La
medida de elongación del hipocotilo se considera desde el nudo hasta el sitio de inserción
de los dos cotiledones.

Muestra los distintos estadios de la semilla durante la prueba de germinación y


elongación.

Cajas de Petri

Control Control control Muestra muestra muestra

Variables (-) (-) (+) R1 R2

Numero de 11 7 6 9 8 6
semillas de
germinación

Promedio de 9 9 7.5 9 8.5 7.5


controle
negativos

Porcentaje de 100% 100% 67% 100% 89% 67%


germinación

Calculo del porcentaje de inhibición de la germinación


% 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑔𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑐𝑖ó𝑛=(𝑆𝑔𝐶𝑛𝑒𝑔−𝑆𝑔𝑀𝑅)/𝑆𝑔𝐶𝑛𝑒𝑔∗100

% 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑔𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑐𝑖ó𝑛=(9−7,67)/9∗100

% 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑔𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑐𝑖ó𝑛=14,78%

Medida de elongación de hipocotilo en cada caja de Petri


semillas Caja de Caja Caja Caja de Caja de Caja ade petri muestra
petri (-) de de petri petri r2
petri petri muestra muestra r1
(-) control
(+)

1 31 25 2 27 20 31

2 20 23 22 22 4

3 13 17 5 14 19

4 29 29 22 19 28

5 26 18 20 9 25

6 18 13 13 18

7 15 21

8 22

9 28

10 17

11 18

Promedio 21,55 20,86 2 18,67 16,80 20,83


eh

Desviación 6,09 5,37 8,26 5,26 9,66


estándar

Coeficiente 28,26 25,73 44,26 31,33 46,38


de
variación

Cálculo de porcentaje de inhibición de hipocotilo.

% 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 𝐷𝑒𝑠𝑎𝑟𝑟𝑜𝑙𝑙𝑜 𝐻𝑖𝑝𝑜𝑐𝑜𝑡𝑖𝑙𝑜= (𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝐸𝐻 𝐶𝑛𝑒𝑔−𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 / 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝐸𝐻 𝐶𝑛𝑒𝑔) *100

% 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 𝐷𝑒𝑠𝑎𝑟𝑟𝑜𝑙𝑙𝑜 𝐻𝑖𝑝𝑜𝑐𝑜𝑡𝑖𝑙𝑜= (21,20−18,77 / 21,20)∗100


% 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 𝐷𝑒𝑠𝑎𝑟𝑟𝑜𝑙𝑙𝑜 𝐻𝑖𝑝𝑜𝑐𝑜𝑡𝑖𝑙𝑜=11,48%

Medida de elongación de radícula (ER) en cada caja de Petri

semillas Caja de Caja de Caja de Caja de Caja de petri Caja de petri r2


petri(-) petri (-) petri(+) petri muestra r1
muestra

1 28 21 0 13 15 13

2 21 19 10 28 9

3 9 15 0 9 12

4 17 21 14 12 18

5 23 10 11 7 16

6 16 11 6 12

7 13 18

8 19

9 22

10 14

11 16

Promedio e 18 16,43 0 9,00 14,20 13,33

Desvicion 5.31 4,54 5,22 8,29 3,20


estándar

Coeficiente 29,50 27,64 57,95 58,37 24,03


de
variacion

Cálculo de la inhibición de radícula

% 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 𝐷𝑒𝑠𝑎𝑟𝑟𝑜𝑙𝑙𝑜 𝑅𝑎𝑑í𝑐𝑢𝑙𝑎=(𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝐸𝐻 𝐶𝑛𝑒𝑔−𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝐸𝐻 𝑀 / 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝐸𝐻 𝐶𝑛𝑒𝑔)∗100

% 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 𝐷𝑒𝑠𝑎𝑟𝑟𝑜𝑙𝑙𝑜 𝑅𝑎𝑑í𝑐𝑢𝑙𝑎=(17,21−12,18 / 17,21)∗100


% 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 𝐷𝑒𝑠𝑎𝑟𝑟𝑜𝑙𝑙𝑜 𝑅𝑎𝑑í𝑐𝑢𝑙𝑎=29,26%

Cálculo de índice de germinación IG

% 𝐿𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑑𝑒 𝑟𝑎𝑑í𝑐𝑢𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎=𝐿𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑟𝑎𝑑í𝑐𝑢𝑙𝑎 𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (𝑚𝑚) / 𝐿𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑟𝑎𝑑í𝑐𝑢𝑙𝑎 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙


𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 (𝑚𝑚)∗100

% 𝐿𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑑𝑒 𝑟𝑎𝑑í𝑐𝑢𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎=12,1817,21∗100

% 𝐿𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑑𝑒 𝑟𝑎𝑑í𝑐𝑢𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎=70,74%

% 𝑔𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎=𝑁𝑢𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑠𝑒𝑚𝑖𝑙𝑙𝑎𝑠 𝑔𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑎𝑠 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 / 𝑁𝑢𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑠𝑒𝑚𝑖𝑙𝑙𝑎𝑠


𝑔𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑎𝑠 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜∗100

% 𝑔𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎=7,679∗100

% 𝑔𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎=85,22%

𝐼𝐺=𝐿𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑑𝑒 𝑟𝑎𝑑í𝑐𝑢𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡(%) ∗𝐺𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒(%)100

𝐼𝐺=70,74%∗85,22%100

𝐼𝐺=60,28%

Análisis de resultados.

Una vez realizada la observación de cada una de semillas inoculadas en la muestra, se


alcanza a distinguir una coloración marrón y deformaciones en las hojas, de igual forma
se presenta esta coloración en algunas semillas que no llegaron a germinar, lo cual
permite evidenciar algún grado de toxicidad en las aguas residuales generadas por el
municipio y algunas empresas.

De acuerdo a los datos obtenidos en los cálculos de germinación 14,78%, elongación


hipocotilo 11,48% y elongación de radícula 29,26%, nos permite determinar que la
presencia de tóxicos en la muestra de agua tomada, produjo mayor efecto sobre el
desarrollo de la elongación de la radícula, que en el porcentaje de germinación y la
elongación del hipocotilo.

Finalmente analizando el índice de germinación (IG) se observa una marcada inhibición


en l germinación y el crecimiento del 60,28%.
CONCLUSIONES.

¿Su muestra supera el porcentaje de inhibición de germinación, crecimiento


de radícula o de

Hipocotilo en un 50%?
En la muestra utilizada en el bioensayo se aprecia una inhibición de germinación de
14,78%, el crecimiento de elongación de radícula con 29,26% y el crecimiento del
hipocotilo de 11,48%, por lo tanto, no se supera el 50%

¿Qué indica el índice de germinación obtenido?

De acuerdo al resultado obtenido en el índice de germinación del 60,28%, la muestra de


agua tomada afecta notoriamente la geminación de las plantas, con lo cual podemos
asumir la presencia de contaminantes importantes en el efluente.

¿Hay riesgo de toxicidad en la muestra tomada?

Relacionando la inhibición de la geminación y la afectación en el crecimiento de la


radícula y el hipocotilo, se hace evidente la contaminación por tóxicos en la muestra de
agua utilizada en el bioensayo.
ANEXO

BIBLIOGRAFÍA

https://www.google.com.co/search?q=%E2%80%93+Esquema+general+del+procedimi
ento+de+prueba+de+toxicidad+con+semillas+de+lechuga+Lactuca+sativa+L.&rlz=1C1
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http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/573/cap4.pdf

http://bdigital.uncu.edu.ar/objetos_digitales/2653/lallanaagrarias40-08.pdf