You are on page 1of 7

Metodele PCR utilizate pentru determinarile de biologie

moleculara
Pentru probarea diagnosticului, se recomanda urmatoarele analize si investigatii:
Reactia de polimerizare in lant PCR (polimerase chain reaction) are la baza o tehnologie in
vitro care imita capacitatea naturala de replicare a ADN si care consta in generarea rapida a
unor copii multiple a unei secvente nucleotidice tinta (ADN sau ARN) dintr-o gena de interes
sau un patogen specific; produsul amplificat PCR este apoi detectat prin diverse metode.
Numarul de copii ale secventei tinta creste exponential cu fiecare ciclu de amplificare,
deoarece fiecare secventa nucleotidica nou sintetizata constituie o matrita pentru o noua
copie. Produsul PCR care reprezinta o copie a ADN/ARN tinta original este
denumit amplicon. Aceasta metoda permite detectarea cu specificitate foarte mare a unor
concentratii foarte scazute ale secventei tinta.
Amplificarea se realizeaza intr-un analizor special (thermal cycler), iar amestecul de
reactie trebuie sa contina urmatoarele elemente:
- ADN sau ARN tinta: extras din proba in cursul etapei de prelucrare;
- enzima care faciliteaza sinteza lantului complementar de acid nucleic: ADN polimeraza Taq
(izolata din Thermophilus aquaticus) pentru o tinta ADN sau RTth ADN polimeraza – pentru o
tinta ARN - care are activitate atat de revers-transcriptaza, cat si de ADN polimeraza (permite
realizarea in acelasi amestec de reactie, atat a transcrierii inverse a ARN tinta in ADN
complementar - ADNc- cat si amplificarea ADNc);
- cofactori enzimatici: Mg2+ si/sau Mn2+;
- primeri (P1 si P2): secvente scurte, monocatenare, cu lungimea maxima 20-30 nucleotide,
care se leaga de o matrita monocatenara prin imperecherea complementara a bazelor;
servesc ca punct de plecare pentru sinteza lantului complementar cu ajutorul ADN
polimerazei, marcand inceputul si sfarsitul regiunii care trebuie sa fie amplificata;
- deoxinucleotidele (dATP, dGTP, dCTP si dUTP): folosite pentru sinteza noii catene ADN
prin atasarea lor la capatul primerilor, complementar cu matrita (observatie: ampliconul va
contine deoxiuridina in loc de o deoxitimidina, deosebindu-l de ADN nativ);
- amperaza: enzima care promoveaza amplificarea selectiva a tintei si distrugerea produsilor
de contaminare din cursul reactiilor de amplificare anterioare; catalizeaza clivarea ADN-ului
care contine deoxiuridina la inceputul primului ciclu de amplificare si nu degradeaza ADN-ul
sau ARN-ul tinta.

Reactia PCR se desfasoara in 3 etape:

1. Denaturarea: in urma incalzirii amestecului de reactie la 94ºC, ADN-ul tinta este separat
(denaturat) in 2 catene;

2. Hibridizarea primerilor: ca urmare a scaderii temperaturii la 55-70ºC, primerii se vor
atasa complementar la capetele 3’ ale celor 2 catene;

3. Elongatia: la temperatura de 72ºC, ADN polimeraza termostabila in prezenta Mn2+ si a
excesului de deoxinucleotid-trifosfati (deoxiadenozina, deoxiguanozina, deoxicitidina si
deoxiuridina) va extinde primerii atasati in lungul matritei tinta si va produce un amplicon
ADN. Analizorul va repeta automat acest proces pentru un numar stabilit de cicluri (de obicei
30-35), la fiecare ciclu dublandu-se cantitatea de amplicon ADN.

cand se produce o dublare exacta a cantitatii de amplicon la fiecare ciclu.Lineara: pe masura ce componentele reactiei sunt consumate. comparativ cu tehnica PCR conventional. in evaluarea raspunsului virusologic sustinut la pacientii cu hepatita cronica cu virus C. . spre exemplu. respectiv in faza de crestere exponentiala a amplificarii. procesul global de amplificare desfasurat de-a lungul unui numar definit de cicluri poate fi divizat in 3 faze: .La randul sau. avantaj esential. dupa ce reactia a fost stopata iar produsii au inceput sa se degradeze.limita inferioara de detectie mult imbunatatita (se pot detecta cantitati mai mici ale ADN-ului tinta. In ultimii ani. se produce o incetinire a reactiei iar produsii PCR incep sa se degradeze. tehnologia PCR a fost revolutionata prin dezvoltarea metodelor de detectie in faza exponentiala (detectie in timp real: real-time PCR).Exponentiala: la fiecare ciclu se dubleaza cantitatea de amplicon ADN (se admite o eficienta de 100% a reactiei). nu se mai formeaza alti produsi de amplificare. detectia in acest moment este optima in sensul ca rezultatele se coreleaza mai bine cu nivelul initial al tintei.Platou (end-point): reactia este stopata. Tehnologia real-time PCR prezinta numeroase avantaje fata de cea conventionala: - acuratete mai mare a rezultatelor obtinute (efectuarea detectiei se realizeaza in faza precoce a reactiei. . unde detectia are loc in faza de platou.domeniu de linearitate mult extins (sunt necesare mai putine dilutii ale probelor). iar daca faza se prelungeste mult produsii PCR vor suferi o degradare importanta. . . Metodele PCR traditionale (conventionale) au la baza o detectie a produsilor PCR in faza de platou a procesului (detectie end-point). .

Cuantificarea viremiei se realizeaza cu ajutorul unei secvente ADN neinfectioase denumita Quantitation Standard (QS). Dupa ce are loc incubarea amestecului. . va fi adaugata amestecului de amplificare si transferata in analizorul in care vor avea loc . . impreuna cu proteaza. Determinarea cantitativa a viremiei . Dupa incheierea etapei de spalare. Analizorul calculeaza concentratia ADN-VHB prin comparararea semnalului tintei cu semnalul QS din fiecare proba si controale. spre deosebire de detectia colorimetrica care avea loc la sfarsitul reactiei. Extractia acizilor nucleici se face automat printr-o tehnica de captura la suprafata unor bilute magnetice de sticla. dar cu o zona unica de legare a sondei de detectie care permite diferentierea ampliconului QS de ampliconul tintei. Proba procesata. QS contine secvente VHB cu zone identice de legare a primerilor ca si ADN- ul tinta.In laboratorul Synevo cele 2 tipuri de metode PCR se aplica la efectuarea urmatoarelor teste: . in tehnologia conventionala. care este cuantificat in cursul desfasurarii reactiei (‘in timp real”) prin monitorizarea fluorescentei emise la fiecare ciclu de amplificare. acizii nucleici adsorbiti vor fi eluati cu o solutie apoasa la temperatura inalta. in timp ce substantele nelegate vor fi indepartate printr-un proces de spalare. In fiecare proba este introdus ADN QS intr-o concentratie cunoscuta.vom descrie in acest document etapa de determinare a incarcaturii virale B.pregatirea probei pentru a izola ADN-VHB. ce include bilutele de sticla impreuna cu ADN VHB si ADN VHB QS. ADN VHB si ADN VHB QS vor fi captati la suprafata bilutelor de sticla. ca si secventa tinta.Real-time PCR: determinarea cantitativa a viremiei la pacientii infectati cu virusurile hepatice B sau C.PCR conventional: detectia calitativa a tipurilor oncogene ale virusului papilomatozei umane (HPV). Particulele virale sunt lizate prin incubarea la temperatura ridicata cu o proteaza si un tampon care elibereaza acizii nucleici si ii protejeaza de actiunea DNA-zelor din plasma. cu mentiunea ca recent in laboratorul nostru s-a trecut de la tehnologia conventionala PCR la tehnologia real-time PCR Taqman cu prelucrarea automata a probelor. ADN QS cu un numar cunoscut de copii este adaugat in fiecare proba si parcurge aceleasi etape de preparare a probei. amplificare PCR si detectie. analiza mutatiei factorului V Leiden si a mutatei protrombinei. agentul lizant si bilutele de sticla. Testele de determinare a viremiei VHB se bazeaza pe 2 procese majore: . Particularitatea o constituie metoda de detectie a produsului PCR.amplificarea PCR a ADN-ului tinta cu detectia simultana a sondei oligonucleotidice dublu marcate clivate specifice tintei.

permitand inregistrarea independenta a emisiilor lor. Cat timp sonda este intacta. in cursul etapei de elongatie. Energia emisa de fluorofor in urma excitarii in UV va fi inregistrata la sfarsitul fiecarui ciclu de amplificare. dublu marcate: la un capat cu o substanta fluorofora (“reporter dye” R) si la celalat capat cu o molecula blocanta (“quencher dye” Q). amplificarea se face in prezenta unui sistem raportor care emite fluorescenta. fiind proportionala cu cantitatea de ADN tinta prezenta in tub pana in momentul respectiv. In cazul in care amplificarea este eficienta. In cazul tehnologiei real-time PCR. ADN polimeraza Taq va degrada sonda prin activitatea sa enzimatica de 5’ endonucleaza si va elibera astfel fluoroforul.amplificarea si detectia. Detectia se realizeaza cu ajutorul sondelor de tip 5’ nucleaza-sonde TaqMan. fluorescenta sistemului R va fi inhibata de molecula Q. Inregistrarile sunt folosite pentru generarea unei . Sondele HBV si HBV QS sunt marcate cu fluorofori R diferiti. moleculele de ADN nou formate vor fixa prin hibridizare sonda TaqMan.

Constantele de calibrare specifice lotului de reactivi vor fi folosite impreuna cu Ct corespunzatoare ADN VHB si ADN VHB QS pentru calcularea titrului ADN VHB din probe si controale. Analiza mutatiei factorului V Leiden Metoda permite detectarea si genotiparea unei mutatii punctiforme a genei umane care codifica factorul V. Cu cat este mai mare titrul de ADN VHB din proba. Prin intermediul unor primeri specifici se asigura amplificarea unui fragment ADN tinta din gena factorului V. fluorescenta emisa de sonda de detectie ar trebui sa fie detectata in cursul aceluiasi ciclu. In treimea inferioara a regiunii de amplificare exponentiala se stabileste o valoare prag (“assigned fluorescence level”). Pentru efectuarea testului se utilizeaza sistemul PCR LightCycler care foloseste o detectie in . procesul se desfasoara intr-un mod similar. Aceasta etapa este realizata tot de ADN polimeraza. izolat printr-o tehnica automata dintr-o proba de sange integral. traversarea acestei valori marcheaza declansarea amplificarii. In cazul determinarii ARN viral hepatita C. ceea ce permite ca atat transcrierea inversa cat si amplificarea PCR sa se produca impreuna cu detectia in timp real a ampliconului.curbe de amplificare cu 3 regiuni: o regiune de latenta in care acumularea de ADN nu atinge inca punctul limita de detectie a semnalului. Cu cat valoarea Ct este mai mare. in care amplificarea secventei tinta inceteaza in special datorita epuizarii enzimei si inhibitiei prin cantitatea mare de ADN. cu atat titrul ADN VHB este mai mic. Pentru fiecare proba se poate determina cu exactitate ciclul de amplificare in care se inregistreaza depasirea valorii prag (Ct= critical threshold value). in cazul tuturor probelor. Deoarece cantitatea de ADN VHB QS este constanta in toate probele. cu atat mai devreme fluorescenta emisa se va ridica deasupra nivelului bazal de fluorescenta. o regiune de amplificare exponentiala si o regiune de platou. dar se adauga si etapa de transcriere inversa a ARN-ului tinta pentru a genera ADN-ul complementar (ADNc).

energia emisa excita la randul sau fluoroforul Red 640. In plus. heteroduplexul ADN este stabil si va avea o temperatura de topire mai mare. mutant homozigot sau genotip heterozigot. Daca este prezenta mutatia factorului V. deoarece sonda cu o secventa mai scurta (sonda mutatiei) este prima care disociaza si cei 2 fluorofori nu mai sunt in apropiere.sonda 1. cresterea semnificativa a temperaturii induce scaderea fluorescentei emise.timp real prin fluorescenta a produsului amplificat diferita de cea obtinuta cu ajutorul sondei TaqMan. testul va fi considerat invalid si vor trebui repetate toate etapele. Ca urmare a apropierii celor 2 fluorofori in cursul fazei de hibridizare. cu mentiunea ca. nepotrivirea sondei mutatiei cu tinta va destabiliza hibridul. Genotipul heterozigot prezinta o combinatie distincta de proprietati. negativ si pozitiv. Pentru analiza mutatiei protrombinei se foloseste o metoda similara. pentru detectia ampliconului se folosesc 2 sonde care hibridizeaza la o secventa interna a fragmentului amplificat. In prezenta genotipului salbatic (fara mutatie). astfel ca scaderea fluorescentei se va inregistra la temperaturi mai joase. marcate cu fluorofori diferiti: . pentru validarea rezultatelor se folosesc 2 controale. prin analiza curbei de topire efectuata dupa incheierea ciclurilor de amplificare. acesta va emite o lumina fluorescenta rosie. Sonda marcata cu Red 640 hibridizeaza la o secventa a tintei care nu contine situsul mutatiei (sonda ancora).sonda 2. marcata la capatul 3’ cu fluoresceina (fluoroforul donator D). Daca nu se produce acest lucru. Sondele de hibridizare sunt de asemenea folosite pentru stabilirea genotipului mutatiei. Cantitatea de fluorescenta emisa va fi proportionala cu nivelul tintei. pentru acesta din urma trebuie sa se obtina obligatoriu un profil de genotip heterozigot. . In cursul analizei curbei de topire. sonda marcata cu fluoresceina hibridizeaza la o secventa care include situsul respectiv (sonda a mutatiei). marcata la capatul 5’ cu substanta LightCycler Red 640 (fluoroforul acceptor A). . printr-un transfer de energie a rezonantei fluorescente (FRET: fluorescence resonance energy transfer). in cursul fazei de hibridizare a primerilor. Rezultatul pentru ADN-ul unei probe trebuie sa prezinte intotdeauna un profil al curbei de topire pentru unul din cele 3 genotipuri: tipul homozigot salbatic (mutatie absenta). facilitand apropierea celor 2 fluorofori. Astfel. Fluoresceina este excitata de lumina albastra emisa de o sursa a LightCycler-ului si emite o lumina fluorescenta verde. a carei intensitate va fi masurata in unitatea optica a LightCycler- ului. Sondele sunt reprezentate de 2 secvente oligonucleotidice specifice. Secventele celor 2 sonde sunt astfel selectate incat sa hibridizeze la secventele tintei intr-un aranjament de tip cap-coada. cand ampliconul este prezent in concentratii crescute.

Etapa de pregatire a probei consta in extractia ADN HPV din celule cervicale recoltate in mediu lichid. identificarea alelelor tinta se face prin electroforeza in gel de agaroza. iar procesarea post-amplificare este redusa la maximum. Specificitatea sistemului de tipizare este parte a procesului de amplificare. Dynal SSP este bazat pe principiul ca un set de primeri cu o complementaritate perfecta cu proba poate fi utilizat mult mai frecvent si mai eficient decat seturile de primeri cu una sau mai multe nucleotide necomplementare la capatul 3’. Amplificarea se realizeaza intr-un termocycler.hibridizarea produsilor de amplificare la sonde oligonucleotidice specifice tintei. Genotiparea HPV In cazul acestui test amestecul de reactie contine primeri pentru amplificarea ADN a 37 genotipuri HPV precum si a genei β-globinei. .amplificarea ADN-ului tinta cu ajutorul unor primeri complementari specifici HPV. Un rezultat negativ pentru o proba este validat numai daca se obtine un rezultat pozitiv pentru ADN-ul β-globinei. cat si pentru ADN-ul β-globinei.Dynal SSP Tool. Amestecul de reactie contine perechi de primeri specifici atat pentru ADN-ul provenit de la 13 tipuri HPV cu risc inalt.Detectia tipurilor oncogene HPV Testul include 4 procese majore: . Pentru detectie si genotipare se utilizeaza un ADN amplificat denaturat si stripuri care includ sonde oligonucleotidice dispuse liniar (sub forma de benzi) care permit identificarea independenta a genotipurilor HPV individuale. iar detectia pe un analizor ELISA automat. precum si o pereche de primeri de control (specifici pentru o secventa nonalelica din proba. . care furnizeaza o a doua opinie dupa interpretarea manuala. Dynal SSP este o tehnica PCR ce utilizeaza primeri cu secventa specifica pentru tipizarea HLA. reducand astfel riscul unor erori umane. Detectia ampliconului este efectuata cu ajutorul unor sonde oligonucleotidice specifice care permit identificarea separata a ampliconului HPV si a celui corespunzator β-globinei. Interpretarea rezultatelor obtinute poate fi facuta rapid cu ajutorul unui program de interpretare . marker pentru spondilita ankilopoietica. care functioneaza ca un control intern al PCR. se foloseste un control celular reprezentat de ADN-ul β-globinei umane care se va amplifica simultan cu ADN-ul tinta. Produsul Dynal SSP consta in amestecuri de primeri. . Tehnica Dynal SSP pentru tipizarea HLA Este aplicata in laboratorul Synevo pentru determinarea HLA-B27. verificand eficienta procesului).pregatirea probei. fiecare continand una sau mai multe perechi de primeri specifici. printr-o tehnica manuala. In cazul in care are loc amplificarea. .detectia acestora printr-o metoda colorimetrica. Pentru monitorizarea acuratetii acestor 4 procese.