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Biología Molecular

MSc Jhonatan Alarcón Baldeón
Lic. Arturo Rivas Cardenas

Ada Catiana Durán Piralla

2.1. Aprender la extracción del ADN a través de la sangre periférica. Encontrar los beneficios de realizar una extracción de ADN por el método Salting out .

La extracción de ácidos nucleicos es el primer proceso del análisis demuestras para PCR. . A su vez es muy importante tener claro nuestros objetivos analíticos para seleccionar correctamente el método más adecuado de extracción. de una importancia capital para el éxito del mismo.

PRECIPITACIÓN: Permite la obtención de un ácido nucleico listo para ser almacenado o diluido en la concentración deseada para su análisis. Kits Comerciales de extracción: Sistema de QIAamp de QIAGEN . Se pueden utilizar varios procedimientos: a. aunque de menor importancia en clínica. b. choque osmótico. para facilitar la salida de los ácidos nucleicos.100) o matriz de sílice. Métodos tradicionales de purificación (extracción y precipitación) 2.En general existen: 1. congelación- descongelación. Sistema de matriz de Sílice y Columnas 4. Proteinasa K 2. Para tal efecto podemos utilizar: a) Métodos físicos: Cizallamiento. 3. SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN: Permite la eliminación progresiva de proteínas y otros contaminantes celulares y la obtención de un material genético cada vez más limpio. y la elusión con tampón TE. previa unión del ácido nucleico a resinas (Chelex . etc. b) Detergentes: como el SDS c) Enzimas: Lisozima. Fenol/Cloroformo: Ha sido uno de los métodos más usados. sonificación. Los principales métodos de extracción de ADN en diagnóstico molecular son: 1. Se suele utilizar el etanol o Isopropanol. HOMOGENIZACIÓN: Permite la disgregación de la estructura celular y tisular. Métodos de extracción con Salting Out 3. ya sea de afinidad o de intercambio iónico. El fenol desnaturaliza las proteínas y componentes celulares. hervido. y el cloroformo permite la separación de las fases durante la centrifugación. Separación cromatográfica: Se emplean columnas preempaquetadas. Kits de purificación de ADN usando columnas prehechas (cromatografía de intercambio aniónico) Los pasos generales en el proceso de extracción de ácidos nucleicos son: 1. Métodos de extracción con Fenol/Cloroformo 2. Luego es necesario lavados sucesivos para eliminar los contaminantes.

000)  Baño María  Propipetas  Micropipetas (100 – 1000 µL)  Pipetas Pasteur (cuentagotas)  Tubos de centrífuga de polipropileno (estériles)  Tubos al vacío con EDTA  Tubos de microcentrífuga estériles (eppendorf)  Jeringas de 5cc  Jeringas de tuberculina  Gradilla de tubos  Rotulador indeleble  Buffer lisis de Glóbulos rojos (Buffer lisis frío)  Solución SE  Solución SDS 10 %  Proteinasa K 20 mg/mL  Solución ClNa 6M  Alcohol isopropílico o estanol absoluto  Solución TE . Centrífuga de tubos (4.000 – 5.

hasta completar 14 mL REFRIGERAR (sangre + buffer lisis frío = 14 mL) . Para lisas las células Rotular nuestro tubo Vaciar los 6mL de de centrífuga de sangre. agregar a estos 6mL. Realizaremos la venopunción usando tubos vacutainer con EDTA Recolectaremos la cantidad de 6 mL (usar 2 tubos de 3mL)  Luego. Buffer lisis frío.en la congeladora - durante 15 min y homogenizar cada 5 min. en el tubo polipropileno de de polipropileno de 15 mL .

solución hipotónica. la punta de tubo. debemos RESUSPENDER. en donde se encontrará el pellet (‘‘pequeñas porciones de material aglomerado’’) . con la pipeta Pasteur No olvidar CONTRAPESAR cada tubo Después de ELIMINAR el sobrenadante. CENTRIFUGAR También notamos que conforme se repite este Dicho procedimiento el proceso se color del líquido repetirá 3 en el tubo. Luego eliminar el sobrenadante. es decir. nuevamente. se veces vuelve más pálido. está siendo lavado Al RESUSPENDER debemos golpear con los dedos. BLF. Luego. que lisa los GR. con el Buffer lisis frío. Centrifugar a 5000 RPM durante 10 min.

golpeándolo en el fondo del tubo.24 horas . No olvidemos. disolver el pellet. Posteriormente RESUSPENDER el pellet con el Buffer lisis caliente hasta los 3 mL El BLC.HCl. tiene en su composición Tris . buffer lisis caliente. NaCl y EDTA Agregar SDS 10% (50 µL) Luego agregar Proteinasa K (50 µL) Llevarlo al Baño María a 50 ° C → durante 17 .

guardar el ADN extraído a T° de refrigeración. . Retirarlo del Baño María Agregar NaCl 6M (2 mL). extraer dicha medusa hacia el Agregar 1mL de solución TE y tubo eppendorf de 2 mL disolverlo en la estufa Finalmente. con la ayuda de la pipeta Pasteur Agregar tanto ALCOHOL (96°) Mezclar como líquido en el tubo suavemente y Corning. Mezclar vigorosamente por unos minutos. Luego llevar a la centrífuga Extraer en otro tubo vacío (Corning) el sobrenadante final. para lograr el observar la precipitado y la formación de formación de la medusa la ‘medusa’ de ADN Dejar secar en la estufa Con la ayuda de una pipeta Pasteur.

Por lo que su aplicacación es de fácil manejo. Permitiendo que sea didáctico. 2. Todos los métodos de extracción poseen la misma estructura: lisis. Y evita el uso de disolventes orgánicos.1. El método del Salting out permite el uso de sales. simples y reemplazables. extracción y purificación .

. . ¿Por qué utilizamos el EDTA cómo anticoagulante? Porque esta no interfiere en la biología molecular. como otros anticoagulantes (fluoruro de sodio. para garantizar el éxito de nuestro procedimiento . Se debe procurar asegurarse de que el Baño María se lleve a cabo las horas correspondientes. heparina. etc). . Se utilizó Alcohol medicinal de 96° para realizar la obtención del precipitado y posteriormente la de la medusa de ADN. Y no produce contaminantes.

Lima – Perú.com/blog-reactivos/post/10-metodos-de- extraccion-de-adn/ .1. Rosado. Guía de prácticas de Biología Molecular.wakolatinamerica. J. H. Adriana Clegg. (2008). FujiFilm [Blog] Recuperado de http://www. 2. Herrera.