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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS E INGENIERÍAS PROGRAMA DE INGENIERIA

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

UNAD

ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS E INGENIERÍAS PROGRAMA DE INGENIERIA DE ALIMENTOS

MODULO DE BIOTECNOLOGÍA ALIMENTARIA

AUTORA: Msc FEDRA LORENA ORTIZ BENAVIDES

TABLA DE CONTENIDO

UNIDAD

1

:

INTRODUCCIÓN

A

LOS

PRINCIPIO

DE

BIOTECNOLOGÍA

4

ALIMENTARIA

 

CAPITULO 1. ASPECTOS GENERALES DE LA BIOTECNOLOGÍA.

 

4

Lección 1. Definiciones de Biotecnología e Historia de la Biotecnología

 

4

Lección 2:

Divisiones de la Biotecnología y Tipos

 

7

Lección 3:

Impacto de la Biotecnología en Colombia y Tendencias Mundiales

 

13

CAPITULO 2. BIOTECNOLOGÍA DE LAS FERMENTACIONES

 

23

Lección 1: Nutrición microbiana.

 

23

Lección 2 Crecimiento microbiano

 

29

Lección 3: Principios de Bioingeniería

 

41

CAPITULO 3 : BIOTECNOLOGIA ENZIMÁTICA

 

47

Lección 1: Las enzimas, biocatalizadores de naturaleza proteínica

 

47

Lección 2

:

Cinética enzimática

 

54

Lección 3 : Producción industrial de Enzimas

 

59

UNIDAD

2

:

PRINCIPIO

DE

INGENIERIA

GENETICA

 

APLICADO

A

LA

70

BIOTECNOLOGÍA

 

CAPITULO 1: TECNICAS UTILIZADAS EN LA MANIPULACIÓN GENÉTICA IN VITRO.

 

71

Lección 1: Tecnología del ADN recombinante

 

72

Lección 2: La reacción en cadena de polimerasa ( PCR)

 

78

CAPITULO 2: OTRAS TÉCNICAS UTILIZADAS EN BIOTECNOLOGIA :

 

81

Lección 1: Mutagénesis

 

81

Lección 2: Mutaciones Dirigidas por Oligonucleotidos

 

81

Lección 3 : Mutagénesis en Casette o interrupción génica

 

83

CAPITULO 3 : APLICACIONES DEL ADN RECOMBINANTE

 

83

Lección 4: Animales transgénicos

 

83

Lección 5: Plantas Transgénicas

 

84

Lección 6: Alimentos genéticamente modificados

 

86

UNIDAD 3 : PRODUCTOS BIOTECNOLÒGICOS DE INTERES ALIMENTARIO

 

88

CAPITULO 1: APLICACIÓN DE LA BIOTECNOLOGÍA EN LA OBTENCIÓN DE PRODUCTOS DERIVADOS DEL METABOLISMO ENERGÉTICO POR VÍA FERMENTATIVA.

88

Lección 1: Bebidas alcohólicas

 

88

Lección 2: Biología de las fermentaciones con levaduras

 

88

Lección 3: Condiciones de la fermentación

 

89

Lección 4 : Compuestos organolépticos

 

91

Lección 5 : Alimentos basados en soja fermentada

 

92

Lección 6 : Productos cárnicos fermentados

 

94

Lección 7 : Vinagre

 

95

lección 8 : acido Láctico

 

96

lección 9: acido Acético

 

96

CAPITULO

2:

COMPUESTOS

OBTENIDOS

A

PARTIR

DE

LA

PRODUCCIÓN

DEL

97

METABOLISMO SECUNDARIO.

 

Lección 1 : Producción de acido cítrico

 

97

CAPITULO 3 ·: PRODUCTOS DERIVADOS DEL METABOLISMO SINTÉTICOS

 

101

Lección 1 : Polisacáridos microbianos y PHAs

 

101

Lección 2 : Alimentos funcionales

 

103

ANEXO PRACTICAS DE LABORATORIO

 

106

BIBLIOGRAFIA

 

120

UNIDAD 1: PRINCIPIOS BÁSICOS DE BIOTECNOLOGÍA

CAPITULO 1. GENERALIDADES DE LA BIOTECNOLOGÍA Lección 1. Definiciones de Biotecnología

Existen diversas definiciones de Biotecnología provenientes de diversos enfoques y puntos de vista, que van desde conceptos más generales hasta particulares. Por ejemplo: “La biotecnología, se ha definido como la aplicación de organismos, componentes o sistemas biológicos para la obtención de bienes y servicios”. Sin embargo, se considera que este enunciado es muy amplio y engloba todas las operaciones de la biología aplicada desde la agricultura hasta la ciencia culinaria.

En un sentido mucho más estrecho, la palabra biotecnología se refiere a veces,

para definir la utilización de la manipulación genética con el fin de obtener la expresión correcta a altos niveles de un gen clonado en células huésped. Así como también la aplicación de la biología molecular en direcciones que se esperan sean de utilidad como el uso de marcadores moleculares para identificar

microorganismos de importancia agrícola. Este enfoque,

supone confundir los

aspectos de moda con los principios de la biotecnología y se debe más a la

filosofía de las agencias de publicidad y medios de comunicación que a la industria.

Según la OTA-USA (1981), la OECD (1982) y la CEPA-Canadá (1985), la biotecnología es la aplicación de la ciencia y la ingeniería en el uso directo o indirecto de organismos vivos o parte de ellos, en sus formas naturales o modificadas, en una forma innovadora para la producción de bienes y servicios o para la mejora de procesos industriales existentes. Desde este punto de vista se evidencia una integración entre las ciencias básicas con las ciencias aplicadas puesto que se pretende emplear de forma controlada y deliberada agentes biológicos sencillos como células vivas o muertas, o componentes celulares en operaciones técnicamente beneficiosas, bien sea de fabricación de productos o como operaciones de servicios.

Para responder a los planteamientos de la anterior definición la biotecnología debe considerarse como un área del conocimiento intensamente interdisciplinar, caracterizada por la reunión de conceptos y metodologías procedentes de numerosas ciencias para aplicarlas tanto a la investigación básica como a la resolución de problemas prácticos y la obtención de bienes y servicios.

Algunas de las ramas de conocimiento implicadas en la biotecnología son: La Microbiología, Embriología, Bioquímica, Genética, Biología celular, Química, Mecánica, Electrónica, Informática. Entre otras.

En conclusión, la biotecnología surge como un espacio de recombinación de conocimiento de diversas áreas del conocimiento que pretende dar soluciones a los problemas relacionados con la medicina, la agronomía, zootecnia, la agroindustria, la ingeniería de alimentos, problemas ambientales, entre otros campos. Es así entonces, que el aporte de la biotecnología se produce en dos etapas, en la primera, la investigación científica básica que se coloca por delante de la innovación tecnológica, exponiendo todo su valor predictivo y transformador, además de su capacidad explicativa. No hay desarrollo en esta rama sin investigación científica. La segunda fase, se caracteriza por el desarrollo de un sistema estandarizado de métodos secuenciales entre los cuales se identifican claramente las relaciones y procedimientos operacionales que condicionan el éxito del proceso.

Lección 2: Historia de la biotecnología

Si bien es cierto, en las primeras etapas de la historia de la humanidad se utilizaron los seres vivos o productos derivados de ellos para atender las necesidades del hombre tales como el vino y el pan, entre otros; estos productos no pueden considerarse como un resultado de procesos biotecnológicos, puesto que en este estadio de desarrollo las fermentaciones son procesos naturales que no involucran la manipulación de los sistemas biológicos para modificar o controlar las propiedades del producto obtenido. Sin embargo, esta es una larga etapa de preámbulo caracterizada por las ideas vitalistas o animistas que desde un enfoque dialéctico motivan el desarrollo de métodos experimentales que buscan predecir, explicar y transformar los fenómenos biológicos para obtención

de bienes

y

servicios,

que

Biotecnología en el siglo XX I.

finaliza con la consolidación

de

la

moderna

Para comprender la historia de la Biotecnología es preciso dividirla en cuatro fases.

Primera época o era precientífica: corresponde a la época anterior a Pasteur y sus comienzos se confunden con los de la humanidad. En esta época, se realizan prácticas empíricas de selección de plantas y animales y sus cruzas, y fermentaciones como un proceso para preservar y enriquecer el contenido proteínico de los alimentos. Este período se extiende hasta la segunda mitad del siglo XIX y se caracteriza como la aplicación artesanal de una experiencia resultante de la práctica diaria. Era tecnología sin ciencia subyacente en su acepción moderna. Como ejemplos concretos cabe mencionar las aplicaciones en :

La domesticación

de plantas

y animales

ya

comenzó en

el período

Neolítico. Las civilizaciones Sumeria y Babilónica (6000 años a.C.) ya conocían cómo

elaborar cerveza. Los egipcios ya sabían fabricar pan a partir del trigo hacia el 4000 a.C.

Antes de la escritura del libro del Génesis, se disfrutaba del vino en el Cercano Oriente: recuérdese que, según la Biblia, Noé "sufrió" (o disfrutó) accidentalmente los efectos de la fermentación espontánea del mosto de la uva (primera borrachera con vino)

Se podría afirmar que esta era pre-científica termina en el siglo XVIII cuando cobra cuerpo la idea de que la materia viva puede ser estudiada como la materia inanimada, es decir, usando el método experimental, con lo que se inicia el lento declive de las ideas vitalistas (creencias erróneas de que "la vida depende de un principio vital irreducible a otras ramas de la ciencia"), que aún darían sus últimos estertores casi al final del siglo XIX.

Segunda época

El trabajo preliminar de los primeros microscopistas, como van Leeuwenhoek y Hooke (siglo XVII), facilitó un par de siglos más tarde, la comprensión, de la verdadera importancia de las células procarióticas y eucarióticas, en procesos relacionados con la fermentación y en el origen de las enfermedades infecciosas.

Un segundo factor contribuyente al nacimiento de la ciencia microbiológica fue el establecimiento de la relación que une ciertas transformaciones químicas que se dan en las infusiones con el crecimiento de los gérmenes en ellas existentes. Cagniard-Latour en 1836, y Schwann y Kützing en 1837 habían sugerido que las levaduras eran las causantes de la fermentación alcohólica por la que el azúcar pasa a alcohol etílico y dióxido de carbono, pero se encontraron con la crítica adversa de los grandes químicos de la época (Berzelius, Wohler y Liebig). Liebig, hacia 1840, había realizado importantes confirmaciones a la "teoría mineral" sobre la nutrición de las plantas, enfrentándose a la "teoría del humus" sostenida por Thaer, asestando un golpe a las ideas vitalistas heredadas de Leibniz. Puesto que se consideraba a las levaduras como plantas microscópicas, se suponía que los procesos de fermentación y putrefacción se debían a fenómenos químicos de descomposición y muerte encuadrables en el marco de la teoría mineral de la fisiología vegetal. Su convencimiento de que toda actividad vital se podía explicar en términos de química y física retrasó por algún tiempo la adscripción de estos fenómenos a células vivas. Fue Pasteur (que, desde sus primeros estudios sobre las propiedades ópticas de los cristales de tartrato, venía suponiendo que estos compuestos tenían un orígen orgánico) quien de nuevo intervino en el debate de forma decisiva. En 1857 demostró que los agentes de la fermentación láctica eran microorganismos, trabajando sobre un problema que había surgido entre los destiladores de Lille cuando en sus cubas la fermentación alcohólica se vio sustituida por una indeseable fermentación láctica. Este fue el inicio de una larga serie de estudios que habría de durar hasta 1876, en los que Pasteur identificó distintos microorganismos responsables de diferentes clases de procesos fermentativos. Así, en 1860 adscribe inequívocamente la fermentación alcohólica a ciertos tipos de levaduras, y en 1866, en sus “ Études sur le vin” resume sus hallazgos al respecto, inaugurando la Microbiología Aplicada, una de las primeras derivaciones prácticas no empíricas emanadas de la Biología. A finales del siglo XIX eminentes

biólogos como Hansen, en Copenhague, y Beijerink, en Delft, desarrollaban su actividad en industrias y destilerías.

Trabajando sobre los agentes de la fermentación butírica, Pasteur descubrió la presencia de microorganismos que se desarrollaban en ausencia de oxígeno, lo cual desmentía la creencia de que todas las formas de vida necesitan aire para crecer. Acuñó los términos aerobiosis y anaerobiosis para denominar, respectivamente, a la vida en presencia y en ausencia de oxígeno.

Tras el descubrimiento de la anaerobiosis, el mismo Pasteur comprendió las distintas implicaciones energéticas subyacentes a la utilización de sustratos orgánicos en presencia y en ausencia de oxígeno, demostrando que, en el segundo caso el rendimiento (medido como crecimiento microbiano) era siempre menor, al no poder realizarse la degradación total de las correspondientes sustancias.

Una profundización en los fenómenos de fermentación llegó cuando en 1897 Buchner obtuvo, a partir de levaduras, una preparación enzimática (zimasa) que era capaz de realizar la misma transformación de "fermentación" que las células vivas. Este descubrimiento, que evocaba las propuestas de Berzelius y Liebig, supuso en realidad la confluencia de los enfoques químico y biológico: las fermentaciones eran procesos químicos catalizados por enzimas presentes dentro de células vivas, que podían ser estudiados extracelularmente. De esta forma, la Bioquímica, nacida como una rama de la química fisiológica, que se venía especializando en la enzimología, encontró una alianza fructífera y duradera con la joven Microbiología, estableciendo las bases enzimáticas y metabólicas de muchos procesos de fermentación. De esta forma se desarrollaron procedimientos industriales para producir enzimas (invertasa, proteasas, amilasas, etc.). y el siguiente descubrimiento por parte de Buchner de la capacidad de las enzimas, extraídas de las levaduras, de convertir azúcares en alcohol.

Tercera época

En la historia de la biotecnología se caracteriza por desarrollos en cierto sentido opuestos, ya que por un lado la expansión vertiginosa de la industria petroquímica tiende a desplazar los procesos biotecnológicos de la fermentación, pero por otro, el descubrimiento de la penicilina por Fleming en 1928, sentaría las bases para la producción en gran escala de este antibiótico con el fin de satisfacer las demandas generadas en la II Guerra Mundial, en esa época, la producción de penicilina es el resultado de avances importantes en técnicas de esterilización a gran escala, mejora de las instalaciones de fermentación, comprensión y control de procesos de fermentación (incluyendo temperatura, pH, aireación), entre otros. A partir de entonces se diseñaron estrategias para mejorar genéticamente las cepas microbianas industriales.

Desde esa época, las técnicas de ingeniería química, aliadas a la microbiología y a la bioquímica, permiten la producción masiva de antibióticos, ácidos orgánicos, esteroides, polisacáridos y vacunas.

Estos desarrollos dieron un gran impulso a la aplicación de las técnicas de fermentación en la industria alimenticia y al desarrollo industrial de productos como las levaduras, los ácidos cítricos y lácticos y, finalmente, al desarrollo de una industria química para la producción de acetona, "butanol" y glicerol, mediante el uso de bacterias. Las décadas de los 60 y 70 vieron la mejora de procesos de obtención de pequeños metabolitos como nucleósidos, aminoácidos y vitaminas.

Los procesos de fermentación experimentaron mejoras con las técnicas de inmovilización de células y enzimas en soportes, y con la fermentación continua para obtener proteína de células sencillas (biomasa microbiana). Así mismo los polímeros microbianos como xantanos y dextranos se obtuvieron industrialmente, con aplicaciones en el campo de la alimentación (como aditivos). Y se abrió la posibilidad de cultivar cada cepa microbiana sin mezclas con otras: cultivos puros en medios de cultivo de laboratorio

Cuarta época.

Es la actual. Se inicia con el descubrimiento de la doble estructura axial del ácido

"deoxi-ribonucleico" (ADN) por Crick y Watson en 1953, seguido por los procesos que permiten la inmovilización de las enzimas, los primeros experimentos de ingeniería genética realizados por Cohen y Boyer en 1973 y aplicación en 1975 de la técnica del "hibridoma" para la producción de anticuerpos "monoclonales", gracias a los trabajos de Milstein y Kohler.(1983). Estos importantes descubrimientos han dado lugar a numerosos trabajos de mejoramiento genético tanto en plantas como animales; el cultivo de tejidos vegetales y animales a partir de células madre, y el importante acontecimiento de la aparición de la oveja Dolli en el contexto científico, que dio un vuelco total al concepto de Biotecnología.

 
Revisión de conceptos : La Biotecnología evidencia como una integración entre las ciencias básicas con las

Revisión de conceptos : La Biotecnología evidencia como una integración entre las ciencias básicas con las ciencias aplicadas puesto que se pretende emplear de forma controlada y deliberada agentes biológicos sencillos como células vivas o muertas, o componentes celulares en operaciones técnicamente beneficiosas, bien sea de fabricación de productos o como operaciones de servicios. Según lo anterior:

Se puede afirmar, qué la fabricación de vino en la época antigua es Biotecnología? Cuáles son los ejes teóricos que sustentan la Biotecnología.

La obtención de azúcar a partir de la caña, se podría considerar un proceso de Biotecnología? Cuáles serían los puntos a tener en cuenta para considerar esta práctica como tal.

La obtención de azúcar a partir de la caña, se podría considerar un proceso de Biotecnología?

Lección 3:

Divisiones de la Biotecnología

En

la historia

de

la

Biotecnología se

puede apreciar que

las técnicas

y

procedimientos utilizados han tenido una aplicación rápida en áreas tan diversas como la agricultura, la industria alimenticia, la farmacéutica, los procesos de diagnóstico y tratamiento médico, la industria química, la minería y la informática, Como se puede apreciar existe una amplia gama de campos de aplicación y en todos ellos se han generado un amplio numero de productos y servicios. Sin embargo, es de señalar que todos los procesos de innovación

tecnológica se caracterizan generalmente por presentar tres núcleos científicos John Smith (1996) :

1. obtención del mejor catalizador biológico para una función o proceso específico: En la mayoría de los casos, el catalizador biológico son células vivas, sobre todo microorganismos. Por ello, uno de los pilares de la biotecnología es precisamente la microbiología (entendiendo esta en sentido amplio de biología microbiana). Parte de lo que hemos aprendido sobre el manejo de microorganismos se puede aplicar, con modificaciones, al manejo de células de animales y plantas, que cada vez son más importantes en la biotecnología. Varias son las características que hacen atractivos a los microorganismos:

2. obtener

el

mejor

ambiente

para

la

función

de

ese

catalizador biológico, mediante una serie de diseños técnicos en

los

que

es

fundamental

la

ingeniería

química

El

segundo

componente o núcleo de las biotecnologías estriba en el entorno industrial en que ponemos a funcionar las células o las enzimas.

Esto nos lleva al concepto de biorreactor,

un

entorno cerrado y

controlado para que nuestros catalizadores biológicos hagan lo que queremos con la máxima eficiencia. En esta parte de la

biotecnología se requiere la colaboración estrecha entre los biólogos y los ingenieros de bioprocesos, incluyendo los ingenieros químicos. Se trata de diseñar biorreactores o fermentadores, especies de cubas cerradas diseñadas para controlar diversos parámetros que condicionan la buena producción: temperatura, aireación, pH, etc

3. procesamiento

del

material,

consistente

en

separar

y

eventualmente purificar el material biológico producido: quizás esta

es el área más desconocida y compleja, el procesamiento de la

biomasa o de la sustancia producida: separación

de

las

células

respecto del medio acuoso en que han funcionado, recuperación eficiente del producto buscado, purificación, entre otros

procedimientos.

Atendiendo a los planteamientos anteriores la biotecnología la podemos clasificar bajo dos enfoques, el primero, de acuerdo con el nivel de tecnología utilizado en la obtención de productos, y el segundo, según el campo de aplicación del

biotecnología se requiere la colaboración estrecha entre los biólogos y los ingenieros de bioprocesos, incluyendo los

producto o servició.

De acuerdo al primer enfoque, las nuevas biotecnologías generalmente se agrupan en tres categorías básicas:

Técnicas para el cultivo de células y tejidos.

Procesos biotecnológicos, fundamentalmente de fermentación, y que incluyen la técnica de inmovilización de enzimas. (Osorio M. 2005)

Técnicas para la manipulación, modificación y transferencia de materiales genéticos (ingeniería genética).

Aunque estos tres grupos se complementan

entre

sí, existe

una

diferencia

fundamental entre los dos primeros y el tercero. Los primeros se basan en el

conocimiento de las características y comportamiento de los microorganismos y en el uso deliberado de estas características (de cada organismo en particular), para el logro de objetivos específicos como la obtención de nuevos productos o procesos. La enorme potencialidad del último grupo se deriva de la capacidad de manipular, las características estructurales y funcionales de los organismos y de aplicación práctica de esta capacidad para superar ciertos límites naturales en el desarrollo de nuevos productos o procesos.

A diferencia de la primera clasificación, que señala las técnicas propiamente tales, la segunda se refiere también a las actividades económicas en las que se hace uso de dichas tecnologías. La nueva biotecnología crea nuevos procesos y nuevos productos en diversas áreas de la economía. Como estos procesos se basan en los mismos principios, ya sea que se apliquen en un sector económico o en otro, ello introduce cierto grado de flexibilidad, ya que permite la movilidad entre diferentes sectores. Por ejemplo, los procesos de fermentación pueden aplicarse para la producción, en gran escala, de alcohol o de antibióticos como la penicilina, o en escalas menores para la producción de aminoácidos en la industria farmacéutica. Esto facilita la, movilidad de factores productivos y tiene impacto sobre la calificación de la mano de obra, la cual, aun cuando deberá adaptarse a este nuevo perfil tecnológico (tanto en términos, cuantitativos como cualitativos) posiblemente logre al mismo tiempo una mayor facilidad de empleo.

Tipos de Biotecnología: Dependiendo del campo de aplicación del servicio o producto obtenido la biotecnología se ha clasificado en:

Biotecnología Microbiana: La biotecnología microbiana o como se llamaba anteriormente microbiología industrial se refiere a los procesos donde participan los microorganismos para la obtención de productos o metabolitos de interés humano.

La microbiología industrial comenzó con los procesos de fermentación alcohólica por ej. La fermentación del vino y de la cerveza. Más tarde se desarrollaron los

procesos microbianos para la producción de agentes farmacéuticos como los antibióticos, la producción de aditivos alimentarios como los amino ácidos, para la producción de enzimas y sustancias químicas industriales como el butanol, el

acido cítrico, entre otros. En la actualidad estamos en una nueva era de la tecnología microbiana con el advenimiento de la tecnología de genes. La tecnología genética permite que un microorganismo procesado genéticamente fabrique sustancias que normalmente

no sería capaz de producir, es así como

utilizando ingeniería genética se ha

podido producir insulina por una bacteria introduciendo el gen de la insulina humana en la bacteria Escherichia coli.

Podemos dividir a la biotecnología microbiana en dos fases distintas:

1) La tecnología microbiana tradicional, que implica la fabricación a gran escala de productos que los microorganismo son capaces de fabricar normalmente. En este caso la tarea del microbiólogo consiste en modificando el organismo o el proceso para aumentar el rendimiento del producto deseado. 2) La tecnología microbiana con organismos alterados mediante procesos de ingeniería, es decir microorganismos en los cuales se ha insertado genes extraños. En esta nueva tecnología el microbiólogo industrial trabaja estrechamente asociado con el ingeniero genético en el desarrollo de un organismo adecuado que no solo produzca el producto de interés, sino que también pueda ser cultivado en la escala necesaria para su explotación comercial. (Brook y Scaligan 2002)

Biotecnología Agrícola ó vegetal: Con las técnicas de la biotecnología moderna, es posible producir más rápidamente que antes, nuevas variedades de plantas con características mejoradas, produciendo en mayores cantidades, con tolerancia a condiciones adversas, resistencia a herbicidas específicos, control de plagas, cultivo durante todo el año. Problemas de enfermedades y control de malezas ahora pueden ser tratados genéticamente en lugar del uso de químicos. Una planta modificada por ingeniería genética, que contiene ADN de una fuente externa, es un organismo transgénico. Un ejemplo de planta transgénica es el

tomate que permite mantenerse durante mas tiempo en los almacenes evitando que se reblandezcan antes de ser transportados

Algunos países desarrollados como Estados Unidos y a sus multinacionales, defienden el uso de la biotecnología y pone de relieve la importancia de su industria, que crea nuevos puestos de trabajo y fomenta la innovación tecnológica y podría acabar con el hambre del mundo. En Europa, los casos de Soja y Maíz transgénicos resultan de especial relevancia. La soja se utiliza en un 40 a 60% de los alimentos procesados: aceite, margarina, alimentos dietéticos e infantiles, cerveza, etc. España importa de EEUU 1´5 millones de toneladas, el cuarto país importador detrás de Japón, Taiwan y Holanda.

La comercialización del maíz transgénico está autorizada en EEUU, Canadá, Japón y también en la Unión Europea desde Enero de 1997.

China planea plantar tomates, arroz, pimientos y patatas por lo menos en la mitad de todas sus tierras de labor (500.000 kilómetros cuadrados) en el plazo de cinco años. Sus investigadores analizaron el efecto de los pimientos y los tomates transgénicos en ratas de laboratorio, comparando el peso y el estado de los mismos con los de otros no alimentados, y no observaron diferencias significativas.

Para profundizar en

este tema

haga

clic

aquí:

alimentación y la agricultura

La biotecnología en

la

Biotecnología animal: Esta ha experimentado un gran desarrollo en las últimas décadas. Las aplicaciones iniciales se dirigieron principalmente a sistemas diagnósticos, nuevas vacunas y drogas, fertilización de embriones in vitro, uso de hormonas de crecimiento, entre otros procedimientos. Los animales transgénicos como el "ratón oncogénico" han sido muy útiles en trabajos de laboratorio para estudios de enfermedades humanas.

Existen tres áreas diferentes en las cuales la biotecnología puede influir sobre la producción animal:

-El uso de tecnologías reproductivas

-Nuevas vacunas y -cultivos celulares que producen hormonas.

En animales tenemos ejemplos de modelos desarrollados para evaluar enfermedades genéticas humanas, el uso de animales para la producción de drogas y como fuente donante de células y órganos, por ejemplo el uso de animales para la producción de proteínas sanguíneas humanas o anticuerpos.

Para las enfermedades animales, la biotecnología provee de numerosas oportunidades para combatirlas, y están siendo desarrolladas vacunas contra muchas enfermedades bovinas y porcinas, que en los últimos tiempos han hecho mella en estos animales.

Biotecnología Humana Las técnicas del ADN están siendo utilizadas para determinar relaciones familiares en litigios de paternidad, para confrontar

donantes de órganos con receptores en programas de trasplante,

unir

sospechosos con la evidencia de forense).

ADN en la escena del crimen (biotecnología

El desarrollo de técnicas para el diagnóstico de enfermedades infecciosas o de desordenes genéticos es una de las aplicaciones de mayor impacto de la tecnología de ADN. Al utilizar las técnicas de secuenciación de ADN los científicos pueden diagnosticar infecciones víricas, bacterianas o mapear la localización específica de los genes a lo largo de la molécula de ADN en las células.

El primer tratamiento exitoso en terapia génica fue en 1990, cuando se trató una enfermedad del sistema inmune de niños llamada "Deficiencia de ADA". Células sanguíneas con los genes correctos de ADA fueron inyectadas al cuerpo del paciente donde produjeron suficientes células normales que permitieron mejorar el sistema inmune.

Hoy,

la

terapia

génica

esta

tratando

enfermedades

tales

como

tumores

cerebrales malignos, fibrosis quística y HIV. Con esta técnica se pretende también reparar órganos, como por ejemplo un hígado cirrótico a partir de las pocas células sanas que le quedan, un par de ventrículos nuevos para reemplazar

los efectos devastadores de un infarto, la regeneración de una mano amputada o disponer de una fuente inagotable de neuronas para corregir los efectos de enfermedades tan graves como el Alzheimer o el mal de Parkinson.

Impacto de la Biotecnología en el contexto colombiano

Su impacto ha alcanzado varios sectores productivos: agricultura, industria de alimentos, industria farmacéutica, bioindustria, entre otros. Aumentando la productividad y la competitividad con la generación de nuevos productos, por lo cual se han convertido en parte clave del crecimiento de la economía en la mayoría de los países industrializados y algunos países en desarrollo. En general, el alto valor agregado que se genera con la moderna Biotecnología, particularmente a nivel farmacéutico, está determinado por su novedad y especificidad de uso en consumo humano. (Osorio,1995)

En Colombia el avance de la moderna biotecnología en los últimos diez años ha comenzado a generar algunos productos, particularmente en el sector agrícola. Existen cerca de 70 instituciones entre estatales y privadas, que involucran biotecnología en sus procesos de investigación y/o producción.

En el sector agrícola se ha avanzado en técnicas de cultivo de tejidos vegetales in vitro, en el estudio y uso sostenible de microorganismos con el fin de buscar alternativas de control biológico de enfermedades y plagas y se están realizando algunos trabajos en mejoramiento genético de plantas de papas, pasifloras, entre otros basados en el ADN recombinante. Se observan trabajos escasos a nivel de estudios de diversidad genética en especies silvestres del país, los cuales se desarrollan para identificar nuevos genes útiles en el mejoramiento de variedades comerciales y para aumentar la eficiencia y calidad de los bancos de germoplasma existentes en el país.

En el sector pecuario, la aplicación de la biología se limita a la producción de

vacunas

y

a

la

búsqueda de razas

mejoradas

mediante la implantación

de

embriones. Actualmente se están realizando trabajos de investigación en la

estandarización de kits de diagnóstico de enfermedades serológicas y moleculares, vacunas sintéticas y aplicación selectiva de microorganismos relacionados con la nutrición animal mejorada. A nivel de diversidad genética de especies nativas los trabajos son discontinuos y aislados.

En el sector de la salud humana se desarrollan proyectos de investigación con producción de kits serológicos y moleculares para el diagnóstico rápido de enfermedades tropicales y se estudian los espectros de variabilidad existentes por ejemplo, enfermedad de Chagas.

En el sector agroindustrial y de la alimentación animal, la Biología es aplicada para generar productos lácteos, bebidas fermentadas, destilación de fermentaciones etanólicas para la elaboración de licores, producción de levaduras por fermentación y producción de materias primas como ácido cítrico y solventes orgánicos. Este sector utiliza fundamentalmente métodos biotecnológicos tradicionales.

En el sector del medio ambiente se han iniciado algunos trabajos a nivel del tratamiento de aguas residuales industriales como lodos activados y biofiltros, métodos de descontaminación de los derramamientos de petróleo mediante el uso de microorganismos nativos o transformados genéticamente. Algunos trabajos de investigación científica se están realizando sobre biodigestores de alta calidad. Sin embargo, el desarrollo nacional en este sector es todavía discreto.

La diversidad biológica de Colombia es una ventaja comparativa que al ser usada sosteniblemente puede apoyar el desarrollo del sector productivo. Así mismo constituye una respuesta a problemas de seguridad alimentaria, sostenibilidad de aguas, suelos y aire, así como un elemento de negociación política internacional y fortalecimiento de la soberanía. Por estas razones, su conocimiento, conservación y uso sostenible es prioritario. Sin embargo, como se observa con el estado de la biotecnología en Colombia, los avances en estos campos son muy pequeños

comparativamente con otros países de América Latina como Costa Rica, Brasil y otros del mundo.

Con relación a los bio-recursos, Colombia es un país privilegiado ya que se encuentra entre uno de los países de mayor diversidad biológica del planeta por área . Sin embargo, para aprovechar ese potencial, el país debe desarrollar la capacidad científica y técnica que le permita explorar, conocer, estudiar, investigar, valorar, conservar y desarrollar esos biorrecursos como un patrimonio altamente productivo y no simplemente como una diversidad ecológica, social y económicamente improductiva.

Tendencias de la Biotecnología a nivel mundial

A nivel mundial el interés por la biotecnología es indudable, como se ve a través del, frecuente abordaje de tales temas en los periódicos, libros y medios de comunicación.

Algunos descubrimientos útiles serán una consecuencia directa del uso de las técnicas de ingeniería genética que logren transferir determinados genes (a veces incluso genes humanos) a un determinado microorganismo apropiado, para hacer el producto que es precisamente requerido en el mercado. Determinadas proteínas humanas y algunos enzimas requeridos en Medicina se conseguirán de esta forma, en el futuro. Otros muchos beneficios, serán el resultado de la fabricación mediante técnicas de fermentación, de anticuerpos específicos para, fines analíticos y terapéuticos. Estos anticuerpos monoclonales se producirán mediante el uso de microorganismos en grandes fermentadores, como por ejemplo la producción de antibióticos como la penicilina.

Se están desarrollando

en

la actualidad, importantes descubrimiento y

aplicaciones comerciales en cada uno de los campos de la Biotecnología, incluyendo las que tienen lugar en las industrias de fermentación, la biotecnología de los enzimas y células inmovilizadas, el tratamiento de residuos y la utilización de subproductos. Aquellos procesos que resulten productivos serán

útiles a la sociedad, atractivos para la industria por motivos comerciales y en algunos casos recibirán el apoyo de los respectivos gobiernos.

Una gran potencialidad de la biotecnología se da en el campo de la investigación y el desarrollo científico, ya que proporciona herramientas que permiten una mejor comprensión de los procesos fisiológicos, por ejemplo, del sistema inmuno- defensivo, o que reducen, en forma considerable, los plazos de la I y D,

facilitando así los procesos de innovación

tecnológica.

A

su

vez,

con

el

advenimiento de nuevas técnicas en el campo biológico, la actividad de la I y D en este campo tiende a hacerse cada vez más científica y menos empírica,

acentuándose así las biotecnología.

características de intensidad científica propias de

la

Resulta claro que siendo la biotecnología un sistema de diversas innovaciones científico-tecnológicas interrelacionadas, no todas ellas evolucionan al mismo ritmo. Las condiciones de mercado, las expectativas de beneficios, aspectos organizativos y de gestión, entre otros, favorecen la rápida puesta en marcha y difusión de algunas de estas tecnologías, relegando a otras. La literatura sobre la innovación tecnológica acostumbra distinguir entre aquellas innovaciones que surgen como respuesta a una situación de mercado, y a expectativas de beneficios económicos, de aquéllas que se originan en el área de I y D como resultado de un proceso continuo y acumulativo de desarrollo científico- tecnológico. En el primer caso se habla de "demand or market-pull" y en el segundo, de "technological-push". Ha sido frecuente, en los últimos tiempos, señalar el láser y la biotecnología como ejemplos del segundo tipo de innovación. Es decir, descubrimientos científicos a los que se arriba sin una aplicación específica predeterminada en mente, pero que luego encuentran una gama considerable de aplicaciones prácticas.

Sin embargo, pareciera más correcto considerar ambos actores, el inherente proceso científico-tecnológico y aquél que corresponde a incentivos eonómicos, como complementarios. Así, en el caso de la biotecnología, aun cuando ésta nace e el ámbito de la I y D, de las muchas aplicaciones posibles, las que se

desarrollan primero son aquellas que ofrecen expectativas de importantes beneficios económicos en un plazo más ó menos breve.

En la agricultura, la biotecnología se orienta a la superación de los factores limitantes de la reducción agrícola a través de la obtención de variedades de plantas tolerantes a condiciones ambientales negativas (sequías, suelos ácidos), resistentes a enfermedades y pestes, que permitan aumentar el proceso fotosintético, la fijación de nitrógeno o la captación de elementos nutritivos. También se apunta al logro de plantas más productivas y/ o más nutritivas, mediante la mejora de su contenido proteínico o aminoácido.

Un desarrollo paralelo es la producción de pesticidas (insecticidas, herbicidas y fungicidas) microbianos. Las técnicas que ya se emplean, o que están desarrollándose, van desde los cultivos de tejidos, la fusión protoplasmática, el cultivo in vitro de "meristemas", la producción de nódulos de "rhizobium" y "micorizas", hasta la ingeniería genética para la obtención de plantas de mayor capacidad fotosintética, que puedan fijar directamente nitrógeno, resistentes a plagas y pestes, etc. El cultivo de tejidos consiste en la regeneración de plantas completas a partir de una masa amorfa, de células, que se denomina "callo". En su forma más general, se aplica a todo tipo de cultivo "in vitro", desde simples unidades indiferenciadas hasta complejos multicelulares y órganos. El proceso consiste en la incubación, en condiciones controladas y asépticas, de una célula o parte de un tejido vegetal (hoja, tallo, raíz, embrión, semilla, "meristema", polen, etc.) en un medio que contiene elementos nutritivos, vitaminas y factores de crecimiento (Osorio, 2005)

La magnitud del mercado potencial agrícola para la biotecnología es, en gran medida materia de especulación debido precisamente a la falta de un conocimiento detallado de muchas de estas condiciones locales. En este campo, la biotecnología está orientada a la utilización en gran escala de "biomasa" para la producción de materias primas orgánicas, que actualmente se obtienen mediante procesos químicos convencionales. Las ventajas son que la "biomasa" es un recurso altamente subutilizado y relativamente barato., ya que en gran

parte esta constituidos por residuos y desechos de plantaciones forestales y de cultivos en gran escala. Es además un recurso renovable. Las principales fuentes potencialmente disponibles para la producción tanto de etanol como de otros productos químicos a granel son (aparte de las melazas de la caña) cultivos como la yuca, el sorgo, las papas y el maíz; los sueros de la industria de la leche; los residuos de las plantaciones de café y, en general, todo tipo de residuo celuloso.

Actualmente la biotecnología está siendo aplicada en gran escala en la producción de alcohol (etanol), como combustible sustituto del petróleo, fundamentalmente en el Brasil y en menor medida en Estados Unidos y la India. En el Brasil, la producción se logra a partir de melazas de la caña de azúcar, mientras que en Estados Unidos se usa el maíz. Otro producto importante es el ácido cítrico. Los principales productores son los Estados Unidos, Italia, Bélgica y Francia que utilizan como materia prima melazas de remolacha. La importancia que tiene cada una de las aplicaciones mencionadas es incuestionable desde el punto de vista económico.

A pesar que en el siglo XX, cuando la Genética había resuelto el misterio de la naturaleza del material de la herencia, las posibilidades que había para actuar sobre dicho material eran limitadas: cruces entre plantas y animales de la misma especie (o de especies similares), selección de los individuos con rasgos deseados, retrocruzamientos (un proceso largo y lento), mutaciones con agentes físicos (rayos UV, rayos X) o químicos, con ulterior búsqueda (selección o rastreo -screening) de alguna variante de interés (algo tedioso y frecuentemente infructuoso), etc.

Debimos esperar a la década de los 70 para que surja un conjunto de técnicas de laboratorio revolucionarias que por primera vez permiten "tocar" de modo racional el sancta sanctorum de la vida. Son técnicas y herramientas con las que se puede modificar el ADN de acuerdo a diseños previos y objetivos concretos (de ahí el nombre popular de Ingeniería Genética).

La Ingeniería Genética (I.G.), mejor llamada tecnología del ADN recombinante in vitro, se caracteriza por su capacidad de cortar y empalmar genes o fragmentos de ADN de organismos distintos, creando nuevas combinaciones no existentes en

la Naturaleza, combinaciones que ponemos a trabajar en el interior de una variedad de organismos hospederos, para nuestro provecho.

Teniendo en cuenta lo anterior se puede inferir que las tendencias científicas mundiales a todos los niveles y clasificación de la Biotecnología, se han concentrado en seis aspectos:

  • - Cultivos de tejidos y células para: la rápida micropropagación "in vitro" de plantas, la obtención de cultivos sanos, el mejoramiento genético por cruza amplia, la preservación e intercambio de "germoplasma", la "biosíntesis" de "metabolitos" secundarios de interés económico y la investigación básica.

  • - Metabolomica La manipulación del metabolismo para inhibir unas rutas biosinteticas o favorecer otras sin afectar la economía celular con el propósito de obtener una mayor producción del producto de interés.

  • - El uso de enzimas o fermentación microbiana, para la conservación de materia primas definidas como sustratos en determinados productos, la recuperación de estos productos, su separación de los caldos de fermentación y su purificación final.

  • - Tecnología del "hibridoma", que se refiere a la producción, a partir de "clones", de anticuerpos de acción muy específica que reciben el nombre de anticuerpos "monoclonales".

  • - Ingeniería de proteínas ó Proteomica, que implica la modificación de la estructura de las proteínas para mejorar su funcionamiento o para la producción de proteínas totalmente nuevas.

  • - Ingeniería genética o tecnología del "ADN", que consiste en la introducción de un "ADN" híbrido, que contiene los genes de interés para determinados propósitos, para capacitar a ciertos organismos en la elaboración de

productos específicos, ya sean estos enzimas, hormonas o cualquier otro tipo de proteína u organismo.

  • - Bioinformática, que se refiere a la técnica basada en la utilización de proteínas en aparatos electrónicos, particularmente sensores biológicos y "bioships"; es decir, "microchips" biológicos, capaces de lógica y memoria.

A todo esto tenemos que añadir que un factor importantísimo en el desarrollo de la biotecnología es la evaluación de la seguridad del producto, sometida a controles rigurosos según normativas nacionales e internacionales. De hecho este factor es tan importante que se puede convertir en limitante, de modo que las regulaciones estrictas desincentivan ciertos desarrollos biotecnológicos. Por todo ello, es importante que tales regulaciones sean realistas, y no exijan más de lo que la evidencia científica sugiere, manteniendo en todo momento la preservación de la salud y el medio ambiente. A su vez, las regulaciones reflejan la percepción pública de los riesgos y promesas de la biotecnología. Por ejemplo, hoy en Europa la percepción pública ha logrado prácticamente una parada en las plantas transgénicas, a pesar de los informes científicos que dicen que en la mayor parte de los casos, sus riesgos son similares a las plantas convencionales. La creación o elaboración de este tipo de alimentos depende del nivel de desarrollo del país, de los intereses políticos del mismo y del grado de presión que ejerzan las grandes industrias privadas del sector. Hay un gran debate en torno a la conveniencia o no de este tipo de organismos.

Habrá que llegar a un diálogo racional entre los diversos actores (científicos, empresas, consumidores, ecologistas, entre otros) para asegurar el correcto empleo de estas tecnologías, que por un lado no impida aplicaciones benéficas sin riesgos, y por otro regule adecuadamente aquellos ámbitos donde las dudas razonables hagan recomendables más restricciones. El ideal sería permitir todo aquello que aporte beneficios sin aumentar riesgos, pero no caer en el error de prohibir usos positivos solo bajo vagas ideas de riesgos no sustanciados, en buena parte imaginaciones y tergiversasiones de grupos de presión que pueden esconder agendas políticas ocultas.

CAPITULO 2 BIOTECNOLOGÍA DE LAS FERMENTACIONES

Lección 1: Nutrición microbiana. Las células contienen grandes cantidades de pequeñas moléculas así como de macromoléculas. La célula puede obtener la mayoría de las pequeñas moléculas que necesita del exterior o sintetizarlas a partir de moléculas más simples. Las macromoléculas, por el contrario, son siempre sintetizadas en la célula.

Las sustancias que son tomadas de medio externo las cuales son utilizadas con fines energéticos o plásticos se denominan como nutrientes, en cualquier caso, los nutrientes deben suministrase en los diferentes medios de cultivo.

Los nutrientes pueden ser divididos en dos clases: (1) macronutrientes, los que son requeridos en grandes cantidades; (2) Micronutrientes, y (3) factores de crecimiento que lo son solamente en pequeñas cantidades. Empezaremos por los macronutrientes mayoritarios: carbono y nitrógeno.

1.1 Macronutrientes:

Prácticamente la totalidad de la masa celular está formada por sustancias con cuatro tipos de átomos: Carbono, oxígeno, hidrógeno y nitrógeno. Estos cuatro elementos constituyen el esqueleto de las macromoléculas así como las moléculas orgánicas pequeñas.

La mayoría de los procariotas requieren un compuesto orgánico de algún tipo como fuente de carbono. Estudios nutricionales han demostrado que muchas bacterias pueden asimilar varios compuestos de carbono orgánico y utilizarlos para fabricar material celular. Un incontable número de compuestos tales como animoácidos, ácidos grasos, y compuestos aromáticos pueden ser usados por una bacteria u otra. En peso seco, una célula típica consta de aproximadamente 50% de carbono y a su vez este es el elemento mayoritario de las macromoléculas.

Después del carbono, el siguiente elemento más abundante en la célula es el nitrógeno. Una bacteria típica contiene aproximadamente el 12% de nitrógeno

(peso seco) y a su vez el nitrógeno es un componente mayoritario de proteínas, ácidos nucleicos y otros constituyentes celulares. El nitrógeno se encuentra en la naturaleza tanto en forma orgánica como inorgánica. Sin embargo, la globalidad del nitrógeno utilizable está en forma inorgánica, bien como amoníaco (NH 3 ), nitrato (NH 3 - ) ó N 2 . La mayoría de las bacterias pueden utilizar amoníaco y muchas además nitrato. El nitrógeno molecular (gas), sin embargo, puede ser fuente de nitrógeno para un reducido grupo de bacterias (bacterias fijadoras de nitrógeno).

1.2 Otros macronutrientes: P,S,K,Mg,Ca,Na,Fe

El fósforo acontece en la naturaleza en forma de fosfatos orgánicos o inorgánicos y es requerido por la célula para la síntesis de ácidos nucleicos y fosfolípidos. El azufre es fundamental por ser un elemento estructural en los aminoácidos cisteina y metionina y porque está presente en vitaminas tales como la tiamina, biotina, ácido lipoico así como coenzima A. El potasio es necesario en todos los organismos. Una gran diversidad de enzimas, incluyendo varias implicadas en la síntesis de proteínas, lo requiere específicamente. El magnesio estabiliza los ribosomas, las membranas celulares, los ácidos nucleicos y se requiere también para la actividad de muchas enzimas. El calcio (que no es nutriente esencial para el crecimiento de muchos microorganismos), ayuda a estabilizar la pared celular bacteriana y juega un papel fundamental en la termorresistencia de la endospora bacteriana. El sodio es requerido por algunos, pero no todos, microorganismos y cuando lo es, es debido a la naturaleza química de su hábitat. El hierro es requerido por las células en mayores cantidades que otros metales traza y por ellos debe ser considerado como un macronutriente. El hierro juega un papel fundamental en la respiración celular, siendo un componente clave de los citocromos, y de las proteínas que contiene hierro y azufre implicadas en el transporte de electrones. Debido a que la mayor parte de las sales inorgánicas son altamente insolubles, muchos microorganismos producen agentes que unen el hierro de una manera muy específica, denominados sideróforos, que solubilizan las sales de hierro trasportándolo al interior celular.

1.3

Micronutrientes (elementos traza)

Aunque los micronutrientes son requeridos en muy pequeñas cantidades son, sin embargo, tan importantes como los macronutrientes para la función celular. Los micronutrientes son metales, muchos de los cuales forman parte de enzimas que son los catalizadores celulares. Entre los micronutrientes más importantes de sistemas vivos, que son necesarios para el funcionamiento de enzimas están:

Cromo, Cobalto, Cobre, Manganeso, Molibdeno, Níquel, Selenio, Tungsteno, Vanadio, Zinc, Hierro.

  • 1.4 Factores de crecimiento

Estos son compuestos orgánicos que, como los micronutrientes, son requeridos en muy pequeñas cantidades y sólo por algunas células. Los factores de crecimiento incluyen vitaminas, aminoácidos, purinas y pirimidinas. Aunque la

mayoría de los microorganismos son capaces de sintetizar estos compuestos,

otros microorganismos requieren tomar uno o más compuestos preformados del medio ambiente.

1.5. Medios de cultivo

En microbiología industrial se usan dos grandes grupos de medios de cultivo: Los químicamente definidos y los indefinidos (complejos). Los medios químicamente definidos se preparan añadiendo al agua destilada cantidades precisas de compuestos orgánicos o inorgánicos altamente purificados. Por ellos se conoce la composición química exacta .En muchos casos, sin embargo, el conocimiento exacto de la composición química no es crítico. En estas ocasiones los medios complejos pueden ser suficientes, e incluso presentar ventajas sobre los definidos. Los medios complejos emplean lisados de caseína (proteína de la leche), de carne, de soja, de levadura o cualquier otra sustancia altamente nutritiva (químicamente indefinida): Tales lisados están disponibles comercialmente en forma de polvo y pueden ser pesados rápidamente y disueltos en agua destilada para dar lugar a un medio. Sin embargo, cuando se utilizan medio complejos hay que tener en cuenta que no se conoce la composición de nutrientes.

El metabolismo es la suma de transformaciones de la materia que ocurre en el interior de la célula y que da lugar a la síntesis de material celular a partir de sustancias nutritivas.

El metabolismo puede dividirse, para su mejor estudio, en tres aspectos diferentes pero íntimamente ligados (figura 1) : el catabolismo (Metabolismos energético) que es la suma de reacciones exergónicas que permiten liberar la energía contenida en los nutrientes o estratos y ser acumulada en forma de ATP u otros compuestos, el anfibolismo o metabolismo intermediario, que es el conjunto de reacciones en que los productos de hidrólisis del catabolismo y algunos nutrientes son transformados en ácidos orgánicos , ésteres fosfóricos y otros compuestos como aminoácidos; el anabolismo o metabolismo biosintético que es la parte del metabolismo implicado en la síntesis de macromoléculas- ácidos nucleicos, proteínas sustancias de reserva y otros.

Figura 1: Diferentes fases del metabolismo microbiano:

El metabolismo es la suma de transformaciones de la materia que ocurre en el interior de
  • 1.2 Metabolismo energético

Es tradicional agrupar a los microorganismos en clases metabólicas dependiendo de la fuente de energía que utilicen. Todos los términos utilizados para describir estas clases emplean la terminación trofo que deriva del griego y significa “alimentarse”. Así, lo organismos que utiliza luz como fuente de energía se llaman fototrofos (foto es luz en griego) y los organismos que utilizan productos químicos como fuente de energía se denominan quimiotrófos. La mayor parte de los organismos que estudia la microbiología utilizan compuestos orgánicos como fuente de energía; pertenecen por tanto a los quimiotrófos y se denominan quimiorganotrofos. Los organismos capaces de utilizar compuestos inorgánicos como fuente de energía se denominan quimiolitotrofos

Los mecanismo por los que se sintetiza ATP como resultado de reacciones de oxidación – reducción que implican compuestos orgánicos, pueden contemplarse en dos grandes grupos: (1) Fermentación, en que los procesos de oxido – reducción ocurren en ausencia de aceptores terminales de electrones añadidos; y (2) respiración, en que el oxígeno molecular u otros oxidantes sirven como aceptores terminales de electrones.

1.2.1 Naturaleza de la fermentación:

La fermentación es el mecanismo más simple y quizás el más antiguo desde el punto de vista evolutivo, de los procesos de obtención de energía. Se suponen que en las condiciones del mundo primitivo, donde no existía oxígeno libre, ni los rayos del sol llegaban a su superficie, los primero organismos solo podían obtener la energía a partir de la contenida en los compuestos orgánicos.

Se puede definir entonces, la fermentación como el proceso metabólico de generación de ATP, en el cual los donantes y los aceptores de electrones son moléculas orgánicas. (Martinez, J; 1995) Los compuestos que llevan acabo estas

dos funciones son usualmente dos metabolitos diferentes derivados de un sustrato fermentable simple (como azúcar, por ejemplo). En la fermentación el sustrato da lugar a una serie de compuestos, unos más oxidados y otros más reducidos; en el proceso fermentativo mantiene un estricto balance O-R. El nivel de oxidación promedio de los productos finales es muy cercano al del sustrato. De ahí que la generación de ATP asociada a la fermentación se denomina fosforilación a nivel de sustrato. la fermentación posee tres características:

  • 1. En la fermentación, tanto donantes como aceptores de electrones son moléculas orgánicas; en ocasiones es la misma molécula la que se oxida y se reduce.

  • 2. El proceso ocurre en ausencia de oxigeno

  • 3. Existe un riguroso balance de C, O e H entre los sustratos y los productos

Un ejemplo de fermentación es el catabolismo de la glucosa por una bacteria del ácido láctico:

Glucosa
Glucosa
dos funciones son usualmente dos metabolitos diferentes derivados de un sustrato fermentable simple (como azúcar, por

( C c H 12 O 6

dos funciones son usualmente dos metabolitos diferentes derivados de un sustrato fermentable simple (como azúcar, por
2 lactatos +2 H +
2 lactatos +2 H +

2C 3 H 4 O 3 - + 2CO 2 )

Nótese que ésta es una reacción balanceada y que los productos, lactato más protones, tienen la misma proporción de átomos de hidrógeno y oxígeno que la

glucosa.

Esta

reacción

puede

analizarse

desde

tres

puntos

de

vista:

Termodinámicamente, por la energía de intermediario.

enlace

y

por el metabolismo

Desde el punto de vista termodinámico, las fermentaciones se caracterizan por ser una suma de reacciones, al final de las cuales los productos poseen un contenido energético menor que el inicial.

Si analizamos la fermentación a través de la energía de enlace, tendremos que

en ella se producen reordenamientos moleculares

en

los

que

se

pasa

de

funciones de mayor contenido a funciones de menor contenido energético. Así, en la mayoría de las fermentaciones se pasa de grupos carbonilo e hidroxilo a grupos carboxilo de menor contenido energético.

Existen tres rutas básicas empleadas aprovechamiento energético de los sustratos.

por

los

microorganismo

para

el

  • 1. La vía fructosa – difosfato (FDP) también conocida como glicólisis o vía de Embden-Meyerhof

  • 2. la vía de las pentosas – fosfato (PP) o de Warburg-Dickens Horecker

  • 3. La vía de Entner-Doudorff p KDPG

Cada una de estas vías tiene funciones y unidades específicas para los microorganismos. Las dos primeras vías son comunes tanto a organismos respiratorios como fermentativos, procariontes o eucariontes. La tercera se halla restringida a procariontes. Al existir diferentes vías de fermentación se obtienen también diferentes productos: Algunos productos derivados de la fermentación se observan en la siguiente tabla

Tabla 1. Productos derivados de la fermentación

Tipo de fermentación

Producto(s)

Fermentación láctica

Lactato

Fermentación alcohólica

etanol, CO 2

Fermentación ácida-mixta

etanol, succinato, acetato, formiato, lactato, CO 2 , H 2

Fermentación butilénglicólica

butilénglicol, CO 2

Fermentación aceto-butírica

acetato, acetona, butirato, butanol, etanol, CO 2 , H 2

Fuente : J. Martines. Microbiología, La Habana – Cuba 1989

1.2.3

Naturaleza de la respiración

La respiración es un mecanismo metabólico de generación de ATP en el que, a diferencia de la fermentación, sirven como donantes de electrones tanto compuestos orgánicos como inorgánicos (oxidándose). Generalmente el aceptor electrónico final es el oxigeno molecular. A diferencia de la fermentación, los electrones son transferidos a través de una cadena transportadora de electrones al final de la cual existe un aceptor exógeno oxidado (A), que se reduce. Si el aceptor final es el O 2 , hablamos de respiración aerobia; Si el aceptor final es distinto del O 2 (nitrato, sulfato, etc.), respiración anaerobia.

En ambos casos, la transferencia se da ordenadamente, en la dirección de mayor potencial redox positivo, con la consiguiente liberación de energía libre. Como veremos enseguida, esta energía libre se va a traducir en un potencial electroquímico de protones, cuya disipación a través de ATP-asas de membrana origina ATP, conociéndose este proceso como fosforilación oxidativa

  • 1.2.4 Aspectos generales de los procesos biosintéticos

Diversas reacciones catabólicas producen unidades para la biosíntesis, pero otras pueden ser tomadas desde exterior y un tercer grupo de unidades, al igual que las coenzimas, son el resultado de las vías biosintéticas que han sido denominadas reacciones metabólicas. Finalmente, en la síntesis de macromoléculas los productos mayoritarios son proteínas y ácidos nucleicos. También son importantes, e incluso pueden ser mayoritarios otros tipos de moléculas de gran tamaño, entre los que se encuentran los polisacáridos y lípidos complejos. El tipo de estructura de estos dos últimos variar mucho de un organismo a otro, y tiene especial interés en las bacterias.

La mayor parte de peso seco de la bacteria está constituidos por macromoléculas de cuatro tipos: ácidos nucleicos, proteínas, polisacáridos y lípidos complejos. Estas macromoléculas son polímeros formados por unidades estructurales debajo peso molecular que tiene que formarse como precursores. Ya sabemos que las subunidades estructurales de los ácidos nucleicos son 8 tipos distinto de nucleótidos, las de las proteínas 20 aminoácidos diferentes, las de los

polisacáridos, unos 15 azucares diferentes, y que para la formación de los lípidos se requieren ácidos grasos, polialcoholes, azúcares, aminas y aminoácios que constituyen también unos 20 tipos diferentes de moléculas orgánicas. Además se requieren sintetizar unas 20 coenzimas y transportadores de electrones.

Un tipo más interesante y bastante más complejo de proceso microbiano industrial es aquel en el que el producto deseado no es producido durante la primera fase de crecimiento, sino poco después que se inicie la fase estacionaria. Metabolitos producidos durante la fase estacionaria son llamados metabolitos secundarios y son algunos de los más comunes e importantes metabolitos de interés industrial. Los mejor conocidos y el más extensamente estudiados metabolitos secundarios son los antibióticos.

Se han reconocido las siguientes características de los metabolitos secundarios:

1) Cada metabolito secundario se forma únicamente a partir de relativamente pocos organismos. 2) La formación de metabolitos secundarios es sumamente dependiente de las condiciones de crecimiento, en particular de la composición del medio. Es frecuente la represión de la formación de metabolitos secundarios. 3) Los metabolitos secundarios no son indispensables para el crecimiento y la reproducción. 4) Los metabolitos secundarios se suelen producir como un grupo de sustancias estrechamente relacionadas. Por ej. una sola cepa de Streptomyces ha llegado ha producir 32 antibióticos de antraciclina diferentes, pero relacionados.

2.1 Crecimiento Bacteriano

Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biológico como el incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicación celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicación se traduce en un aumento del tamaño del individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisión o por gemación, lo que ocurre es un aumento de la población. En los

microorganismos cenocíticos (en los que la duplicación del genoma no se acompaña de división celular) el crecimiento se traduce en aumento de tamaño de la “colonia” cenocítica. El crecimiento bacteriano podemos estudiarlo desde dos puntos de vista: a escala individual y a escala poblacional. Para efectos prácticos, esta sección nos centraremos al estudio del crecimiento poblacional. El cual en cultivo cerrado atraviesa por las siguientes fases:

4.1. Fases del crecimiento en un sistema cerrado en medio líquido En sistema de producción cerrado, en el cual la adición de sustancias y microorganismos solo se realizan al inicio d ela fermentación se pueden identificar 6 fases de crecimiento. (Figura 2)

microorganismos cenocíticos (en los que la duplicación del genoma no se acompaña de división celular) el

Figura 2 : Curva de crecimiento microbiano

Como se puede constatar en el anterior gráfico, el crecimiento en un sistema cerrado consta de varias fases, que pasamos a comentar:

1) Fase de latencia: Es el período de tiempo durante el que el inóculo se adapta a las condiciones del medio fresco sobre el que se ha sembrado. Se trata de un período de ajuste metabólico. Su duración depende de varios factores:

- Tamaño del inóculo

  • - Estado fisiológico del inóculo: Si las células están dañadas por algún agente, la

fase de latencia también es larga, ya que necesitan un tiempo para la reparación

de los daños.

Si las células del inóculo se tomaron de un cultivo previo en fase exponencial, la fase de latencia es más corta.

  • - Medio de cultivo del que procede el inóculo:

Si el medio es similar al medio fresco, la fase de latencia es más corta; Si el medio del inóculo era un medio rico y el medio fresco es más pobre, la fase de latencia se hace más larga, porque las bacterias necesitan un tiempo adicional para activar la síntesis de las enzimas biosintéticas que estaban reprimidas en el medio rico.

2) Fase de transición, de crecimiento acelerado, que conduce a la siguiente fase

3) Fase de crecimiento exponencial. Durante esta fase se produce un crecimiento balanceado no restringido durante unas pocas generaciones (normalmente menos de 10). El tiempo de generación (g) es característico para cada especie o cepa, en cada medio concreto:

El valor del tiempo de generación (g) depende de:

composición

del

medio,

temperatura, pH, osmolaridad (tonicidad), entre otros.

Los microorganismos heterótrofos suelen crecer más rápidamente en los medios complejos, ricos, que en los medios sintéticos, y dentro de estos últimos, mejor con glucosa que con otras fuentes de carbono. Algunos microorganismos tienen, a su temperatura óptima tiempos de generación muy cortos (15, 20 min), mientras que otros tienen crecen más lentamente, con tiempos de generación que pueden ser de varias horas o incluso días.

4) Fase de aceleración negativa, de crecimiento desequilibrado, que conduce a…

5) Fase estacionaria: Esta fase se caracteriza porque el coeficiente neto de crecimiento se hace nulo ( = 0), pero aún existe crecimiento. Lo que ocurre es que el crecimiento bruto se equilibra con las muertes celulares.

En este período se agotan nutrientes especiales y se acumulan sustancias de

desecho.

Incluso

el

crecimiento celular.

pH

del medio

empieza

a hacerse inadecuado para

el

Si la bacteria crece en un medio complejo, la fase 4 de transición (de aceleración negativa) puede ser relativamente larga, debido a que va recurriendo a fuentes alternativas (p. ej., puede recurrir a aminoácidos como fuente de C una vez agotados los hidratos de carbono).

6) Fase de muerte exponencial: Se da muerte y lisis masiva, exponencial, del cultivo. Se debe a agotamiento de reservas de energía. Algunas veces las células aparecen grandes, hinchadas, distorsionadas (formas “fantasmas”, “ghost”). La pendiente de esta parte de la curva depende de las especies (por ejemplo, en bacterias entéricas es suave, mientras que en Bacillus es más acentuada).

2.2: Modelos Matemáticos del crecimiento microbiano

Para muchos propósitos en biotecnología microbiana es necesario conocer el número de generaciones, la población de bacterias con el fin de estimar el estado fisiológico de la población microbiana y establecer relaciones con los sustratos del medio de cultivo o los productos de biosíntesis.

En los organismos unicelulares la célula se divide por fisión binaria dando lugar a dos células hijas, cada una de las cuales se divide nuevamente produciendo dos células nuevas, por lo que en cada periodo e división la población se duplica. Esta multiplicación representa una progresión geométrica en la cual hay una relación directa entre el número de células iniciales y la cantidad de células en otro tiempo determinado. La expresión matempática que representa esta relación es:

N = No2 n Donde:

N= numero final de células, No = número inicial de células

n = número de generaciones

Para explicar la anterior ecuación en términos de n se aplica una transformación logarítmica cuyo resultado es:

n = número de generaciones Para explicar la anterior ecuación en términos de n se aplica

El tiempo de generación (G) de la población es:

  • donde,

t = horas o minutos de crecimiento exponencial

Una expresión alternativa del crecimiento se deriva de asumir que la velocidad de incremento en la masa celular o densidad celular (dx/dt) en un tiempo (t) es proporcional a la densidad celular en dicho tiempo. Por consiguiente:

  • de donde:

x = número de células o algún componente (proteína) Integrando se obtiene:

ln X 1 –= ln Xo + t

Tomando el antilogaritmo a cada lado se obtiene

X1 = Xoe t
X1 = Xoe t

Considerando que después de un tiempo la población se duplica (td) entonces:

X1 = 2Xo por tanto, la duplicación de la población celular se puede expresar así:

X1/Xo = 2 reordenando los valores en la penúltima ecuación se obtiene:

2 = e t aplicando antilogaritmo a cada lado se obtiene:

Considerando que después de un tiempo la población se duplica (td) entonces: X1 = 2Xo por

entonces:

= 0.693/td
= 0.693/td

Ejemplo explicativo:

A continuación se muestran los datos de un experimento de crecimiento bacteriano de E. colli el cual se realizo durante 5 horas. El número de células fue cuantificado por unidades formadoras de colonia por cajas petri. Con los datos de la tabla calcular el número de generaciones, el tiempo generacional y la velocidad especifica de crecimiento (µ)

Tiempo(hr)

 

N

Número de

células /ml

0

2x10 7

1

3x10 7

2

4

x10 7

3

6

x10 7

4

8

x10 7

5

1

x10 8

Debido a que el crecimiento bacteriano es una progresión geométrica, existe una relación directa entre el número de células presente en el momento inicial y el habido en un momento determinado del crecimiento exponencial de modo que:

N= N2 n

Donde N = numero final de células, No= numero inicial de células y n = numero de generaciones, por tanto despejando la ecuaciones anteriores tenemos que

n= ( logN-logNo) / log 2

n =( log N – log No ) / 0,301; remplazando tenemos

n= log 10 8 – log (2 x 10 7 ) / 0.301, resolviendo :

n=(8 – 7,301) /0,301

n = 2,32
n = 2,32

G = t/n G= 5hr/2.32 generaciones

  • G= 2.15 horas

====

ln 2 /td

====

0.6931/ 2.15

= 0.3223

== =

 

Una aplicación especialmente importante de la constante de velocidad instantánea, es el Quimiostato, el cual es un dispositivo de cultivo continuo donde el Volumen es constante y el nutriente entra con la misma velocidad con la que sale. En este equipo el tamaño de la población y la velocidad de crecimiento pueden mantenerse constantes, puesto que la velocidad de crecimiento es una función de la concentración de nutrientes. Monod propueso la siguiente ecuación para representar esta relación:

Donde N = numero final de células, No= numero inicial de células y n = numero

Donde máx. es la velocidad de crecimiento a saturación de nutriente, S es la

concentración

de nutriente,

y

K

es

una

constante de

saturación

que

es

numéricamente igual a la concentración de nutriente a la que = ½ de max La ecuación anterior es formalmente equivalente a la ecuación de Michaelis- Mente usada en el análisis de la cinética enzimática. La determinación de los parámetros desconocidos max y Ks se puede hacer representando 1/sobre el eje y frente a 1/S sobre el eje X. Se obtendrá una línea recta que corta al eje Y, y el valor en el punto de intervenciones 1/ max .La pendiente de la recta es Ks/ máx y como se

conoce máx se puede calcular Ks. En general los valores de Ks son muy bajos

LECCIÓN 3: SISTEMAS DE FERMENTACIÓN

3.1 Tipos de fermentación

1) Fermentación discontinua: Una fermentación discontinua (en «batch») puede ser considerada como un sistema cerrado. A tiempo cero t = 0, la solución

esterilizada de nutrientes se inocula con microorganismos y se permite que se lleve a cabo la incubación en condiciones óptimas de fermentación. A lo largo de toda la fermentación no se añade nada, excepto oxígeno (en forma de aire), un agente antiespumante y ácidos o bases para controlar el pH. La composición del medio de cultivo, la concentración de la biomasa y la concentración de metaboli- tos cambia generalmente en forma continua como resultado del metabolismo de las células. Después de la inoculación de una solución nutritiva estéril con microorganismos y su cultivo en condiciones fisiológicas se observan cuatro fases típicas de crecimiento: fase de latencia, fase logarítmica, fase estacionaria y fase de muerte

2) Proceso de fermentación alimentada (fed-batch)

En los procesos convencionales discontinuos que acabamos de describir, todos los substratos se añaden al principio de la fermentación. Una mejora del proceso cerrado discontinuo es la fermentación alimentada, que se utiliza en la producción de substancias como la penicilina. En los procesos alimentados los substratos se añaden escalonadamente a medida que progresa la fermentación. La formación de muchos metabolitos secundarios está sometida a represión catabólica por altas concentraciones de glucosa, por otros carbohidratos, o por

compuestos nitrogenados. Por esta razón en el método alimentado los elementos críticos de la solución de nutrientes se añaden en pequeñas concentraciones al principio de la fermentación y continúan añadiéndose a pequeñas dosis durante la fase de producción.

Puesto que generalmente no es posible medir la concentración del substrato directa y continuamente durante la fermentación a fin de controlar el proceso de alimentación, tienen que ser medidos parámetros indirectos que estén correlacionados con el metabolismo del substrato crítico. Por ejemplo, en la producción de ácidos orgánicos, el valor del pH puede ser utilizado para determinar la velocidad de alimentación de la glucosa. En fermentaciones con valores osmóticos críticos la alimentación puede ser regulada controlando el valor de pO 2 o el contenido en CO 2 , en los gases que se liberan.

3) Fermentación continua.

En la fermentación continua se establece un sistema abierto. La solución nutritiva estéril se añade continuamente al biorreactor y una cantidad equivalente de solución utilizada de los nutrientes, con los microorganismos, se saca simultáneamente del sistema. Entre las distintas clases de fermentaciones

continuas pueden ser distinguidos dos tipos básicos:

a. Biorreactor mezclado homogéneamente. Este es utilizado como un quimiostato o como un turbidostato. En el quimiostato en estado de equilibrio, el crecimiento de las células se controla ajustando la concentración de un substrato (Fig. 3.A). cualquier substrato que se requiera (carbohidrato, compuesto nitrogenado, sales, a,) puede ser utilizado como substrato limitante. En el turbidostato el crecimiento de las células se mantiene constante utilizando la turbidez para controlar la concentración de biomasa y la velocidad de alimentación de la solución de nutrientes se ajusta de forma apropiada (Fig. 3).

Figura 3 Fermentación continua en Fermentador de flujo de tapón

quimiostato

A),

Turbidostato

B)

y

Fuente: Crueger y Crueger, 1993 Manual de Microbiología industrial b. Reactor de flujo de tapón .

Fuente: Crueger y Crueger, 1993 Manual de Microbiología industrial

b. Reactor de flujo de tapón. En este tipo de fermentación continua la solución de cultivo fluye a través de un reactor tubular sin mezclado. La composición de la solución de nutrientes, el número de células, la transferencia de masa (suministro de O 2 ) y la productividad varían en distintas posiciones dentro del sistema (Fig. 3C). A la entrada del reactor las células deben añadirse continuamente junto con la solución de nutrientes (generalmente como un flujo que revierte de una desviación desde la salida del fermentador o desde una segunda fermentación continua).

En un proceso continuo en condiciones de equilibrio la pérdida de células debida al fluido que sale debe ser balanceada por el crecimiento del microorganismo

Fuente: Crueger y Crueger, 1993 Manual de Microbiología industrial b. Reactor de flujo de tapón .

La velocidad de flujo D se define corno la velocidad de flujo volumétrico (que entra y sale) a través del volumen del fermentador. Utilizando la ecuación de Monod que describe la dependencia de la velocidad específica de crecimiento sobre la concentración de substrato limitante pueden

ser determinados en el biorreactor

la

constante de rendimiento

biomasa/substrato (Y X/S ), la densidad de las células (X) y la concentración de

substrato (S).

La velocidad de flujo D se define corno la velocidad de flujo volumétrico (que entra y

A velocidad más baja de flujo el substrato es casi completamente agotado por las células (S  O). La concentración de células es entonces X = S o /Y. Si D aumenta, X desciende lentamente, al principio en forma lineal y luego a D = µ m cae bruscamente hasta O. S aumenta lentamente al principio y se aproxima a S o a D = µ m . Cuando X es cero en la ecuación que explica el sustrato (S), se alcanza el punto de lavado D m .

La velocidad de flujo D se define corno la velocidad de flujo volumétrico (que entra y

Por encima de D m no es posible un estado de equilibrio. Si la velocidad de flujo es sólo ligeramente más baja que D" el sistema es muy sensible a las influencias externas. Pequeñas desviaciones en la alimentación pueden originar cambios extremos en la biomasa o en la separación de las células. La Figura 4 muestra la

interdependencia de la velocidad de flujo,

la concentración de substrato, la

concentración de células y la velocidad de formación de células (µ m = 1 h -1 K s =

0,2 g/l Y = 0,5).

Figura 4. Efecto de la velocidad de flujo sobre la concentración de substrato (5), la concentración de células (X). Tiempo de duplicación (1,) y velocidad de fermentación de células (D * X)

Por encima de D no es posible un estado de equilibrio. Si la velocidad de flujo

Fuente: Crueger y Crueger, 1993 Manual de Microbiología industrial

La velocidad específica máxima de crecimiento en los procesos industriales se escoge de forma que se obtenga el rendimiento más alto en el volumen más pequeño de fermentador y en el tiempo más corto.

El modelo de Monod no es generalmente aplicable a la fermentación continua a velocidades muy bajas o muy altas de dilución. A velocidades medias de dilución

la relación

molar

entre la

biomasa producida y

el

CO 2

que se desprende es

constante. A bajas velocidades de dilución la proporción de CO 2 se hace más

grande.

Esto

se

debe

a

que

se

utiliza

más

fuente de energía

para

el

mantenimiento de la estructura celular, para la regulación osmótica o para la

motilidad.

Por otra parte,

a velocidades altas de flujo

una parte del carbono

añadido es oxidado incompletamente (a productos como piruvato, acetato o

ácidos tricarboxílicos)

y

de

esta

forma se reduce la productividad.

A

bajas

velocidades

de

flujo,

con

nitrógeno como substrato limitan

te,

se forman

materiales de reserva, como polisacáridos, lo que resulta en un aumento en el

tamaño de la célula y por tanto de la biomasa.

3.2 Productividad y velocidad específica de producción

La productividad de una fermentación se define como Productividad P = Concentración de producto / I = unidades

Tiempo de fermentación

h x L

Para evaluar la economía de un proceso deben ser considerados varios factores, el tiempo de producción de la fermentación, el tiempo requerido para limpiar y poner a punto el fermentador, el tiempo de esterilización y la duración de la fase de latencia. En la Figura 5 la pendiente de la tangente de la curva de formación del producto es una medida de la productividad máxima y la pendiente de la línea recta, al final de la curva de formación de producto, indica la productividad total.

Que el proceso de fermentación termine al tiempo de la productividad máxima o más tarde depende de los costes de operación, que incluyen la energía, gastos generales, costes de mano de obra, gastos en personal y la capacidad del sistema. Utilizando una gráfica como la de la Figura 5 se puede hacer una estimación de como optimizar el proceso. En fermentaciones a tiempo corto (8- 70 h) el tiempo para la puesta a punto es significativo, mientras que en fermentaciones largas (>3 días) el tiempo de puesta a punto es menos crucial.

Las condiciones de fermentación afectan directamente la productividad. La Figura 6 muestra la productividad de un proceso para la obtención de proteína de origen

unicelular en relación al contenido del substrato (hidrocarburo). Existe un aumento lineal de [a productividad a medida que el contenido del substrato aumenta, hasta que se alcanza la concentración a la que el hidrocarburo se convierte en la fase continua (aceite y agua no son miscibles). Por encima de esta concentración la productividad decrece.

Figura 5. Productividad total y productividad máxima

unicelular en relación al contenido del substrato (hidrocarburo). Existe un aumento lineal de [a productividad a

Fuente: Crueger y Crueger, 1993 Manual de Microbiología industrial

En fermentaciones continuas la productividad puede ser expresada como:

P

=

D

*

X

(g/l *h)

Cuando se utiliza la relación de la ecuación sobre sustrato (S) resulta la siguiente

ecuación:

 

P=D*Yx/y (S 0 – D*K s m -D)

Figura 6. Productividad en relación a la concentración de ácidos grasos en un proceso de producción de proteína de origen unicelular.

Figura 6. Productividad en relación a la concentración de ácidos grasos en un proceso de producción

Fuente: Crueger y Crueger, 1993 Manual de Microbiología industrial

En fermentaciones continuas la productividad máxima es igual a la productividad total ya que el tiempo de establecimiento y la fase de latencia pueden ser despreciados. Por ejemplo, si el tiempo inicial de puesta a punto requiere 24 h Y la propia fermentación continua funciona durante 24 horas con una velocidad de flujo de O,1 h-l, 24 h con 0,15 h-l Y al menos 72 h con 0,2 h-l, la productividad total para el producto X se calcula como se muestra en la Tabla 2.

La velocidad específica de producción q deriva de la ecuación 1 de la siguiente forma: El

La velocidad específica de producción q p deriva de la ecuación 1 de la siguiente forma:

La velocidad específica de producción q deriva de la ecuación 1 de la siguiente forma: El

El valor P 1 es la concentración de producto y la velocidad específica de producción qp es equivalente a la velocidad específica de crecimiento µ en la ecuación 1. Sin embargo, en los procesos de tipos II y IlI no hay correlación directa entre µ y q p

  • 3.3 Coeficientes de rendimiento

Monod definió originalmente el coeficiente de rendimiento Y como la relación de células producidas a substrato consumido:

La velocidad específica de producción q deriva de la ecuación 1 de la siguiente forma: El

Hoy los coeficientes generales de rendimiento se utilizan para caracterizar los procesos de fermentación, es decir las relaciones de las células producidas a los substratos individuales convertidos o a la energía liberada o energía consumida. Sin embargo, los coeficientes de rendimiento no son constantes, ya que dependen de parámetros biológicos (X, µ) y de parámetros químicos (pO 2 relación C/N, y contenido en fósforo del medio.

Los coeficientes de rendimiento han sido clasificados en tres grupos. El primer grupo de coeficientes (Y s Y 02 Y kcal ) da información acerca de los procesos técnicos y por tanto acerca de la economía. El segundo grupo (Y c Y p Y N Y ave ) describe el catabolismo, anfibolismo y anabolismo.

El tercer grupo incluye Y ATP un coeficiente que describe las relaciones de energía de las células (Tempest y Neijssel, 1984). Algunos autores utilizan otros coeficientes de rendimiento que deben ser propiamente designados, como muestra;

Hoy los coeficientes generales de rendimiento se utilizan para caracterizar los procesos de fermentación, es decir

3.4 PRINCIPIOS DE BIOINGENIERÍA

Como ya se dijo, el equipo donde se realiza el proceso se denomina biorreactor o fermentados. El mismo provee todos los servicios que son necesarios para el cultivo, tales como mezclado, termostatización, suministro de oxígeno, entradas para adición de nutrientes, control del pH, etc. Por otra parte, cuando se habla de sistemas de cultivo o, también, métodos de cultivo, se hace referencia al modo de operar el biorreactor, esto es en forma continua o discontinua. En esta fase nops ocuparemos de los birreactores.

3.4.1 Biorreactores

El biorreactor, es sin duda, uno de los equipos fundamentales de la microbiología industrial. Es el recipiente donde se realiza el cultivo, y su diseño debe ser tal que asegure un ambiente uniforme y adecuado para los microorganismos. Las "tareas" que realiza el biorreactor pueden resumirse del siguiente modo:

  • a) Mantener las células uniformemente distribuidas en todo el volumen de cultivo

a fin de prevenir la sedimentación o la flotación.

  • b) Mantener constante y homogénea la temperatura.

  • c) Minimizar los gradientes de concentración de nutrientes.

  • d) Suministrar oxígeno a una velocidad tal que satisfaga el consumo

  • e) El diseño debe ser tal que permita mantener el cultivo puro; una vez que todo

el sistema ha sido esterilizado y posteriormente sembrado con el microorganismo

deseado.

Para satisfacer los cuatro primeros puntos es necesario que el biorreactor esté provisto de un sistema de agitación, a demás para el punto d) se requiere de un sistema que inyecte aire en el cultivo.

Describiremos brevemente dos tipos de biorreactores de uso muy difundido: el tanque “agitado” y al "air lift". En el primero de ellos (Figura 7) la agitación se realiza mecánicamente mediante un eje provisto de turbinas accionado por un motor.

El biorreactor, es sin duda, uno de los equipos fundamentales de la microbiología industrial. Es el

Figura 7. Esquema de un reactor aerobio con agitación mecánica.

El aire se inyecta por la parte inferior del tanque y es distribuido por una corona que posee pequeños orificios espaciados regularmente. El chorro de aire que sale de cada orificio es "golpeado" por las paletas de la turbina inferior generándose de este modo miles de pequeñas burbujas de aire, desde las cuales difunde el O 2 hacia el seno del líquido. El sistema de agitación se completa con cuatro o seis deflectores que tienen por finalidad cortar o romper el movimiento circular que imprimen las turbinas al líquido, generando de este modo mayor turbulencia y mejor mezclado. El tanque está rodeado por una camisa por la que circula agua, lo que permite controlar la temperatura. Para tanques mayores que 1000 ó 2000 litros este sistema ya no es eficiente y es reemplazado por un serpentín que circula adyacente a la pared interior del tanque. Debe tenerse en cuenta que a medida que es mayor el volumen de cultivo también lo es la cantidad de calor generado, por lo que se hace necesario una mayor área de refrigeración. Los tanques son de acero inoxidable y están pulidos a fin de facilitar la limpieza y posterior esterilización.

Figura 7. Esquema de un reactor aerobio con agitación mecánica. El aire se inyecta por la

Figura 8. Esquema de un reactor tipo Air lift.

El aire que ingresa al biorreactor debe estar estéril, lo que se consigue haciéndolo pasar por un filtro cuyo diámetro de poro es de 0,45 micrones, que impide el paso de microorganismos y esporas. En los reactores de tipo "air lift" (Figura 8) es el mismo aire inyectado al cultivo lo que promueve la agitación. Básicamente consiste en dos cilindros concéntricos y por la base de uno de ellos, por ejemplo el interior, se inyecta aire. De este modo se genera una circulación de líquido ascendente en el comportamiento interno y descendiente en el externo, lo que favorece el mezclado.

4.4.2Transferencia de O 2

En los procesos de fermentación aerobios es necesario un suministro adecuado de oxígeno que satisfaga los requerimientos metabólicos de los microorganismos empleados. La oxidación de la fuente de carbono y su transformación en células, productos y CO 2 establece una demanda de oxígeno que es esencial satisfacer a a través de la aireación y mezclado del cultivo. Por ejemplo en el cultivo de levadura sobre medio mineral glucosado al 1%, la demanda de O 2 para una concentración celular de 10 g de peso seco de células / litro es de 41 mg/lmin

Esta demanda de oxigeno es bastante más alta en comparación con la concentración de saturación de oxigeno a temperatura normal de la fermentación (30°C) que es de 7.5 mg/l. Cuando se evalúa la transferencia de oxigeno en una fermentación es necesario calcula las resistencia a la transferencia que encuentra el O2 antes de llegar a la célula.

la resistencias a la transferencia de una gas poco soluble, tal como el O. a partir de una burbuja hacia una agregado microbiano se puede descomponer en :

  • - Difusión del oxigeno del interior de la burbuja hacia la interfase gas – liquido

  • - Transferencia a través de la interfase

  • - Difusión en la película liquida de la burbuja

  • - Transferencia en la fase liquida homogénea

  • - Difusión en la película líquida que rodea el agregado

  • - Difusión dentro del agregado.

Se ha demostrado que la resistencia mayor la opone la película de líquido que rodea las burbujas. Pero esto solo ocurre en el caso de los organismos

unicelulares;

en

los

agregados

celulares

(pellets) la

difusión a

través

del

agregado mismo constituye el paso controlante.

La velocidad de transferencia de 0 2 ,

R02, desde el seno de la fase gaseosa

(burbujas) hasta la fase líquida está dada por la siguiente ecuación:

- Difusión en la película liquida de la burbuja - Transferencia en la fase liquida homogénea

Donde KLa es el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno,

C

la

concentración de 0 2 disuelto en el seno del líquido y C* la concentración de 0 2 disuelto que estaría en equilibrio con la presión parcial de oxígeno de la fase

gaseosa.

El

KLa

depende del diseño

del biorreactor, de

las

condiciones de

operación (caudal de

aire,

agitación) y

de la viscosidad

del cultivo.

A mayor

viscosidad menor K La. El KLa es una medida de la capacidad que posee un

biorreactor para sumínistrar O2 y el rango de valores usuales está comprendido entre 50 h-1 y 1000 h. por tanto la ecuación sería :

- Difusión en la película liquida de la burbuja - Transferencia en la fase liquida homogénea

4.3: Características de la Fermentación en gran escala.

El fermentador donde se lleva a cabo los procesos industriales pueden variar en tamaño de la escala pequeña de laboratorio 5-10 litros a la enorme escala industrial de 400.000 litros. Las dimensiones dependen del proceso y de cómo

opera. Los procesos manejados en lote o batch requieren fermentadores más grandes que los manejados en forma contínua o semicontínua.

Tabla 1. Tamaño de fermentadores para varios procesos

Tamaño del fermentador (litros)

Producto

1-20.000

Enzimas para diagnóstico, sustancias para biología molecular

40-80.000

Algunas enzimas, antibióticos

100- 150.000

Penicilina, antibióticos amino-glicósidos, proteasas, amilasas, transformaciones de esteroides, amino ácidos

450.000

Amino ácidos ( ácido glutámico)

- Control y monitoreo del proceso.

Debido a los elevados costos de producción, los fermentadores industriales están cuidadosamente controlados. No solo se necesita controlar el crecimiento y la formación del producto, sino que se deben controlar otros factores ambientales a medida que el proceso se efectúa. Los factores ambientales controlados más frecuentemente son: la concentración de oxígeno, pH, masa celular y concentración del producto. También es necesario en muchos casos controlar la espuma dentro del fermentador y ajustar la temperatura. En la actualidad se utilizan computadoras para controlar los procesos de fermentación ya sea en la obtención de datos que reflejen los cambios que tienen lugar durante el proceso de fermentación o en el control de varios factores ambientales que se deben ajustar o alterar durante la fermentación. La obtención de datos a medida que el proceso de fermentación tiene lugar se llama adquisición inmediata y tiene un valor especial cuando estos datos se puedan procesar para convertirlos en cifras que puedan interpretarse en términos microbiológicos o bioquímicos. Las computadoras también permiten graficar los datos obtenidos permitiendo al operador del fermentador tener una representación visual del progreso de la fermentación. Finalmente la computadora nos permite almacenar los datos en

forma legible de modo que estos datos se puedan traducir a otro sistema, o analizar en forma mas sofisticada.

Un uso mas sofisticado de las computadoras es el control inmediato del proceso de fermentación por ej. cambiando los parámetros ambientales a medida que la fermentación progresa o agregando un nutriente a la velocidad de equilibrio exacto del crecimiento, en esta forma el nutriente es añadido cuando se necesita evitando en algunos casos que el mismo sea metabolizado a productos indeseables.

Finalmente, las computadoras pueden ayudar a modular los procesos de fermentación, para ello se debe desarrollar un modelo matemático del proceso de fermentación, el cual incorpora ecuaciones diferenciales para describir el crecimiento microbiano y la formación del producto. El valor del uso de una computadora para modelar el proceso de fermentación es que se puede ensayar el efecto de varios parámetros sobre el crecimiento y sobre la formación del producto en forma rápida e interactivamente, y entonces hacer modificaciones en los parámetros para ver como afectan al proceso. De esta forma se pueden estudiar con gran economía muchas variaciones de la fermentación en la Terminal de la computadora y no en forma más costosa en la planta piloto o en la planta industrial.

- Escalamiento del proceso de fermentación. Uno de los aspectos mas importantes y complicados de la microbiología industrial es la transferencia de un proceso del equipo de laboratorio a pequeña escala, al equipo comercial a gran escala, procedimiento que se llama escalamiento. Es sumamente importante comprender los problemas del escalamiento ya que es raro que un proceso microbiano se comporte de la misma forma en fermentadores a gran escala que en un equipo de laboratorio a pequeña escala. La mezcla y la aireación son mucho mas eficientes en el matraz de laboratorio pequeño que en el fermentador industrial grande. A medida que cambia el tamaño del equipo, cambia la relación superficie/volumen. El fermentador tiene un volumen mucho mayor para un área superficial determinada. Como la

transferencia del gas y la mezcla dependen de la superficie expuesta más que del volumen del fermentador, es obvio que sea más difícil mezclar el contenido del tanque grande que del matraz pequeño. Como la mayor parte de las fermentaciones industriales son aeróbicas, es indispensable una transferencia efectiva del oxigeno. Con el medio de cultivo rico que se utiliza en los procesos industriales se obtiene una alta biomasa, que origina una gran demanda de oxigeno. Si se reduce la aireación, aun durante un periodo corto, el cultivo puede experimentar una anaerobiosis parcial, con serias consecuencias en términos de rendimiento del producto. El escalamiento en el fermentador industrial es la tarea del ingeniero bioquímico, quien esta familiarizado con la transferencia de gases, la dinámica de fluidos y la termodinámica. El papel del microbiólogo industrial en el proceso de escalamiento es trabajar estrechamente con el ingeniero bioquímico para asegurar que se han abarcado los parámetros necesarios para una fermentación exitosa y que se dispone de las cepas microbianas apropiadas para una fermentación en gran escala.

Las distintas etapas que deben realizarse para llegar de un proceso de laboratorio a un proceso industrial son las siguientes:

1) Experimentos en el matraz de laboratorio que son generalmente la primera indicación que es posible un proceso de interés industrial.

2)

El

fermentador

de

laboratorio,

un

fermentador

a

escala

pequeña,

generalmente de vidrio y de 5 a 10 litros de capacidad. En el fermentador de laboratorio es posible ensayar variaciones en el medio de crecimiento, temperatura, pH, etc., ya que los costos son bajos tanto en el equipo como en los medios de cultivo.

3) La etapa en planta piloto, que se suele llevar a cabo en equipos de 300 a 3000 litros. Aquí las condiciones se acercan mas a la escala industrial, pero el costo no es aun un factor de importancia. En el fermentador de una planta piloto es deseable una cuidadosa instrumentación y un control con computadora, de modo

que las condiciones que se obtengan sean lo más similares a las del fermentador industrial.

CAPITULO 3: PRINCIPIOS DE BIOTECNOLOGÍA ENZIMÁTICA Lección 1: Las enzimas, biocatalizadores de naturaleza proteínica

Definición:

El choque entre dos moléculas produce energía que puede ser absorbida por las moléculas mismas, o puede ser disipada bajo forma de calor en el medio. Si la energía absorbida por el substrato (S) es suficiente para franquear la barrera de potencial, llamada energía de activación, el substrato se puede transformar y conducir a la formación de un producto (P), es decir llegar a un estado final, diferente del estado inicial. Esta energía de activación generalmente es elevada y no es compatible con las condiciones del medio en el cual se deben desarrollar las reacciones del metabolismo de los organismos vivientes: pH vecino de la neutralidad, temperatura comprendida entre O y 40°C, presión vecina a la presión atmos- férica. Por tanto, la realización de esas reacciones necesita de catalizadores bioquímicos, las enzimas cuya acción consiste, como la de todo catalizador abatir la energía de activación lo que tiene por efecto acelerar la reacción, cuya velocidad se encuentra multiplicada por un factor del orden de 10 12 -10 20 . Al final de cada ciclo de reacción, la enzima permanece inalterada.

E + S

que las condiciones que se obtengan sean lo más similares a las del fermentador industrial. CAPITULO

ES

que las condiciones que se obtengan sean lo más similares a las del fermentador industrial. CAPITULO

E + P

Las enzimas son pues, catalizadores biológicos de naturaleza protídica que intervienen en todas las reacciones metabólicas energéticamente posibles, que ellas aceleran por activación específica. Permiten alcanzar rápidamente el estado de equilibrio de la reacción sin modificarlo. Son las llaves útiles de la biotecnología y de la bioindustria. Son ellas las que en la ingeniería micro- biológica, catalizan las reacciones metabólicas puestas en juego y aseguran su regulación. Son ellas igualmente las que conducen la ingeniería genética para realizar las modificaciones del equipamiento enzimático de ciertos

microorganismos con vista a hacerlos aptos para la biosíntesis de metabolitos interesantes El conocimiento de las enzimas, de su naturaleza y de sus propiedades, así como de la cinética de las reacciones que catalizan es fundamental en biotecnología

1.2 Naturaleza de las enzimas

Todas ellas son macromoléculas que corresponden a la clase de las proteínas

globulares. Algunas son holoproteínas constituidas únicamente por un enca- denamiento de ácidos aminados; otras son heteroproteínas, que poseen una parte no proteínica, el cofactor, necesario para la actividad catalítica y asociado más o menos fuertemente a la proteína.

Especificidad de la catálisis enzimática sitio activo:

Una de las características más importantes de la catálisis enzimática reside en su especificidad, mucho más marcada que la especificidad de la catálisis química. Esta especificidad presenta un doble aspecto:

Especificidad de reacción. Una enzima no puede catalizar sino un solo tipo de reacción, por ejemplo: hidrólisis de enlaces glucosídicos o hidrólisis de enlaces ésteres (lipólisis), etc. Esta especificidad sirve de base a la clasificación de estos catalizadores bioquímicos.

Especificidad en cuanto al substrato. Esta propiedad resulta delhecho, plenamente establecido, de que toda reacción enzimática implica la fijación del substrato en puntos bien precisos de la proteína enzimática. Esta fijación se hace por el establecimiento de enlaces de tipo del de hidrógeno, hidrófobos o de Van der Waals.

La conformación de la proteína enzimática es tal, que no reconoce sino un tipo de substrato. Ciertas enzimas presentan una especificidad estricta y son capaces de asociarse a un único substrato; éste es el caso de la fumarasa (EC. 4.2.1.2) que transforma el L-malato en fumarato y que no tiene acción sobre el D-malato o

sobre ningún otro compuesto relacionado. Otras enzimas, por el contrario, se pueden fijar a substratos diferentes, pero de la misma naturaleza y provocar un mismo tipo de reacción química. La enzima, después de haber fijado el substrato, lo transforma en seguida. Para esto, su estructura espacial es tal, que en la vecindad y a las distancias adecuadas se encuentran grupos funcionales en donde las acciones diferentes y complementarias realizan la reacción. La pequeña porción de la enzima, implicada en la fijación y posicionamiento del substrato, así como en la reacción de catálisis, delimita un volumen denominado "sitio activo". En las enzimas holoproteínicas, éstos son principalmente los agrupamientos funcionales libres situados en los radicales de algunos ácidos aminados que intervienen al nivel del sitio activo (función OH de la serina, núcleo imidazol de la histidina, función fenol de la tirosina, función COOH de los ácidos aspártico o glutámico, función tiol de la cisteína).

En

lo

que concierne a

las

enzimas del tipo heteroproteínico, la fijación

al

substrato se hace sobre la parte proteínica,

la apoenzima, mientras que la

catálisis de la reacción es hecha por la parte no proteínica, el grupo prostético o el cosubstrato.

La parte "apoenzima" de la molécula enzimática que lleva el sitio de fijación al substrato es por consiguiente responsable de la especificidad en cuanto al substrato de esa enzima. Pero también puede intervenir en la especificidad de la reacción e inducir un tipo particular de reacción. Así es, por ejemplo, que en el metabolismo de los ácidos aminados, el fosfato depiridoxal puede, de acuerdo a la apoenzima con la cual está combinado, catalizar reacciones, sean de transaminación, sean de descarboxilación, de desaminación, o de racemización.

La actividad de las enzimas es función directa de su estructura terciaria o de la cuaternaria. En estas condiciones, todo tratamiento que modifique la conformación de la enzima (calentamiento, modificación del pH), es decir estorbando o impidiendo, la fijación del substrato a la enzima o cambiando la estructura del sitio activo, alterará las propiedades catalíticas de la enzima y por tanto su función.

1. 3: Cofactores Las enzimas heteroproteínicas utilizan diversos tipos de cofactores: algunos son iones metálicos (Mg++,

1. 3: Cofactores

Las enzimas heteroproteínicas utilizan diversos tipos de cofactores: algunos son iones metálicos (Mg++, Fe++, eu++, Mo+++, Zn++), Fig. otros cofactores son orgánicos (heme, nicotinamida, flavina, coenzima A, fosfato de piridoxal, tiamina, etc.). Este tipo de enzima adopta diversas formas de funcionamiento, lo que con frecuencia entraña una confusión en la terminología de estos cofactores. En efecto, algunos están combinados fuertemente a la apoenzima por intermedio de enlace covalente; son parte integrante de la enzima y no se le separan: se les designa con el nombre de grupos prostéticos. Otros, por el contrario, son co- substratos; se fijan en un primer tiempo sobre la apoenzima, provocando la transformación del substrato sufriendo una modificación en su estructura química; después se separan de la apoenzima: se les denomina coenzimas. Regresan a su estado inicial en el transcurso de una segunda etapa enzimática fijándose sobre otra apoenzima.

Para ilustrar esta distinción, tomemos el caso de dos enzimas responsables de la oxidación de ácidos aminados: la L-aminoácido-oxidasa y la glutamato deshidrogenada.

La primera (EC. 1.4.3.2) es una flavoproteína en la cual el cofactor, la flavina adenosina dinucleótido (FAD) se comporta como un grupo prostético. Permaneciendo fija a la apoenzima provoca la oxidación por deshidrogenación y

desaminación del ácido aminado y se reduce a F ADH:z. La enzima regresa a su

estado

inicial cediendo los

dos hidrógenos, fijados transitoriamente, a un

segundo substrato, oxidante más potente, que provoca la reoxidación del F ADH:z a F AD.

A la inversa, la glutamato deshidrogenasa (EC. 1.4.1.2) cataliza una reacción del mismo tipo, la oxidación del ácido glutámico a ácido 2-oxoglutárico con ayuda de la coenzima nicotinamida adenina dinucleótido (NAD). Esta se encuentra reducida. Abandona la superficie de la apoenzima. En seguida será reoxidada a expensas de otro substrato que es reducido por otro sistema enzimático del medio. El NAD se comporta en estas dos reacciones sucesivas como un substrato.

segundo substrato, oxidante más potente, que provoca la reoxidación del F ADH:z a F AD. A
  • 1.4 Nomenclatura y clasificación de las enzimas:

La nomenclatura y la clasificación de las enzimas han sido normalizadas por la Comisión sobre Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica, creada en 1955

antes de solucionar la confusión que había y el-riesgo de que la situación se agravara con el rápido progreso del conocimiento acerca de las enzimas. Los objetivos que fueron asignados a esa Comisión sobre Enzimas desde su creación fueron:

Hacer un inventario de las enzimas identificadas y caracterizadas,

precisando para cada enzima la naturaleza exacta de la reacción catalizada. Establecer, a partir de este inventario, una clasificación de las enzimas.

Definir, con base en esta Clasificación, reglas de nomenclatura que permitan designar, sin ambigüedad, a una enzima dada, proporcio- nando la mayor información posible sobre la naturaleza de la reacción catalizada.

Para cada enzima es preciso:

La reacción catalizada.

Su nombre sistemático en nomenclatura normalizada.

Y sobre todo su número de identificación que define sin ninguna am- bigüedad, el lugar de la enzima en la clasificación normalizada. Este I número contiene 4 cifras o números, separados por puntos, cada uno de

ellos corresponde a los elementos siguientes:

  • a) La primera cifra indica la clase a la cual pertenece la enzima. Estas

clases, en número de 6 se definen de acuerdo a la naturaleza general de la reacción catalizada. Hay: l-oxidorreductasas, 2-Transferasas, 3- Hidrolasas, 4-Liasas, 5-Isomerasas, 6-Ligasas (o sintetasas). I

  • b) La segunda y la tercera cifras designan la subccase y la sub-sub- I clase, definiendo en cada clase, según ciertos criterios que se pre- cisarán más adelante.

  • c) La cuarta

cifra da

el número

de orden

de la

enzima

en

la

sub-clase

considerada

La regla general adoptada para designar

a

una

enzima

de acuerdo

a

la

nomenclatura sistemática es que el nombre de una enzima se forme de dos

partes:

La primera

lleva

el

nombre

del

substrato;

o

en

el

caso

de

reacciones

bimoleculares, los nombres de los dos substratos separados por "dos puntos".

La segunda parte indica la clase a la cual pertenece la enzima; el nombre de la clase puede. Precisarse por un prefijo que precede al tipo exacto de reacción catalizada.

1.4.1: Clasificación de las enzimas según la naturaleza de la reacción

OXIDORREDUCTASAS

Catalizan las reacciones de oxidorreducción: transferencia de hidrógeno o de electrón(es) de un donador, que está oxidado, a un receptor, que está redu- cido.(Fig. 5) En esta clase, que lleva la cifra, se reagrupan todas las enzimas llamadas: oxidasas, reductasas, deshidrogenasas y peroxidasas.

Los nombres comunes que se han

retenido

son

del

tipo

"donador:

deshi-

drogenasa" o "receptor: reductasa". El término oxidasa no se ha conservado salvo cuando el receptor es el oxígeno.

1.4.1: Clasificación de las enzimas según la naturaleza de la reacción OXIDORREDUCTASAS Catalizan las reacciones de

Fig. 3 . Enzimas de oxido – reducción, participan en la respiración y fermentación

TRANSFERASAS

Catalizan las reacciones de transferencia de radicales o de agrupamientos

(metilo, hidroximetilo, carboxilo, acilo, glucosilo, amino, etc.).

En esta clase, que lleva la cifra 2, se reagrupan las transferasas, fosforilasas, cinasas, entre otras

Las sub-clases se definen por la naturaleza del agrupamiento que es transferido (agrupamientos de un carbono, de dos carbonos, nitrogenados, etc.).

El nombre sistemático está formado según el modelo: donador: receptor o grupo transferido: transferasa.

1.4.1: Clasificación de las enzimas según la naturaleza de la reacción OXIDORREDUCTASAS Catalizan las reacciones de

Fig. 4: TRANSFERASAS se encargan de transferir grupos funcionales

HIDROLASAS

Provocan la hidrólisis de diversos tipos de enlaces: éster, acetal (osídico), amida

(peptídico), (Fig. 7)

Las

subclases

son definidas

por

la

naturaleza

general del enlace

que

es

hidrolizado.

 

El nombre sistemático se forma de acuerdo al modelo "substrato hidrolasa", un

prefijo que precisa la naturaleza del grupo eliminado cuando la enzima es

específica para este enlace. -

El nombre común que se recomienda es, en la mayor parte de los casos,

formado por el nombre del substrato al cual se adiciona el sufijo "asa". En

general las hidrolasas son holoproteínas. Algunas pueden tener un grupo

prostético, por ejemplo el fosfato de piridoxal.

HIDROLASAS Provocan la hidrólisis de diversos tipos de enlaces: éster, acetal (osídico), amida (peptídico), (Fig. 7)

Fig.5: HIDROLASAS Reacciones

..

de hidrólisis, transforman polímetro

en monómeros

LIASAS

Son enzimas que rompen los enlaces C - C, C - O, C - N u algún otro, por medios

diferentes a la hidrólisis o a, la oxidación, con formación de un doble enlace en

alguno de los dos fragmentos. Cuando ellas actúan en sentido inverso -

condensación de dos moléculas con desaparición de un doble enlace se les

designa con el nombre de sintetasas.

Las subclases son definidas por la naturaleza del enlace roto y las sub. clases

precisan la identidad de la fracción eliminada: CO2, aldehído, amoniaco, etc.

El nombre sistemático se forma de acuerdo al modelo, substrato: fracción

eliminada-liasa.

HIDROLASAS Provocan la hidrólisis de diversos tipos de enlaces: éster, acetal (osídico), amida (peptídico), (Fig. 7)

Fig. 6: Liasas. Condensación

de moléculas con desaparición

de doble enlace

ISOMERASAS

Catalizan las reacciones de isomerización: racemización, epimerización,

isomerización cis-trans, o también originan modificaciones intramoleculares tales

que transfieren un agrupamiento o producen oxidorreducción.

Para su nomenclatura se retiene el principio

"substrato. .

.asa", pero el término

isoÍnerasa se reserva a ciertas subclases; un prefijo hace precisa la naturaleza de

la isomerización, por ejemplo cis-trans isomerasa.

I SOMERASAS Catalizan las reacciones de isomerización: racemización, epimerización, isomerización cis-trans, o también originan modificaciones intramoleculares

Fig. 7: Ejemplo de Isomerización

LIGASAS O SINTETASAS

Son enzimas que catalizan la reacción de unión de dos moléculas, acopladas a la

ruptura, sin intervención del agua, de un enlace pirofosfórico en el ATP o

eventualmente en un nucleótido trifosfórico del mismo tipo.

Las subclases corresponden al tipo de enlace que se establece (C - °, C - S, C -

N, C - C) y la sub-subclases se refieren a la naturaleza del producto formado

(amida, péptido, etc.) o a la reacción que es catalizada.

El nombre sistemático es formado de acuerdo al modelo, " X: Y ligasa (formando

ADP), X Y, son los dos substratos que se condensan; el producto formado a partir

del nucleótido trifosfórico implicado .en la reacción (ADP o AMP) se indica entre

paréntesis.

Para darle nombre común se utiliza, en general, el nombre del producto formado

seguido del término "sintetasa".

I SOMERASAS Catalizan las reacciones de isomerización: racemización, epimerización, isomerización cis-trans, o también originan modificaciones intramoleculares

Fig. 8: Ligazas

Capitulo 3:

CINETICA ENZIMATICA

El objeto de la cinética enzimática es el estudio de las enzimas en su

funcionamiento. Se propone, en particular, establecer las relaciones que existen

entre la velocidad de la reacción enzimática y las concentraciones del substrato

(S) y de la enzima (E), así como la influencia de algunos factores: pH, tem-

peratura, presencia de efectores y eventualmente, actividad del agua.

La Comisión sobre Enzimas ha definido una unidad internacional de actividad

enzimática, el katal, cantidad de enzima que transforma un mol de substrato por

segundo bajo las condiciones experimentales estándar. Esta es una unidad de

valor elevado: por ello se utilizan más corrientemente sub. múltiplos de ella:

microkatal (JLkat), nanokatal (nkat) y picokatal (pkat), que valen,

respectivamente 10-6, 10-9 y 10-12 katal (kat).

Las enzimas se pueden presentar bajo la forma pura, o bajo la forma de

preparaciones enzimáticas, más o menos purificadas. Con frecuencia es

interesante determinar la actividad enzimática de una cantidad unitaria de prepa-

ración enzimática no purificada o de una enzima purificada. Se refiere entonces la

actividad, sea a 1 kilogramo de proteína, sea a una molécula gramo, así se define

una actividad específica, katal por kg de proteínas y una actividad molar, katal

por mol de enzima.

2.1: Enzimas Michaelianas

Principales hechos experimentales: Debemos subrayar, como un preámbulo,

la necesidad absoluta de que las enzimas sean puras y desprovistas de actividad

parásita.

Los tres hechos experimentales principales, en que se basan las leyes generales

de la cinética enzimática son:

a) El substrato, S, forma con la enzima, E, un complejo intermediario

transitorio ES. Este complejo resulta de una complementaria de la estructura

entre el sitio activo de la enzima y la molécula del substrato.

b) La velocidad de la reacción en el tiempo t, es decir la velocidad de dS/dP

desaparición del substrato, o de aparición del producto, dt/dt que se representa

por la pendiente de la tangente a la curva, P o S = f(t) no es constante para las

concentraciones dadas en enzima o en substrato (fig.9), y disminuye en función

del tiempo debido a la desaparición del substrato en el curso de desarrollo de la

reacción.

Siempre, al principio de la reacción, se puede considerar que la tangente a la

curva se confunde con aquélla en que la velocidad permanece constante.

Los estudios de cinética enzimática corresponden siempre a esta parte lineal de

la curva; lo que implica el trabajar a velocidades iniciales. En estas condiciones,

al principio de la reacción, la concentración en producto es muy débil; puede

despreciarse, así como la reacción inversa de transformación del producto en

substrato. Entonces se puede escribir

 

k1

k3

E

+

S

=

ES

E

+

P

 

k2

Fig. 9. Curva de aparición del producto en función del tiempo

por la pendiente de la tangente a la curva, P o S = f(t) no es

Fuente: Scriban, Biotecnología,

1985

c) Por otra parte, para una concentración dada de substrato, el estudio de las

variaciones de la velocidad inicial de reacción en función de la concentración

de enzima (fig. 10) muestra que esta variación no es lineal. La curva presenta

un trazo hiperbólico correspondiente al hecho de que para una cierta

concentración de enzima, la totalidad del substrato se encuentra bajo la forma

de complejo enzima-substrato;

Fig. 10. Curva que representa la velocidad enzimática en función de la concentración de la enzima

Fig. 10. Curva que representa

la velocidad enzimática en

función de la concentración de

la enzima

Fuente: Scriban, Biotecnología,

1985

de lo que resulta que la velocidad inicial, función de la concentración de este

complejo, permanece constante. Para los estudios cinéticos, es necesario situarse

en las condiciones que corresponden al principio de la curva, donde es lineal, es

decir a concentraciones bajas de enzimas.

En otros términos, la cantidad de enzima debe ser pequeña en comparación a la

concentración del substrato, de tal manera, que la formación del complejo

enzima-substrato, ES, no modifica, o modifica poco la concentración del

substrato,

Hipótesis de Michaelis-Menten: Al establecer la ecuación de la velocidad,

Michaelis y Menten toman como principio de que la velocidad de transformación

del complejo ES en E + P es muy lenta, con relación a la velocidad de la ruptura

del complejo que vuelve a dar E + S.

Esta hipótesis significa que k3 ~ k2 Y que E y ES están en equilibrio, sea:

Hipótesis

del

Fig. 10. Curva que representa la velocidad enzimática en función de la concentración de la enzima
estado estacionario de Briggs y Haldane: Estos autores
estado
estacionario
de
Briggs
y
Haldane:
Estos
autores

consideraron que la hipótesis de Michaelis-Menten es demasiado restrictiva y que

es preferible postular un estado estacionario, estado para el cual la velocidad de

formación del complejo ES es igual a su velocidad de descomposición en todas

las direcciones (formación de productos y aumento del substrato).

Velocidad de formación de ES = k1 [E] [S]

Velocidad de desaparición de ES = k2 [ES] + k3 [ES] = (k2 + k3)

[ES]

El estado estacionario se describe entonces:

es preferible postular un estado estacionario, estado para el cual la velocidad de formación del complejo

Al escribir que la cantidad de enzima que se ha puesto en el medio de reacción

[E T ] se reparte en una fracción libre [E], y una fracción que forma un complejo

[ES], se tiene:

[E T ] = [E] + [ES]

Al sustituir E por su valor, se obtiene:

es preferible postular un estado estacionario, estado para el cual la velocidad de formación del complejo

La velocidad de formación del producto está dada por: v = k3 [ES], la ecuación

general es de la forma:

es preferible postular un estado estacionario, estado para el cual la velocidad de formación del complejo

Ecuación de Michaelis-Menten: Cuando la concentración en substrato cambia al

infimito; la velocidad inicial tiende hacia k3 [Er], o sea hacia la velocidad máxima

V m; toda la enzima se encuentra entonces bajo la forma ES.

La ecuación es en su forma más simple:

Ecuación de Michaelis-Menten: Cuando la concentración en substrato cambia al infimito; la velocidad inicial tiende hacia

Esta es la ecuación de Michaelis-Menten, según la cual la velocidad de la reacción

enzimática es una función hiperbólica de la concentración del substrato.

Los resultados experimentales en el caso de las enzimas michaelianas con un

solo substrato corroboran la validez de esta ecuación.

Significación de Km Y de Vm: Vm representa la velocidad máxima que puede

alcanzar la reacción: toda la enzima se encuentra bajo la forma compleja ES.

Cuando la velocidad de la reacción alcanza la mitad de la velocidad máxima, v =

1/2 Vm, Km es entonces igual a (S].

Si kz > k3, Km = kz/k1 que es la hipótesis de Michaelis-Menten : [E] + [S] y

[ES] están en equilibrio y la formación del producto representa una ligera fuga.

En este caso, Km puede ser asimilada a la inversa de la afinidad de las enzimas

por el substrato.

Mientras

más

pequeña sea Km,

mayor será

la

afinidad y

viceversa.

Si kz < k3, la hipótesis de Michaelis-Menten no tiene validez y Km ya no tiene

relación con

la afinidad

de

la

enzima por el substrato. También es preferible

considerar

Km como

una constante empírica igual

a

la concentración del

substrato para la

cual la

velocidad inicial es igual a

V

m/2en las

condiciones

experimentales definidas.

 

Reversibilidad y relación

de Haldane:

En distintos

puntos de

la

curva

las

reacciones enzimáticas son reversibles, es decir las enzimas pueden catalizar la

reacción inversa:

Keq = constante de equilibrio de la reacción global. Figura 11 : Representaciòn gráfica de Michaelis-
Keq = constante de equilibrio de la reacción global. Figura 11 : Representaciòn gráfica de Michaelis-

Keq = constante de equilibrio de la reacción global.

Keq = constante de equilibrio de la reacción global. Figura 11 : Representaciòn gráfica de Michaelis-

Figura 11 : Representaciòn

gráfica de Michaelis-

Menten

Representación gráfica de la cinética michaeliana

de

un

substrato:

La

representación de Michaelis-Menten, v en función de S.

Esta relación resalta la interdependencia de la constante de equilibrio y de los

parámetros cinéticos de una reacción enzimática reversible y muestra que no es

posible olvidar la reacción inversa en la que los productos se acumulan.

2.2 Enzimas alostéricas

Las enzimas con múltiples subunidades tienen estructura cuaternaria. Una

consecuencia de las subunidades múltiples es que cada subunidad catalítica

individual tiene su propio centro activo. Esto significa que una enzima con

estructura cuaternaria puede unir más de una molécula de sustrato. Alostérico

significa "forma diferente". Las enzimas alostéricas cambian de forma entre las

formas activas e inactivas como resultado de la unión de los sustratos en el

centro activo y de las moléculas reguladoras en otros sitios. En el caso simple de

una enzima alostérica con una forma activa e inactiva, el cambio en la velocidad

de reacción con el incremento de la concentración de sustrato es típicamente una

curva de forma "S".

El significado de la curva de forma S para una enzima alostérica

A bajas concentraciones de sustrato, la enzima está en

la forma inactiva

(conformación inactiva). Cuando la concentración de sustrato aumenta, el

sustrato se une a la enzima y provoca un cambio de conformación a la forma

activa de la enzima. Después de que el primer sustrato esté unido, la segunda y

siguientes moléculas de sustrato se unen con mayor afinidad. Este fenómeno es

lo que se llama "cooperatividad", y la forma S de la curva indica la unión

cooperativa del sustrato. El resultado del cambio a la forma activa es un fuerte

incremento en la unión de los otros sustratos, y como resultado, la velocidad de

reacción aumenta muy rápidamente en un estrecho margen de concentración de

sustrato. Cuando todos los centros activos de una enzima alostérica están

ocupados con sustrato, la velocidad de la reacción es constante y se alcanza la

meseta de la V máx .

3. PRODUCCIÓN DE ENZIMAS La producción mundial de enzimas representa una cifra anual de 1.5 millares
  • 3. PRODUCCIÓN DE ENZIMAS

La producción mundial de enzimas representa una cifra anual de 1.5 millares de

millones de dólares, 60% de ellos con utilización en las industrias agroali-

mentarias.

Las enzimas que se utilizan en procesos agroalimentarios son objeto de una

reglamentación estricta, en lo que concierne a su producción, su pureza química

y microbiológica. En su presentación comercial, sea bajo la forma más o menos

diluida, fijada sobre soportes inertes, o diluyentes están también igualmente

reglamentadas. Las enzimas, biocatalizadores utilizados en la bioindustria o en

otras diversas industrias (farmacia, textiles, pieles

...

)

pueden provenir de varias

fuentes, especialmente:

De origen vegetal, de origen animal y de origen microbiano.

Cada

una

de

estas

fuentes se estudiará tomando en

cuenta sólo algunos

ejemplos.

 
  • 3.1 Enzimas de Origen Vegetal

Las enzimas de origen vegetal y especialmente las proteasas son por orden

decreciente de interés tecnológico, una de las más importantes enzimas

vegetales de uso industrial se encuentran: la papaína que proviene de una planta

ecuatorial y tropical (Carica papaya L.), la bromelina, extraída de la pifia (Ananas

comosus Merr) y la ficina proveniente del higo (Ficus carica).

La preparación de papaína industrial más pura (papaína refinada) ha sido

desarrollada en 1969 por Baudard en Zaire (Jones y Mercier, 1974). El látex

fresco es guardado en frío, agitado, diluido, centrifugado, filtrado sobre kieselgur

y a través de placas esterilizantes, a fin de eliminar toda impureza y finalmente

atomizada al vacío a 50°C. Se debe obtener un polvo blanco y evitar por un lado

cualquier obscurecimiento debido a la oxidación y el empleo de temperaturas

anormales, además evitar toda infección microbiológica (Escherichia co/i,

Salmonella,

. .

.). El látex fresco contiene alrededor de 12% en peso de papaína.

Son numerosas las aplicaciones de la papaína industrial (alrededor de 300 ton.),

de las cuales se usa 75% en la industria cervecera para la estabilización coloidal

de la cerveza; 10% en la industria de la carne (ablandamiento), 5% en la

fabricación de hidrolizados de pescado destinados a la alimentación animal, 2%

en la industria farmacéutica, entre otros. La tasa de utilización puede variar

seriamente en función de la legislación alimentaría de cada país. El desarrollo de

la papaína industrial es ciertamente interesante de seguir, pues puede sufrir

fluctuaciones por razones diversas (producción, acontecimientos políticos,

cambios de tecnologías). En los últimos años se han introducido exigencias muy

estrictas sobre la calidad del producto.

3. 2:Enzimas de origen animal

Un ejemplo importante de este tipo de enzimas en la pepsina, esta enzima es

producida industrialmente a partir de la mucosa gástrica del cerdo donde se

encuentra en forma de un precursor, el pepsinógeno, de una masa molecular de

42,000. La preparación industrial de la pepsina se puede hacer de acuerdo a

varios métodos: en general se practica la auto digestión de mucosas gástricas

de cerdo, raspadas y trituradas, en medio acuoso. acidificado con ácido clor-

hídrico, en presencia de cloroformo. Después de flltración se efectúa una

concentración por liofilización. La pepsina purificada es blanquecina y soluble en

agua.

Su actividad enzimática es más elevada entre pH 1 Y 4 con un máximo a valores

de 1.8 y varía según la naturaleza del substrato; es termosensible en solución

arriba de los 55°C, lo que limita su utilización en tecnología.

Sin embargo, puede ser utilizada en bebidas refrescantes, en cervecería en el

transcurso de la estabilización coloidal durante la pasteurización en botellas

(Trolle, 1949) en razón de su actividad en medio ácido (pH de la cerveza = 4 a

4.5). Tiene, como la papaína, la propiedad de precipitar las proteínas o los

polipéptidos en medio líquido (leche, cerveza.) (efecto "coagulante ").

Finalmente es necesario advertir que la pepsina puede provocar la hidrólisis de

enzimas como las amilasas, la tripsina, la papaína industrial, lo que debe tenerse

en cuenta para su uso tecnológico ocasional.

3.3: Enzimas de Origen Microbiano

Desde que el desarrollo de la microbiología ha permitido comprender mejor los

sistemas que condicionan la síntesis de enzima s en los microorganismos, la

producción industrial de enzimas se ha orientado hacia los procesos de

fermentación. Las principales ventajas de las enzimas en la fermentación con

relación a las enzimas en la extracción son las siguientes:

  • - Una producción independiente de restricciones estaciónales o geográficas.

  • - La posibilidad de utilización de materias primas de fácil adquisición.

  • - Los rendimientos en

la producción

se pueden aumentar en proporción

importante al mejorar las capas microbianas y aplicar las óptimas condiciones de

fermentación.

Por otro lado, las enzimas de origen microbiano presentan propiedades y

especificidades diversas.

Estas ventajas predominan sobre los inconvenientes propios de las industrias de

fermentación (fuertes inversiones, consumo de energía, riesgos de

contaminación

...

)

y

en

el transcurso

de

los

últimos treinta años

se

han

desarrollado un número importante de fermentaciones productoras de enzimas.

Las principales producciones se presentan en el cuadro 1

La fundamentación de la producción de enzimas microbianas exocelulares es muy simple: un microorganismo es cultivado

La fundamentación de la producción de enzimas microbianas exocelulares es muy

simple: un microorganismo es cultivado en un medio apropiado, a partir del cual

es extraída la enzima (para las enzimas endocelulares es necesario Un

tratamiento previo de la biomasa). Los problemas radican en los detalles de

proceso.

En la Industria alimentaría, existe una gran variedad de enzimas de mucha

importancia. En el cuadro (2) se muestran algunos ejemplos:

3. 4: Producción Industrial de enzimas

En la producción industrial de las enzimas se consideran las siguientes etapas .

(Scriban, 1985)

A. Definición de la enzima que se busca

La producción de una enzima industrial que responda, en principio, a una

exigencia potencial de quienes la pueden utilizar, hace necesario determinar las

propiedades que esta enzima pueda tener. Prioritariamente, de acuerdo a Sicart

(1980):

- La especificidad: Aunque en la industria las enzimas sean utilizadas para la

hidrólisis de macromoléculas complejas en las cuales los sitios de acoplamiento

con, frecuencia se desconocen, el efecto global que se busca involucra,

generalmente, la utilización de un tipo preciso de enzima. En ciertos casos, como

sucede con la pectinasa, una enzima asocia tres actividades diferentes, y se debe

precisar estrechamente la relación entre estas tres actividades de acuerdo al

producto que se vaya a tratar.

Cuadro: 2 Enzimas utilizadas, en la industria alimenticia

INDUSTRIA

ENZIMAS

USOS

 

Tripsina.

Enmascara el gusto a óxido.

Láctea

Lactasa

Fabricación de leche delactosada, evita la cristalización de leche concentrada.

 

Quimosina

 

(renina)

Coagulación de las proteínas de la leche (caseína).

Quesería

Lactasa

Influencia en el sabor y aceleración de la maduración.

Lipasa

 

Lactasa

 

Helados

Glucosa-

Evita la textura “arenosa” provocada por la cristalización.

isomerasa

Permite la utilización de jarabes de alta fructosa.

 

Papaína,

 

Cárnicas

Fiscina

Ablandamiento de carnes.

Bromelina

Producción de hidrolizados.

 

Amilasa

Mejora la calidad del pan.

Proteasa

Disminuye la viscosidad de la pasta.

Panificación

Lipoxidasa

Produce una miga muy blanca

Lactasa

Mejora la coloración de la superficie.

 

Amilasas

Usadas para licuar la pasta de malta.

Cervecería

Papaína,

Evitan la turbidez durante la conservación de ciertos

Pepesina

productos.

 

Pectinasas

 

Vinificación

Glucosa-

Mejoran la clarificación y extracción de jugos.

oxidasa

Evitan el oscurecimiento y los sabores desagradables.

 

Pectinasas

 

Glucosa-

Mejoran la clarificación de jugos. Conversión de la glucosa en fructosa (jarabes de alta

Bebidas no

isomerasa

alcohólicas

Tannasa

fructuosa).

Glucosa-

Aumenta la solubilidad y disminuye la turbidez del té.

oxidasa

Evita el oscurecimiento y los sabores desagradables.

  • - El valor óptimo de pH: Este factor tiene una influencia variable según las

enzimas; algunas de ellas, como la proteasa alcalina aún son activas a pH = 10,

en tanto que las enzimas fúngicas funcionan aún a pH = 3.

  • - El valor óptimo de temperatura: Generalmente, quienes utilizan enzimas se

interesan en poder disponer de enzimas que soporten temperaturas elevadas, ya

que estas temperaturas conservan en parte la esterilidad del medio de

fermentación.

Después, es necesario definir el sistema que se adoptará para medir su actividad,

pero conviene disociar la noción de actividad que se aplica a la cantidad de

enzima presente en una preparación, la que se puede determinar mediante un

método de laboratorio, de la noción de eficacia que caracteriza el

comportamiento de la misma preparación colocada en las condiciones industriales

en las que vaa utilizarse. (Sicart, 1980).

B. Selección de una cepa microbiana

Los microorganismos que son capaces de producir enzimas de degradación de

ciertos compuestos se localizan generalmente en donde abundan esas subs-

tancias. Por ejemplo, los microorganismos que secretan celulosas son numerosos

en el suelo de los bosques. Inicialmente, las cepas se han aislado del suelo o de

elementos naturales.

Los métodos de aislamiento que se utilizan son los métodos clásicos, el más

importante es el cultivo de enriquecimiento, seguido de un sub cultivo en un

medio selectivo. En el medio selectivo ideal, el substrato de la enzima es la única

fuente de uno de los elementos vitales. Por ejemplo, el almidón como única

fuente de carbono. para aislar a los microorganismo s que tienen una amilasa.

Las técnicas de difusión en agar se han desarrollado para la detección de la

actividad enzimática. Esta prueba, en las condiciones estándar, puede dar

información de orden cualitativo. Para que la cepa aislada sea retenida

definitivamente debe presentar algunas características, de acuerdo a Aunstrup y

col. (1979) y Sicart (1980):

  • - Desarrollarse sobre un medio sencillo fácilmente asequible.

  • - Producir

el

menor

número

posible

de

metabolitos

secundarios,

como

antibióticos, por ejemplo.

 
  • - Excretar la enzima en forma que se facilite su separación y su

 

.

  • - No originar contaminantes diversos

  • - No ser patógena ni producir compuestos tóxicos.

Con los progresos de la genética, las posibilidades de mejoramiento de las cepas

son, teóricamente, ilimitadas; por una 'parte por una mutación, por otra parte,

mediante la nueva vía de la ingeniería genética.

En cualquier forma, la genética de los microorganismos que se utilizan en la

producción industrial de enzimas (Bacillus, Aspergillus) aún está mal conocida

para que puedan realizarse las aplicaciones de la ingeniería genética y son las

mutaciones las más utilizadas.

Las cepas industriales deben ser protegidas contra la degeneración, la pérdida

de viabilidad y las contaminaciones. Los medios más seguros son la liofilización

o la conservación a temperatura del nitrógeno líquido. Estas técnicas permiten

conservar las cepas casi indefinidamente.

  • C. Producción industrial de la enzima

Tradicionalmente, las enzimas microbianas eran producidas por cultivo en

superficie, en una delgada capa de medio líquido o de medio semisólido. Esta

técnica es aún utilizada para algunas producciones, en particular de enzimas de

origen fúngico, tales como las amilasas de Aspergillus, las proteasas de

Aspergillus y de Mucor o las pectinasas de Penicillium. Pero existen varios

problemas en el control de la temperatura, de la aireación y de la humedad, por

ello se prefieren los cultivos sumergidos a los cultivos en superficie. Los cultivos

en medio líquido, profundos, agitados, son mejor adaptados a los diferentes

controles mediante métodos modernos y reducen los riesgos de contaminación.

Además se prestan mejor a las operaciones de extrapolación y de optimización

necesarias para el paso del fermentador piloto de laboratorio al fermentador

industrial.

Preparación del inóculo

En esta etapa de preparación del inóculo, la capacidad de producción de la cepa

debe conservarse y eliminarse todo riesgo de contaminación. Para ello es

necesario evitar que haya un número excesivamente grande de cultivos

sucesivos. Es preferible el sembrar directamente un matraz de medio gelosado,

a partir de la cepa liofilizada, después, a partir de este cultivo se sembrará un

único fermentador que servirá el mismo de inóculo para el fermentador

industrial. El volumen del inoculo representa generalmente de 3 a 10% del

volumen del fermentador de producción y la composición del medio para la

preparación del inóculo se aproxima bastante a la del medio de producción. El

tiempo de permanencia en el fermentador varía de 10 a 80 horas según el

procedimiento, la cepa, las condiciones de cultivo, (Aunstrup y col., 1979)

D. Composición del medio de cultivo

El medio de cultivo debe contener la fuente de carbono, la fuente de nitrógeno y

los principales factores de crecimiento necesarios para la cepa microbiana. Se

pueden adicionar ciertos factores para abreviar la fase de latencia. De todas

formas, la producción de enzima puede no tener lugar a pesar de que el medio

sea el conveniente para un buen desarrollo. Hay que tomar en cuenta la

necesidad de un inductor, de las represiones posibles debida a algún componente

del medio, de la represión catabólica producida por la glucosa. Esta represión

puede ser evitada reemplazando la glucosa por glúcidos fermentables lentamente

o por almidón parcialmente hidrolizado.

Para aumentar la productividad, se utilizan medios concentrados, pero esta

concentración puede igualmente -ser causa de aumento en la presión osmótica y

dificultar la aireación.

A menudo se adicionan sales para complementar la cantidad de nitrógeno en el

medio

E. Fermentación y equipo necesario

Vincent y Priestley (1975) han detallado las condiciones de fermentación que

deben mantenerse para producir una enzima.

Los fermentadores utilizados habitualmente contienen volúmenes de 100 a 200

m3. Deben estar equipados de un sistema de agitación de gran potencia, capaz

de agitar medios relativamente viscosos, ya que pueden contener hasta 350 g/lt.

de materia seca (Sicart, 1980).

Los fermentadores están equipados de una corona clásica de aereación, ya que la

mayor parte de las fermentaciones productoras de enzimas tienen una fuerte

demanda de oxígeno. Generalmente, estas fermentaciones son conducidas en

condiciones limitadas de oxigenación. Para la glucoamilasa, la productividad está

limitada a la transferencia de oxígeno (Aunstrup y col., 1979).

Los equipos de medición y de control del fermentador permiten seguir y regular

los parámetros del cultivo. Los controles se ejercen generalmente sobre el pR, la

temperatura, el oxígeno disuelto, la espuma y la evolución de la concentración de

ciertos nutrientes. Además la medición de la aparición de la actividad enzimática

se efectúa a intervalos regulares por el laboratorio de control. Aún no existen

reguladores que permitan hacer esas mediciones en forma continua. (Sicart,

1980). Esta medición es importante porque de ella depende la decisión de

detener la fermentación.

Para la producción de enzimas, son necesarias condiciones rigurosas de asepsia,

por una parte para obtener un buen rendimiento, por otra parte para no tener el

riesgo de secreción de substancias tóxicas como contaminantes. Esta asepsia es

difícil de mantener, siendo el medio muy rico y el pH cercano a la neutralidad.

Se necesita tomar precauciones a nivel de la construcción del fermentador y para

la elección de las instalaciones y los equipos colaterales. Durante toda la

fermentación, una ligera supresión de aire en el fermentador impide la

penetración de contaminantes, esta precaución la refuerzan las protecciones de

vapor en todos los puntos de comunicación con el exterior (fig. 12).

Aún no se ha establecido el modelo cinético general para la síntesis de enzimas,

pero, ya se ha estudiado la regulación de la formación de algunas enzimas.

Algunas enzimas se forman durante la fase exponencial de crecimiento, pero la

mayor parte aparecen en la fase postexponencial. Según sean las enzimas y los

procedimientos, la fermentación dura de 30 a 150 horas.

La cantidad

de proteína -enzima

en

el medio,

al

final

de

la

fermentación,

representa de 1 a 5% de la materia seca inicial, en tanto que la biomasa celular

puede alcanzar de 2 a 10%.

La calidad de las enzimas producidas está en estrecha relación a la forma en que

se condujo la fermentación. La selección de las materias primas, el método de

esterilización, el procedimiento para regular la formación de espuma, la aireación

y la agitación, así como la duración de la fermentación afectan, no solamente al

rendimiento y al costo de producción, sino también al color, olor y a la

estabilidad de la enzimas.

Fig. 12: Esquema para una producción de fermentación para la

producción de enzimas (Aunstrup, 1979)

La cantidad de proteína -enzima en el medio, al final de la fermentación, representa de 1

Utilizado este biocatalizador. En la práctica, la mayor parte de las operaciones

industriales se realizan de forma discontinua, en lotes, con la renovación de la

enzima al principio de cada ciclo.

Para los enzimólogos, la fijación sobre un soporte realiza un modelo cercano a

las condiciones de la célula viviente, en donde las enzimas se encuentran con

frecuencia asociadas a la membrana ó a organelos intracelulares.

Desde 1916, Nelson y Griffin habían demostrado que la invertasa adsorbida

sobre carbón activo, conservaba su actividad. Pero de cualquier modo hubo

que esperar hasta la década de los 50's para que aparecieran las primeras

aplicaciones de esta técnica, en particular con los trabajos de Grubhofer y

Schleith.

Después de 1960, las investigaciones se han intensificado y bajo el impulso de

los equipos de Katchalski en Israel y de Manecke en Alemania, se han

multiplicado las utilizaciones potenciales de las enzimas inmovilizadas. En1969

Chibata y sus colaboradores desarrollaron en Japón el primer reactor industrial

con enzima fijada, una L-aminoácidos a partir de la correspondiente mezcla

racémica. Esta técnica permitiría, según los autores, disminuir el precio de

costo a menos del 40% con relación al procedimiento convencional.

En la actualidad, se han desarrollado numerosos métodos de fijación de interés

para más de 100 enzimas, tanto en la etapa de laboratorio como en escala piloto

y se ha abierto un campo de experimentación, después de algunos años, para la

inmovilización de células intactas, vivas o muertas. Esta multiplicación de

trabajos ha dado lugar a una abundante literatura científica.

5. Inmovilización de enzimas

La actividad de las enzimas está ligada al mantenimiento de la integridad de su

conformación temaria, en particular al nivel de su sitio activo. Los procedimientos

de inmovilización deben, por consiguiente, ser métodos suaves, bien regulados,

que respeten la estructura nativa de la proteína, que los enlaces que se crean

entre el soporte y la enzima, excluyan los ácidos aminados involucrados

directamente en la reacción catalítica.

Se han

propuesto diversos

tipos

de métodos

y

en

1971,

en

la primera

conferencia de Ingeniería Enzimática de Henniker (E.U.A.)

se definió

una

clasificación de enzimas inmovilizadas, según el método de fijación utilizado.

Fig : 13 : Clasificación de formas de obtención de enzimas

Se han propuesto diversos tipos de métodos y en 1971, en la primera conferencia de Ingeniería

En esta clasificación, las enzimas inmovilizadas se consideran como un caso

particular de las enzimas modificadas. Después apareció la técnica de reticulación

(enlazamiento cruzado) en el cual las moléculas enzimáticas son polimerizadas

por intermedio de un ligando polifuncional.

- Propiedades de las enzimas inmovilizadas

Los efectos de la inmovilización sobre la actividad de las enzimas resultan de la

interacción de diferentes factores:

  • a) Modificaciones de la estructura tridimensional de la enzima, a causa

de tensiones durante la fijación.

  • b) Modificaciones del microambiente: pH local, interacciones electrostáticas.

  • c) Fenómenos difusionales en el interior del complejo.

  • d) Impedimentos estéricos.

Este conjunto de factores juega un papel determinante en la actividad y

la estabilidad de la enzima.

- Medición de la actividad

Las condiciones óptimas de acción de las enzimas inmovilizadas difieren a

menudo de las de las enzimas en solución y deben ser perfectamente conocidas

para evitar todo riesgo de error de interpretación. Así para la ureasa, fijada

sobre bentonita, la actividad de pH 7.7 no alcanza sino a 75% de la actividad de

la enzima libre mientras que es de 100% a pH 7.1.17

La Comisión Internacional de Hennicker en 1971, ha propuesto caracterizar la

actividad de los complejos por la velocidad inicial de reacción expresada en

microkatales (JIkat): cantidad de producto formado en micromoles por segundo y

por mg (materia seca) o por unidad de superficie del soporte; precisando las

condiciones de determinación de la materia seca, el tenor en proteínas fijadas y

la actividad específica de la enzima antes de la inmovilización.

Con las reservas antes dichas, parece que la inmovilización entraña con

frecuencia una pérdida de actividad, muy variable según sea la naturaleza de la

enzima y el modo de fijación; pero también se han señalado algunos casos en los

que hay aumento de actividad. Estas variaciones en un sentido o en otro podrían

explicarse por una modificación estérica del sitio activo de la enzima bajo el

efecto de un cambio de conformación de la cadena polipeptídica.

Gracias a la gran especificidad en su acción, las enzimas constituyen una

herramienta de fabricación y de análisis indispensable en numerosos sectores de

la investigación, del control y de la producción industrial.

La introducción de las técnicas de insolubilización de los biocatalizadores suscita

un interés considerable en razón de las ventajas que presenta: tratamientos en

continuó, control automatizado, mejoramiento de los rendimientos por unidad de

enzima, obtención de derivados más puros, disminución de requerimientos

energéticos. . .

y los recientes desarrollos de los métodos de inmovilización de

células enteras han abierto nuevas perspectivas.

A pesar de los numerosos trabajos de investigación, las instalaciones de

producción industrial son aún muy limitadas. Es necesario buscar la causa en la

complejidad del funcionamiento de los reactores, en donde la matriz es a menudo

muy delicada y en la gran inestabilidad de los catalizadores biológicos; sin olvidar

las limitaciones debidas a regulaciones legales.

La obtención de nuevas fuentes de enzimas más estables, el desarrollo de

sistemas multienzimáticos, la recuperación y la re utilización de cofactores de.

Las enzimas son las vías de investigación susceptibles de ampliar el campo de las

aplicaciones actuales:

Actividades 1:

1. Realice un mapa conceptual sobre las generalidades de la Biotecnología,

teniendo en cuenta: definición, historia, tipos y tendencias.

2. Teniendo en cuanto los modelos matemáticos que explican el crecimiento

microbiano. Realice los siguientes ejercicios.

a. Comenzando con 4 células bacterianas por mililitro en un medio rico, con una

hora de fase de adaptación y un tiempo de generación de 20 minutos. Cuántas

células habrá en un litro de este medio en una hora?; y en dos horas?

  • b. Calcule el tiempo de generación en un experimento de crecimiento en el que

el medio se inoculó con 5 x 10 6 células /ml de E. coli y después de una hora de

fase de adaptación, creció exponencialmente durante 5 horas, siendo entonces

la población de 5,4 x 10 9 células ml.

  • c. En un Cultivo de Cephalosporium sp productor de una sustancia antibiótica,

en medio de cultivo agitado con glucosa 30 g/L

Tiempo

X (Biomasa

P

S (Sustrato

(hr)

g/L)

(µg/L)

g/L)

0

0.05

0

30

1

0.1

0

27

2

1.4

0

24

4

4.6

0

14.5

6

7.4

0

7.0

8

10.8

1

5.8

10

14.21

7

4.6

12

14.1

15

3.0

24

14.0

30

2.0

2.

Calcule el tiempo de duplicación (Td) y µ.

 

3.

Calcule el rendimiento biomasa/ sustrato (Y X/ S) y producto/ sustrato (Y

 

P/ S).

 

4.

3.

Investigue en su localidad los sustratos o subproductos que pueden utilizarse

como fuente de Carbono, nitrógeno y fósforo. Enuncie sus características

relacionadas en cuanto a producción mensual del sustrato, estabilidad del

sustrato y concentración de los nutrientes.

 

4.

Investiga sobre métodos de cuantificación del crecimiento microbiano, realiza

un foro con tus compañeros y compara las diferentes técnicas.

5.

Establezca

las

ventajas y

desventajas entre los diferentes métodos de

fermentación.

 

6.

Realice una investigación bibliográfica sobre las enzimas más importantes en

la industria alimenticia, escoja una de ellas y realice un diagrama de flujo para la

producción de la misma.

UNIDAD 2: PRINCIPIO DE INGENIERIA GENETICA APLICADO A LA

BIOTECNOLOGÍA

El principal objetivo de la ingeniería genética en el campo de la Biotecnología es

alterar la composición genética de los seres vivos de importancia industrial, con

el fin de incrementar la eficiencia global del proceso para el que se emplea dicho

ser vivo. Aunque el objetivo principal es incrementar el rendimiento de un

producto específico, es interesante tener en cuenta otros parámetros,

particularmente los que se refieren a las mejoras en las características de

crecimiento y la eliminación de subproductos perjudiciales. (Wiseman, A,1986)

El desarrollo de organismo súper productores, se considera el principal objetivo

de este campo de la biotecnología, aunque se podrían añadir otros dos: en

primer lugar, la obtención de nuevas especies que produzcan productos nuevos o

modificados y en segundo lugar, el conocimiento de las rutas biosintéticas que

conducen a la producción de metabolitos de interés comercial, así como

mecanismos de control que regulan estas rutas.(Wiseman, A. 1986)

La estructura y función básica de los genes se conocía desde finales de los años

sesenta. Más aún, la labor de los bioquímicos había producido un gran cúmulo de

conocimientos respecto de los conjuntos de reacciones químicas que ocurren

dentro de los seres vivos. Las vías metabólicas fundamentales para la generación

de energía y la biosíntesis de la mayoría de los compuestos esenciales para la

vida ya estaban establecidos. (Saberon , 1997)

Este conocimiento se basaba en la aplicación inteligente de métodos de ensayo y

purificación de enzimas clave, y de la identificación y análisis de sus sustratos y

productos. Al mismo tiempo, otras disciplinas como la inmunología y la genética,

realizaban avances y eran actividades de gran complejidad y finura.

La biología molecular, sin embargo, se encontraba en un punto en el que su

desarrollo se había hecho muy lento. Una vez sentadas las bases fundamentales

de la replicación y expresión de la información genética, el siguiente paso era

desentrañar; en forma detallada, los mecanismos de regulación de la expresión

genética.

Todas las vías metabólicas, la expresión de anticuerpos, la actividad de los virus,

en fin, todas las manifestaciones del fenómeno viviente, están, en última

instancia, orquestados por la expresión ordenada y regulada de los genes, por

medio de la producción de proteínas específicas.

El extraordinario proceso por el cual una sola célula, el huevo fecundado, da

origen a un organismo complejo, es decir; las etapas de diferenciación celular;

constituía un reto extremadamente atractivo, pero a la vez formidable. Un

descubrimiento clave inició el cambio dramático que conocemos hoy como

ingeniería genética o ADN recombinante: en 1970 Hamilton Smith y Daniel

Nathans descubren una enzima capaz de reconocer y cortar el ADN en secuencias

específicas, que les valió el Premio Nobel de fisiología o medicina, compartido con

Werner Arber, en 1978.

Este descubrimiento (consecuencia de un hallazgo accidental, en el que los

investigadores profundizaron con gran sentido) dio origen a una sucesión de

nuevos descubrimientos y potenció el desarrollo de toda una serie de otras

disciplinas y metodologías. En este capítulo revisaremos los fundamentos de

algunas de las más importantes.

Capitulo 1: TÉCNICAS UTILIZADAS EN LA MANIPULACIÓN GENÉTICA IN

VITRO.

Muchos microorganismos producen enzimas que modifican y digieren o rompen el

ADN. Estos sistemas, llamados de modificación-restricción, son análogos a un

sistema inmune, los cuales probablemente evolucionaron como un mecanismo de

protección de los microorganismos contra infecciones virales. En efecto, las

bacterias, por ejemplo, son infectadas por virus, llamados bacteriófagos, que

inyectan su propio ADN en la célula bacteriana para después controlar su

maquinaria celular y redirigirla hacia la síntesis de sus propios componentes,

dando como resultado final la ruptura de la célula y la liberación de cientos o

miles de nuevos virus. En algunas bacterias el ADN propio está modificado en

ciertas secuencias. Una enzima de modificación se desliza sobre la hebra de ADN,

y cada vez que se topa con su secuencia blanco, por ejemplo GAATTC, introduce

un pequeño grupo químico en la adenina (A) central. Otra enzima, la enzima de

restricción, también se desliza en la hebra de ADN, y si encuentra la secuencia

GAATTC, corta el ADN en esa posición. La enzima, sin embargo, no corta el ADN

modificado, por lo que efectivamente es capaz de degradar el ADN extraño que

puede entrar a la célula, sin alterar el ADN propio.

Hoy en día se conoce miles de diferentes enzimas de restricción, provenientes de

otros tantos distintos microorganismos. Más de cien distintas secuencias

pequeñas de ADN pueden ser rotas, específicamente, por medio del uso de la

adecuada enzima de restricción. Otra interesante propiedad de las enzimas de

restricción es que, en general, reconocen secuencias palindrómicas, es decir;

secuencias que son iguales si se leen en una dirección, o en la dirección

contraria. Por ejemplo:

— 5´GAATTC3´—

— 3´CTTAAG5´—

Es una secuencia palindrómica. Cuando actúa la enzima que reconoce y corta

esta secuencia, llamada EcoRI, genera segmentos de ADN con extremos que se

proyectan fuera de la doble cadena:

— 5´G AATTC3´—

— 3´CTTAA G5´—

Estos extremos se denominan cohesivos o pegajosos, porque tienden a aparearse

o hibridarse nuevamente. En realidad, cualquier extremo de ADN generado por

un corte con EcoRI puede hibridarse o aparearse con otro extremo generado por

la misma enzima. Los descubridores de las primeras enzimas de restricción

pronto se dieron cuenta de que su acción sobre el ADN (comúnmente llamada

"digestión") producía un conjunto definido de diferentes segmentos.

Súbitamente, el ADN dejó de ser una sustancia monótona y frágil, donde purificar

un segmento específico resultaba una tarea ardua o imposible. Al poder generar

segmentos específicos, con las enzimas de restricción, la molécula de la vida

quedó a merced del biólogo molecular y por lo tanto nos facilitó el camino para

manipular la secuencia del ADN, de cualquier especie. Este, entonces se convirtió

en

la

nueva

herramienta

BIOTECNOLOGÏA.

de

la

Biología

segmentos específicos, con las enzimas de restricción, la molécula de la vida quedó a merced del

moderna

y

por

lo

tanto

de

la

Figura 1. La separación de los ácidos nucleicos Cuando se utiliza la electroforesis, es posible visualizar la acción de las enzimas de restricción. Si se colocan muestras que contienen ADN de diversos tamaños en los pozos de un gel en forma de placa, y se aplica corriente eléctrica, la diferencia de velocidad de migración de estas moléculas las distribuirá, por separado, al cabo de un tiempo, dentro del gel. Si después se agrega una sustancia que se hace luminosa al interaccionar con el ADN y bañarse con luz ultravioleta, directamente se puede observar el patrón de distribución de las bandas constituidas por las moléculas de diversos tamaños, por medio del cual es factible deducir sus respectivas dimensiones

Al usar diferentes enzimas de restricción, se generan diferentes segmentos. Por ejemplo, si la secuencia reconocida por la enzima Sall aparece en la molécula del ejemplo una vez, cortaría el segmento en dos partes. Si la secuencia reconocida por EcoRI, aparece dos veces, generaría tres pedazos. Al usar las dos enzimas simultáneamente, se producirían cuatro segmentos.

Fuente: Saberon Maneiro, Biología molecular y la nueva

Biotecnología, Mexico, Fondo de cultura, 1997

Lección 1: Tecnología del ADN recombinante.

Como se menciono anteriormente, los fragmentos generados por las enzimas de

restricción tienen además la propiedad de reasociarse unos con otros, por medio

de sus extremos cohesivos. La importancia de manipular este

procedimiento(también conocido como tecnología del ADN recombinante) es la

que nos permite en primer lugar evitar los múltiples mecanismo que restringen la

transferencia de genes entre organismos no relacionado y, en segundo lugar, que

se lleven a cabo manipulaciones precisas y sutiles aprovechando estas

características del proceso de recombinación Este procedimiento consite,

entonces, en cortar el ADN en fragmentos específicos utilizando enzimas

llamadas endonucleasas de restricción y ligar los fragmentos a un vector, es

decir, una molécula de ADN que es capa de ser incorporada y replicada por la

célula hospedadora ..

En resumen, los elementos esenciales de la técnica de ADN recombinante (véase

la figura 2): son los siguientes

  • 1. Obtención de fragmentos específicos de ADN (enzimas de restricción).

  • 2. Ligación (o reasociación covalente) de las moléculas para obtener hebras

continúas de ADN (enzima ligasa).

  • 3. Mecanismo para introducir al interior de células vivas el ADN recombinante (transformación).