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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA AGRARIA ANTONIO NARRO

SUBDIRECCIÓN DE POSGRADO

RESPUESTA FISIOLÓGICA Y BIOQUÍMICA A LA APLICACIÓN DE


NANOPARTÍCULAS DE COBRE Y ÓXIDO DE HIERRO EN LA GERMINACIÓN
Y CRECIMIENTO DE Cucumis spp.

Tesis

Que presenta ESMERALDA JACKELIN SILVERIO MATA


como requisito parcial para obtener el Grado de
MAESTRO EN TECNOLOGÍA DE GRANOS Y SEMILLAS

Saltillo, Coahuila, Diciembre 2017

i
RESPUESTA FISIOLÓGICA Y BIOQUÍMICA A LA APLICACIÓN DE
NANOPARTÍCULAS DE COBRE Y ÓXIDO DE HIERRO EN LA GERMINACIÓN
Y CRECIMIENTO DE Cucumis spp.

Tesis

Elaborada por ESMERALDA JACKELIN SILVERIO MATA como requisito


parcial para obtener el grado de MAESTRO EN TECNOLOGÍA DE GRANOS Y
SEMILLAS con la supervisión y aprobación del Comité de Asesoría

_______________________________ ___________________________
Dra. Norma Angélica Ruiz Torres Dr. Celestino Flores López
Asesor principal Asesor

_______________________________ ____________________________
Dr. Ricardo Hugo Lira Saldívar Dra. Ileana Vera Reyes
Asesor Asesor

Dra. Rosalinda Mendoza Villarreal


Subdirectora de Posgrado
UAAAN

Saltillo, Coahuila Diciembre 2017

ii
Agradecimientos

A mi “ALMA MATER” Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, por


darme la oportunidad de realizar los estudios de licenciatura y posgrado.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), por el apoyo


otrogado para la realización de la maestría.

Al Centro de Investigación en Química Aplicada (CIQA), por abrirme las puertas


para la realización del presente trabajo de investigación.

Al núcleo académico de la Maestría en Tecnología de Granos y Semillas, y al


personal del CENTRO DE CAPACITACIÓN Y DESARROLLO EN
TECNOLOGÍA DE GRANOS Y SEMILLAS.

A la Ph. D. Norma angélica Ruiz Torres. Por el apoyo incondicional brindado


a lo largo del desarrollo del presente trabajo, por el tiempo dedicado y por todos
sus consejos que han contribuido con mi crecimiento profesional y personal, por
ello muchas gracias.
A la Dra. Ileana Vera Reyes, por el apoyo y el tiempo dedicado al presente
trabajo de investigación, por sus contribuciones y por su amistad.

Al Dr. R. Hugo Lira Saldivar, por su apoyo y tiempo otorgado para la


elaboración de la presente investigación.

Al Dr. Celestino Flores López. Por su aportación y tiempo brindado al


presente trabajo, así como su apoyo académico.

Y a todas aquéllas personas que de una u otra manera colaboraron en el


presente trabajo.

iii
Dedicatoria

iv
Índice General

Agradecimientos ............................................................................................................. iii


ÍNDICE GENERAL .......................................................................................................... v
Índice de Cuadros ........................................................................................................ viii
Índice de Figuras ............................................................................................................ ix
Resumen.......................................................................................................................... xi
Abstract ........................................................................................................................... xv
1 INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 1
1.1 Hipótesis .............................................................................................................2
1.2 Objetivo ..............................................................................................................2
1.3 Objetivos específicos .......................................................................................2
2 REVISIÓN DE LITERATURA ............................................................................ 4
2.1 Aspectos generales del género Cucumis .....................................................4
2.1.1 Morfología de la germinación del género Cucumis. ............................4
2.2 Definición de germinación y vigor .................................................................. 5
2.3 Nutrientes en las plantas .................................................................................7
2.3.1 Principales funciones de micronutrientes en las plantas ....................8
2.3.2 Funciones del hierro (Fe) en la fisiología vegetal ................................9
2.3.3 Funciones cobre (Cu) en la fisiología vegetal ..................................... 11
2.4 Nanotecnología (NT) ......................................................................................13
2.4.1 Nanomateriales ........................................................................................15
2.4.2 Nanopartículas metálicas y sus derivados .......................................... 16
2.5 Nanopartículas en la agricultura ................................................................... 18
2.5.1 Nanoplaguicidas ......................................................................................19
2.5.2 Detección de residuos de plaguicidas ................................................. 20
2.5.3 Detección y control de fitopatógenos ................................................... 21
2.5.4 Inocuidad alimentaria .............................................................................. 22
2.5.5 Nanopartículas como promotoras de la germinación y crecimiento.
22
v
2.6 Nanotoxicología en especies vegetales ......................................................26
2.6.1 Estrés oxidativo y sistema antioxidante en plantas ...........................27
2.6.2 Prolina ....................................................................................................... 33
3 MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................... 35
3.1 Ubicación del experimento ............................................................................ 35
3.2 Material biológico ............................................................................................35
3.3 Estudios preliminares ..................................................................................... 35
3.3.1 Germinación estándar ............................................................................ 35
3.3.2 Curva de imbibición................................................................................. 36
3.3.3 Preparación de soluciones con nanopartículas (NPs) y
micropartículas (MPs). ......................................................................................36
3.3.4 Elección de un método para adicionar Fe2O3, mediante la
germinación in vitro, realizando comparación entre la imbibición con NPs
y un medio de cultivo con NPs dispersas. ..................................................... 36
3.4 Establecimiento de Bioensayos ................................................................... 38
3.4.1 BIOENSAYO I. Evaluación del efecto potencial de NPsCu como
promotor de la germinación y vigor en semillas de Cucumis sativus. ...... 38
3.4.2 BIOENSAYO II. Efecto diferencial en el comportamiento fisiológico
de semillas, debido a la aplicación de nanopartículas NPsFe2O3 y
micropartículas de sulfato de hierro MPsFe2SO4. ........................................ 40
3.4.3 BIOENSAYO III. Efectos de la aplicación de NPsFe2O3 y
MPsFeSO4 a concentraciones medias en el proceso de la germinación y
vigor de semillas de Cucumis melo. ...............................................................41
3.4.4 BIOENSAYO IV. Efecto de NPsFe2O3 en la germinación y vigor,
bajo condiciones in vitro de semillas de Cucumis sativus. .........................41
3.4.5 BIOENSAYO V. Cuantificación de la activación enzimática
antioxidante y la producción de Prolina en las plántulas provenientes de
semillas sometidas a NPsFe2O3 y MPsFeSO4. ............................................ 42
3.5 Diseño experimental.......................................................................................44
4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................ 46

vi
4.1 BIOENSAYO I. Evaluación del efecto potencial de nanopartículas de
cobre NPsCu, como promotor de la germinación y vigor en semillas de
Cucumis sativus L. .................................................................................................... 46
4.2 BIOENSAYO II. Efecto de nanopartículas NPsFe2O3 y micropartículas
MPsFeSO4 a bajas concentraciones, en el comportamiento fisiológico de
semillas de Cucumis melo L. ................................................................................... 52
4.3 BIOENSAYO III. Comportamiento fisiológico de semillas de Cucumis
melo L., debido a la aplicación de nanopartículas de NPsFe2O3 y
micropartículas de MPsFeSO4 a concentraciones medias. ................................56
4.4 BIOENSAYO IV. Efecto de NPsFe2O3 en la germinación y vigor de
semillas de Cucumis sativus L., bajo condiciones in vitro. ................................. 61
4.5 BIOENSAYO V. Pruebas bioquímicas para la determinación de la
producción de estrés oxidativo, mediante la cuantificación de la activación del
sistema antioxidante enzimático y la producción de prolina en plántulas
tratadas con NPsFe2O3 y MPsFeSO4. ................................................................... 64
5 CONCLUSIONES ..............................................................................................70
6 REFERENCIAS ................................................................................................. 72
Commented [CTQ1]: No números (quitar)

vii
Índice de Cuadros

Cuadro 1. Descripción de tratamientos con NPsCu aplicados en semillas de C.


sativus mediante imbibición. _______________________________________ 38
Cuadro 2. Concentraciones utilizadas para realizar un comparativo por tamaño
de partícula en la germinación de semillas de Cucumis m. _______________ 40
Cuadro 3. Análisis de varianza de las variables fisiológicas evaluadas en
semillas de C. sativus tratadas con NPsCu a dosis altas y bajas durante
diferentes periodos de imbibición. __________________________________ 46
Cuadro 4. Análisis de varianza de las variables fisiológicas evaluadas en
semillas de C. sativus tratadas con NPsCu a concentraciones bajas y altas,
durante diferentes periodos de imbibición. ____________________________ 47
Cuadro 5. Comparación de medias de variables fisiológicas evaluadas en
semillas de C. sativus tratadas con dosis bajas y altas de NPsCu, durante dos
periodos de imbibición. ___________________________________________ 49
Cuadro 6. Cuadrados medios y nivel de significancia obtenidos en el análisis de
varianza para variables fisiológicas de semillas de C. melo tratadas con NPs y
MPs, evaluadas en la prueba de germinación. ________________________ 52
Cuadro 7. Comparación de medias de las variables fisiológicas evaluadas en
semillas de melón tratadas con NPs y MPs de hierro. ___________________ 53
Cuadro 8. Cuadrados medios y nivel de significancia de variables fisiológicas
de semillas de C. melo tratadas con NPs y MPs a concentraciones medias
(0,10, 50 y 100 ppm). ____________________________________________ 56
Cuadro 9. Comparación de medias de variables evaluadas en semillas de C.
melo tratadas con NPs y MPs, bajo condiciones de laboratorio. ___________ 57
Cuadro 10. Cuadrados medios y nivel de significancia estadística de variables
avaluadas bajo condiciones in vitro de semillas tratadas con NPs Fe2O3. ___ 61
Cuadro 11. Comparación de medias para variables fisiológicas evaluadas en el
ensayo de germinación in vitro de semillas de C. sativus tratadas con
NPsFe2O3. _____________________________________________________ 62

viii
Índice de Figuras

Figura 1.Obtención de la ecuación de la curva de calibración para la


cuantificación de proteína. ________________________________________ 43
Figura 2. Efecto de dos dosis de NPsCu aplicadas en semillas de C. sativus:
dosis bajas a 12 h (1a 12 h), y 24 h de imbibición (1a 24 h); y dosis altas a 12 h
(2b 12 h) y 24 h (2b 24 h) de imbibición. _____________________________ 50
Figura 3. Efecto de NPsFe2O3 y MPsFeSO4 en bajas concentraciones como
promotor de la germinación de semillas de C. melo. ____________________ 54
Figura 4. Aumento de la longitud de radícula y de vástago, estimulada por la
aplicación de NPsFe2O3 y MPsFeSO4, en semillas de C. melo L. _________ 54
Figura 5. Comportamiento de la germinación como respuesta a la aplicación de
dos tipos de partículas y cuatro concentraciones (0, 10, 50 y 100 ppm) de fierro.
_____________________________________________________________ 58
Figura 6. Respuesta del IVE bajo efecto de la interacción entre tipo de partícula
(NPs y MPs) y concentración (A), e IVE obtenidos por concentración utilizada
(B). __________________________________________________________ 58
Figura 7. Efecto de diferentes concentraciones (A) y su interacción con tipo de
partícula (NPs y MPs) en la longitud de vástago de plántulas de C. melo L. _ 59
Figura 8. Comportamiento de vigor y germinación se semillas sembradas bajo
condiciones in vitro y tratadas con NPsFe2O3. _________________________ 62
Figura 9. Respuesta de longitud de vástago y radícula por efecto de NPsFe2O3
bajo condiciones in vitro. _________________________________________ 63
Figura 10. Cuantificación de APX en plántulas de Cucumis melo tratadas con
NPsFe2O3 y MPsFeSO4 a concentraciones de 0 a 100 ppm. _____________ 64
Figura 11. Cuantificación de POD en parte aérea y raíz de plántulas de C.
melo, tratadas con NPsFe2O3 y MPsFeSO4 a concentraciones de 0 a 100 ppm.
_____________________________________________________________ 65
Figura 12. Microgramos de prolina por peso fresco de material vegetal,
cuantificado en plántulas de C. melo sometidas a tratamientos de fierro en su
forma de NPs y MPs en bajas concentraciones. _______________________ 66

ix
Figura 13. Microgramos de prolina por peso fresco de material vegetal,
cuantificado en plántulas de C. melo sometidas a tratamientos de fierro en su
forma de NPs y MPs a concentraciones de 0 a 100 ppm. ________________ 67

x
Resumen

RESPUESTA FISIOLÓGICA Y BIOQUÍMICA A LA APLICACIÓN DE


NANOPARTÍCULAS DE COBRE Y ÓXIDO DE HIERRO EN LA GERMINACIÓN
Y CRECIMIENTO DE Cucumis spp.

POR

ESMERALDA JACKELIN SILVERIO MATA


MAESTRÍA PROFESIONAL EN TECNOLOGÍA DE GRANOS Y SEMILLAS

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA AGRARIA ANTONIO NARRO


DRA. NORMA ANGÉLICA RUIZ TORRES- ASESOR

Saltillo, Coahuila Diciembre 2017

xi
Se estudió el efecto potencial de NPsFe2O3 y NPsCu en los procesos
fisiológicos relacionados con el vigor de la germinación, crecimiento de
plántulas y su respuesta en el estrés oxidativo, en semillas de C. melo y C.
sativus. La investigación incluyo cinco bioensayos llevados a cabo en el
Laboratorio de Fisiología y Bioquímica del Centro de Capacitación y Desarrollo
en Tecnología de Semillas (CCDTS), de la Universidad Autónoma Agraria
Antonio Narro y en el Laboratorio de Biotecnología perteneciente al
Departamento de Plásticos en la Agricultura del Centro de Investigación en
Química Aplicada (CIQA), en Saltillo, Coahuila México. Se realizaron pruebas
preliminares para el establecimiento de los bioensayos que incluyeron curvas
de imbibición, pruebas de germinación estándar, preparación de soluciones con
NPs y MPs, y métodos para la adición de NPs en un medio de cultivo para la
germinación in vitro. Bioensayo I: ensayo de germinación y vigor de semillas de
C. sativus tratadas con NPsCu a dosis bajas (0- 100 ppm) y altas (0- 500 ppm)
imbibidas por 12 y 24 h por medio de agitación, estableciendo 24 tratamientos
con cuatro repeticiones cada uno, el vigor (VIG) se evaluó al cuarto día después
de la siembra y la germinación (GERM), plántulas anormales (PA), semillas sin
germinar (SSG), longitud de vástago (LV) y longitud de radícula (LR) al octavo
día después de la siembra. Bioensayo II: efecto diferencial del comportamiento
fisiológico en semillas de C. melo debido a la aplicación de NPsFe2O3 y
MPsFeSO4 a concentraciones de 0 a 50 ppm imbibidas por 24 h, se realizó una
prueba de germinación, donde se evaluó VIG, GERM, PA, SSG, LV y LR,
además de colectar muestras de tejido vegetal de 100, 200 y 500 mg.
Bioensayo III: se determinó los efectos de la aplicación de NPsFe2O3 y
MPsFeSO4 a concentraciones medias (0 a 100 ppm) en el proceso de la
germinación y vigor de semillas de C melo, se evaluó IVE, VIG, GERM, PA,
SSG, LV, LR. Bioensayo IV: efecto de NPsFe2O3 (0, 50, 100, 200 y 500 ppm)
en la germinación en medio de cultivo in vitro, para mejorar la expresión del
vigor en la germinación de C. sativus, se evaluó IVE, VIG, GERM, LR, LV y PS
(peso seco). Bioensayo V: se analizó el estrés oxidativo, mediante la

xii
cuantificación de la actividad enzimática antioxidante (POD y APX) y la
producción de prolina en las plántulas provenientes del Bioensayo II y
Bioensayo III. Los resultados del bioensayo I, indican que NPsCu a bajas
concentraciones promueven el vigor con respecto al crecimiento de plántulas, si
las semillas pasan por periodos cortos de imbibición y a medida que aumenta
las concentraciones el vigor de germinación se ve afectado de forma
progresiva, mientras que la aplicación de altas concentraciones de NPsCu
provoca toxicidad y esta es expresada con la inhibición del crecimiento de
raíces principales. Bioensayo II. Los resultados indican que es posible mejorar
la germinación y el crecimiento de plántulas de C. melo al aplicar
concentraciones de 0.5 y 50 ppm (NPsFe2O3) y con 0.5, 5, y 10 ppm
(MPsFe2SO4), además, que permiten reducir el número de plántulas anormales.
Bioensayo III. En la FV concentración se encontró que 10 y 50 ppm mejoran el
IVE y LV, y en la FV partícula la mejor fue NPs a 10 ppm. En cuanto a
interacciones, el porcentaje de germinación se incrementó 6 y 8 % con los
tratamientos de 50 y 100 ppm (MPs), respectivamente, para la variable IVE el
tratamiento con 100 ppm de MPs superó al testigo. De igual forma, para LV los
tratamientos de 10 y 50 ppm de NPs superó al testigo por 1.58 y 0.98 cm,
respectivamente. Bioensayo IV. Los resultados revelan que los tratamientos de
NPsFe2O3 bajo condiciones in vitro son favorables para mejorar la expresión de
semillas con bajo vigor de germinación y para el crecimiento de las plántulas, el
IVE (con 50 y 500 ppm) y acumulación de biomasa (con 100 y 500 ppm).
Bioensayo V. En lo que respecta actividad enzimática se observó que, con
tratamientos con 10 y 0.5 ppm de NPs y MPs respectivamente, aumentaron la
actividad de APX hasta 10 veces con respecto al testigo (en parte aérea),
además, en los tratamientos con MPs el APX decreció exponencialmente
(Bioensayo II). Por otro lado en plántulas obtenidas del Bioensayo III, con el
tratamiento de 50 ppm (MPs) la actividad enzimática aumento al doble con
respecto al testigo. En lo que respecta a POD, en la parte aérea, los
tratamientos con 50 ppm (MPs) y 10 ppm (NPs y MPs) superaron al control
hasta en un 60, 29 y 28 %, respectivamente. En la raíz la mayor actividad

xiii
enzimática se registró con tratamientos de 50, 10 y 5 ppm (MPs) y con 0.5 y 10
ppm (NPs) (Bioensayo II). Por otro lado en el Bioensayo III, la actividad
enzimática se mantuvo por debajo del control, tanto en la parte aérea como en
la raíz. En cuanto a prolina, en la parte aérea se registró un aumento de 444.2
µg (50 ppm de NPs) con respecto al control, y un incremento tanto en raíces,
como en parte aérea (con 1 y 10 ppm MPs) (Bioensayo II), y en la parte aérea
se observó un aumento de 437.5 y 241.8 µg (con 10 y 50 ppm de NPs),
respectivamente, mientras que con 50 y 100 ppm (MPs) se registró un aumento
en ambas partes de la plántula. En general NPsCu a bajas concentraciones y
tiempos reducidos de imbibición son favorables en el vigor con respecto al
crecimiento de plántulas, y al aumentar las concentraciones el vigor de
germinación se ve fuertemente afectado, y provocan toxicidad la cual es
expresada con la inhibición del crecimiento de raíces principales. Por otro lado
la aplicación de NPsFe2O3 y MPsFeSO4 resultan ser buenos candidatos como
fertilizantes y se descartó la fitotoxicidad en plántulas de C. melo, además que
al adicionar NPsFe2O3 en medio de cultivo in vitro mejoran considerablemente
la expresión de las semillas de C. sativus. Se puede intuir que las plántulas
podrían tolerar concentraciones <100 ppm de NPs y MPs mejorando las
actividades de enzimas antioxidantes que eliminan ERO y de prolina, como
resultado, logran un equilibrio entre la formación de ROS y la desintoxicación
celular.

Palabras claves: NPsFe2O3, NPsCu, vigor, germinación, sistema antioxidante.

xiv
Abstract

PHYSIOLOGICAL AND BIOCHEMICAL RESPONSE TO THE APPLICATION


OF COPPER NANOPARTICLES AND IRON OXIDE IN THE GERMINATION
AND GROWTH OF Cucumis spp.

BY

ESMERALDA JACKELIN SILVERIO MATA


PROFESSIONAL MASTER'S DEGREE IN GRAIN AND SEED TECHNOLOGY

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA AGRARIA ANTONIO NARRO


DRA. NORMA ANGÉLICA RUIZ TORRES- ADVISER

Saltillo, Coahuila December 2017

xv
The potential effect of NPsFe2O3 and NPsCu on the physiological processes
related to the vigor of germination, seedling growth and its response in oxidative
stress, in seeds of C. melo and C. sativus was studied. The research included
five bioassays carried out in the Laboratory of Physiology and Biochemistry of
the Seed Technology Training and Development Center (CCDTS), the Antonio
Narro Autonomous Agrarian University and the Biotechnology Laboratory
belonging to the Department of Plastics in Agriculture of the Center for Research
in Applied Chemistry (CIQA), in Saltillo, Coahuila, Mexico. Preliminary tests
were conducted for the establishment of bioassays that included imbibition
curves, standard germination tests, preparation of solutions with NPs and MPs,
and methods for the addition of NPs in a culture medium for germination in vitro.
Bioassay I: germination and vigor test of C. sativus seeds treated with NPsCu at
low doses (0-100 ppm) and high doses (0-500 ppm) imbibed for 12 and 24 h by
means of agitation, establishing 24 treatments with four Each repetition, vigor
(VIG) was evaluated on the fourth day after sowing and germination (GERM),
abnormal seedlings (PA), ungerminated seeds (SSG), stem length (LV) and
radicle length (LR ) on the eighth day after sowing. Bioassay II: differential effect
of physiological behavior in seeds of C. melo due to the application of NPsFe2O3
and MPsFeSO4 at concentrations of 0 to 50 ppm imbibed for 24 h, an anchor
paper germination test was carried out, where VIG, GERM was evaluated , PA,
SSG, LV and LR, in addition to collecting tissue samples of 100, 200 and 500
mg. Bioassay III: the effects of the application of NPsFe2O3 and MPsFeSO4
were determined at medium concentrations (0 to 100 ppm) in the process of
seed germination and vigor of C melo, IVE, VIG, GERM, PA, SSG, LV were
evaluated , LR. Bioassay IV: effect of NPsFe2O3 (0, 50, 100, 200 and 500 ppm)
on germination in in vitro culture medium, to improve the expression of vigor in
the germination of C. sativus, IVE, VIG, GERM, LR, LV and PS (dry weight).
Bioassay V: Oxidative stress was analyzed by quantifying antioxidant enzymatic
activity (POD and APX) and proline production in seedlings from Bioassay II and
Bioassay III. The results of the bioassay I, indicate that NPsCu at low
concentrations only promote vigor with respect to the growth of seedlings, if the

xvi
seeds go through short periods of imbibition and as the concentrations increase
the vigor of germination is affected progressively, while that the application of
high concentrations of NPsCu causes toxicity and this is expressed with the
inhibition of the growth of main roots. Bioassay II. The results indicate that it is
possible to improve the germination and growth of C. melo seedlings by
applying concentrations of 0.5 and 50 ppm (NPsFe2O3) and with 0.5, 5, and 10
ppm (MPsFeSO4), in addition, that allow to reduce the number of abnormal
seedlings. Bioassay III. In the FV concentration it was found that 10 and 50 ppm
improve the IVE and LV, and in the particle FV the best was NPs at 10 ppm.
Regarding interactions, the germination percentage increased 6 and 8% with the
treatments of 50 and 100 ppm (MPs), respectively, for the variable IVE the
treatment with 100 ppm of MPs exceeded the control. Similarly, for LV,
treatments of 10 and 50 ppm of NPs surpass the control by 1.58 and 0.98 cm,
respectively. Bioassay IV. The results reveal that the treatments of NPsFe2O3
under in vitro conditions are favorable to improve the expression of seeds with
low germination vigor, besides being favorable for the growth of the seedlings,
the IVE (with 50 and 500 ppm) and accumulation of biomass (with 100 and 500
ppm). Bioassay V. Regarding enzymatic activity, it was observed that, with
treatments with 10 and 0.5 ppm of NPs and MPs respectively, they increased
the activity of APX up to 10 times with respect to the control (aerial part), in
addition, in the treatments with MPs the APX decreased exponentially (Bioassay
II). On the other hand, in seedlings obtained from Bioassay III, with 50 ppm
treatment (MPs) the enzymatic activity increased twice as compared to the
control. With regard to POD, in the aerial part, treatments with 50 ppm (MPs)
and 10 ppm (NPs and MPs) exceeded the control by up to 60, 29 and 28%,
respectively. At the root the highest enzymatic activity was registered with
treatments of 50, 10 and 5 ppm (MPs) and with 0.5 and 10 ppm (NPs) (Bioassay
II). On the other hand, in Bioassay III, enzymatic activity remained below control,
both in the aerial part and in the root. Regarding proline, in the aerial part an
increase of 444.2 μg (50 ppm of NPs) was registered with respect to the control,
and an increase in both roots, as in aerial part (with 1 and 10 ppm MPs)

xvii
(Bioassay II), and in the aerial part an increase of 437.5 and 241.8 μg was
observed (with 10 and 50 ppm of NPs), respectively, while with 50 and 100 ppm
(MPs) an increase was registered in both parts of the seedling. In general
NPsCu at low concentrations and reduced imbibition times are favorable in the
vigor with respect to the growth of seedlings, and when increasing the
concentrations the vigor of germination is strongly affected, and cause toxicity
which is expressed with the inhibition of the growth of main roots. On the other
hand, the application of NPsFe2O3 and MPsFeSO4 turned out to be good
candidates as fertilizers and the phytotoxicity in C. melo seedlings was ruled out,
besides adding NPsFe2O3 in in vitro culture medium considerably improves the
expression of C. sativus seeds. It can be intuited that the seedlings could
tolerate concentrations <100 ppm of NPs and MPs improving the activities of
antioxidant enzymes that eliminate ERO and proline, as a result, achieve a
balance between ROS formation and cellular detoxification.

Keywords: NPsFe2O3, NPsCu, vigor, germination, antioxidant system

xviii
1

INTRODUCCIÓN

En los últimos años, en la agricultura se ha tratado de mejorar los sistemas de


producción, buscando nuevas alternativas para mejorar el uso de los recursos
naturales y tecnologías que implican un menor impacto ambiental. Dentro de
dichas tecnologías se encuentra la nanotecnología (NT), que no es más que el
estudio de nanomateriales con propiedades morfológicas más pequeños que un
micrómetro, en al menos una de sus dimensiones y estos materiales
comúnmente se definen como nanopartículas (NPs), éstas tienen propiedades
que difieren a los materiales de mayor escala, aunque sean de la misma
naturaleza, por lo que su campo de estudio involucra nuevas áreas de
exploración como lo es en la agricultura.
Se ha demostrado que las NPs tienen propiedades químicas, estructurales y
bioquímicas, que representan una ventaja sobre otros productos aplicados
como promotores de crecimiento y vigor, en especies de importancia
económica, esto dependiendo del tipo del micro elemento del que se trate.
Existe evidencia que algunos sistemas enzimáticos son activados dentro de las
plantas al aplicar elementos en forma de NPs, ya que éstas contienen mayor
potencial de absorción del elemento aplicado y de otros elementos afines
actuando como conductores y formando complejos minerales, además que la
traslocación dentro de los sistemas vasculares son más eficientes en
comparación de sus homólogos a mayor escala, por otro lado recientes
estudios indican que los nuevos materiales metálicos y/o basados en el carbón
afectan a plantas y microorganismos en diferentes formas, tanto en niveles
fisiológicos, bioquímicos, nutricionales y genéticos.
En el caso de NPs metálicas existen antecedentes que indican su aplicación
como antimicrobiales, formulación de insecticidas y herbicidas, usos para
sintetizar y estructura de plásticos utilizados en invernaderos para la reducción
de radiación solar y disminuir las temperaturas dentro del mismo; lo que
demuestra que estas se pueden explotar y aprovechar sus propiedades para
diferentes usos en la agricultura.
2

Sin embargo, en algunas áreas aún no hay suficiente información documentada


en lo que respecta a respuestas fisiológicas y bioquímicas que nanomateriales
metálicos pueden tener en plantas y semillas para algunos géneros específicos,
y como estos pueden ayudar a expresar su máximo potencial en la germinación
y vigor al ser sometidas a tratamientos con NPs de dicha naturaleza. Por ello
existe la necesidad de estudiar su potencial como promotores de crecimiento,
establecer las dosis adecuadas para que ello suceda y determinar en qué
momento estas NPs pueden causar fitotoxicidad, así como analizar las
respuestas bioquímicas que esto desencadenan en las plantas, y al mismo
tiempo establecer en qué especies de importancia agrícola es preciso su
aplicación y para con ello establecer su uso potencial dentro de los sistemas
agrícolas actuales. Por lo anteriormente planteado, en el presente trabajo de
investigación se han estudiado las nanopartículas de cobre (NPsCu),
nanopartículas de óxido de Hierro (Fe2O3) y su homólogo como sulfato hierro
(Fe2SO4) planteándose la siguiente hipótesis
1.1 Hipótesis Commented [CTQ2]: Quitar números detodos los titulo,
subtitulos y títulos menores
Las nanopartículas metálicas de óxido de hierro (Fe2O3) y de cobre (Cu)
promueven procesos metabólicos relacionados con el vigor y germinación, por
su función como cofactores en la activación de algunos sistemas enzimáticos y
desencadenarán procesos bioquímicos, principalmente la formación de
especies reactivas de oxigeno (ERO) como respuesta a la fitotoxicidad que
estas causen.
1.2 Objetivo
Estudiar el efecto fisiológico y bioquímico causado por la aplicación de
nanopartículas de óxido de hierro (Fe2O3) y de cobre (Cu), en la germinación y
crecimiento de plántulas, en dos especies del género Cucumis.

1.3 Objetivos específicos


 Evaluar el efecto que tienen dosis altas y bajas de NPsCu durante dos
periodos de imbibición en el vigor de la germinación y crecimiento de
plántulas de Cucumis sativus L.
3

 Evaluar el efecto de nanopartículas de óxido de hierro (NPsFe2O3) y de


cobre (NPsCu) como promotores del vigor en la germinación en plántulas
de Cucumis melo L.
 Determinar si existe un efecto diferencial en el comportamiento fisiológico
de semillas de Cucumis melo L., debido a la aplicación de nanopartículas
(NPsFe2O3) y micropartículas (MPsFe2SO4).
 Estudiar el efecto de NPsFe2O3 en la germinación, bajo condiciones in
vitro, para mejorar la expresión del vigor en la germinación de Cucumis
sativus.
 Analizar estrés oxidativo, mediante la cuantificación de la actividad
enzimática antioxidante y la producción de prolina en las plántulas
provenientes de semillas de Cucumis melo. tratadas con NPsFe2O3 y
MPsFe2SO4 durante la germinación.
4

REVISIÓN DE LITERATURA

1.4 Aspectos generales del género Cucumis


Este género es originario de los trópicos y subtrópicos del viejo Mundo y está
constituido por cerca de 30 especies incluidas el melón (C. melo L.) y el pepino
(C. sativus L.) (CONABIO, 2008). La mayoría anuales y algunos perennes, pero
todos sensibles a las heladas y cuentan con la característica principal de contar
con un tremendo desarrollo vegetativo y dan origen a una notable cantidad de
frutos, a partir de un sistema radical extenso y con profundidad de
enraizamiento considerable (Rubatzky et al., 2012). Son plantas herbáceas,
rastreras a trepadoras, monoicas; tallos anguloso - sulcados; hojas pecioladas,
zarcillos simples hispídulos, flores estaminadas y pistiladas, fruto globoso,
ovoide, con epicarpo grueso, liso a rugoso, mesocarpo jugoso o carnoso,
pedúnculo corto, semillas numerosas, elípticas a lanceoladas, amarillentas o
blanquecinas, lisas y con capacidad germinativa de unos 5 años (Saade, 2001).

1.4.1 Morfología de la germinación del género Cucumis.


Di Benedetto (2005) clasifica a las semillas de las cucurbitáceas entre las de
mayor rapidez de germinación y crecimiento inicial en condiciones óptimas,
estas características han sido asociadas con algunas particularidades, como
son el tamaño relativamente grande de las semillas (30 mg por semilla), y un
contenido promedio de aceite del 49 %, y proteínas del 35 % (Jacks et al.,
1972). Estas dos condiciones, relacionadas con el tamaño y la composición de
las reservas, posibilitan una elevada cantidad de material de reserva disponible
para el crecimiento inicial, previo a que los cotiledones y primeras hojas
verdaderas comiencen a fotosintetizar (Di Benedetto, 2005).
Morfológicamente hablando y según la clasificación de la International Seed
Testing Association (ISTA, 2004), el género Cucumis pertenecen al tipo de
germinación de plántulas del tipo E, que comprenden a semillas de
dicotiledóneas con germinación epigea y la parte de la plántula que crece hacia
la luz es el hipocótilo que gira con dos cotiledones unidos. El tamaño, la
5

posición y el grado de diferenciación del embrión en la semilla madura son muy


variables, sin embargo, cuentan con un embrión bien diferenciado, el cual
consiste en el eje embrionario con los dos puntos de crecimiento, la radícula y
la plúmula, y los dos cotiledones unidos al eje embrionario. La germinación
visible se aprecia cuando la raíz primaria perfora la testa, esta se alarga
rápidamente y se establece la plántula en el suelo, contando con un sistema
radical muy potente que consiste en la raíz primaria, usualmente con pelos
radicales y a menudo raíces secundarias, mientras que el sistema aéreo
consiste en el hipocótilo alargado y los dos cotiledones con el borde terminal, la
elongación del hipocótilo no ocurre durante el período de la prueba de
germinación, y el epicótilo y brote terminal no son usualmente visibles. El
hipocótilo para alcanzar la superficie, forma un arco y esto ayuda a su paso por
el suelo. El sistema aéreo crece hacia arriba y levanta la testa de la semilla,
esto es una característica de la germinación bajo condiciones naturales, la testa
emerge del suelo con los cotiledones, pero frecuentemente la testa es retenida
en el suelo y los cotiledones son liberados por medio de la elongación del
hipocótilo. En la luz, el hipocótilo se endereza; los cotiledones se expanden y
desechan la testa, si aún permaneciera. El incremento en el tamaño de los
cotiledones puede ser considerable, los cotiledones giran rápidamente y
proporcionan a la plántula de energía a través de la fotosíntesis hasta que son
remplazadas por las hojas verdaderas (ISTA, 2004).

1.5 Definición de germinación y vigor


La germinación es definida como la reanudación del crecimiento activo del
embrión, el desarrollo de aquellas estructuras esenciales para el crecimiento de
la planta (Jann y Amen, 1977), así mismo desde el punto de vista morfológico,
es la reanudación del crecimiento activo del embrión, lo cual provoca la ruptura
de los tegumentos seminales y el brote de una planta nueva; y desde el punto
de vista fisiológico, es la reanudación del metabolismo y crecimiento, incluyendo
la transcripción de genomio (Meyer et al., 1972). Por su parte Moreno (1996),
puntualiza a la germinación como la emergencia y desarrollo de aquellas
6

estructuras esenciales que provienen del embrión, y que manifiestan la


capacidad de las semillas para producir una planta normal bajo condiciones
favorables, como mencionan la Association of Official Seed Analysts (AOSA,
1993) y la ISTA (2004). Mientras que, en un ensayo de laboratorio la
germinación es, la emergencia o desarrollo a partir del embrión de aquellas
estructuras esenciales y de la capacidad de desarrollarse en una plántula
normal, bajo condiciones favorables (Sánchez et al., 2006). Desde cualquiera
que sea el punto de vista del que se considere la germinación, es preciso incluir
el vigor como una medida complementaria que no se puede pasar por alto,
cuando se trata de la calidad de las semillas.
Poulsen (2000) describe el vigor de una semilla como la adición total de
aquellas propiedades que establecen el nivel de actividad y desempeño durante
los procesos de germinación y emergencia de plántulas, y a partir de dicho
desempeño son clasificadas como semillas con alto o bajo vigor.
Complementando el concepto de vigor, según Perry (1978) las diferencias en
vigor se manifiestan en aspectos particulares del comportamiento tales como:
1. Durante la germinación, reacciones enzimáticas y actividad respiratoria.
2. Rapidez y uniformidad de la germinación de la semilla y crecimiento de la
plántula.
3. Celeridad y uniformidad de la emergencia y crecimiento de la plántula en el
campo.
4. Capacidad de emergencia de las semillas bajo condiciones adversas.
De igual manera, Sánchez y et al. (2006) señalan al vigor como aquella
propiedad de las semillas, las cual determina su potencial para una emergencia
rápida y uniforme, el desarrollo de plántulas normales en un amplio rango de
condiciones del suelo donde fueron sembradas y el potencial o fuerza de la
plántula para proporcionar una planta en el menor tiempo posible. Los efectos
del nivel de vigor pueden persistir para influir en el crecimiento de las plantas
maduras, uniformidad y rendimiento del cultivo, por ello se ha utilizado un
amplio orden de métodos para caracterizar y determinar el vigor de las semillas
(Garay, 1991).
7

a) Pruebas de crecimiento de plántulas, esta prueba de vigor implica la


germinación en condiciones estándares e incluye mediciones del tamaño de
las plántulas y/o peso, o la clasificación de plántulas en clases de vigor.
b) Tasa de germinación, se considera que la tasa de germinación se
relaciona positivamente con una rápida emergencia en el campo y con el
desarrollo de las plántulas de muchas especies, frecuentemente reconocida
como el porcentaje de germinación.
c) Velocidad de germinación, el porcentaje de germinación sólo contempla el
porcentaje de las semillas que han germinado durante el período de la
prueba, sin tener en cuenta si la germinación ocurrió durante la primera o la
última parte de la evaluación; la velocidad de germinación es, por lo tanto,
una expresión del vigor y es conocido que las semillas de alto vigor
germinan más rápido que las de bajo vigor en cualquier condición (Venter,
2000). La velocidad germinativa, denominada 'energía de germinación',
puede ser expresada de varias formas a partir de los registros de
germinación diaria (Schmidt, 2000).
Existen fuentes de variación del vigor, de los cuales se pueden mencionar la
constitución genética, la cual establecerá su máximo potencial fisiológico; el
ambiente de crecimiento de la planta madre, lo que influirá en el peso, tamaño y
densidad de las semillas; el estado de madurez en la cosecha, siendo la que le
confiere a las semillas su mayor potencial de vigor de nacencia; integridad física
y finalmente el deterioro y envejecimiento (García, 1991). La emergencia de la
plántula en el campo puede ser influenciada fuertemente por factores abióticos,
siendo difícil predecir el potencial real de vigor de las semillas.

1.6 Nutrientes en las plantas


Margulis y Sagan (2006) señalan que existen elementos de suma importancia
para el desarrollo vegetal y que de los 90 elementos químicos que se
encuentran en la naturaleza, 60 se pueden encontrar en las plantas, aunque de
ellos un total de 16 nutrientes son considerados como “nutrientes inorgánicos
esenciales”, que son aquellos elementos necesarios en las plantas, y si hace
8

falta uno de ellos la planta presenta anormalidades de crecimiento,


reproductivos y síntomas de deficiencia. Así mismo, los nutrientes son
clasificados de acuerdo a la concentración relativa en el tejido vegetal: a) Los
macronutrientes (aquellos que son requeridos en grandes cantidades) como
son: carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, potasio, calcio, magnesio, fósforo
y azufre, b) Los micronutrientes (oligoelementos, necesarios en pequeñas
cantidades) como el hierro, manganeso, zinc, cobre, cloro, boro y molibdeno
(Taiz & Zeiger, 2006). Los nutrientes inorgánicos desempeñan un importante
papel en las células, regulan la osmosis, afectan la permeabilidad celular,
pueden ser componentes estructurales de las células, así como componentes
de compuestos metabólicos críticos y también pueden actuar como activadores
y componentes de las enzimas (Raven et al., 1992).
Además cabe señalar que la nutrición en plantas está constituido por las
siguientes fases: a) absorción y transporte de agua y sales minerales desde la
raíz hasta el xilema; b) transporte del agua y sales minerales por el xilema; c)
intercambio de gases en las hojas; d) fotosíntesis; e) transporte de materia
orgánica por el floema; f) respiración celular; g) excreción de los productos de
desecho del metabolismo (Margulis y Sagan, 2006).

1.6.1 Principales funciones de micronutrientes en las plantas


Las concentraciones de los micronutrientes son mucho más bajas, en
comparación con los macronutrientes, sin embargo en los tejidos de las plantas
cada de uno de estos elementos tiene diferente papel en los procesos
fisiológicos. Incluso en bajas concentraciones los micronutrientes son de suma
importancia por su función como constituyentes de los grupos prostéticos en las
metaloproteínas y como activadores de reacciones enzimáticas. Su presencia
en grupos prostéticos permite que éstos catalicen procesos redox por
transferencia de electrones (Fe, Mn, Cu y Mo), los micronutrientes también
forman complejos enzimáticos ligando una enzima con un sustrato (Fe y Zn).
Actualmente se conoce que también varios nutrientes (Mn, Zn y Cu) están
presentes en las isoenzimas superóxido dismutasa (SD), las cuales actúan
9

como sistemas de barrido para erradicar radicales de oxígeno tóxicos,


protegiendo las biomembranas, ADN, clorofila y proteínas (Kirkby y Römheld,
2008).

1.6.2 Funciones del hierro (Fe) en la fisiología vegetal


De acuerdo con Raven y colaboradores (1992) el hierro es un micronutriente de
contenido elevado en suelos, pero de muy baja disponibilidad para la planta, la
absorción de Fe en suelos calizos es problemática debido a que su solubilidad a
pH básico es muy baja y es asimilable por la planta en su forma Fe2+ después
de ser reducido el Fe3+ por una reductasa férrica en el exterior de la raíz, en
caso de baja disponibilidad de Fe hay plantas capaces de desarrollar
mecanismos de absorción más activos como son 1) en dicotiledóneas y
monocotiledóneas no gramíneas: excreción de protones y agentes reductores,
que aumentas la capacidad de reducción en la raíz; 2) en gramíneas: síntesis y
expulsión de fitosideróforos al medio, estos disuelven y complejan Fe (III), y de
esa manera es asimilado por la planta.
Sus principales funciones son:
1. Cataliza la biosíntesis de la clorofila, puesto que forma parte constituyente
de enzimas responsables, a pesar de que la molécula de clorofila no
contiene Fe, necesita de este micronutriente en tres periodos de su
biosíntesis (Machold, 2008).
2. Activación de enzimas, actuando como grupo prostético, regula la actividad
del sistema enzimático para la formación de la protoclorofila.
3. Forma parte de los grupos catalíticos de muchas enzimas redox del tipo
hemoproteínas, las cuales se caracterizan por la presencia de un complejo
Fe hemo-porfirina, el cual actúa como grupo prostético de citocromos que
facilitan el transporte de los electrones en la respiración
4. Interviene en reacciones fundamentales de óxido-reducción, tanto en
hemoproteínas (citocromos, leghemoglobina, catalasa, peroxidasa,
superóxido dismutasa), como en proteínas no-hémicas con enlace Fe-S, en
ferredoxina y enzimas reductasa, nitrogenasa y sulfato y nitrito reductasa.
10

1.6.2.1 Deficiencias de Fe en las plantas


Cuando existe deficiencia de Fe, se reduce el contenido de clorofila, al igual que
el de otros pigmentos que captan la luz, así como la actividad de
transportadores de electrones de ambos fotosistemas. Por lo tanto, la
deficiencia de Fe afecta inicialmente el desarrollo y el funcionamiento del
cloroplasto. La ferridoxina (proteína Fe-S) es el primer compuesto redox estable
en la cadena de transporte de electrones durante la fotosíntesis, la falta de Fe
reduce la producción de ferridoxina, lo que a su vez afecta el transporte de
electrones necesarios para estos procesos, incluyendo la reducción a nitrito y
sulfito, por esta razón, tanto nitrato como el sulfato se acumulan en plantas
deficientes en Fe (Schmidt, 2003).
Por su parte Taiz y Zeiger (2006), señalan que el Fe tiene la característica de
tener baja movilidad en los tejidos vegetales y que esta movilidad está influida
negativamente por varios factores, como el elevado contenido en fósforo,
deficiencia de potasio, cantidad elevada de Mn y baja intensidad lumínica. La
presencia de bicarbonato en el medio radicular reduce la movilidad de Fe en los
tejidos vegetales. Esta es la razón de que, en ocasiones, la deficiencia de Fe no
es tal, sino que es un problema de movilidad del mismo, por ello los primeros
síntomas visibles de deficiencia de Fe aparecen como clorosis en las hojas
jóvenes, en la mayoría de las especies, la clorosis aparece entre las nervaduras
en un reticulado fino, sin embargo, las nervaduras permanecen verdes en
acentuado contraste con el fondo verde más claro o amarillento del resto del
tejido y las hojas más jóvenes pueden carecer completamente de clorofila, en
cereales, la deficiencia de Fe se evidencia por fajas verdes y amarillas alternas.
Como el 80% del Fe en las hojas está localizado en los cloroplastos, y este es
el sitio primario de las funciones de Fe, no es sorprendente que la deficiencia de
este micronutriente cause cambios marcados en la estructura de estos
organelos, y en extrema deficiencia, los tilacoides pueden estar ausentes
(Kirkby & Römheld, 2008).
11

1.6.3 Funciones cobre (Cu) en la fisiología vegetal


El Cu forma quelatos altamente estables que permiten la transferencia de
electrones (Cu2+ + e- ↔ Cu+) por ello, juega un papel importante en procesos
redox de la fisiología de la planta, además las enzimas que contienen Cu
pueden reaccionar con oxígeno molecular y catalizan preferentemente procesos
terminales de oxidación. También proteínas que contienen Cu desempeñan un
papel fundamental en procesos tales como la fotosíntesis, respiración,
desintoxicación de radicales superóxido y lignificación (Kirkby y Römheld,
2008). A nivel celular, Cu también juega un papel esencial en la señalización de
la transcripción y el transporte de proteínas, fosforilación oxidativa y
movilización del hierro (Yruela, 2005). Añadido a esto Hernández (2002), señala
al cobre como constituyente de ciertas enzimas, incluyendo la oxidasa del ácido
ascórbico, tirosinasa, citocromo-oxidasa y la plastocianina (que suministra
equivalentes de reducción al fotosistema I, siendo así el elemento terminal en la
cadena transportadora de electrones del cloroplasto). Además de que el Cu
enlazado participa en enzimas de óxido-reducción, con la excepción de ciertas
amino oxidasas y galactosa oxidasas, este elemento participa en reacciones de
óxido-reducción. Al presentarse deficiencia de Cu, la actividad de estas enzimas
se reduce y es evidente en la reducción del transporte fotosintético de
electrones, como consecuencia de menores contenidos de plastocianina,
disminuye la tasa de fijación de CO2, de modo que el contenido de almidón y de
carbohidratos solubles también disminuye; siendo el principal factor que
provoca la reducción de la producción de materia seca en plantas que sufren de
deficiencia de Cu durante el crecimiento vegetativo (Kirkby y Römheld, 2008).
Las enzimas polifenol oxidasa, ascorbato oxidasa y diamino oxidasa que
contienen Cu aparecen en las paredes celulares y desempeñan un papel
importante en la biosíntesis del fenol, vía quinona, a sustancias melanóticas y a
lignina. La deficiencia de Cu disminuye la actividad de esas enzimas,
provocando la acumulación de fenoles y la reducción de la lignificación y de
sustancias melanóticas, y por ello el Cu es importante para incrementar la
resistencia de la planta a enfermedades (Hernández, 2002).
12

1.6.3.1 Toxicidad por cobre en las plantas


El cobre es un metal esencial para el crecimiento y desarrollo normal de las
plantas, aunque también es potencialmente tóxico, se sabe que participa en
numerosos procesos fisiológicos y es un cofactor esencial para muchas
metaloproteínas, sin embargo, surgen problemas cuando el exceso de cobre
está presente en las células. El exceso de cobre inhibe el crecimiento de
plantas y deteriora importantes procesos celulares (transporte fotosintético de
electrones), por ello, las plantas han desarrollado estrategias para regular
apropiadamente su homeostasis como una función para nivelar el cobre
ambiental. Tales estrategias deben prevenir la acumulación del metal en la
forma libremente activa (vías de desintoxicación de metal) y asegurar la entrega
apropiada de este elemento para trazar las metaloproteínas (Yruela, 2005).
Otros autores resaltan la importancia del Ciclo redox entre Cu2+ y Cu+ y como
este puede catalizar la producción de radicales hidroxilo altamente tóxicos, con
daño subsiguiente al ADN, lípidos, proteínas y otras biomoléculas (Halliwell y
Gutteridge, 1984), por lo tanto, a altas concentraciones, el Cu puede volverse
extremadamente tóxico y causar síntomas como clorosis y necrosis, atrofia,
decoloración de las hojas e inhibición del crecimiento de las raíces (Van Assche
y Clijsters, 1990). A nivel celular, la toxicidad puede resultar de a) unión a
grupos sulfhidrilo en proteínas, inhibiendo así la actividad enzimática o la
función proteica; b) inducción o una deficiencia de otros iones esenciales; c)
procesos de transporte celular deteriorados; d) daño oxidativo (Van Assche y
Clijsters, 1990; Meharg, 1994). Por su parte Cakmak (2000), hace énfasis en
que las enzimas superóxido disminutasa (SOD) han atraído recientemente una
atención especial por el papel que desempeñan en la desintoxicación de
radicales superóxido, los cuales pueden causar severos daños a las células por
varios mecanismos, la Cu-Zn-SOD está localizada en los estromas de los
cloroplastos, sitio donde el átomo de Cu está directamente involucrado en la
desintoxicación de O2 generado durante la fotosíntesis.
A nivel mundial, se han producido cambios increíbles en los patrones de
producción agrícola y se ha hecho posible solo a través de la aplicación de
13

tecnologías modernas de ahorro de mano de obra para la mecanización


intensiva en campo, el riego, el manejo pos cosecha y el uso de variedades
mejoradas de cultivos, a pesar del tremendo progreso logrado en la
productividad agrícola, todavía hay inseguridad alimentaria y pobreza en
muchos países en desarrollo, por ello dentro de las nuevas investigaciones para
mejorar los sistemas de producción se encuentra la introducción de tecnologías
alternas como lo son la nanotecnología aplicada en la agricultura, siendo esta
una de las nuevas ciencias en camino de exploración como uso alternativo a las
tecnologías actualmente empeladas, buscando mejorar el futuro del campo y de
la producción de alimentos.

1.7 Nanotecnología (NT)


El término nanotecnología fue utilizado por primera vez en 1974 por el
japonés Norio Taniguchi, un investigador de la Universidad de Tokio, quien
señaló así la capacidad de manejar materiales a nivel nanométrico. El prefijo
nano en la palabra nanotecnología significa una millonésima (1x10 -9), la
nanotecnología trata sobre las diferentes estructuras de la materia y su control
a escalas de entre 1 y 100 nanómetros (Mejias et al., 2009). La NT involucra el
diseño, la caracterización y la aplicación de estructuras, dispositivos y sistemas
complejos mediante el control de la forma, el tamaño y las propiedades de la
materia a escala nanométrica (Royal Society, 2004), el atractivo de la NT, está
relacionado con el hecho de que a escala nanométrica, las propiedades de la
materia cambian, presentando una superficie más grande que los materiales a
macroescala. Esta característica puede hacerlos químicamente más reactivos,
afectando su resistencia y propiedades eléctricas, magnéticas u ópticas
(Delgado, 2009). Se tiene documentado que los primeros inicios de la NT fue
reportado por Michael Faraday, quien en 1857 publicó un artículo en la revista
Philosophical Transactions of the Royal Society, en el que trato de explicar
cómo las nanopartículas (NPs) metálicas influyen sobre el color de las
ventanas de las iglesia, sin embargo, se considera que fue Richart Feynman
(premio Nobel de física en 1965), quien marcó un hito para el desarrollo de la
14

nanotecnología, cuando en 1960 presentó una conferencia visionaria titulada


“hay bastante espacio en el fondo”, en una reunión de la Sociedad Americana
de Física, donde especuló sobre las posibilidades y potencialidades de los
materiales nanométricos y propuso manipular los átomos individualmente para
poder construir pequeñas estructuras que poseyeran las más variadas
propiedades, además reconoció, tal como lo hacen en la actualidad los
investigadores en el campo de la nanotecnología, la existencia de
nanoestructuras en sistemas biológicos. Para los años 50 y 60 se empezó a
trabajar de forma experimental sobre pequeñas NPs metálicas,
específicamente, en 1956 Uhlir informó sobre la observación de silicio poroso,
pero sería hasta 1990 cuando se observaría la fluorescencia a temperatura
ambiente de este material, lo que aumentó el interés en la materia. Otra área de
actividad fue en los años 60 que estuvo relacionada con la resonancia
paramagnética electrónica (RPE) de electrones conductores en partículas
metálicas nanodimencionadas, denominadas coloides en esa época, las
partículas se obtenían por descomposición térmica y por irradiación de solidos
con iones metálicos positivos y iones moleculares negativos, tales como azidas
de sodio y potasio; para los años 70, ya se esclarecían las características
estructurales de las NPs metálicas, sin embargo, no fue hasta los años 80, con
la aparición de los métodos apropiados para la fabricación de nanoestructuras,
cuando obtuvo lugar un incremento notable de la actividad de investigación y se
alcanzó un apreciable número de resultados, en 1981 se desarrolla un método
para obtener cúmulos metálicos mediante el uso de un potente rayo láser
concentrado que permitiera vaporizar metales a plasma caliente y en 1982
Ekimov y Omushchenko, explican la primera observación sobre confinamiento
cuántico y se desarrolla la invención de la microscopia de efecto túnel (STM,
Scaning Tunneling Microscopy) y la microscopia de fuerza atómica (AFM,
Atomic Force Microscopy), los cuales sirvieron de importantes herramientas
para visualizar, caracterizar y manipular nanoestructuras a escala atómica
(Poole y Owens, 2007); otros avances fueron, el descubrimiento de los
nanotubos de carbono (NTC), nanobiosensores de excelentes propiedades
15

mecánicas y eléctricas, realizado en Japón por Sumio Iijima en 1991, por


mencionar los más relevantes. El campo de la NT es muy amplio, demasiado
interdisciplinario, y cambia de una forma rápida como para poder abarcarla
exhaustivamente, las posibles aplicaciones de los materiales nanoestructurados
son ciertamente una de las razones del creciente interés en el tema, y ya se
dan muchas aplicaciones en el mundo comercial (Mejias et al., 2009).

1.7.1 Nanomateriales
Una definición de trabajo para una nanopartícula (NPs), es la de un agregado
de átomos entre 1 y 100 nm, visto como una subdivisión de un material
voluminoso y de dimensiones menores que la longitud critica de cierto
fenómeno (Poole y Owens, 2007). Usualmente, las NPs poseen dimensiones
nanométricas en sus tres dimensiones, mientras que los términos material
nanoestructurado y nanomaterial son más generales y se aplican a materiales
cuya fabricación, o cuyas dimensiones sean controladas a nivel nanométrico.
Hay tres tipos de NPs: las naturales (biológicas); las incidentales, como las
emisiones de la combustión en motores; y las fabricadas, generadas a propósito
con una finalidad (Medina et al., 2016).
El fundamento de los nanomateriales es que, muchas de las propiedades de los
materiales dependen de cómo se comporten los electrones que se mueven en
su seno o de como estén ordenados los átomos en la material. En un material
nanométrico, el movimiento de los electrones está muy limitado por las
dimensiones del propio material. Además la proporción de átomos en la
superficie con respecto al interior es con mucho, más alta que en materiales de
tamaño más elevado. Por consiguiente, si se reducen las dimensiones de un
material, se modifican sus propiedades y en consecuencia se pueden diseñar
materiales con propiedades de acuerdo a cada interés en particular (Díaz del
Castillo, 2012). Los nanomateriales se pueden construir mediante técnicas de
"top down", produciendo estructuras muy pequeñas a partir de piezas de
material más grandes o pueden construirse mediante técnicas de "botton up",
átomo por átomo o molécula por molécula. Una forma de hacerlo es el auto
16

ensamblaje, en el que los átomos o las moléculas se organizan en una


estructura debido a sus propiedades naturales (Royal Society, 2004). Los
nanomateriales son clasificados de acuerdo a sus componentes: basados en
carbono (fullurenos y nanotubos) (Fernández, 2009), basados en metales y sus
derivados, dendrímeros (nanoencapsulados) (Murru, 2017) y nanomateriales
compuestos (nanoarcillas); y de acuerdo a sus dimensiones: cero (NPs), una
(nanoalambres y nanotubos), dos (películas delgadas) o tres dimensiones
(sólidos formados por unidades nanométricas) (Wing, 2006).

1.7.2 Nanopartículas metálicas y sus derivados


Las NPs metálicas poseen propiedades con aplicación en diversas áreas
tecnológicas, siendo las propiedades físicas, químicas, térmicas, magnéticas y
ópticas únicas de las nanopartículas diseñadas y han dado lugar a múltiples
aplicaciones, incluidos alimentos y productos comunes de uso diario (Trujillo,
2014). Adicionalmente, Wing (2006) atribuye lo anterior a que actualmente se
han logrado diversos avances en el conocimiento de las NPs metálicas entre los
que están: desarrollo de diferentes métodos de síntesis químicos y físicos, con
el objetivo de poder diseñar sus dimensiones, forma, composición, y
modificadores de superficie, y con esto controlar su comportamiento frente a
diversos estímulos. Las aplicaciones actuales abarcan los siguientes campos:
materiales aislantes térmicos, máquinas herramienta, materiales cerámicos,
óptico y electrónico, imanes de alto potencial, aeronaves, fármacos, magnético,
refrigeración magnética, metales, celdas solares, catalítico, polímeros
mejorados, pinturas autolimpiables, sector textil, sector energético e industria
cosmética (López et al., 2013). Según (Mohanpuria et al., 2008) señala diez
aplicaciones más prometedoras de estas NPs: almacenamiento, producción y
conversión de energía, producción agrícola, tratamiento y remediación de
aguas, diagnóstico y control de enfermedades, sistemas de administración de
fármacos, procesamiento de alimentos, remediación de la contaminación
atmosférica, construcción, monitorización de la salud, detección y control de
plagas, informática, también se ha encontrado que las NPs en bajas
17

concentraciones, podrían usarse como portadores de nutrientes y suministrarlos


a los organismos para mejorar su crecimiento, debido a que poseen ventajas de
alta actividad, estabilidad y efectividad en la entrega de nutrientes a los
objetivos, en comparación con sus contrapartes sólidas o iónicas (Liu y Lal,
2015). Entre las NPs más utilizadas están: las de plata (Ag), oro (Au), cobre
(Cu), titanio (Ti), zinc (Zn), hierro (Fe) y los óxidos de: titanio (TiO 2), zinc (ZnO),
cerio (CeO2), hierro (Fe3O4 y γ-Fe2O3) y cobre (CuO).

1.7.2.1 Nanopartículas de cobre


La síntesis de nanopartículas de cobre (NPs Cu) han estado ganando atención
debido a su alta disponibilidad, fácil manipulación y por ser un metal
semiconductor, por sus propiedades físicas, químicas, antimicrobianas, así
como por su abundancia, sin embargo, factores como la aglomeración y la
oxidación rápida lo han convertido en un área de investigación difícil, debido a
que esto representan limitaciones importantes (Usman et al., 2013).
Uso de NPs de cobre
 Medicina, fabricación de calcetines antimicrobianos (fibras con NPsCu)
para diabéticos (Campos y Lisboa, 2011), Usman y colaboradores
(2013), reportaron su potencial antimicrobial al comprobar que estas NPs
influyen en la tasa de crecimiento de varios microorganismos, incluyendo
Staphylococcus aureus resistente a meticilina, Bacillus subtilis,
Pseudomonas aeruginosa, Salmonella choleraesuis y Candida albicans.
 Electrónica, las tintas y pastas conductoras (Lee et al., 2008).
 Metales y aleaciones de alta resistencia, disipadores de calor y
materiales altamente conductores térmicos (Qu y Dai, 2005).

1.7.2.2 Nanopartículas de óxido de hierro


En general las NPs de óxidos metálicos presentan mejores propiedades
eléctricas, ópticas, magnéticas, químicas y físicas en relación a las de sus
homólogos de tamaño volumétrico, lo cual dependerá de manera directa de los
cambios estructurales que experimentan las partículas cuando se acercan a la
18

escala nanométrica (Valdivieso et al., 2013). El óxido de hierro en su forma más


estable, la α-hematita, posee propiedades conductoras y magnéticas
específicas, por las cuales ha recibido gran aplicación científica y tecnológica en
calidad de: catalizador, intercambiador iónico y como material aditivo en
baterías iónicas de litio (Picasso et al., 2010). Adicionalmente, Sánchez y
colaboradores (2009) mencionan que estas NPs poseen ventajas como su
pequeño tamaño, elevada área superficial específica, alta estabilidad y baja
resistencia a la transferencia de masa, y que en aplicación de Fe2O3 como
nanoconjugados funcionales (biocatalizadores), por lo que su investigación se
encuentra en una etapa avanzada y se han encontrado diversas aplicaciones
como: son utilizadas para la reutilización de enzimas lignocelulolíticas para el
aprovechamiento de biomasa lignocelulósica para la producción de bioetanol de
segunda generación (Sánchez et al., 2014), útil en la biotecnología ambiental
(nanorremediación) de mantos acuíferos (Noubactep et al., 2011), transporte de
fármacos usados como portadores magnéticos con el fin de atacar sitios
específicos dentro del cuerpo humano (biomedicina) (Grande, 2007), aplicación
en la remoción de cromo (Valdivieso et al., 2013) usos en nanocatálisis,
nanodieléctricos, biosensores, cerámicos, y pigmentos (Altavilla y Ciliberto
2016).

1.8 Nanopartículas en la agricultura


La NT en las diferentes áreas agrícolas está adquiriendo cada vez mayor
protagonismo y las investigaciones sobre ello se encuentran en su auge.
Actualmente la agricultura es considerada como la segunda área de aplicación
nanotecnológica, después del área energética, el desarrollo de los sistemas de
producción nos han encaminado en un desarrollo basado en “la agricultura sin
perdidas”, los principales insumos que se han pretendido utilizar de manera
óptima y controlada son el uso de fertilizantes, plaguicidas y agua (Quispe,
2009). Con el uso de NT es posible combinar los métodos convencionales con
alternativas promisorias para la implementación de nuevos productos que
mejoren el aprovechamiento de insumos y lograr un uso eficiente de nutrientes
19

y agua, contrarrestando los niveles de contaminación ambiental, así como, la


reducción de los costos de la producción. El uso potencial de las NPs dentro de
la agricultura radica en que podría ser posible resolver problemas que con
productos a escala normal son muy costosos y no siempre se solucionan
eficientemente como lo harían los productos formulados con NPs (Carrillo y
González, 2009), además de para mejorar la capacidad de los cultivos en la
absorción de los nutrientes del suelo, permitiendo incrementar los rendimientos
de las cosechas, así como la búsqueda de mejorar la calidad de los productos.
Adicionalmente, se tiene como premisa de que los dispositivos o componentes
a nanoescala son de menor tamaño que las células tanto animales como
vegetales, estos pueden ser usados para penetrar el interior de las células y
aprovechar esta propiedad para usos como los a continuación se mencionan.

1.8.1 Nanoplaguicidas
Implican partículas muy pequeñas de ingredientes activos de pesticidas u otras
estructuras pequeñas con propiedades pesticidas útiles, estos mismos, pueden
aumentar la dispersión y la humectabilidad de las formulaciones agrícolas (es
decir, la reducción de la escorrentía de disolventes orgánicos) y el movimiento
no deseado de plaguicidas (Bergeson, 2010). Los nanomateriales y
biocompuestos exhiben propiedades útiles tales como rigidez, permeabilidad,
cristalinidad, estabilidad térmica, solubilidad y biodegradabilidad (Bouwmeester
et al., 2009; Bordes et al., 2009), necesarios para formular nanoplaguicidas. Por
su parte, Jianhui y colaboradores (2005) desarrollaron un nanoplaguicida de
decilsulfato de sodio (SDS) modificado con el nanomaterial de TiO 2 / Ag
fotocatalítico, conjugado con dimetomorf (DMM) (plaguicida convencional) y
reportaron que la formulación modificada con granularidad de 96 nm, aumento
de la dispersividad y descomposición del plaguicida en el suelo, al tiempo que
aumentó su efectividad en estudios de plántulas vegetales (de col y pepino),
concluyendo que los nano plaguicidas también ofrecen una gran superficie
específica y, por lo tanto, una mayor afinidad con el objetivo. Las
nanoemulsiones, nanoencapsulados y nanocontenedores, son algunas de las
20

técnicas de liberación de nano plaguicidas que se han discutido recientemente


(Lyons y Scrinis, 2009; Bouwmeester et al., 2009) para la protección de las
plantas. Mollins (2008) menciona que estos productos que también tienen
posibilidad de atacar la testa de semillas de malezas y con ello impedir la
germinación aun cuando la semilla se encuentre profundamente enterrada,
fuera del alcance de plaguicidas convencionales, además de que las nano
formulaciones deberían degradarse más rápidamente en el suelo y lentamente
en las plantas con niveles de residuos por debajo de los criterios regulatorios en
los alimentos (Jianhui et al., 2005).

1.8.2 Detección de residuos de plaguicidas


Se han desarrollado nanosensores que son útiles para detectar residuos de
plaguicidas como una alternativa a las técnicas tradicionales de cromatografía
de gases- espectroscopia de masas (GC / LC) (-MS) (Balinova et al., 2007).
Aunque son precisas y confiables, las técnicas superiores a las tradicionales
implican largos pasos como la recolección de muestras de campo, la extracción
en fase sólida en laboratorio, el análisis de la muestra y la comparación de los
picos espectrales obtenidos con referencias para determinar los residuos de
plaguicidas. Actualmente, el Departamento de Agricultura de los EE. UU.
(USDA) sigue GC / LC-MS basados en residuos únicos y múltiples para evaluar
residuos de "organofosforados, organoclorados, carbamatos, triazinas,
triazoles, piretroides, neonicotinilos, estrobilurinas" en 85 productos agrícolas
(USDA, 2010). Los nanosensores para la detección de residuos de plaguicidas
ofrecen "alta sensibilidad, bajos límites de detección, súper selectividad,
respuestas rápidas y tamaños pequeños" (Liu et al., 2008). Además, Van Dyk y
Pletschke (2011) han estudiado los biosensores basados en enzimas para
detección de residuos de organoclorados, organofosforados y carbamatos
usando C, Au, titanio híbrido (Ti), Au-Platino (Pt) y dióxido de plomo
nanoestructurado (PbO2) / TiO / Ti para inmovilizar las enzimas en el sustrato
del sensor y aumentar la sensibilidad del sensor. Los nanomateriales, también
se han aplicado para la degradación de pesticidas como Yu et al. (2007)
21

estudiaron el potencial del uso de películas NPsTiO 2 en la degradación


fotocatalítica de plaguicidas organoclorados. Por su parte Zeng et al (2010)
establecieron que los plaguicidas organofosforados y carbamatos en las hojas
de tomate y el suelo también pueden degradarse fotocatalíticamente a una tasa
de 15 y 30% usando Re3+ dopado con nano TiO2, el mismo nanomaterial fue
capaz de degradar el carbofurano a una tasa del 55%, que es un 30% mayor
que la degradación natural.

1.8.3 Detección y control de fitopatógenos


Las NPs pueden usarse como biomarcadores o como una herramienta de
diagnóstico rápido para la detección de patógenos de plantas y pueden
modificarse directamente para detectar compuestos indicativos de una
enfermedad (Baac et al., 2006). Así mismo, existen los nanochips que son tipos
de microarrays que contienen sondas de captura oligo fluorescentes a través de
las cuales se puede detectar la hibridación son conocidos por su sensibilidad y
especificidad en la detección de cambios de un solo nucleótido de bacterias y
virus (López et al., 2009). Yao et al. (2009) utilizaron nanopartículas de sílice de
fluorescencia en combinación con anticuerpos para detectar Xanthomonas
axonopodis pv. vesicatoria en las plantas de Solanaceae, indicando un
potencial para la aplicación de nanopartículas en la detección de enfermedades.
Singh et al. (2010) utilizaron inmunosensores basados en NPsAu que podían
detectar Tilletia indica en trigo utilizando resonancia de plasmón superficial
(SPR), donde se intentó detectar la enfermedad en parcelas de trigo para
certificación de semillas y para establecer cuarentenas de plantas. La
investigación sobre nanosensores que detecten los patógenos para su
aplicación en el campo sería muy valiosa para el diagnóstico rápido y el manejo
de la enfermedad.
Las plantas responden a diferentes condiciones de estrés a través de cambios
fisiológicos. Una de esas respuestas es la inducción de la defensa sistémica,
que se cree está regulada por las hormonas vegetales: ácido jasmónico,
jasmonato de metilo y ácido salicílico. Wang et al. (2010) aprovecharon este
22

estímulo indirecto para desarrollar un sensor electroquímico sensible, utilizando


un electrodo de oro modificado con NPsCu, para monitorear los niveles de
ácido salicílico en las semillas oleaginosas para detectar hongos (Sclerotinia
sclerotiorum). En relación con el efecto antifúngico de algunas NPs, se ha
demostrado que NPsCu tienen actividad antifúngica significativa contra hongos
fitopatógenos como Phoma destructiva, Curvularia lunata, Alternaria alternata y
Fusarium oxysporum y se sugiere su uso como un nuevo agente antifúngico en
la agricultura y también como potente desinfectante en aves de corral y en la
cría de animales (Kanhed et al., 2014). De igual forma, He et al. (2011)
estudiaron las actividades antifúngicas de NPZnO y su modo de acción contra
dos hongos patógenos pos cosecha (Botrytis cinerea y Penicillium expansum)
donde reportan su alta efectividad para la reducción de sus poblaciones. Por su
parte Jo y Jung (2009), probaron que las NPsAg influyen en la formación de
esporas y el avance de la enfermedad de hongos fitopatógenos, actuando como
inhibidores del crecimiento de las partes reproductivas de Bipolaris sorokiniana
y Magnaporthe grisea.

1.8.4 Inocuidad alimentaria


Se ha reportado su uso para la detección rápida, portátil y simultánea de
bacterias patógenas como Salmonella spp y Escherichia coli en los alimentos
(con nanocables y anticuerpos para la detección de presencia y tipo de
contaminación específica) (Roach, 2006); también su aplicación en fotocatálisis
usando NPs de TiO2 (procesos en el que la luz fomenta una reacción entre
compuestos como residuos de plaguicidas y el nanomaterial sin que este se
consuma), que es útil para la descontaminación del agua para consumo
humano y agrícola (Joseph y Morrison, 2006).

1.8.5 Nanopartículas como promotoras de la germinación y crecimiento.


En los últimos años, varios investigadores han estudiado los efectos de los
nanomateriales en la germinación y el crecimiento de las plantas con el objetivo
de promover su uso para aplicaciones agrícolas. Para ilustrar esto, Zheng et al
23

(2005) estudiaron los efectos de NPsTiO2 y su homólogo iónico sobre el


crecimiento de las semillas de espinaca naturalmente envejecidas. Reportaron
que las semillas tratadas con NPsTiO2 produjeron plantas que tenían un 73%
más de peso seco, una tasa fotosintética tres veces mayor y un 45% de
aumento en la formación de clorofila en comparación con el control, además, la
tasa de crecimiento de las semillas de espinaca fue inversamente proporcional
al tamaño del material, lo que indica que cuanto más pequeños sean los
nanomateriales, mejor será la germinación. Los autores coincidieron en que el
tamaño nano del TiO2 podría haber aumentado la absorción de nutrientes
inorgánicos, acelerado la descomposición de sustancias orgánicas y también
provocado el apagado de radicales libres de oxígeno, formado durante el
proceso fotosintético, aumentando así la tasa fotosintética. La clave para
aumentar la tasa de germinación de semillas es la penetración de
nanomateriales en la semilla. Con este criterio coinciden con Khodakovskaya et
al. (2009) quienes informaron que los nanotubos de carbono (CNT) penetran las
semillas de tomate y afectan su germinación y tasas de crecimiento. Se
encontró que la germinación era dramáticamente más alta para las semillas que
germinaban en medio que contenía CNT (10-40 μg / ml), en comparación con el
control, también indicaron que los CNT pueden penetrar la capa gruesa de la
semilla y soportar la absorción de agua dentro de las semillas, un proceso que
puede afectar la germinación de la semilla y el crecimiento de las plántulas de
tomate. Del mismo modo Dehkourdi et al (2015), evaluaron los efectos de
NPsTiO2 aplicadas por imbibición a semillas de Capsicum annum L. a cuatro
concentraciones (3.5, 5.5, 7.5 y 9.5 %) durante 24 y 48 horas, examinaron el
porcentaje de germinación, el índice de germinación, la longitud de la radícula y
de la plúmula, el peso fresco de las plántulas y el índice de vigor, los resultados
mostraron que el aumento en la concentración de NPsTiO2 causó un aumento
significativo en el porcentaje de germinación, tasa de germinación, longitud de
radícula y plúmula, peso fresco e índice de vigor de las plántulas al 7.5 % de
concentración, atribuyendo que los resultados fueron favorables debido al
tamaño de las NPs, además del aumento de penetración de agua durante los
24

diferentes tiempos de imbibición. Además se han estudiado NPs de cobre


como promotoras del crecimiento y germinación en lechuga (0.013% w/w), en
donde no afecto la germinación (Shah y Belozerova, 2009). En frijol mungo a
concentraciones de <200 mg L-1 en el que el crecimiento de las plántulas se vio
reducida y a 800 mg L -1 se encontró una reducción de la longitud de las raíces
y en trigo al aplicar <200 mg L-1 también se observó una reducción de raíces,
así como de la plántula en general (Lee et al., 2008). Al evaluar NPsCu a 1,000
mg L-1 en el cultivo de calabaza, se observó una reducción considerable de la
longitud de raíces y por ende una reducción de biomasa (Stampoulis et al.,
2009). Con respecto a estudios realizados concretamente con NPs de Fe en
plantas de lino, trébol rojo, trébol blanco, se encontró que a concentraciones de
100, 250 y 500 ppm la germinación no se vio afectada y en cebada y ryegrass a
100 y 250 ppm tampoco afecta la germinación, sin embargo, en cebaba, lino y
ryegrass a 2000 y 5000 ppm se inhibe completamente la germinación y que con
300 ppm en cebada solo se alcanza a reducir el porcentaje de germinación,
pero al incrementar la concentración a >1500 ppm tanto la cebada como el lino
y el ryegrass no germinan (El-Temsah y Joner, 2010). A demás, se han
desarrollado estudios para determinar si ciertas nanopartículas pueden ser
asimiladas por las plantas como nutrientes o si estas pueden producir
respuestas de fitotoxicidad, por ejemplo: la evaluación de NPs de óxido de Cu,
Zn, Mn y Fe, en donde Liu et al. (2016) reportan sus efectos en comparación
con sus homólogos iónicos determinado que las NPsMnO y FeO tienden a
estimular el crecimiento de las plántulas de lechuga, resultando ser menos
tóxicas que sus contrapartes iónicas (con potencial de ser nanofertilizantes), en
lo que respecta a NPsCuO, estás son ligeramente más tóxicas que los iones de
Cu, y NPsZnO y su homólogo iónico presentaron una toxicidad similar, de esta
forma es posible clasificar a las NPs de acuerdo a su efecto como nutriente
comparado con sus contrapartes iónicas, además de establecer los rangos de
tolerancia a la fitotoxicidad de algunos elementos específicos. De forma
semejante Almutairi y Alharbi (2015), evaluaron el efecto de dosificación de
plata NPsAg para mejorar la germinación y crecimiento de plantas, en el que
25

examinaron su efecto en tres especies de plantas; maíz (Zea mays L.), sandía
(Citrullus lanatus) y calabacín (Cucurbita pepo L.), evaluando porcentaje de
germinación, la tasa de germinación, el tiempo medio de germinación, la
longitud de la raíz, el peso fresco y seco de las plántulas. Se evaluaron siete
concentraciones (0.05, 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2 y 2.5 mg / L), observaron una mejora
significativa en los valores de porcentaje de germinación para las plantas de
sandía y calabacín mediante el tratamiento con NPsAg en comparación con las
semillas no tratadas, sin embargo, las NPsAg mostraron un efecto tóxico en el
alargamiento de raíces de maíz, mientras que el crecimiento de plántulas de
sandía y calabacín se vio afectado positivamente por cierta concentración de
NPsAg. Este estudio mostró que la exposición a estas NPs causó efectos tanto
positivos como negativos sobre el crecimiento y la germinación de la planta. En
la misma línea Monica y Cremonini (2009), mencionan que una de las
preocupaciones de las aplicaciones de nanomateriales en la germinación de
semillas es su fitotoxicidad y que el nivel puede depender del tipo de
nanomaterial y su posible aplicación. Por ejemplo, Lin y Xing (2007) evaluaron
la fitotoxicidad de nanomateriales (Al2O3, ZnO, Al y Zn) y su impacto en las
tasas de germinación en rábano, canola de colza, ryegrass, lechuga, maíz y
pepino. Ellos confirieron la hipótesis de que las concentraciones más altas
(2000 mg / L) de NPsZn de (35 nm) y ZnO (20 nm) inhibieron la germinación en
el raigrás y el maíz, respectivamente, la longitud de la raíz también se inhibió a
2000 mg/l de NPsZn y ZnO. La fitotoxicidad de NPsAl y Al afectó
significativamente la elongación de la raíz de maíz; mientras que NPsAl facilitó
el crecimiento de la raíz del rábano y la colza.
Por otra parte, las nanopartículas de óxido de hierro (NPs γ-Fe2O3) que han
surgido como un método innovador y prometedor de aplicación de hierro en los
sistemas agrícolas. Sin embargo, la posible toxicidad de las NPs de γ-Fe2O3 y
su absorción y translocación requieren más estudios antes de la aplicación en el
campo a gran escala. Por lo que se ha investigado la absorción y distribución en
maíz (Zea mays L.) y se determinaron sus impactos en la germinación de
semillas, la actividad de enzimas antioxidantes, el contenido de
26

malondialdehído (MDA) y el contenido de clorofila, y se ha demostrado que fue


posible promover la elongación de raíz, aumentar el índice de germinación e
índice de vigor, y en lo que respecta a las enzimas antioxidantes se observó
evidencia de ellas específicamente en la raíz al utilizar concentraciones de 50 y
100 mg/ L-1, también encontraron que las NPs existían en su mayoría alrededor
de la epidermis de la raíz y no se observaba la translocación de las NPs de las
raíces a los brotes (Li et al., 2016). Bombin et al. (2015) coinciden con el autor
anterior, adicionando que las NPs γ-Fe2O3 a 3 mg/l no influyen en el desarrollo
de plántulas de Arabidopsis thaliana pero con 25 mg/L mostraron una reducción
de la longitud de tallo y raíz, además de evaluar su forma iónica en la que
encontró que a una concentración de 3 mg/L se ve afectada la viabilidad del
polen así como el rendimiento de la semillas. Por ello, las futuras
investigaciones sobre nanomateriales para germinación y crecimiento de
plantas deberían abordar algunas de los siguientes desafíos (según lo
informado por Nair et al. (2010): 1) la imprevisibilidad de reacción de los
nanomateriales en las diferentes plantas, 2) fitotoxicidad debido a
concentraciones más altas, y 3) reducción de la asimilación y fotosíntesis de la
planta debido a nanomateriales más grandes.

1.9 Nanotoxicología en especies vegetales


La comprensión de los mecanismos de respuesta por toxicidad es crucial para
la reducción de los efectos tóxicos de las NPs en los cultivos, en efecto dichos
mecanismos ocasionados por NPs en las plantas han sido ampliamente
estudiados. A nivel del suelo, estos mecanismos de toxicidad pueden incluir
daño físico a las raíces debido a la adsorción de NPs en la superficie de la raíz
y la alteración de las comunidades bacterianas en el suelo, que afectan
indirectamente el crecimiento del cultivo: en el nivel de la planta, estos
mecanismos pueden incluir genotoxicidad, alteración en la absorción de
nutrientes minerales por las plantas, generación de especies reactivas de
oxígeno (ERO), lo que reduce la fotosíntesis y el intercambio de gases y puede
resultar en una disminución del crecimiento de la planta y la biomasa, además
27

es posible incluir el incremento de niveles de Prolina como indicativo de defensa


antioxidante como lo mencionan Rizwan et al.(2017). Dentro de las células las
nanopartículas pueden provocar directamente alteraciones de membranas y
otras estructuras celulares, así como alteraciones bioquímicas como
mecanismos de protección como pueden ser obstrucciones físicas,
solubilización de compuestos tóxicos o la producción de especies reactivas de
oxígeno.

1.9.1 Estrés oxidativo y sistema antioxidante en plantas


El estrés oxidativo tanto en plantas ha recibido una gran atención en los últimos
tiempos, a partir de las implicaciones en el orden fisiológico que tienen las
especies reactivas del oxígeno (ERO) para el buen desarrollo y funcionamiento
de los organismos en general (Martínez-Cayuela, 1998). El O2 es una molécula
relativamente estable que puede generar especies mucho más reactivas por
transferencia de electrones (anión radical superóxido, peróxido de hidrógeno,
radical hidroxilo), o por alteración del estado del espín (oxígeno singlete). Las
ERO, son moléculas con moderada o elevada reactividad química que se
producen como parte del metabolismo celular y que tienen la capacidad de
dañar una variedad de biomoléculas de la célula (Riveros, 2009). Sin embargo,
actualmente se les está considerando como moléculas señal para el
crecimiento y desarrollo de la planta (D’Autréaux y Toledano 2007). El oxígeno
se convierte en ERO por reacciones de reducción univalente, y por reacciones
de dismutación del radical superóxido. El oxígeno se convierte en ERO por
reacciones de reducción univalente, y por reacciones de dismutación del radical
superóxido (Halliwell y Gutteridge, 1984). Las ERO como el radical superóxido
(O2 -), el peróxido de hidrógeno (H2O2), y el radical hidroxilo (OH) son
producidos durante procesos celulares aeróbicos normales de la células, como
en la cadena de transporte electrónico en cloroplasto y mitocondria, la oxidación
del glicolato en el proceso de fotorrespiración, y por transformaciones
metabólicas de determinados compuestos como la xantina y la glucosa. Las
ERO actúan como intermediarios en muchos procesos metabólicos y para su
28

control natural existen diversos mecanismos que permiten conservar a la célula


en un estado redox equilibrado acorde al estadio metabólico, cuando se
incrementa el contenido de ERO, por alguna tensión biótica o abiótica, las ERO
entran en un proceso de ceder la energía ganada para restablecer su estado
basal. En este proceso reaccionan con un gran número de moléculas
generando un desbalance en el estado redox de la célula el cual es a su vez
contrarrestado por la activación de diversos mecanismos de defensa (Arora, et
al., 2002).
Con respecto a lo anteriormente mencionado, las plantas poseen un sistema
antioxidante eficiente que provee de protección a las mismas frente a los daños
provocados por las especies reactivas del oxígeno. Estas defensas no están
restringidas a compartimentos intracelulares, sino que también se localizan
aunque de manera limitada, en el apoplasto (Cakmak, 2000). En general,
existen dos tipos de mecanismos de respuesta ante estos estados redox
alterados: el sistema no enzimático (ácido ascórbico, polifenoles, tocoferoles,
antocianinas, carotenoides, glutatión, entre otros), y el sistema enzimático
(catalasa, peroxidasa, ascorbato peroxidasa, glutatión reductasa, superóxido
dismutasa, entre otras). El sistema enzimático antioxidante para el control de
ERO es el conjunto de enzimas que en común tienen la utilización de alguna
ERO como sustrato o cofactor y que al final produce especies no reactivas o
reactivas en una menor proporción, regulándose de esta forma la cadena
incontrolada de oxidación. Dentro del sistema enzimático antioxidante se han
identificado dos grandes grupos:
i) Enzimas que usan H2O2 como sustrato o cofactor, las cuales son capaces de
remover o neutralizarlo de forma directa: Ascorbato Peroxidasas (APX),
Catalasas (CAT), Glutatión Peroxidasa (GPOD), Peroxiredoxinas (PRX),
Peroxidasas (POD) tipo III.
ii) Enzimas que usan otras especies reactivas de oxígeno como sustrato o
cofactor: Superóxido Dismutasa (SOD) y Glutatión Reductasa (GR) (Moreno et
al., 2010).
29

Otras enzimas de este grupo que desempeñan un papel importante en la


detoxificación celular son: la monodehidroascorbato reductasa (MDHAR),
dehidroascorbato reductasa (DHAR) y la glutatión peroxidasa (GPX) (Arora et
al., 2002). Algunas de las propiedades de las enzimas relacionadas con estos
procesos neutralizadores son:
Catalasa (CAT): Es una enzima que contiene hierro en su estructura y cataliza
la dismutación del H2O2 en agua y oxígeno molecular y no requiere un sustrato
que se reduzca para lograrlo, esta enzima se encuentra en todos los
organismos eucariota aeróbicos y constituye un mecanismo esencial para la
eliminación del H2O2 generado en los peroxisomas por oxidasas que participan
en la ß-oxidación de ácidos grasos, la fotorrespiración y el catabolismo de las
purinas. La catalasa fue una de las primeras enzimas en ser aislada y obtenida
con un alto grado de pureza (Corrales y Ariza, 2010). Existen tres grandes
grupos de catalasas: monofuncionales, bifuncionales (catalasa/peroxidasa),
mono y bifuncionales sin grupo hemo-Mn. Su reacción catalítica se lleva a cabo
en dos pasos, en un primer paso una ferricatalasa es oxidada por una primera
molécula de H2O2 resultando en un intermediario I, formado por la adición de un
electrón al Fe (III) que genera un grupo oxoferril Fe (IV)=O y la adición de otro
electrón en el centro porfirínico formándose un radical π-catiónico, en un
segundo paso, una segunda molécula de H2O2 dona otro par de electrones para
reducir el intermediario I, con lo cual la ferricatalasa es regenerada y se produce
oxígeno y agua. Por otra vía, el intermediario I, al ser también un antioxidante
fuerte, puede reaccionar con otros donores de electrones (polifenoles, polioles,
etc.) que se encuentren en la célula y que compiten con el H 2O2, que de forma
similar logra regenerar la ferri-catalasa. Las catalasas se localizan en
peroxisomas de forma mayoritaria y en menor proporción en mitocondria
(Asada y Badger, 1984).
Ascorbato Peroxidasa (APX): El ascorbato se encuentra presente en
cloroplasto, citosol, vacuola y el espacio apoplástico de las células de las hojas
en elevada concentración (Foyer et al., 1991). Este sistema antioxidante es
quizá el más importante en las plantas, con la función fundamental de eliminar
30

el H2O2 . La oxidación del ascorbato se produce en dos etapas secuenciales,


primariamente se produce el compuesto monodehidroascorbato, el cual si no es
rápidamente vuelto a reducir a ascorbato, es transformado a ascorbato y
dehidroascorbato. La actividad ascorbato peroxidasa ha sido reportada
principalmente en cloroplasto y citosol (Arora et al., 2002). En los cloroplastos,
la SOD y la enzima Ascorbato peroxidasa se presentan en forma soluble y
unida a los tilacoides. El superóxido generado en la superficie de la membrana
es atrapado y convertido inmediatamente a H2O2 para ser posteriormente
eliminado por la ascorbato peroxidasa unida a membrana (Nakano y Asada,
1980).
Superóxido dismutasa (SOD): Constituyen la primera línea de defensa de las
plantas contra el radical superóxido O2-, este radical se presenta en todos los
organelos celulares donde tenga lugar una cadena de transporte de electrones,
incluyendo: mitocondria, cloroplastos, microsomas, glicosomas, peroxisomas,
apoplasto y citosol. Es una metaloenzima que convierte el radical superóxido
O2- en H2O2. El proceso de dismutación es promovido por un ión metálico (Cu,
Mn o Fe) en el sitio catalítico (Nakano y Asada, 1981). La superóxido dismutasa
constituye una familia de metaloenzimas que cataliza la dismutación del radical
superóxido a H2O2 y O (Scandalios, 1993). Esta reacción es 10 000 veces más
rápida que la dismutación espontánea del anión superóxido y esta enzima
elimina el O2- y por tanto disminuye el riesgo de formación del radical hidroxilo
vía reacción de Haber-Weiss (Bolwell et al., 1995).
Para ilustrar lo anteriormente planteado, se ha relacionado a ciertas NPs
metálicas con inducción de estrés oxidativo en especies vegetales diferentes,
Trujillo y Reyes (2014), al estudiar el efecto de NPsCu / CuO y CuSO 4 y el
efecto de NPsFe / Fe3O4 y FeSO4 en lechuga por hidroponía, en términos de
estrés oxidativo, se encontró que el NPsCu / CuO era más tóxico que el NPsFe
/ Fe a 10 mg / L, sin embargo, el nano-Cu / CuO a 10 y 20 mg / L afectó el
crecimiento de la planta, el potencial hídrico, la producción de biomasa seca y la
concentración de varios nutrientes y a 10 mg / L, el material de nano cobre
aumentó CAT y redujo APX en las raíces. Las NPsCu / CuO fue más tóxico
31

para las plantas de lechuga que el sulfato de cobre a 10 mg / L, en términos de


absorción de nutrientes, contenido de agua y actividades enzimáticas y que los
tratamientos de Fe, los efectos fisiológicos / toxicológicos se produjeron,
principalmente, por la acumulación de Fe; mientras que en el caso de los
tratamientos con Cu, los efectos se debieron a la presencia de materiales Cu
iones / NPsCu / CuO. De igual manera se ha encontrado evidencia de que las
NPs de óxido de metal y metal causaron estrés oxidativo en las plantas al
producir especies reactivas de oxígeno (ERO). Se ha informado que las NP de
óxido de metal y metal causan más estrés oxidativo de manera dependiente de
la dosis en diferentes especies vegetales a diferencia de sus iones homólogos.
En las raíces de arroz, las NPsCeO2 (125 mg L-1) mejoraron la peroxidación
lipídica y la fuga de electrolito, pero no afectaron el contenido de H 2O2, mientras
que la generación de H2O2 aumentó en las raíces a 500 mg/L-1 de NPs. (Rico et
al., 2013a; Rico et al., 2013b). De manera similar, en las hojas de maíz, los
monodosis de NPsCeO2 (400 y 800 mg kg-1) aumentaron la acumulación de
H2O2en diferentes partes de las hojas, como el floema, el xilema, las células de
envoltura y las células epidérmicas (Zhao et al., 2012). Además, NPsCuO (1.5
mM) aumentó las concentraciones foliares de H2O2 (2-8 veces mayor que el
control) en la cebada (Shaw et al., 2014). Similares NPsCuO mediada por
aumentos en los niveles de H2O2 y MDA se observaron en las hojas de arroz y
plántulas de garbanzo (Shaw et al., 2013; Abou-Zeid y Moustafa, 2014). Del
mismo modo, NPs de CuO y ZnO causaron estrés oxidativo en el trigo, que se
evidenció por el aumento de la peroxidación lipídica y el glutatión oxidado en las
raíces (Dimkpa et al., 2012). En tomate, las NPs de NiO (2.0 g L-1) causaron un
aumento significativo (122%) en la producción de ERO intracelular en las raíces
en comparación con el control, bajo estrés leve con NPs, las actividades de las
enzimas antioxidantes clave aumentaron en muchas plantas del cultivo (Faisal
et al., 2013). Sin embargo, bajo un mayor estrés, las actividades de las enzimas
antioxidantes disminuyeron, lo que podría deberse al estallido oxidativo en las
plantas (Rao y Shekhawat, 2014). Por ejemplo, las actividades de superóxido
dismutasa (SOD), ascorbato peroxidasa (APX) y catalasas (CAT) aumentaron
32

en plántulas de trigo expuestas a 200 mg L-1 de NPs Al2O3 durante 5 días, y a


mayor concentración de NPs, las actividades de antioxidante las enzimas se
mantuvieron iguales o disminuyeron en comparación con el control (Yanık y
Vardar, 2015). Además, NPs Ag inhibió las actividades de CAT y SOD en hojas
y raíces de trigo (Gorczyca et al., 2015). Las NPsCeO2, 500 ppm durante 48
días, disminuyeron las actividades de CAT, dehidroascorbato reductasa (DHAR)
y glutatión reductasa (GR) en hojas de cebada en comparación con el control
(Rico et al., 2015). En plantas de cilantro las NPsCeO2 (125 mg kg-1)
aumentaron las actividades de CAT en los brotes y APX en las raíces (Morales
et al., 2013). Del mismo modo, NPsCeO2 (≥ 500 mg L-1 en medio de agar) alteró
la actividad de SOD en raíces de lechuga (Cui et al., 2014). De manera similar,
Nair y Chung (2015) informaron que NPsCuO (500 mg L-1) aumentó
significativamente la actividad de SOD en raíces y brotes de mostaza india,
mientras que la misma concentración de NPs causó una disminución
significativa en la actividad de APX en brotes y raíces. NPs de CuO y ZnO (100
ppm) causaron un aumento significativo en las actividades de SOD, POD y CAT
en las raíces de pepino (Kim et al., 2012). Faisal et al. (2013), informaron que
las NPsNiO (2.0 g L-1) aumentaron las actividades CAT, GR y SOD, 6.8, 3.7 y
1.7 veces más, respectivamente, en raíces de tomate en comparación con el
control. Las NPs también indujeron cambios significativos en las actividades
enzimáticas del suelo, como proteasa, catalasa, peroxidasa, deshidrogenasa, β-
glucosidasa y fosfatasa ácida (Du et al., 2011; Kim et al., 2011). Los estudios
anteriores mostraron que las NPs causaron estrés oxidativo como lo indica la
producción de ERO bajo estrés. Bajo estrés leve, el sistema de defensa de la
planta fue efectivo para eliminar la producción de ERO, pero a mayor estrés, las
plantas no pudieron combatir la generación de ERO debido a estallidos
oxidativos severos. Además, el aumento o la disminución de las actividades de
las enzimas antioxidantes mediadas por las NPs podrían deberse a diferencias
en las plantas, el tipo y el tamaño de las NPs, la duración de la exposición y las
condiciones experimentales.
33

1.9.2 Prolina
La prolina es un aminoácido que se encuentra en las plantas en cantidades muy
pequeñas, en condiciones adecuadas para el desarrollo y crecimiento y es
considerada como un osmolito compatible, que se sabe que se acumula en
respuesta a diversos tipos de estrés abiótico, como la sequía, la salinidad, la
alta temperatura, la deficiencia de nutrientes y la exposición a metales pesados
(Moreno et al., 2010) la prolina se acumula en citosol y contribuye al ajuste
osmótico en respuesta al estrés de deshidratación y tiende a mantener
suficiente turgencia celular para crecer y evitar la deshidratación, además la
prolina participa con múltiples funciones y que está relacionada con la expresión
de genes de tolerancia de las plantas a diferentes condiciones de estrés,
actuando como osmorregulador, estabilizador de proteínas y membranas,
inductor de genes relacionados con estrés osmótico, fuente de carbono y
nitrógeno fácilmente disponible en la rehidratación celular (Hoque et al., 2007).
La acumulación del aminoácido en los tejidos vegetales en respuesta a
diferentes tensiones abióticas puede jugar un papel importante contra el daño
oxidativo causado por ERO, debido a su acción como desactivador de oxígeno
singlete y secuestrante de radicales hidroxilo, la prolina puede estabilizar ADN,
proteínas y membranas (Mohanty y Matysik, 2001). Además de ser un
eliminador de ERO, la prolina desempeña varios papeles importantes durante la
adaptación al estrés, actuando como un mediador de ajuste osmótico (Zhang et
al., 1999) y almacenamiento de carbono, nitrógeno y energía. Además, su
síntesis y degradación pueden proporcionar una forma de amortiguar el pH
citosólico, equilibrando el estado redox celular (Freitas et al., 2011). La dificultad
en su estudio se acentúa al considerar que la concentración del aminoácido se
afecta por la edad o etapa fenológica y que existen diferencias de concentración
entre los diversos órganos de la planta, Barcenas (1999), indica que la
acumulación de prolina se ve afectada por la edad o etapa fenológica, y
describe una tendencia a presentar una mayor acumulación del aminoácido en
las raíces primarias (más viejas) que en las raíces secundarias (más jóvenes),
de igual manera menciona los diferentes niveles de acumulación de prolina en
34

cultivares tolerantes y cultivares susceptibles, en que los susceptibles tienden a


acumular mayores niveles de prolina, mientras que los tolerantes acumulan
menos prolina y esta es mayormente acumulada en las raíces de las plantas.
35

MATERIALES Y MÉTODOS

1.10 Ubicación del experimento


Durante la presente investigación se establecieron cinco bioensayos, los cuales
fueron realizados y distribuidos en las siguientes etapas:
La primera etapa se realizó en el Laboratorio de Fisiología y Bioquímica del
Centro de Capacitación y Desarrollo en Tecnología de Semillas (CCDTS), de la
Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, ubicada en Buenavista, Saltillo,
Coahuila, México, en las coordenadas 25° 22´ de latitud norte y 101° 02´
longitud oeste y a una altitud de 1742 msnm.
La segunda etapa se realizó en el Laboratorio de Biotecnología, perteneciente
al Departamento de Plásticos en la Agricultura del Centro de Investigación en
Química Aplicada (CIQA), ubicado al norte de la ciudad de Saltillo, Coahuila.

1.11 Material biológico


Se utilizaron semillas de Cucumis sativus var. Modan, semilla de Cucumis melo
var. Edisto.; las NPs estudiadas fueron NPsCu (25 nm) y NPsFe2O3 (10 nm),
las cuales se adquirieron con la empresa Skyspring Nanomaterials y
MPsFe2SO4.

1.12 Estudios preliminares

1.12.1 Germinación estándar


Se realizó una prueba de germinación con el fin de conocer la calidad fisiológica
de la semilla a utilizar en el presente trabajo de investigación. La prueba
consistió en la siembra, "entre papel" anchor, se sembraron 25 semillas
distribuidas en una hilera, entre dos toallas previamente humedecidas con agua
destilada y se enrollaron en forma de "taco", los cuales se introdujeron en una
cámara germinadora Seedburo a 25 °C por ocho días, con riegos cada tercer
día. Se llevaron a cabo dos evaluaciones durante la prueba, el primero, al
cuarto día después de la siembra evaluando porcentajes de vigor (VIG), y el
36

segundo al octavo día después de la siembra evaluando porcentaje de


germinación (GERM), plántulas normales (PN), plántulas anormales (PA),
semilla sin germinar (SSG), longitud de vástago (LV) , longitud de radicula (LR)
tomados en centímetros y peso seco (PS), expresado en mg/pta (ISTA, 2009).

1.12.2 Curva de imbibición


Esta prueba nos permitió determinar el tiempo óptimo de imbibición de semillas
tratadas con diferentes soluciones (NPs y MPs), para cada uno de los
bioensayos. Se utilizaron 100 semillas de Cucumis sativus L. y Cucumis melo
L., se establecieron cuatro repeticiones.Primero se registró el peso inicial de las
semillas en gramos, después se colocaron en cajas Petri de vidrio (100x15
mm), la cual contenia una capa de papel filtro y 15 ml de agua destilada,
posteriormente, se registró la ganancia de peso por hora, y en base a ello se
observó el comportamiento de la curva para localizar el punto de estabilización
de la misma, es decir, cuando la semilla cesó la absorción de agua.

1.12.3 Preparación de soluciones con nanopartículas (NPs) y


micropartículas (MPs).
La elaboración de las soluciones para los diferentes tratamientos se realizó a
partir de una solución madre (500 ppm), la cual fue colocada de manera
individual en un tubo falcón cónico (50 ml) para ser disuelta a diferentes
concentraciones aforando con agua destilada, después las soluciones fueron
sometidas a un proceso de sonicación ultrasónica en un ultrasonicador Branson
2510 durante tres períodos de veinte minutos cada uno.

1.12.4 Elección de un método para adicionar Fe2O3, mediante la


germinación in vitro, realizando comparación entre la imbibición con
NPs y un medio de cultivo con NPs dispersas.
La prueba consistió en estudiar el comportamiento de semillas germinadas en
condiciones in vitro, se establecieron dos ensayos, el primero utilizando medio
MS (Murashigue y Skoog, 1962) al 2% y un segundo ensayo con MS al 2% +
37

NPsFe2O3 dispersas en el medio, utilizando 600ml de MS, sembrando 100


semillas distribuidas en 20 frascos para cada caso.

1.12.4.1 Preparación de medios de cultivo

I. Medio convencional
Para la preparación del medio de cultivo, se utilizó MS 2% (4.4 g/L,) Phytagel™
Sigma- Aldrich (2.2 g/L) y sacarosa (20 g/L). Primero se pesó el MS y la
sacarosa y se colocarón en un vaso de precipitado de 1000 ml, se adiciono 600
ml de agua destilada, posteriormente se homogenizo en un agitador magnético
a una velocidad constante, después se ajustó el pH a 6.2. Finalmente se agregó
el Phytagel™ y se diluyó con calor en un horno de microondas convencional
durante dos ciclos de 50 segundos cada uno; luego se procedió a vaciar el
medio en frascos de vidrio de 100 ml, colocando 30 ml de medio en cada uno,
estos fueron tapados y llevados a la autoclave para su esterilización durante 15
minutos a 121 °C, a una presión de 15 libras.

II. Medio con NPsFe2O3 dispersas


El procedimiento es similar al descrito anteriormente, excepto que después de
ajustar el pH a 6.2, se adicionan las NPsFe2O3 y esta mezcla es llevada a
sonicación por dos ciclos de 20 minutos cada uno para su dispersión, después
se adiciona el Phytagel™ y se diluyó con calor y finalmente se procede a vaciar
y esterilizar el medio, al salir de la autoclave el medio es agitado durante 5
minutos.

III. Desinfestación de semillas


Se realizó la desinfestación de 200 semillas de C. sativus, las cuales fueron
colocadas en un tubo falcón de 50 ml donde se realizó el lavado de impurezas
a chorro de agua, agregando detergente (5 gotas / L), y se agitaron por 5
minutos, luego se enjuagaron tres veces con agua destilada y se trasladaron a
una cámara de flujo laminar, una vez ahí, las semillas fueron colocadas en una
38

solución de alcohol al 70 % por 60 segundos, inmediatamente se lavaron tres


veces con agua destilada estéril y después se colocaron en hipoclorito de sodio
al 30 % + tween 20 % durante 15 minutos, agitando periódicamente, finalmente
se enjuagaron 5 veces con agua destilada estéril y se procedió a la siembra en
el medio con NPsFe2O3 dispersas. Se colocaron 5 semillas por frasco (un total
de 100), los frascos se sellaron con papel parafilm y se incubaron en una
cámara de crecimiento a 25 °C constante, las variables evaluadas fueron: índice
de velocidad de emergencia (IVE) y porcentaje de vigor y germinación.
Las otras 100 semillas, se colocaron en una caja de Petri (vidrio, 60x15 mm)
previamente identificadas de manera individual, en ellas se adicionó 30 ml de
solución con NPsFe2O3 a una concentración de 50 ppm, después fueron
tapadas y selladas con papel parafilm y se colocaron en agitación en un
agitador orbital horizontal tipo shaker a 90 rpm durante 24 h, para su imbibición,
después de este período se procedió a la siembra en el medio convencional
(MS al 2%).

1.13 Establecimiento de Bioensayos

1.13.1 BIOENSAYO I. Evaluación del efecto potencial de NPsCu como


promotor de la germinación y vigor en semillas de Cucumis sativus.
Se estudió el efecto de NPsCu en el vigor y germinación en C. sativus L.,
utilizando dos dosis diferentes, durante dos periodos de imbibición (Cuadro 1);
para ello se utilizó un total de 2400 semillas, distribuidas en 24 tratamientos,
con cuatro repeticiones cada uno.
Cuadro 1. Descripción de tratamientos con NPsCu aplicados en semillas de C.
sativus mediante imbibición.
Dosis Concentración Imbibición
(ppm) (h)
Bajas 0, 5, 10, 20, 50 y 100 12
0, 5, 10, 20, 50 y 100 24

Altas 0, 100, 200, 300, 400 y 500 12


0, 100, 200, 300, 400 y 500 24
ppm= Partes por millón; h= Horas.
39

Para el desarrollo del bioensayo, se preparó las soluciones de NPsCu, de


acuerdo a las concentraciones indicadas en el Cuadro 1, se utilizaron 25
semillas por repetición, las semillas se colocaron en cajas de Petri (vidrio, 60x15
mm) se adicionaron 30 ml de cada solución, fueron tapadas y selladas con
papel parafilm y finalmente se colocaron en agitación (agitador orbital horizontal
tipo shaker a 90 rpm), durante los períodos de 12 y 24 h, para su imbibición.
Una vez transcurrido el tiempo de agitación se continuó con la siembra, la cual
se realizó en “tacos” entre papel anchor identificando cada taco con el
tratamiento correspondiente y colocándolos de manera aleatoria en bolsas
plásticas dentro de canastas las que después fueron colocadas en una cámara
de crecimiento Seedburo con una temperatura constante de 25 °C.

Evaluación de variables
Se realizaron dos evaluaciones bajos las consideraciones de la International
Seeds Testing Association ISTA (2009), la primera al cuarto día después de la
siembra contabilizando:
Plántulas normales (PN): parámetro considerado como indicador del vigor (VIG)
que posee la semilla para una germinación en menor tiempo y la capacidad
para establecerse en campo, considerando como PN aquellas que presentan
todas sus estructuras básicas y que tienen el potencial para continuar
desarrollándose bajo condiciones óptimas.
Una segunda valoración al octavo día después de la siembra en la que se
evaluaron:
 Germinación (GERM): porcentaje de plántulas normales al final del
bioensayo.
 Plántulas anormales (PA): porcentaje de plántulas con alguna malformación
que impida su desarrollo normal.
 Semillas sin germinar (SSG): porcentaje de semillas que iniciaron el proceso
de germinación, sin embargo no llegan a la tercera etapa de la misma.
40

 Longitud de vástago (LV) y longitud de radícula (LR), mediciones realizadas


en la PN obtenidas, las medidas se expresaron en centímetros y fueron
tomadas con ayuda de una regla convencional.

1.13.2 BIOENSAYO II. Efecto diferencial en el comportamiento fisiológico


de semillas, debido a la aplicación de nanopartículas NPsFe2O3 y
micropartículas de sulfato de hierro MPsFe2SO4.
Se realizó la aplicación de NPsFe2O3 y MPsFeSO4 a bajas concentraciones,
para determinar su efecto en la germinación y crecimiento de plántulas de
Cucumis melo, dado por el tamaño y tipo de partícula utilizada, constó de once
tratamientos con cuatro repeticiones cada uno.
La metodología seguida fue similar a la del bioensayo I, pero con una diferencia
durante la imbibición. Las semillas no fueron colocadas en agitación, si no que
se colocó papel filtro en cada una de las cajas de Petri; además el tiempo que
las semillas estuvieron en contacto con las soluciones fue de 24 h y las
concentraciones utilizadas se detallan en el Cuadro 2. Se realizó la evaluación
de las variables al 4 y octavo día después de la siembra, evaluando: VIG,
GERM, PA, SSG, LV y LR. Al finalizar las evaluaciones fisiológicas se tomaron
muestras de tejido vegetal de parte aérea y raíz por separado, realizando
paquetes de 100, 200 y 500 mg para cada uno, con tres replicas, después
fueron congeladas en nitrógeno líquido y almacenadas a -20 °C en un
congelador para su uso posterior.
Cuadro 2. Concentraciones utilizadas para realizar un comparativo por tamaño
de partícula en la germinación de semillas de Cucumis m.

Partícula Concentración (ppm)

I 0, 0.5, 1, 5,10, y 50

II 0.5, 1, 5,10, y 50

= NPsFe2O3; II= MPsFeSO4; ppm= Partes por millón.


41

1.13.3 BIOENSAYO III. Efectos de la aplicación de NPsFe2O3 y MPsFeSO4


a concentraciones medias en el proceso de la germinación y vigor de
semillas de Cucumis melo.
El estudio se realizó bajo la metodología ya descrita en el bioensayo II, se
evaluaron las variables: VIG, GERM, PA, SSG, LV y LR; además para la
evaluación del vigor se agregó el la determinación del índice de velocidad de
emergencia (IVE) evaluada mediante la fórmula de Maguire (1962), en la que se
cuenta el número de días que emergieron para establecer un índice, el cual
permite obtener mejores estimadores de vigor de las plántulas.
Se establecieron ocho tratamientos con cuatro repeticiones a concentraciones
de 0, 10, 50 y 100 ppm para NPsFe2O3 y las mismas concentraciones para
MPsFeSO4 teniendo un testigo para cada partícula. Al finalizar las evaluaciones
se tomaron muestras de tejido vegetal para su uso posterior.

1.13.4 BIOENSAYO IV. Efecto de NPsFe2O3 en la germinación y vigor, bajo


condiciones in vitro de semillas de Cucumis sativus.
El bioensayo consistió en la siembra de semillas con bajo vigor (germinación de
53%, obtenido en el estudio preliminar) en condiciones in vitro, imbibidas en
soluciones de NPsFe2O3 por 24 h, para mejorar su expresión fisiológica. Se
establecieron 5 tratamientos a concentraciones de 0, 50, 100, 200 y 500 ppm,
con 10 repeticiones cada uno (10 frascos con 5 semillas c/u). Primero se realizó
la preparación del medio de cultivo MS 2 %, después la desinfestación de la
semilla y finalmente la siembra (todo ello siguiendo las metodologías
anteriormente descritas). Se realizó la determinación del índice de velocidad de
emergencia (IVE), y al cuarto día después de la siembra se evaluó vigor (VIG) y
para el octavo día se evaluó GERM, PA, SSG, LV, LR, además del peso seco
(PS), donde, las PN son sometidas a deshidratación en una estufa a 70°C por
24 h, al pasar dicho tiempo las muestras son colocadas en un desecador por 15
minutos y se procede al registró del peso de la materia seca con ayuda de una
balanza analítica, los resultados se expresaron en miligramo por plántula
(mg/pta).
42

1.13.5 BIOENSAYO V. Cuantificación de la activación enzimática


antioxidante y la producción de Prolina en las plántulas provenientes
de semillas sometidas a NPsFe2O3 y MPsFeSO4.
Se realizó con la finalidad de estudiar las respuestas fitoquímicas en plántulas
de C. melo L. como respuesta a la aplicación de NPsFe2O3 y MPsFeSO4,
realizando principalmente la cuantificación del sistema de defensa antioxidante
enzimático y determinación de prolina, como indicativos de la producción de
ERO como respuesta al estrés ocasionado por una posible fitotoxicidad.
Se utilizó material vegetal proveniente de los bioensayos II, III los cuales fueron
manipulados de la siguiente manera:
1.13.5.1 Elaboración de extracto proteico y
cuantificación de proteínas.
Se realizó un extracto proteico de las plántulas normales obtenidas en los
ensayos de germinación. De acuerdo a la metodología reportada por Elavarthi y
Martin (2010), se tomaron 200 mg de muestras de tejido vegetal, el material se
congeló en nitrógeno líquido, se trituró en un mortero con el 5 % de
Polivinilpirrolidona (PVP); las muestras se homogenizaron en 500 μl de solución
amortiguadora de fosfatos 0.2 M, pH 7.0 adicionada con 0.1 mM EDTA (ácido
etilendiaminotetraacético). Enseguida las muestras fueron centrifugadas a 1200
rpm por 5 min a 4 ºC y el sobrenadante se almacenó a -20 ºC hasta su uso.
Se llevó acabo la cuantificación de proteínas de acuerdo a la metodología
reportada por Bradford (1976), utilizando el reactivo de Bradford de Sigma-
Aldrich. Se empleó albumina de suero de bovino (BSA) como estándar y se
siguió la metodología del proveedor. Se obtuvo la siguiente ecuación de la
curva que se utilizó para cuantificar la cantidad de proteína de cada muestra,
comparando los valores de la curva estándar con la absorbancia neta 595 nm.
43

y = 0.0417x + 0.1426
0.6 R² = 0.9282

0.5
Absorbancia (UA)

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 10 20 30 40 50 60
BSA (µg/µl)

Figura 1.Obtención de la ecuación de la curva de calibración para la


cuantificación de proteína.

1.13.5.2 Determinación de sistema antioxidante


enzimático.

Peroxidasas (POD)
La actividad de peroxidasas se realizó utilizando como sustrato guayacol, de
acuerdo a la metodología reportada por Pütter (1974). El volumen de reacción
fue de 2 ml, el cual contenía: 10 µl de extracto proteico de parte aérea y de raiz,
300 µl de una solución de guayacol (100 mM), amortiguador de fosfatos 100
mM pH 6 y 60 µl de una solución de H 2O2 (100 mM), la reacción empezó
cuando se agregó el H2O2. Se leyó inmediatamente a 470 nm en
espectrofotómetro (Genesys 10 UV) por 2 min cada 20 segundos.

Ascorbatos peroxidasas (APX)


La actividad de APX es determinada por la disminución en la absorbancia de
290 nm debido a la oxidación del Ascorbato en la reacción. La cuantificación se
realizó por un método descrito por Nakato y Asada (1981). El coeficiente de
extinción de 2.8 Mm-1 cm -1 del Ascorbato fue utilizado para calcular la actividad
enzimática reportada como µmol de Ascorbato /min / mg de proteína.
44

1.13.5.3 Determinación de Prolina


Se realizó una curva de calibración para la obtención de la ecuación de la curva
y con ello realizar la cuantificación de prolina por muestra. Se siguió la
metodología reportada por Abrahám et al. (2010). Se tomaron 100 mg de tejido,
los cuales se maceraron en mortero pre enfriado con nitrógeno líquido,
agregando 500 µl de ácido sulfosalicílico, las muestras fueron homogenizadas y
centrifugadas a 1400 rpm 5 min para eliminar restos celulares.
Consecutivamente se tomaron 50 µl del extracto vegetal de cada muestra,
añadiendo 150 µl de ácido sulfosalicílico, 200 µl de una solución de ninhidrina y
200 µl de ácido acético glacial. La mezcla de reacción se incubo a 96°C por una
hora, se terminó la reacción en hielo y posteriormente se agregó 1 ml de
tolueno a la mezcla de reacción, se homogenizo en un vortex por 20 segundos
y al separarse las dos fases se tomó el sobrenadante y se midió la absorbancia
a una longitud de onda de 520 nm, usando como blanco touleno, la
concentración de prolina se determinó usando la curva de calibración y
calculado en peso base fresco (µg de prolina / mg PF).

1.14 Diseño experimental


Para analizar la información obtenida de las variables estudiadas, para el
Bioensayo II y IV se estableció un diseño completamente al azar, y la
comparación de medias mediante la prueba de Tukey (α = 0.05).
Modelo: Yij     i   ij
i= 1,2,3,..., t
j = 1,2,3,..., n
Dónde:
Yij = Variable respuesta en la j-ésima repetición del i-ésimo tratamiento.
μ = Media general.
ti = Efecto del tratamiento i.
εij = Error aleatorio.
45

Para BIOENSAYOS I y III, se estableció un diseño completamente al azar con


arreglo factorial de A x B y la comparación de medias una mediante la prueba
de Tukey (α= 0.05) los resultados fueron analizados con el programa estadístico
SAS V. 9.4

Modelo: Yijk     j   k  ( ) jk   ijk

Dónde:

Yijk= La puntuación del i sujeto bajo la combinación del j valor del factor A y el k
valor del factor B.
μ= La media común a todos los datos del experimento.
αj= El efecto o impacto de j nivel de la variable de tratamiento A.
ßk= Efecto del k valor de la variable de tratamiento B.
(αß) jk= Efecto de la interacción entre el i valor de A y el k valor de B.
εij= Error experimental.
46

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1.15 BIOENSAYO I. Evaluación del efecto potencial de nanopartículas de


cobre NPsCu, como promotor de la germinación y vigor en semillas de
Cucumis sativus L.
De acuerdo a los resultados obtenidos en el Bioensayo I, se presentan los
cuadrados medios del análisis de varianza (ANVA) para las variables
fisiológicas evaluadas en la prueba de germinación bajo la aplicación de dosis
bajas y altas de NPsCu, en el que, para todas las variables mostró diferencias
significativas en la FV dosis (P< 0.01), mientras que para la FV tiempo mostró
diferencias en la variable vigor (VIG) (P< 0.05) y longitud de radícula (LR) (P<
0.01). En cuanto a interacciones (dosis por tiempo), mostró diferencias
significativas en las variables LR (P< 0.01) y longitud de vástago (LV) (P< 0.05)
(Cuadro 3).
Cuadro 3. Análisis de varianza de las variables fisiológicas evaluadas en
semillas de C. sativus tratadas con NPsCu a dosis altas y bajas durante
diferentes periodos de imbibición.

FV GL VIG GERM PA SSG LR LV


(%) (%) (%) (%) (cm) (cm)
Tiempo 1 2904.0* 416.6 ns 486.0 ns 6.0 ns 2038.3** 161 ns
Dosis 1 53016.0** 79350.0** 71722.6** 170.6** 0.69 ns 913.5**
Dosis* Tpo. 1 130.6 ns 1014.0 ns 1232.6 ns 24.0 ns 1308.6** 71.6*

Error 697.4 811.6 787.6 9.5 31.7 9.1


C.V. 50.1 44.4 83.3 138 38.1 34
47

*, **= Significativo al 0.05 y 0.01 niveles de probabilidad respectivamente; FV = Fuente de


variación; GL= Grados de libertad; CV= Coeficiente de variación; VIG= Vigor; GERM=
Germinación; PA= Plántulas anormales; SSG= Semillas sin germinar; LV= Longitud de vástago;
LR= Longitud de radícula; Tpo= Tiempo.

FV GL VIG GERM PA SSG LR LV


(%) (%) (%) (%) (cm) (cm)
Concentración 11 10070.0** 416.6.1** 486.0** 6.1 ns 2038.3** 16.1 ns
Tiempo 1 2904.7** 13653.0** 12818.6** 35.3** 76.5* 144.2**
Tiempo*Conc. 11 453.3** 25.90** 303.6** 27.0** 318.0** 26.0*
Error 72 21.5 13.3 15.1 5.4 31.2 8.81
C.V. 8.8 5.6 11.5 103.7 37.7 33.4

Como se encontraron diferencias significativas entre las FV dosis y tiempo, se


realizó un ANVA para concentraciones que se presenta en el Cuadro 4, y se
encontró que diferencias significativas a P< 0.01 para todas las variables con
excepción de semillas sin germinar (SSG) y LV en la FV concentración,
mientras que, para la FV tiempo e interacciones, mostró diferencias en todas las
variables a P< 0.01, con excepción de LV que mostró diferencias a P< 0.05.

Cuadro 4. Análisis de varianza de las variables fisiológicas evaluadas en


semillas de C. sativus tratadas con NPsCu a concentraciones bajas y altas,
durante diferentes periodos de imbibición.
*, **= Significativo al 0.05 y 0.01 niveles de probabilidad respectivamente; FV = Fuente de
variación; GL= Grados de libertad; CV= Coeficiente de variación; VIG= Vigor; GERM=
Germinación; PA= Plántulas anormales; SSG= Semillas sin germinar; LV= Longitud de vástago;
LR= Longitud de radícula, Conc = Concentración.

Comparación de medias
El Cuadro 5 presenta la comparación de medias de acuerdo a la Prueba de
Tukey (α= 0.05), el cual arrojó diferencias estadísticas en la FV concentraciones
en todas las variables, donde para VIG se observa que ningún tratamiento
superó al testigo. En lo que respecta a la variable GERM, se observó que
ningún tratamiento a concentraciones bajas superó al testigo, mientras que en
tratamientos a concentraciones altas mostró que el porcentaje de germinación
es inversamente proporcional a las concentraciones. En las medias de la
48

variable plántulas anormales (PA), los porcentajes aumentan de forma


exponencial dentro de los tratamientos a concentraciones altas de NPsCu, lo
que indica que las plántulas expresaron una respuesta por toxicidad, de manera
que, a 500 ppm las anormalidades aumentaron a un 97 %, lo que significa que
niveles de altas concentraciones aumentan la toxicidad y por ende se refleja en
una respuesta morfológica (anormalidades),que posiblemente tenga que ver
con la inhibición de la división celular, esto fue comprobado al evaluar la
variable LR, ya que se observó la inhibición del desarrollo de raíces primarias,
bajo efecto de tratamientos con altas concentraciones, sin embargo, a
concentraciones de 50 y 100 ppm la LR aumentó 1.8 cm con respecto al testigo.
Finalmente para la variable LV los mejores tratamientos fueron 10 y 50 ppm
aumentando 0.6 y 0.4 cm con respecto al testigo.
Según la FV tiempo, hay diferencias estadísticas en todos los tratamientos,
excepto para las variables SSG y LV, mejorando los porcentajes de VIG en 11
%, de GERM en un 4% (12 h), y la LR incrementa 2 cm con respecto a la
longitud obtenida a 24 h de imbibición. Al contrario de lo anterior, el número de
PA aumento en un 5 % a tiempos prolongados de imbibición (24 h).
Por otro lado, en la FV dosis mostró que hay diferencias estadísticas en todas
las variables, logrando mejorar la respuesta de VIG, GERM y LV a dosis bajas,
mientras que el número de PA aumentó 58% a dosis altas. Por lo que se
determinó que conforme se incrementa la concentración y al duplicar el tiempo
de imbibición el vigor de semillas de C. melo es afectado negativamente e
indica que la respuesta de las semillas no es independiente del tiempo de
imbibición y el nivel de concentración aplicado (Figura 2).
49

Cuadro 5. Comparación de medias de variables fisiológicas evaluadas en


semillas de C. sativus tratadas con dosis bajas y altas de NPsCu, durante dos
FV VIG GERM PA SSG LV LR
(%) (%) (%) (%) (cm) (cm)
Concentración
(ppm)
Altas
Testigo 91 a 96 a 4 d 0d 9.1 b 14.1 b
100 56 e 82 b 14 c 4 ab 7.7 b 0 c
200 12 f 16 c 77 b 7a 5.2 c 0 c
300 14 f 15 c 80 b 5 bc 5.3 c 0 c
400 0 g 4 d 96 a 0d 5.2 c 0 c
500 0 g 0 d 97 a 3 cd 0 d 0 c
Tukey (α= 0.05) 3.6 4.3 6.2 3.8 4.1 7.5

Bajas
Testigo 89 b 94 a 5d 1 cd 9.1 ab 13.7 b
5 80 bc 92 a 7 cd 1 cd 9.7 a 15.0 ab
10 75 c 92 a 5 cd 1 bcd 9.1 ab 14.7 ab
20 76 c 94 a 5d 1 bcd 8.9 b 14.4 b
50 76 c 93 a 6d 1 bcd 9.5 a 15.5 a
100 66 d 95 a 4d 1 bcd 9.2 ab 15.5 a
Tukey (α= 0.05) 7.8 6.1 6.5 3.9 0.9 0.7

Tiempo
12 h 58 a 66 a 31 b 3a 9.6 a 16.3 a
24 h 47 b 62 b 36 a 2a 10.0 a 13.7 b
Tukey (α= 0.05) 1.8 1.4 1.5 1.4 0.2 0.8

Dosis
Bajas I 76 a 93 a 6b 1b 9.3 a 15.0 a
Altas II 29 b 35 b 61 a 4a 7.4 b 14.3 a
Tukey (α= 0.05) 10.7 11.5 11.3 1.2 0.3 0.6

Media general 52.6 64 33.6 2.2 7.2 8.5


periodos de imbibición.
Medias con letras iguales en cada columna son estadísticamente iguales (Tukey, α= 0.05); CONC=
Concentración; VIG= Vigor; GERM= Germinación; PA= Plántulas anormales; LV= Longitud de vástago;
LR= Longitud de radícula; ppm= Partes por millón; h= Horas; cm= Centímetros.
50

100
90
80
70
1a 12h
60
1a 24h
50
%

2b 12h
40
2b 24h
30
20
10
0
VIG GERM PA SSG

Figura 2. Efecto de dos dosis de NPsCu aplicadas en semillas de C. sativus:


dosis bajas a 12 h (1a 12 h), y 24 h de imbibición (1a 24 h); y dosis altas a 12 h
(2b 12 h) y 24 h (2b 24 h) de imbibición.

Los resultados anteriormente descritos demostraron que las NPsCu a bajas


concentraciones solo promueven el vigor con respecto al crecimiento de
plántulas, si las semillas pasan por periodos cortos de imbibición y que a
medida que aumenta las concentraciones el vigor se ve afectado de forma
progresiva, sin embargo los porcentajes de germinación y longitud de vástago
se mantienen constantes con respecto al control, mientras que la LR se vio
afectada conforme el tiempo de imbibición, y la aplicación de altas
concentraciones de NPsCu provocando toxicidad y esta es expresada con la
inhibición del crecimiento de raíces principales y brotes color pardo. Es posible
que el cobre al no afectar significativamente el porcentaje de germinación y la
longitud de vástago a dosis bajas, se debe al hecho de que la planta requiere
mínimas cantidades a este elemento, sin embargo, aunque el cobre en un
micronutriente que participa en numerosos procesos fisiológicos, y es un
cofactor esencial para muchas metaloproteínas, surgen daños cuando el
exceso de cobre está presente en las células y es expresado con la inhibición el
crecimiento de plántulas, principalmente de raíces, y además deteriora
51

importantes procesos celulares. Los hallazgos encontrados en el presente


estudio son similares a los reportados por Liu et al. (2016), quienes
desarrollaron estudios para determinar si las NPs pueden ser asimiladas por las
plantas como nutrientes o si estas pueden producir respuestas de fitotoxicidad,
evaluaron CuO, iones de Cu y NPsCu a concentraciones basadas en los
requerimientos nutritivos (0, 0.02, 0.04, 0.4, 4 y 8 ppm) y sus efectos en
semillas de Lactuca sativa L., determinando que el CuO es ligeramente más
tóxico que los iones de Cu, y que las NPsCu no suprimieron significativamente
el porcentaje de germinación a concentraciones de 0.02 a 8 ppm, pero
redujeron la longitud de la raíz en todas estas concentraciones, lo que indicó
una toxicidad directa por las NPsCu sobre las plántulas, con ello se trató de
establecer los rangos de tolerancia a la fitotoxicidad de algunos elementos
específicos en especies de importancia económica. Otros investigadores
coinciden con estos resultados como Stampoulis et al. (2009), quienes al
evaluar NPsCu y su contraparte a granel (polvo) (1000 mg L-1) y su efecto en la
germinación, elongación de raíz y biomasa en semillas de Cucurbita pepo,
observaron que ninguno de los tratamientos afecto la germinación, pero las
NPsCu presentaron una reducción considerable (77 %) de la longitud de raíces
y por ende una reducción de biomasa de 90 %, con respecto al control. De
forma similar Lee et al. (2008), han demostrado que NPsCu a concentraciones
<200 mg L-1 afectan el crecimiento (reducción) de plántulas de Phaseolus
radiatus y Triticum aestivum, y a 800 mg L -1 se encontró que la reducción de la
longitud se presentó principalmente en las raíces, concluyendo que la longitud
de plántulas se relacionó negativamente con la concentración de exposición, y
se demostró que la raíz es la parte más sensible a la toxicidad a comparación
del crecimiento del brote, debido a que la absorción de NPs ocurre durante la
absorción de humedad y absorción de nutrientes. Con ello coinciden Yasmeen
et al. (2015), que comprobaron el efecto inhibitorio de NPsCu adicionadas
mediante tres métodos a semillas de Triticum aestivum L., concluyendo que
estas NPs no son buenas candidatas como promotores del crecimiento.
52

1.16 BIOENSAYO II. Efecto de nanopartículas NPsFe2O3 y micropartículas


MPsFeSO4 a bajas concentraciones, en el comportamiento fisiológico de
semillas de Cucumis melo L.
De acuerdo al análisis de varianza, los resultados mostraron diferencias
significativas entre los tratamientos evaluados, para las variable vigor (VIG),
longitud de vástago (LV) y longitud de radícula (LR) (P< 0.01), y para
germinación (GERM) y plántulas anormales (PA) (P< 0.05) en semillas de C.
melo (Cuadro 6). Estos resultados indican que los tratamientos con NPs y MPs
influyen en la respuesta fisiológica de las semillas en estudio durante el proceso
germinativo, y que su aplicación tiene efectos diferentes.
Cuadro 6. Cuadrados medios y nivel de significancia obtenidos en el análisis de
varianza para variables fisiológicas de semillas de C. melo tratadas con NPs y
MPs, evaluadas en la prueba de germinación.
FV GL VIG GERM PA SSG LV LR
(%) (%) (%) (%) (cm) (cm)
TRAT. 10 501.47** 190.61* 139.56* 48.29ns 77.23** 73.67**

Error 33 33.54 42.06 41.57 31.12 9.43 4.92

C.V (%) 14.20 8.17 63.89 54.21 18.72 15.81

*, ** = Significativo al 0.05 y 0.01 niveles de probabilidad, respectivamente; FV = Fuente de


variación; GL= Grados de libertad; CV= Coeficiente de variación; VIG= Vigor; GERM=
Germinación; PA= Plántulas anormales; SSG= Semillas sin germinar; LV= Longitud de vástago;
LR= Longitud de radícula; TRAT.= Tratamiento.

Comparación de medias
En el Cuadro 7 se presenta la comparación de medias de las variables
evaluadas en la prueba de germinación de semillas tratadas con NPsFe2O3
(Tukey α= 0.05), mostrando para la variable VIG medias estadísticamente
diferentes entre tratamientos, y que todos los tratamientos presentan
porcentajes de vigor inferiores al testigo, excepto los tratamientos de 1 y 5 ppm
de NPs superando al testigo en un 14 y 6 %, respectivamente. Estos resultados
permiten deducir que existe diferencia en la respuesta en la aplicación de
nanopartículas de hierro y de sulfato ferroso durante la fase de imbibición de la
53

germinación, logrando promover el vigor de germinación de semillas de melón,


a concentraciones bajas, siendo más recomendable la aplicación de NPs que
de MPs. En lo que respecta a la variable GERM, los mejores resultados se
obtuvieron con tratamientos de 0.5 y 50 ppm (NPs) aumentando en un 10 y 12
% respectivamente, y con 0.5, 5, y 10 ppm (MPsFeSO4) incrementando 12, 11 y
10 %, respectivamente, con respecto al testigo (Figura 3). Estos resultados
permiten establecer una decisión económica acerca de elegir aplicar NPs o
MPs. Por otro lado la aplicación de tratamientos con Fe tanto en forma de NPs
como de MPs, fueron beneficiosos en la reducción del número de PA, a un valor
mínimo de 4%. En la variable LV se observó un aumento, siendo los
tratamientos con 5 ppm (NPs), 5 y 10 ppm (MPs), los que superan al testigo con
2.1, 2.4 y 2.3 cm, respectivamente, y finalmente la LR fue promovida de manera
substancial en comparación con el testigo, logrando las longitudes máximas con
tratamientos de 5 y 10 ppm de MPs, aumentando 3.2 y 3.4 cm, respectivamente
(Figura 4).
Cuadro 7. Comparación de medias de las variables fisiológicas evaluadas en
semillas de melón tratadas con NPs y MPs de hierro.

VIG GERM PA SSG LV LR


(%) (%) (%) (%) (cm) (cm)
Partícula (ppm)
NPsFe2O3
Testigo 41 c 73 d 19 a 8 e 5.1 b 9.2 c
0.5 35 de 83 a 8 d 9 e 6.6 ab 11.5 ab
1 55 a 77 bc 13 c 10 de 5.9 ab 10.4 bc
5 47 b 80 b 16 b 4 f 7.2 a 12.2 a
10 43 bc 77 c 11 c 12 bc 6.3 ab 10.7 bc
50 11 g 85 a 5 ef 10 de 5.9 ab 11.7 ab

MPsFeSO4
0.5 35 e 85 a 7 de 8 e 5.9 ab 12.0 a
1 40 cd 72 de 15 b 13 ab 5.4 b 9.7 bc
5 39 cd 84 a 4 f 12 bc 7.5 a 12.4 a
10 24 f 83 a 6 ef 11 a 7.4 a 12.6 a
50 39 cd 70 e 16 b 14 a 5.4 b 9.5 c

Media general 40.7 79.3 10 10.4 6.2 11.1


Tukey (α= 0.05) 14.1 15.8 15.7 13.8 1.5 2.2
Medias con letras iguales en cada columna son estadísticamente iguales (Tukey, α= 0.05);
VIG= Vigor; GERM= Germinación; PA= Plántulas anormales; LV= Longitud de vástago; LR=
Longitud de radícula; ppm= Partes por millón; cm= Centímetros.
54

100
NPs MPs
90
80
70
Porcentaje

60
50
40
30
20
10
0
0 0.5 1 5 10 50 ppm 0.5 1 5 10 50
VIG GERM PA

Figura 3. Efecto de NPsFe2O3 y MPsFeSO4 en bajas concentraciones como


promotor de la germinación de semillas de C. melo.

14 NPs MPs
12

10
Longitud (cm)

8
LV
6 LR
4

0
0 0.5 1 5 10 50 0.5 1 5 10 50
ppm

Figura 4. Aumento de la longitud de radícula y de vástago, estimulada por la


aplicación de NPsFe2O3 y MPsFeSO4, en semillas de C. melo L.
Resumiendo los resultados obtenidos en el bioensayos II, todos los tratamientos
con NPs mejoraron la expresión de las variables vigor del desarrollo de
plántulas (LV) y germinación, al igual que los tratamientos con MPs (0.5, 5 y 10
ppm). Lo que demuestra que es posible mejorar la expresión de la germinación
de la semilla al aplicar tratamientos con bajas concentraciones en ambas
formas del fierro y por ende, sería posible resolver algunos problemas de
55

deficiencias de este elemento en cultivos agrícolas que crecen en tipos de


suelos donde es difícil su asimilación.
Se han realizado investigaciones de NPs de Fe en especies diferentes, como es
el caso del lino, trébol rojo y trébol blanco, en el que al aplicar 100, 250 y 500
ppm se observó la promoción de la germinación, sin embargo, en cebada, lino y
ryegrass al aplicar 2000 y 5000 ppm se inhibe completamente la germinación; y
con 300 ppm en cebada solo se alcanza a reducir el porcentaje de germinación,
pero al incrementar la concentración >1500 ppm tanto en la cebada como en el
lino y el ryegrass no hay germinación, de esta manera sugieren que es afectiva
la aplicación de NPs de Fe, siempre y cuando sean concentraciones bajas y se
demuestra que el efecto es diferente para cada especie agrícola (El-Temsah y
Joner, 2010). Otros investigadores han demostrado que la aplicación de NPs a
bajas concentraciones mejora la respuesta fisiológica de la planta, debido a la
ventaja del tamaño de las NPs sobre el tamaño de sus homólogos iónicos,
como por ejemplo Zheng et al. (2005), indicaron que debido al tamaño de
NPsTiO2 podría haber aumentado la absorción de nutrientes inorgánicos,
acelerando la descomposición de sustancias orgánicas y también provocado el
apagado de ERO, y establecen que la clave para aumentar la tasa de
germinación de semillas es la penetración de nanomateriales en la semilla.
Coincidiendo con ello Khodakovskaya et al. (2009), informaron que los
nanotubos de carbono (CNT) penetran las semillas de tomate, afectando su
germinación y tasa de crecimiento, donde la germinación era dramáticamente
más alta para las semillas que germinaban en medio que contenía CNT (10-40
μg / ml), en comparación con el control, también indicaron que los CNT pueden
penetrar la capa gruesa de la semilla y soportar la absorción de agua dentro de
las semillas, un proceso que puede afectar la germinación y el crecimiento de
las plántulas de tomate. Del mismo modo Dehkourdi et al (2015), evaluaron los
efectos de NPsTiO2 aplicadas por imbibición a semillas de Capsicum annuum L.
a cuatro concentraciones (3.5, 5.5, 7.5 y 9.5 %) durante 24 y 48 horas,
examinaron el porcentaje de germinación, el índice de germinación, la longitud
de la radícula y de la plúmula, peso fresco de las plántulas y el índice de vigor,
56

observaron que al 7.5 % de concentración de NPsTiO2 causó un aumento


significativo en todas las variables evaluadas, atribuyendo que los resultados
fueron favorables debido al tamaño de las NPs, además de un aumento de
penetración de agua durante los diferentes tiempos de imbibición.
1.17 BIOENSAYO III. Comportamiento fisiológico de semillas de Cucumis
melo L., debido a la aplicación de nanopartículas de NPsFe2O3 y
micropartículas de MPsFeSO4 a concentraciones medias.
En el Cuadro 7 se muestran los cuadrados medios del análisis de varianza, en
el que arrojó que existen diferencias significativas en la FV concentración, para
las variables IVE, LV (P< 0.01) ambas relacionadas con el vigor de la
germinación de la semillas, y LR (P< 0.05). En lo que respecta a interacciones,
mostró diferencias a P< 0.05 en todas las variables con excepción de LV (P<
0.01). Con ello se demostró que con la aplicación de NPs y MPs de la misma
naturaleza a concentraciones medias, es posible obtener resultados diferentes
al testigo.
Cuadro 8. Cuadrados medios y nivel de significancia de variables fisiológicas de
semillas de C. melo tratadas con NPs y MPs a concentraciones medias (0,10,
50 y 100 ppm).

FV GL VIG GERM PA SSG IVE LR LV


(%) (%) (%) (%) (cm) (cm)
Conc. 3 19.3 ns 27.3 ns 23.3 ns 32.6 ns 1.70** 36.0* 44.2**
Part. 1 18.0 ns 18.0 ns 32.0 ns 2.0 ns 0.45* 0.4 ns 37.2 ns
Conc.*Part. 3 56.6* 86.0* 93.3* 72.6* 0.67* 46.3* 23.4**
Error 682 9.6 21.6 24.6 16.0 0.13 7.6 2.7
CV (%) 13.9 5.3 68.5 64.0 14.7 20.0 28.4

*, ** = Significativo al 0.05 y 0.01 niveles de probabilidad, respectivamente; FV = Fuente de


variación; GL= Grados de libertad; CV= Coeficiente de variación; VIG= Vigor; GERM=
Germinación; PA= Plántulas anormales; SSG= Semillas sin germinar; Part.= Partícula; Conc.=
Concentración; cm= Centímetros.
57

Comparación de medias
De acuerdo con la comparación de medias (Tukey, α= 0.05), en la FV
concentración ninguna variable mostró diferencias estadísticas entre los
tratamientos, con excepción del IVE y LV. En el que para la variable IVE se
observó índices más altos con respecto al testigo a concentraciones de 10 y 50
ppm. Mientras que para la variable LV a concentraciones de 10 y 50 ppm,
superó al testigo con 0.90 y 0.55 cm, respectivamente, y en la FV partícula, la
mejor partícula fue NPs a 10 ppm (Cuadro 8).

Cuadro 9. Comparación de medias de variables evaluadas en semillas de C.


melo tratadas con NPs y MPs, bajo condiciones de laboratorio.
Medias con letras iguales en cada columna son estadísticamente iguales (Tukey, α= 0.05); CONC=

VIG GERM PA SSG IVE LR LV


(%) (%) (%) (%) (cm) (cm)
Partícula
NPs 21.5 a 86.0 a 8.2 a 6.0 a 2.3 a 13.7 a 6.1 a
MPs 23.0 a 87.5 a 6.2 a 6.5 a 2.5 a 13.7 a 5.6 b

Tukey (α= 0.05) 2.2 3.3 3.6 2.9 0.2 0.4 0.2

Concentración
(ppm)
Testigo 23 a 86 a 8 a 6a 2.0 b 13.9 a 5.5 b
10 24 a 86 a 6 a 8a 2.7 a 13.4 a 6.4 a
50 23 a 86 a 10 a 4a 2.0 b 13.3 a 6.0 a
100 20 a 90 a 6 a 4a 2.9 a 13.3 a 5.2 b

Tukey (α= 0.05) 4.2 6.4 6.8 5.5 0.5 7.2 3.6
Media general 22.2 86.7 7.5 5.5 2.4 13.7 5.8
Concentración; VIG= Vigor; GERM= Germinación; PA= Plántulas anormales; SSG= Semillas sin germinar;
IVE= Índice de velocidad de emergencia; LV= Longitud de vástago; LR= Longitud de radícula; ppm=
Partes por millón; cm= Centímetros; NPs= Nanopartículas; MPs= Micropartículas.

En cuanto a interacciones, el porcentaje de germinación se incrementó 6 y 8 %


con los tratamientos de 50 y 100 ppm (MPs), respectivamente (Figura 5), para
la variable IVE el tratamiento con 100 ppm de MPs superó al testigo (Figura 6).
De igual forma, para LV los tratamientos de 10 y 50 ppm de NPs superan al
testigo por 1.58 y 0.98 cm, respectivamente (Figura 7).
58

NPs MPs
100
90
80
70 VIG
60 GERM
50
%

PA
40
30
20
10
0
0 10 50 100 ppm 0 10 50 100

Figura 5. Comportamiento de la germinación como respuesta a la aplicación de


dos tipos de partículas y cuatro concentraciones (0, 10, 50 y 100 ppm) de fierro.

4 4

3.5 3.5

3 3

2.5 2.5
IVE

IVE

2 2

1.5 1.5

1 1
0.5 0.5
0 0
0 10 50 100
A ppm 0 10 50 100
B
0 10
ppm
50 100
NPs MPs

Figura 6. Respuesta del IVE bajo efecto de la interacción entre tipo de partícula
(NPs y MPs) y concentración (A), e IVE obtenidos por concentración utilizada
(B).
59

8 8

7 7

Longitud de vástago (cm)


Longitud de vástago (cm)

6 6

5 5

4 4

3 3

2 2

1 1

0 0
0 10 50 100 0 10 50 100
A 0 10 ppm 50 100 B NPs MPs
Figura 7. Efecto de diferentes concentraciones (A) y su interacción con tipo de
partícula (NPs y MPs) en la longitud de vástago de plántulas de C. melo L.

En resumen los resultados del bioensayo III, arrojó que a concentraciones de 50


y 100 ppm de MPs mejoran el porcentaje de germinación, mientras que a 10 y
50 ppm de NPs favorecen el crecimiento de las plántulas, lo que sugiere que
diferentes fuentes de hierro a concentraciones apropiadas es efectivo como
micronutriente para mejorar la germinación y el vigor de crecimiento en las
plántulas, por lo que ambos tienen efectos fertilizantes. Considerando que los
requerimientos de hierro para las plantas exceden los de todos los demás
micronutrientes, excepto el cloruro, por lo tanto, la deficiencia de hierro es más
común en suelos neutros a alcalinos y arenosos y es difícil de corregir mediante
la fertilización con Fe inorgánico debido a una rápida conversión a formas
insolubles y una absorción reducida (Fageria, 2009). Por lo que, se sugiere que
el desarrollo de fertilizantes con NPs de Fe es una estrategia importante para
remediar la deficiencia de Fe y aumentar la eficacia de la fertilización en los
agroecosistemas.
Los resultados obtenidos en el presente estudio son similares a los encontrados
por Liu et al. (2016), que al estudiar óxido de hierro y su contraparte iónica a
concentraciones bajas de 1 a 50 ppm, encontró que NPs de hierro tienen
efectos positivos en la germinación obteniendo 76 a 91 %, y que a
60

concentraciones de 5 a 20 ppm se incrementó la longitud del tallo a 24 y 30.5


mm con respecto al control y de esta manera sugiere que NPs de óxido de
hierro a bajas concentraciones no ejercen toxicidad, pero mejoran el
crecimiento de plántulas de Lactuca sativa L. De igual forma Shankramma et al.
(2015), estudiaron el efecto de NPsFe2O3 (50, 100, 200, 400 y 800 mg L-1) en
semillas de Solanum lycopersicum, y encontraron que se mejoró la germinación
a 93 y 97 % (con 50 – 200 mg L-1), mientras que el crecimiento de brotes y raíz
aumentan al incrementar de forma gradual las concentraciones, y que el vigor
se vio afectado positivamente (50 mg L-1) con respecto al testigo. En otros
estudios se ha encontrado que al evaluar NPsFe2O3 en Arachis hypogaea fue
posible incrementar la longitud de radícula aplicando tratamientos de 50 – 1000
mg kg -1, además de promover el crecimiento de la altura de planta y
acumulación de biomasa, esto al comparar NPs contra EDTA-Fe, y se
determinó que las NPsFe2O3 resultaron ser buenos candidatos para reemplazar
algunos fertilizantes de Fe de uso convencional para esta especie en específico
(Riu et al., 2016). De igual forma, estudios recientes sugieren el uso de NPs
como fertilizantes efectivos para la adición de Fe como Delfani et al. (2014), que
informaron que la aplicación foliar de 500 mg L-1 de NPs de Fe a guisantes
aumentó significativamente el número de vainas por planta en un 47 %, peso de
1000 semillas (7 %) y el contenido de Fe en hojas (34 %). Por otra parte, se
sabe que el sulfato de hierro sirve para acidificar y adicionalmente para aportar
algo de Hierro, aunque no mucho y su principal función es para bajar el pH y
tiene la propiedad de que en agua se disocia en "Sulfato" y "Hierro", lo que
permite deducir que por ello muestra resultados similares al NPsFe2O3 pero
utilizado a mayores concentraciones. Es pertinente realizar más estudios
comparativos de las diferentes fuentes de Fe, ya sean en quelatos o sulfatos en
condiciones que permitan esclarecer cuál de ellos permiten una mejor adición
de Fe a las plantas y de esta manera incursionar en la nanoformulación de
fertilizantes para este elemento y especie agrícola en específico.
61

1.18 BIOENSAYO IV. Efecto de NPsFe2O3 en la germinación y vigor de


semillas de Cucumis sativus L., bajo condiciones in vitro.
Los resultados estadísticos (ANVA) se muestran en el Cuadro 9 e indican que
existe diferencias significativas para las variables IVE, PS, LV, LR (P< 0.01),
VIG y GERM (P< 0.05). Lo que revela que los tratamientos utilizados bajo
condiciones in vitro son favorables para mejorar la expresión de semillas con
bajo vigor y germinación (53 %) inicial.
Cuadro 10. Cuadrados medios y nivel de significancia estadística de variables
avaluadas bajo condiciones in vitro de semillas tratadas con NPs Fe2O3.
FV GL VIG GERM PA SSG IVE PS LV LR
(%) (%) (%) (%) (mg/pta) (cm) (cm)
TRAT 10 680.0* 366.0* 96.0 ns 124.0* 1.6** 0.01** 61.3** 28.5**

Error 33 134.0 80.0 52.0 34.0 0.16 0.03 1.97 1.87

C.V (%) 28.9 9.8 138 161.9 12.7 13.2 21.3 17.9
*, ** = Significativo al 0.05 y 0.01 niveles de probabilidad, respectivamente; FV = Fuente de
variación; GL= Grados de libertad; CV= Coeficiente de variación; VIG= Vigor; GERM=
Germinación; PA= Plántulas anormales; SSG= Semillas sin germinar; IVE= Índice de velocidad
de emergencia; PS= Peso seco; LV= Longitud de vástago; LR= Longitud de radícula; mg/pta =
Miligramos por plántula.

Comparación de medias
La comparación de medias mediante la Prueba de Tukey (α= 0.05) arrojó que
para las variables VIG, GERM, PS, LV y LR existe diferencia estadística entre
los tratamientos (Cuadro 10), donde para la variable VIG se observó un
aumento del 24 %, con respecto al control (con 500 ppm); mientras que para la
variable GERM superó al testigo en un 8 % (con 50 ppm) y se incrementa un 47
% comparado con la germinación inicial del material (53%, obtenido del estudio
preliminar de germinación) (Figura 8). En el caso de la variable LR el
tratamiento con 500 ppm superó al testigo al aumentar 2 cm (Figura 9); de igual
manera para la variable LV se obtuvo un incremento de 2.4 y 2.1 cm con los
tratamientos de 50 y 500 ppm, respectivamente; mientras que el IVE se duplicó
al aplicar 50 ppm, con respecto al control y finalmente se detectó un aumento
en la acumulación de biomasa superior al testigo con 100 y 500 ppm en un 99.6
y 82 mg/pta, respectivamente.
62

Cuadro 11. Comparación de medias para variables fisiológicas evaluadas en el


ensayo de germinación in vitro de semillas de C. sativus tratadas con
NPsFe2O3.
IVE VIG GERM PA SSG PS LV LR
(%) (%) (%) (%) (mg/pta) (cm) (cm)
Conc.
(ppm)
Testigo 2.44 c 30 bc 88 ab 4 a 8 a 110.0 b 5.4 b 7.0 b

50 4.02 a 38 abc 100 a 0 a 0 a 114.2 b 7.8 a 7.0 b


100 2.94 bc 28 c 78 b 12 a 10 a 209.6 a 5.2 b 7.1 b
200 3.34 ab 50 ab 94 ab 6 a 0 a 72.2 c 6.6 ab 7.9 ab
500 3.30 ab 54 a 96 a 4 a 0 a 192.8 a 7.5 a 9.0 a

Tukey 0.7 21.9 16.9 13.6 11 0.3 0.8 0.4


(α= 0.05)

Media 3.2 40 91.2 5.2 3.6 139.7 6.5 7.6


general
Medias con letras iguales en cada columna son estadísticamente iguales (Tukey, α= 0.05);
Conc.= Concentración; VIG= Vigor; GERM= Germinación; PA= Plántulas anormales; SSG=
Semillas sin germinar; IVE= Índice de velocidad de emergencia; PS= Peso seco LV= Longitud
de vástago; LR= Longitud de radícula; ppm= Partes por millón; cm= Centímetros.

100
90
80
70
Porcentaje

60
50
40
30
20
10
0
0 50 100 200 500
ppm
VIG GERM PA SSG

Figura 8. Comportamiento de vigor y germinación se semillas sembradas bajo


condiciones in vitro y tratadas con NPsFe2O3.
63

10
9
8
7
Longitud (cm)

6
5 LV
4 LR
3
2
1
0
0 50 100 200 500
ppm

Figura 9. Respuesta de longitud de vástago y radícula por efecto de NPsFe2O3


bajo condiciones in vitro.
Los resultados obtenidos en este bioensayo concuerdan con otros autores
anteriormente mencionados (Liu et al., 2016; Shankramma et al., 2015; Delfani
et al., 2014) y permite intuir que es posible que las NPsFe2O3 en las condiciones
adecuadas estén biodisponibles y estas sean transportadas y asimiladas por la
planta. Tomando en cuenta que la germinación en medio de cultivo permitió que
las condiciones abióticas se controlaran de mejor manera y con ello los
resultados sean más confiables. Investigadores han comprobado que las NPs
de Fe pueden ser absorbidas y transportadas por plántulas de Critrullus lanatus,
por lo que es posible que se encuentren biodisponibles para ciertas especies
bajo condiciones específicas (Li et al., 2013). De igual manera, se ha
demostrado que NPsFe2O3 son fácilmente absorbidas y transportadas durante
la fase de imbibición y que esto coadyuva a acelerar el proceso germinativo (Lin
y Xing, 2007), asimismo, estudios en Cucurbita máxima sugieren que además
se pueden absorber, traslocar y acumular en algunos tejidos de la planta sin
afectar su fisiología de forma negativa (Zhu et al., 2008). Se cree que este
estudio aporta información para futuras investigaciones con NPs con nutrientes
y especies agrícolas específicas, y de esta manera establecer su efecto
potencial como nutriente o bien como ion fitotóxico. Con este bioensayo, para
NPsFe2O3 se descarta su potencial fitotóxico, concordando con Riu et al.
(2016), Bombin et al. (2015); Alidoust e Isoda (2014).
64

1.19 BIOENSAYO V. Pruebas bioquímicas para la determinación de la


producción de estrés oxidativo, mediante la cuantificación de la
activación del sistema antioxidante enzimático y la producción de prolina
en plántulas tratadas con NPsFe2O3 y MPsFeSO4.
Estado antioxidante
1. Cuantificación de Ascorbato Peroxidasa (APX).
La cuantificación realizada en plántulas tratadas con NPsFe2O3 y MPsFeSO4 a
diferentes concentraciones mostró que, en tratamientos con 10 y 0.5 ppm de
NPs y MPs respectivamente, aumentaron la actividad de APX hasta 10 veces
con respecto al testigo, además, en los tratamientos con MPs el APX decreció
exponencialmente. Es posible relacionar estos resultados con el bajo porcentaje
de vigor obtenidos con dichos tratamientos, además, de observar un incremento
en el crecimiento de la radícula, lo cual es ampliamente identificado como una
respuesta a la fitotoxicidad en ciertos elementos, ya sean en NPs o MPs
(Bioensayo II). Por otro lado, al aumentar las concentraciones de 0 a 100 ppm
(Bioensayo III), los tratamientos con NPs mantuvieron la actividad enzimática
cercana a la registrada en el control, mientras que con tratamientos de 50 ppm
(MPs) la actividad enzimática aumento al doble (9 µmol de APX) con respecto
al testigo (Figura 10).

Bioensayo II Bioensayo III

Figura 10. Cuantificación de APX en plántulas de Cucumis melo tratadas con


NPsFe2O3 y MPsFeSO4 a concentraciones de 0 a 100 ppm.
65

2. Cuantificación de Peroxidasas (POD)


Se observó mayor actividad enzimática en la parte aérea de las plántulas
evaluadas, siendo el tratamiento con 50 ppm de MPs el que supero al control
hasta un 60 %, seguido de los tratamientos con 10 ppm de ambas partículas
(NPs y MPs) con 29 y 28 %, respectivamente. En la zona de raíz la mayor
actividad enzimática se registró con tratamientos de 50, 10 y 5 ppm (MPs)
aumentando en un 75, 17 y 11 %, respectivamente, y 24 y 33 % (con 0.5 y 10
ppm de NPs), con respecto al control (Bioensayo II). Por otro lado al aplicar
tratamientos de 0 a 100 ppm de NPs y MPs (Bioensayo III), la actividad
enzimática se mantuvo por debajo del control, tanto en la parte aérea como en
la raíz (Figura 11).

Bioensayo II Bioensayo III

Figura 11. Cuantificación de POD en parte aérea y raíz de plántulas de C. melo,


tratadas con NPsFe2O3 y MPsFeSO4 a concentraciones de 0 a 100 ppm.
Cuantificación de Prolina
La producción de prolina fue registrada como µg de prolina por miligramo de
peso fresco, y durante su cuantificación los niveles más altos se obtuvieron en
la parte aérea de las plántulas evaluadas.
NPsFe2O3: Al aplicar concentraciones de 0 a 50 ppm (Bioensayo II), en
tratamientos con NPs no hubo incremento del aminoácido en las raíces (Figura
12), pero en la parte aérea se registró un aumento de 444.2 µg (50 ppm) con
respecto al control. Por otro lado al aplicar tratamientos de 0 a 100 ppm
66

(Bioensayo III), en las raíces se observó un ligero incremento en todos los


tratamientos con 170, 92.1 y 60 µg, con respecto al control (Figura 13). En la
parte aérea se observó un aumento de 437.5 y 241.8 µg con los tratamientos de
10 y 50 ppm, respectivamente.
MPsFeSO4: Dentro de los tratamientos a bajas concentraciones de 0 a 50 ppm
(Bioensayo II), con los tratamientos de 1 y 10 ppm incrementaron los niveles de
prolina a 305, 313 (raíces), 180 y 855 µg (parte aérea), respectivamente, y con
respecto al testigo (Figura 12). En los tratamientos de 0 a 100 ppm (Bioensayo
III), en la raíz y parte aérea se registró un incremento del aminoácido (con 50 y
100 ppm) de 564 y 242 µg (raíz) y 685 y 290 µg (parte aérea) superando al
testigo (Figura 13).

Bioensayo II

Figura 12. Microgramos de prolina por peso fresco de material vegetal,


cuantificado en plántulas de C. melo sometidas a tratamientos de fierro en su
forma de NPs y MPs en bajas concentraciones.
67

Bioensayo III

Figura 13. Microgramos de prolina por peso fresco de material vegetal,


cuantificado en plántulas de C. melo sometidas a tratamientos de fierro en su
forma de NPs y MPs a concentraciones de 0 a 100 ppm.
A partir de estos resultados, se puede establecer que es posible que las plantas
podrían tolerar una menor concentración de NPs y MPs, mejorando las
actividades de enzimas antioxidantes que eliminan ERO y, como resultado,
logran un equilibrio entre la formación de ERO y la desintoxicación celular, de
manera que, es posible que el hierro en cualquiera de sus formas es asimilado
por las plántulas sin causar alta toxicidad que provoque un estallido oxidativo,
descartando al fierro como un ion nanotóxico significativo para especies del
género Cucumis, esto podría deberse a que el hierro es un elemento de poca
movilidad dentro de la plantas, también tiende a quedar precipitado en las
soluciones, por lo que su absorción podría ser mínima, además, considerando
que es un micronutriente y que a pesar de que en promedio una planta lo
requiere de 1 a 5 mg L-1, la planta no lo detecta ni como exceso ni como
deficiencia, y se ha reportado que los requerimientos varían entre cada etapa
fisiológica (Salas, 2002). Por otro lado la mayoría de la actividad enzimática y
producción de prolina se presentó en las partes aéreas de la plántula y aunque
se sabe que a pesar de que las hojas representan la relación entre el contenido
de nutrimentos en los tejidos (foliares) y el rendimiento de un cultivo, el análisis
68

químico de los tejidos requiere de investigación previa para determinar la


reacción del rendimiento ante cambios en la concentración de nutrimentos en
los tejidos (Salisbury y Ross, 1992). Por lo que es de suma se detecta en esta
área de la plántula (parte aérea) y con ello determinar de qué manera esto
afectaría los rendimientos deseados mediante la aplicación de NPs de fierro.
Por lo tanto se estima que la absorción y translocación del fierro en cualquiera
de sus formas es lenta y ello puede contribuir a un nivel moderado de estrés.
Aldama et al. (2009) al realizar un estudio de comportamiento
superparamagnético de hematita y magnetita, determinaron que debido al
tamaño de las NPs y a su comportamiento magnético, muestran alta tendencia
a la formación de agregados y se podría evitar si las NPs se dispersaran en
presencia de un agente surfactante (ácido oleico por ejemplo), y se recubrieran
con un material polimérico.
Los nanomateriales son considerados un factor de estrés en las plantas, ya que
se cree que pueden modificar la función y estructura de las membranas y pared
celular en plantas (Liu et al., 2013). Además se ha demostrado que las NPs
metálicas, son capaces de producir estrés generando niveles elevados de ERO
las cuales afectan biomoléculas esenciales para el funcionamiento óptimo de
las plantas (Rico et al., 2015). De acuerdo con lo anterior, se ha reportado que
las NPs de óxido de metal y metal (ion) causaron estrés oxidativo en las plantas
al producir especies reactivas de oxígeno (ERO), debido a que las NPs de
metales y óxidos metálicos al disolverse pueden liberar iones que pueden
interactuar con diferentes grupos de proteínas y desencadenar la formación de
ERO (Riswan et al., 2011). Actualmente se han realizado investigaciones que
permitan esclarecer la relación entre las concentraciones de NPs y la
producción de ERO como respuesta a dichas partículas, cuantificando el
sistema antioxidante enzimático y no enzimático, además de la producción de
prolina como respuesta al estrés. Las NPsFe2O3 han surgido como un método
innovador y prometedor para la adición de hierro en los sistemas agrícolas, sin
embargo, existe la posibilidad de toxicidad por NPsFe2O3, por lo que se ha
investigado su absorción y distribución en algunas especies como el maíz (Zea
69

mays L.), donde se determinó su impacto en la germinación, la actividad de


enzimas antioxidantes, el contenido de malondialdehído (MDA) y el contenido
de clorofila, y se ha demostrado que es posible promover la elongación de raíz,
aumentar el índice de germinación e índice de vigor, y en lo que respecta a las
enzimas antioxidantes, se observó evidencia de ellas específicamente en la raíz
al utilizar NPsFe2O3 a concentraciones de 50 y 100 mg/ L-1; también
encontraron que las NPs existían en su mayoría alrededor de la epidermis de la
raíz y no se observó su translocación de las raíces a los brotes (Li et al., 2016).

Con respecto a la prolina es importante su producción en estado de estrés, ya


que es eliminador y secuestrante de ERO, desactiva el oxígeno singlete y
elimina al radical hidroxilo, además puede estabilizar el ADN, proteínas y
membranas, y es considerado como un mediador del ajuste osmótico. Además
su síntesis y degradación puede proporcionar una forma de amortiguar el pH
citosólico equilibrando el estado redox de las celulas (Moreno, 2010; Arora,
2002; Shaw et al., 2013).
Estudios apuntan que el aumento y acomulación de prolina sucede
principalmente en la raíz, y sugieren que existe traslocación de prolina a otras
partes de la planta en condiciones de tensión, de manera que, cuando la parte
aérea demanda más prolina, esta posiblemente provenga de la sintetizada por
las raices (Barcenas y Arguello, 1997). En estudios realizados con NPs
biogénicas, se detectó que se mejoran los niveles de prolina, ácido ascórbico y
se estimuló la producción de enzimas antioxidantes, lo que indicó que se supero
los efectos perjudiciales de las ERO, mejorando el sistema de defensa
antioxidante (Freitas et al., 2011). Por su parte Trujillo et al. (2014), reporta la
baja toxicidad de NPs de Fe comparado con su homólogo iónico. Por otra parte
en lo que respecta a sulfatos, se ha reportado que su aplicación contribuye con
el incremento de los niveles de prolina, com sulfato de cobre en Plantago
psyllium (Mohammadi et al., 2013).
70

CONCLUSIONES

 NPsCu a bajas concentraciones promueven el vigor con respecto al


crecimiento de plántulas, si las semillas pasan por periodos cortos de
imbibición y a medida que aumenta las concentraciones el vigor de
germinación se ve afectado de forma progresiva.
 La aplicación de altas concentraciones de NPsCu provoca toxicidad y
esta es expresada con la inhibición del crecimiento de raíces principales.
 La aplicación de NPsFe2O3 y MPsFe2SO4 en bajas concentraciones
tienen efectos similares para mejorar la germinación y el crecimiento de
plántulas además, que permiten reducir el número de plántulas
anormales.
 Durante la aplicación de NPsFe2O3 y MPsFe2SO4 a concentraciones de
0- 100 ppm, se detectó como la mejor partícula a las NPs a 10 ppm y de
esta forma mejoran el vigor de germinación y favorecen el crecimiento de
plántulas
 La germinación en un medio de cultivo (in vitro) y la imbibición con
NPsFe2O3, mejoran considerablemente la expresión de las semillas de C.
sativus mejorando IVE, germinación, y LV (con 50 ppm) y a 500 ppm
optimizan el vigor, la germinación, la acumulación de biomasa y la
longitud de radícula.
 Se puede intuir que las plántulas podrían tolerar concentraciones <100
ppm de NPs y MPs mejorando las actividades de enzimas antioxidantes
que eliminan ERO y de prolina, como resultado, logran un equilibrio entre
la formación de ERO y la desintoxicación celular.
 NPsFe2O3 pueden resultar mejores para ser utilizadas como
nanofertilizantes y promotores de crecimiento
 Se sugiere estudiar el efecto de NPsCu a bajas concentraciones, durante
periodos de 8 y 12 h de imbibición para determinar un rango más
específico en cuanto a tiempos favorables que permitan niveles óptimos
de germinación y vigor.
71

 También, es preciso un estudio bioquímico de plántulas tratadas con


NPsCu, cuantificar el sistema antioxidante de defensa enzimático y con
ello determinar a que concentraciones se causa un estallido oxidativo, y
de esta manera ampliar el panorama en cuanto la participación de las
NPs en el estrés oxidativo de las plantas.

 con base en los resultados obtenidos en los diferentes bioensayo, se


acepta la hipótesis planteada, la cual se refiere: las nanopartículas
metálicas de óxido de hierro (NPsFe2O3) y de cobre (NPsCu) promueven
procesos metabólicos relacionados con el vigor y germinación, por su
función como cofactores en la activación de algunos sistemas
enzimáticos y desencadenarán procesos bioquímicos, principalmente la
formación de especies reactivas de oxigeno (ERO) como respuesta a la
fitotoxicidad que estas causen.
72

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