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La biología celular y la fertilización de

mamíferos.
La fertilización es el proceso por el cual los huevos y los espermatozoides interactúan,
logran el reconocimiento mutuo y se fusionan para crear un cigoto que luego se desarrolla
para formar un nuevo individuo, lo que permite la continuidad de una especie. A pesar de
numerosos estudios sobre la fertilización de mamíferos, los mecanismos moleculares que
sustentan el evento de la fertilización siguen siendo en gran parte desconocidos. Sin
embargo, como resumiré aquí, un trabajo reciente que utiliza animales manipulados
genéticamente y estudios in vitro ha comenzado a dilucidar las moléculas esenciales de
esperma y huevo y a establecer modelos predictivos de fertilización exitosa.

Introducción

Nuestro cuerpo individual tiene una vida limitada. Sin embargo, a través de la fertilización,
podemos continuar la vida como especie. El papel de los espermatozoides es fertilizar los
huevos. Sin embargo, los espermatozoides de mamíferos no pueden lograr esta tarea
cuando eyaculan. Primero deben experimentar un cambio fisiológico llamado capacitación
y un cambio morfológico posterior conocido como la reacción acrosómica en el tracto
reproductivo femenino. Los espermatozoides también albergan la capacidad de migrar al
oviducto, donde interactúan y se fusionan con el óvulo. Se han identificado varios factores
que contribuyen a las interacciones espermatozoides con los huevos, basados en
observaciones que usan inhibidores enzimáticos y anticuerpos en sistemas de fertilización
in vitro (Cuadro 1). Esta investigación llevó a la conclusión de que varias enzimas de
esperma dentro del acrosoma disolvieron los componentes del huevo y que varias proteínas
de membrana se usaron para unirse con los huevos. Sin embargo, los experimentos
recientes que utilizaron la alteración génica de estos factores no dieron como resultado un
fenotipo infértil, lo que sugiere que no son esenciales para la fertilización, aunque sí pueden
desempeñar un papel durante el evento de fertilización. Por el contrario, utilizando
experimentos de selección de genes in vivo, varias proteínas han surgido inesperadamente
como factores esenciales para la fertilización. En este Manual, analizo los factores que han
estado implicados en las diversas etapas de la fertilización, desde la capacitación y
migración de los espermatozoides hasta la fusión espermatozoide-óvulo. Los puntos de
vista de la fertilización de mamíferos que surgen recientemente se revisan y comparan con
los modelos previamente postulados.

Cuadro 1. Estudio de la fertilización in vitro

La fertilización in vitro (FIV) requiere diferentes elementos para diferentes especies. En los
ratones, los huevos generalmente se obtienen del oviducto después del tratamiento con
hormonas que inducen la súper ovulación. Los huevos se introducen en una pequeña gota
de medio de FIV en un plato cubierto con aceite de parafina y se cultivan con un 5% de
CO2 en el aire. Los espermatozoides de ratones se preparan normalmente exprimiéndolos
de una abertura hecha en el epidídimo, seguido de suspensión en medio de FIV;
alternativamente, los espermatozoides eyaculados se utilizan en animales más grandes
después del lavado con medio. Los espermatozoides se introducen en la gota de cultivo de
huevos a una concentración final de ~ 1 × 105 espermatozoides / ml (tenga en cuenta que
la FIV requiere una gran cantidad de espermatozoides en comparación con la fecundación
in vivo, en la que solo se requieren unos pocos espermatozoides por huevo).

El éxito de la fertilización puede evaluarse observando: (1) espermatozoides dentro de la


ZP; (2) la formación de pronúcleos; o (3) la formación de embriones de dos células. Los
óvulos fertilizados por FIV también se pueden transferir a oviductos de hembras
pseudogestantes para evaluar el resultado de desarrollo de estos embriones. Cuando los
anticuerpos o inhibidores añadidos al medio de FIV inhiben con éxito la fertilización, los
factores que estos anticuerpos e inhibidores se han dirigido han sido tradicionalmente vistos
como factores relacionados con la fertilización.

La naturaleza de los huevos.

Los ovarios se dotan al nacer con un número fijo de ovocitos encerrados en folículos
primordiales. Este número disminuye como resultado de la ovulación y la atresia durante la
vida reproductiva de la hembra (Faddy, 2000). Los ovocitos son arrestados en la etapa
dictaría de la primera división meiótica. Con el tiempo, las cohortes de ovocitos entran en
una fase de crecimiento y se convierten en una de las células más grandes del cuerpo, sus
diámetros alcanzan aproximadamente 80 μm y 100 μm en el ratón y el humano,
respectivamente. Durante el crecimiento, los huevos forman una matriz extracelular llamada
zona pelúcida (ZP) al secretar glicoproteínas (Fig. 1A). La ZP de los óvulos humanos consta
de cuatro glicoproteínas ZP (ZP1 a ZP4), mientras que la del huevo de ratón consta de tres
proteínas ZP (ZP1 a ZP3, Zp4 de ratón es un pseudogen)

Las características de los óvulos de mamíferos y los espermatozoides.

Los huevos ovulados (amarillo) están rodeados por pequeñas células del cumulus
incrustadas en material extracelular (azul) que consiste principalmente en ácido hialurónico.
La capa cúmulo está separada del huevo por la zona pelúcida (gris), que está formada por
proteínas de la zona pelúcida (ZP1-3 en el ratón y ZP1-4 en el humano). (B) Cambios
fisiológicos y morfológicos en los espermatozoides requeridos para la fertilización. Cuando
los espermatozoides se depositan en el tracto reproductivo femenino o se suspenden en un
medio de fertilización in vitro, comienzan a ocurrir varios cambios que implican la
fosforilación de varias proteínas, la activación de PKA y PKC, la eliminación del colesterol
de la membrana y la elevación del Ca2 + intracelular nivel. No se sabe si la interacción con
las células del cumulus es beneficiosa para algunos de estos cambios o si está involucrada
la eliminación de un factor inhibidor o de "decapacitación". Los espermatozoides también
sufren un cambio morfológico llamado reacción acrosómica, durante el cual se liberan
varias enzimas y proteínas del acrosoma. Solo los espermatozoides reaccionados con
acrosomas pueden penetrar y fusionarse con los huevos. La vesícula acrosomal (verde)
está rodeada por la membrana acrosomal externa (OAM) y la membrana acrosomal interna
(IAM). El acrosoma contiene proteínas liberadas de forma instantánea y lenta, y su
contenido se exocitiza durante la reacción acrosómica en la que la membrana plasmática
espermática (PM) y el OAM se fusionan en múltiples lugares dentro del área del casquete
acrosomal. Se cree que la reacción acrosómica implica fosfolipasa C (PLCδ4) y proteínas
SNARE y generalmente se considera que es un buen indicador para la finalización de la
capacitación. Una vez capacitados, los espermatozoides demuestran un patrón de natación
vigoroso llamado hiperactivación, que involucra a los canales iónicos Casper.

El crecimiento completo de los ovocitos debe estar apoyado por las células de la granulosa
que lo rodean, que proliferan y forman múltiples capas de células del cumulus que rodean
al óvulo ovulado (Fig. 1A). Las células de Cumulus soportan la fertilización, y la fertilización
in vitro se puede lograr de manera más eficiente con ellas que sin ellas (Jin et al., 2011;
Tokuhiro et al., 2012). La base molecular de esta observación permanece oscura; sin
embargo, algunos estudios han abordado la función de las células del cumulus (Oren-
Benaroya et al., 2008; Shimada et al., 2008).

Después de la maduración meiótica, los óvulos son ovulados en preparación para la


fertilización. Después de la ovulación, los óvulos se recogen mediante la adhesión entre la
matriz extracelular de las células del cumulus y las células oviductales de las fimbrias
oviductales y posteriormente se transfieren al oviducto (Talbot et al., 2003). Los huevos son
luego transportados a la porción de la ampolla del oviducto, donde esperan los
espermatozoides para la fertilización. Sin embargo, solo hay una breve 'ventana fértil', que
es menos de un día después de la ovulación en humanos (Wilcox et al., 1995) y unas pocas
horas en el ratón, durante el cual la fertilización puede ocurrir con éxito

La naturaleza de los espermatozoides

En los testículos humanos, se producen ~ 1000 espermatozoides por segundo (Amann y


Howards, 1980), aunque no se comprende la razón por la cual los machos mamíferos
producen tantos espermatozoides para fertilizar tan pocos huevos. Los espermatozoides
producidos en los testículos se transfieren a los epidídimos, donde reciben varias proteínas
(Busso et al., 2007), probablemente en parte a través de una estructura llamada
epididimosoma (Frenette et al., 2010). Los espermatozoides son

Maduro (Fig. 1B), sin embargo, siguen siendo incapaces de fertilizar los huevos. Según
Yanagimachi, la membrana plasmática del esperma permanece "biológicamente
congelada" hasta que los espermatozoides abandonan el cuerpo del macho y comienzan
el proceso de "descongelación", conocido como capacitación, que es necesario para que
los espermatozoides sean competentes para la fertilización (Yanagimachi, 1994).

Durante la capacitación, se producen diversos cambios fisiológicos en la cabeza, el


acrosoma y la cola de los espermatozoides, que "descongelan" biológicamente los
espermatozoides y los preparan para la fertilización (figura 1B). Se sabe que los
espermatozoides en suspensión son heterogéneos y, como tal, cuando se considera que
una suspensión de esperma está capacitada, un cierto porcentaje de espermatozoides en
la misma suspensión ya se está degradando. Numerosos trabajos discuten la fosforilación
de las proteínas espermáticas durante la capacitación, pero no se han dilucidado
mecanismos claros que conduzcan a la capacitación (Bailey, 2010; Visconti et al., 2011).
Esto puede deberse, al menos en parte, a la heterogeneidad de los espermatozoides.

Se sabe que la glucosa es esencial para una capacitación exitosa. No solo sirve como una
fuente de energía que permite nadar a los espermatozoides, sino que también funciona
para permitir que los espermatozoides fertilicen los huevos (Goodson et al., 2012; Okabe
et al., 1986). El colesterol, el bicarbonato, el Ca2 + intracelular y muchos otros factores
también participan en la capacitación (Bailey, 2010; Evans, 2012; Florman y Ducibella,
2006; Yanagimachi, 1994); sin embargo, los mecanismos moleculares precisos que
subyacen a su acción aún no se han aclarado.
.
Una vez capacitados, los espermatozoides demuestran un patrón de natación vigoroso
llamado hiperactivación, un movimiento que se considera que da a los espermatozoides el
fuerte poder de empuje que les permite penetrar en ZP. Se caracteriza por golpes
asimétricos flagelares consistentes en curvas pro y anti gancho acompañadas de un
aumento en Ca2 + citoplásmico. Se ha sugerido que los canales de iones CatSper
específicos de esperma controlan la concentración de Ca2 + intracelular y, por lo tanto, el
comportamiento de nado de los espermatozoides (Chang y Suarez, 2011). CatSper1 a 4
son esenciales para la fertilización en ratones (Qi et al., 2007). Además, el canal CatSper
parece estar activado por la progesterona en los espermatozoides humanos (Brenker et al.,
2012; Lishko et al., 2011), que es interesante desde el punto de vista de la interacción
espermatozoide porque las células del cumulus producen progesterona. Sin embargo, no
se informa que la progesterona active los espermatozoides de ratón.

Después de la capacitación, el paso final en el desarrollo del esperma antes de la


fertilización es la reacción acrosómica (Fig. 1B). El acrosoma, que es un orgánulo subcelular
que se encuentra en la punta apical de la cabeza del espermatozoide, está lleno de una
variedad de enzimas líticas y proteínas de unión a ZP. A través de mecanismos poco
conocidos, que pueden involucrar proteínas SNARE (De Blas et al., 2005), la membrana
plasmática y el mechón externo de la membrana acrosomal y los contenidos acrosómicos.
Este proceso, denominado reacción acrosómica, hace que los espermatozoides puedan
penetrar la ZP.

Factores que regulan la fertilización

La fertilización es un evento complicado de varios pasos, que involucra la maduración y el


desarrollo de los espermatozoides y los óvulos, seguido de la migración de los
espermatozoides al oviducto y termina con la interacción espermatozoide-huevo y luego la
fusión. Como tal, varios factores que juegan un papel en cada uno de estos eventos están
emergiendo. Los modelos clásicos de fertilización se centraron principalmente en la unión
de la zona del esperma y la reacción acrosómica inducida por la zona, sobre la base de
experimentos in vitro, y se postularon muchos factores para la fertilización. Con el tiempo,
sin embargo, los genes que codifican estos factores fueron clonados y sus roles fueron
investigados por experimentos de disrupción genética en ratones (Cuadro 2).
Sorprendentemente, casi todos mostraron un fenotipo no muy pequeño en la fecundación
(Ikawa et al., 2010); aunque pueden jugar un papel, el knockout de estos factores
individuales no afectó la fertilización. Además, varios genes esenciales para una fertilización
exitosa comenzaron a surgir de tales experimentos de disrupción genética. La mayoría de
Estas líneas de ratones alteradas genéticamente compartían fenotipos comunes, que
muestran: (1) ninguna migración en el oviducto in vivo con la capacidad de unión a zonas
aberrantes in vitro; o (2) sin capacidad de fusión (Tabla 1, Clase I y II). Curiosamente, todos
los espermatozoides de las líneas de ratones de clase I carecían de ADAM3 (Shamsadin
et al., 1999) sin excepción, lo que sugiere que ADAM3 desempeña un papel clave en la
fertilización en el ratón.

Recuadro 2. Posibles limitaciones de los enfoques knockout

Hay dos inconvenientes principales para los enfoques de orientación genética. La primera
ocurre cuando los ratones knockout muestran un fenotipo menor o nulo. De hecho, no todos
los genes son funcionalmente indispensables. Si la función de un gen es menor, los ratones
knock-out pueden no mostrar un fenotipo fuerte, por lo tanto, este gen no se consideraría
un buen candidato para la experimentación basada en knock-out. Además, la cuestión de
la redundancia también puede complicar la interpretación de los experimentos de selección
de genes, ya que la eliminación de un factor podría ser compensada por otros factores
similares. También se sabe que algunos genes requieren la interrupción de otro gen (es)
como un requisito previo para mostrar un fenotipo (Rudnicki et al., 1993); algunos productos
génicos pueden interactuar juntos y puede ser necesario eliminar ambos / todos los factores
que interactúan para observar un fenotipo. Los factores enumerados en la Tabla 2, que
mostraron casi ningún fenotipo después del knockout, podrían caer en la categoría anterior.
Un segundo inconveniente potencial se relaciona con la interpretación del fenotipo. Por
ejemplo, la fertilina (un heterodímero de ADAM1b / ADAM2) se ha descrito como una
proteína de fusión de esperma-huevo en muchos libros de texto (Blobel et al., 1992) y esto
se confirmó por la disrupción de Adam2 (Cho et al., 1998). resultando en hombres infértiles.
Sin embargo, cuando los ratones knockout de fertilina se produjeron mediante la eliminación
de Adam1b (la segunda subunidad del heterodímero de fertilina), los machos eran fértiles
(Nishimura et al., 2004). La infertilidad en los ratones knockout Adam2 deficientes / fertilina
se atribuyó posteriormente a la pérdida de la ADAM1a testicular / ADAM2 dímero de
proteína, lo que llevó a la ausencia de adam3 (una proteína que juega un papel esencial en
la fertilización) de los espermatozoides.

Por lo tanto, la interpretación de un fenotipo knockout no siempre es simple. Además, el


efecto de la alteración génica podría originarse en una ruta inesperada. Esto incluye la
eliminación involuntaria de microRNA junto con el gen de interés (Osokine et al., 2008). En
otros casos, la manipulación del gen puede afectar a otros genes ubicados cerca del
objetivo deseado y confundir la interpretación de fenotipos de alelos diseñados para ser
simples mutaciones nulas (Olson et al., 1996). Por lo tanto, se requiere precaución al
interpretar los resultados de los knockouts.

Factores que regulan la migración de esperma

Todas las 11 líneas de Clase I de machos alterados genéticamente que se muestran en la


Tabla 1 exhibieron el mismo defecto de migración de espermatozoides hacia el oviducto,
un defecto que no se habría identificado mediante estudios in vitro. En los ratones, el útero
y el oviducto se encuentran en una estructura llamada unión uterotubial (UTJ), que reduce
significativamente la cantidad de espermatozoides que alcanzan los óvulos. El flujo en el
UTJ es bidireccional. Después del coito, los espermatozoides deben moverse hacia arriba
para alcanzar los óvulos y, después de la fusión de los gametos, los embriones resultantes
de los huevos fertilizados deben moverse hacia abajo de la UTJ para su implantación en el
útero. No se conoce cómo la UTJ regula este flujo bidireccional. Sin embargo, está claro
que la migración de los espermatozoides no está regulada por la simple apertura y el cierre
de la entrada UTJ en el ratón. Una chaperona molecular específica para testículos, la
calmegin, es uno de los genes esenciales necesarios para que los espermatozoides migren
hacia el oviducto (Ikawa et al., 1997). Usando ratones quiméricos que eyaculan
espermatozoides de tipo salvaje y etiquetados con GFP, con interrupción de calmegin, se
observó que solo los espermatozoides de tipo salvaje migraron al oviducto, mientras que
los espermatozoides con motonemia igualmente perturbados permanecieron en el útero
(Nakanishi et al. , 2004). Estas observaciones indicaron que la entrada al oviducto está
regulada por un sistema de reconocimiento entre un espermatozoide individual y el UTJ,
pero el mecanismo molecular que sustenta este sistema aún no se ha determinado

La capacidad de unión a la zona de los espermatozoides

La interacción esperma-zona está regulada casi de manera total o nula, como se ilustra
en la Fig. 2. In vitro, muchos espermatozoides pueden unirse (o unirse) a la ZP de los
huevos no fertilizados, pero no pueden unirse a los huevos de dos células , lo que sugiere
que la unión de la zona del esperma podría ser un evento controlado. La pérdida de la
capacidad de unión a la zona, que se observó comúnmente en las líneas de ratones
knockout Clase I, podría evaluarse fácilmente mezclando espermatozoides con óvulos
libres de cúmulos, e inicialmente nadie dudaba de que la infertilidad fue causada por la
pérdida de la capacidad de unión a la zona . Sin embargo, esta suposición no era correcta
como se pensó inicialmente.

Figura 2.
Viaje de los espermatozoides para encontrar el huevo. (A) Los espermatozoides de tipo
salvaje no pueden unirse a la zona pelúcida (ZP) de los óvulos fecundados (izquierda), sino
que se unen fácilmente a la ZP de los huevos no fertilizados (derecha) in vitro. (B) Por el
contrario, los espermatozoides de los ratones alterados genéticamente que se muestran en
la Clase I de la Tabla 1 no pueden unirse a la ZP del huevo no fertilizado in vitro (izquierda).
Sin embargo, estos espermatozoides pueden fertilizar los huevos si los huevos están
cubiertos en capas de células del cumulus (derecha). (C) Los espermatozoides de clase I
comparten el mismo fenotipo: los espermatozoides se pueden observar en el útero pero no
pueden migrar hacia el oviducto (flecha superior), mientras que los espermatozoides de tipo
salvaje (WT) pueden (flecha inferior). (D) Esta infertilidad se puede rescatar inyectando los
espermatozoides alterados genéticamente directamente en el oviducto.

Muchos estudios también han postulado la participación de carbohidratos en la unión de la


zona del esperma. Debe señalarse, sin embargo, que muchas de estas postulaciones se
basaron en estudios in vitro, y aún no se ha confirmado un papel esencial para tales
residuos de carbohidratos in vivo. La eliminación enzimática de residuos terminales Gal
(Bleil y Wassarman, 1988) o GlcNAc (Shur y Hall, 1982) de huevos, por ejemplo, anuló la
capacidad de ZP3 para inhibir la unión de esperma. Sin embargo, los ratones alterados
genéticamente que carecen de estos residuos en sus zonas son fértiles (Asano et al., 1997;
Thall et al., 1995), lo que sugiere que estos residuos no son esenciales per se para la
fertilización. También se indicó que fucosa en los glicanos que contienen Lewis X y A
desempeña un papel en la unión de la zona del esperma (Kerr et al., 2004), pero los ratones
que carecen de la correspondiente fucosiltransferasa (Fut9) eran fértiles (Kudo et al., 2004).
. También se ha propuesto un papel para la manosa presente en los glicanos (Cornwall et
al., 1991), pero ha sido anulado por el tratamiento con N-glicanasa (Florman y Wassarman,
1985). Los experimentos in vitro también han atribuido actividad de unión de esperma a
cadenas laterales oligosacáridas unidas a O unidas a Ser332 y Ser334 de ZP3 (Chen et al.,
1998). Sin embargo, los ratones transgénicos que albergaban mutaciones en Ser332 y 334
eran fértiles (Liu et al., 1995). Además, no se observó glicosilación en estos residuos en las
proteínas ZP nativas (Boja et al., 2003). Además, la alteración de la proteína de unión de
SP56 ZP3-(ZP3R - Mouse Genoma Informatics) en espermatozoides (. Bookbinder et al,
1995) dio como resultado casi ningún fenotipo en la fertilización (Muro et al, 2012)..
Finalmente, las enzimas que producen glucanos core también se han alterado, y los huevos
que carecen de N-glucanos complejos e híbridos así como los O-glicanos derivados de
core-1 se fertilizaron normalmente (Shi et al., 2004; Williams et al., 2007). . La hipótesis de
que los carbohidratos juegan un papel importante en la interacción espermatozoide-huevo
requiere, por lo tanto, un mayor apoyo.

Una visión reciente que ha sido verificada por animales manipulados genéticamente es que
la zona pierde su afinidad por los espermatozoides cuando la ovastacina (también conocida
como metaloendopeptidasa similar a la astacina), una enzima contenida en los gránulos
corticales del huevo (Burkart et al., 2012), escinde ZP2 después de la fertilización (Bleil et
al., 1981; Gahlay et al., 2010). Además, se ha sugerido que el hígado originado
glicoproteína fetuina-B circulante es esencialmente necesario para inhibir la escisión
prematura de ZP2 inhibiendo ovastacina (Dietzel et al., 2013). En conjunto, estos estudios
han demostrado que pueden ocurrir varias interacciones de esperma-zona, pero que
muchas de ellas pueden no ser absolutamente necesarias para una fertilización exitosa.
También debemos recordar que la "unión de la zona del esperma" descrita anteriormente
puede no reflejar la interacción real de esperma-huevo requerida para la fertilización in vivo,
como se muestra en la Fig. 2. Las diferencias anatómicas o de comportamiento entre las
especies garantizan que un macho y una hembra de dos especies diferentes normalmente
no se aparean. Sin embargo, se ha demostrado la penetración de la zona específica del
taxón (Rankin et al., 2003). Sin embargo, si los espermatozoides no requieren una
capacidad de unión a la zona para la fertilización, ¿cómo pueden distinguir la ZP de la
misma especie? Se puede anticipar que existe una afinidad aún no aclarada entre los
huevos cubiertos de cúmulos y los espermatozoides. Podemos especular que la misma
molécula responsable de la unión de la zona se utiliza en el reconocimiento de
espermatozoides UTJ, lo que podría explicar por qué los defectos en la unión de zonas y la
penetración de UTJ tienen lugar de forma inseparable

Se informa que la proteína de esperma zonadhesin (ZAN) contribuye a la unión de zona


específica de especie (Tardif et al., 2010), pero esto aún no se ha demostrado mediante el
rescate de Zan - / - por Zan de otra especie. Además, cuando las proteínas ZP de ratón
fueron reemplazadas por homólogos humanos por manipulación del gen septuple
(interrupción triple del gen mZP1 a mZP3 y inserción cuádruple transgénica de hZP1 a
hZP4), se demostró que los espermatozoides humanos podían unirse y penetrar la ZP
humanizada (Baibakov et al. , 2012). Estos datos pueden indicar la penetración de la zona
específica del taxón. Sin embargo, Gahlay et al. también se mencionó que los
espermatozoides de ratón también podrían penetrar en la ZP humanizada, lo que, de alguna
manera, indicó que la penetración de zonas no específicas de taxones es posible para los
espermatozoides de ratón. También se debe tener en cuenta que se ha demostrado que
los espermatozoides vole de campo penetran en las zonas pelúcidas del ratón y el hámster
sin la necesidad de una reacción acrosómica

Regulación e importancia de la reacción acrosómica inducida por la zona

Varias enzimas consideradas para ayudar a los espermatozoides a penetrar en las capas
de células del cúmulo y ZP se liberan por exocitosis acrosomal (Florman y Ducibella, 2006).
El momento de la reacción acrosómica se cree que es importante para los espermatozoides
a medida que se acercan a los huevos. Por lo tanto, muchos investigadores creyeron que
la reacción acrosómica de los espermatozoides fertilizantes se indujo al contacto con la ZP
y que los espermatozoides que han experimentado la reacción acrosómica antes del
contacto con la ZP no tienen capacidad de fertilización (Bleil y Wassarman, 1983). Más
recientemente, se demostró que la adición de ZP solubilizada puede inducir la reacción
acrosómica (Florman y Ducibella, 2006), y una secuencia parcial de ZP3 puede lograr el
mismo efecto (Hinsch et al., 2005). En este contexto, se asumió que las proteínas de unión
a la zona inducen una cascada de señalización en los espermatozoides (Gong et al., 1995).
De hecho, varias proteínas de unión a la zona se buscaron y se purificaron de los
espermatozoides. Sin embargo, la alteración génica de estos factores no dio como
resultado un fenotipo significativo en la fertilización [p. GalTase (Lu y Shur, 1997), Sp56
(Muro y col., 2012), zonadhesina (Tardif y col., 2010), Crisp1 (Da Ros y col., 2008), acrosina
(Baba y col., 1994)] . Por lo tanto, aunque estos factores pueden desempeñar un papel en
la inducción de la reacción acrosómica, la importancia de estos factores y una reacción
acrosómica inducida por la zona durante la fertilización no está clara.

Curiosamente, los espermatozoides de hámster completan la reacción acrosómica


alrededor del tiempo que pasan a través del cúmulo, o poco antes, o después de
contactar la superficie de la ZP in vivo (Cummins y Yanagimachi, 1982). Del mismo modo,
los espermatozoides de cobaya que participan en la fertilización parecen experimentar la
reacción acrosómica después de llegar a la parte proximal del oviducto o cuando están
muy cerca de los huevos (Yanagimachi y Mahi, 1976). Además, los espermatozoides de
conejo recuperados del espacio perivitelino de los óvulos fecundados aún pueden
penetrar y fertilizar ovocitos frescos (Kuzan et al., 1984). Estos resultados sugieren que la
capacidad de fertilización de los espermatozoides se mantiene por un tiempo después de
la reacción acrosómica. De acuerdo con esta noción, se ha informado una estructura
compartimentalizada dentro del acrosoma (Kim et al., 2001) y la liberación asincrónica de
proteínas acrosómicas durante la exocitosis acrosomal (Hardy et al., 1991; Kim y Gerton,
2003; Nakanishi et al., 2001). Más recientemente, se demostró que los espermatozoides
de ratón reaccionados con acrosomas penetran huevos frescos, rodeados de cúmulos,
zona intactos, y los huevos fertilizados resultantes se desarrollan a término después del
trasplante uterino (Inoue et al., 2011). Estos resultados sugieren que el momento de la
reacción acrosómica puede ser flexible. También sugiere que la interacción crucial entre
la esperma y la zona se produce entre la ZP y los espermatozoides con acrosoma, en
lugar de acrosoma intacto

La fusión de esperma-huevo

Después de la fusión, los espermatozoides activan el huevo induciendo oscilaciones de


calcio y la finalización de la segunda división celular meiótica (Miyazaki e Ito, 2006) PLCζ
de espermatozoides se considera el activador responsable durante este proceso (Nomikos
et al., 2012), pero otros los factores también pueden estar involucrados (Harada et al.,
2011). La activación del huevo conduce a la exocitosis de gránulos corticales localizados
periféricamente. La ovastacina es una enzima que se acumula en los gránulos corticales
como se describió anteriormente, y se informa que da como resultado la segmentación de
ZP2, que se considera que disminuye la afinidad por los espermatozoides (Burkart et al.,
2012). Este fenómeno, que evita la polispermia, se llama zona de reacción.

Para identificar los factores implicados en la fusión espermatozoide-huevo, se


caracterizaron los antígenos de anticuerpos monoclonales que inhiben la fusión in vitro
(Blobel et al., 1992; Okabe et al., 1987; Okabe et al., 1992), y esto condujo a la identificación
de moléculas tales como CD46 (Taylor et al., 1994), IZUMO1 (Inoue et al., 2005) y fertilina
(ADAM1b / heterodímero ADAM2) (Blobel et al., 1992). Para evaluar las funciones de estas
moléculas in vivo, los investigadores recurrieron a experimentos de interrupción de genes
en ratones. Inicialmente, el fertilín llamó la atención pero resultó no ser necesario para la
fertilización in vivo (Cuadro 2). También se produjo una línea de ratón alterada Cd46 pero,
aunque el testículo es el único lugar en el que se expresa CD46 en ratón, no se observaron
efectos sobre la capacidad fertilizante de los espermatozoides de estos ratones (Inoue et
al., 2003). Es posible que estas proteínas desempeñen funciones redundantes y, cuando
se las elimina, su función puede ser compensada por otras proteínas. Alternativamente, es
posible que estos factores interactúen con otros factores o dependan de ellos, y se requiera
la eliminación de factores interactuantes adicionales para observar un efecto in vivo (ver el
Cuadro 2 para una discusión adicional de las limitaciones de tales enfoques de
inactivación).

A pesar de sus limitaciones potenciales, las alteraciones genéticas a veces nos traen
hallazgos fortuitos. Por ejemplo, el gen que codifica la tetraspanina CD9 se interrumpió
inicialmente para aclarar su papel en la inmunología, pero se convirtió en el primer factor
esencial conocido para la fusión esperma-huevo (Kaji et al., 2000; Le Naour et al., 2000;
Miyado et al., 2000). Más recientemente, interrumpimos otro gen, Izumo1, que se demostró
que era esencial para la fertilización; Los ratones Izumo1 - / - producen espermatozoides
de aspecto normal pero son completamente infértiles. Los espermatozoides rotos Izumo1
son capaces de penetrar las capas del cúmulo y la ZP normalmente, pero no se fusionan
con los huevos (Inoue et al., 2005), lo que destaca la importancia de IZUMO1 en el evento
de fusión esperma-huevo.

En base a tales estudios de disrupción genética, CD9 en el huevo e IZUMO1 en los


espermatozoides son los únicos dos factores esenciales para la fusión descritos hasta la
fecha. Sin embargo, la interacción entre los dos factores no se ha observado y,
estructuralmente, ninguno de los factores tiene un dominio fusogénico, lo que sugiere que
podrían actuar a través de proteínas interactuando adicionales. Sin embargo, la reciente
identificación e interrupción de una proteína asociada a IZUMO1 (enzima convertidora de
angiotensina 3; ACE3) dio como resultado machos fértiles (Inoue et al., 2010), lo que implica
que debe haber otros factores adicionales implicados en la fusión.

Para evaluar el papel de IZUMO1 durante la fecundación, se investigó la localización de


IZUMO1 en el momento de la fusión utilizando mCherry-tagged IZUMO1. IZUMO1
inicialmente se oculta debajo de la membrana plasmática antes de la reacción acrosómica,
pero luego se desplaza hacia la membrana plasmática desde la membrana acrosomal
externa durante la reacción acrosómica en los espermatozoides vivos (Satouh et al., 2012).
Esto sugiere que una función adicional de la reacción acrosómica es hacer que los
espermatozoides sean capaces de fusionarse con el huevo transfiriendo IZUMO1 y
posiblemente otras proteínas a la superficie del espermatozoide (Figura 3A). Es de destacar
que se observaron tres patrones de localización de IZUMO1 después de la reacción
acrosómica: (1) un patrón de fluorescencia ecuatorial (EQ); (2) un patrón de fluorescencia
de cabeza (H); o (3) un patrón de fluorescencia de tapón acrosomal tenue (AC) (ACdim)
(figura 3C-E). La formación del patrón ACdim fue notable, ya que este patrón se consideró
producido por la fagocitosis de la membrana acrosomal interna después de que se realiza
el primer evento de fusión (marginal), con parte de la membrana espermática separándose
del plano de fusión (dividiendo fusión) (Fig. 3D, E). La formación de un patrón ACdim es el
producto del paso de fusión 2 (figura 3F). Como cada evento de fusión tiene una naturaleza
característica, cada uno puede requerir factores de fusión individuales. En cualquier caso,
necesitamos identificar más factores involucrados en la fusión esperma-huevo

Fig. 3. Dos pasos distintos de fusión en la fusión esperma-huevo. (A) Cuando los huevos
libres de zona se mezclan con los espermatozoides que expresan el IZUMO1 marcado con
mCherry (rojo), se observan diversos patrones de localización de IZUMO1: tapón acrosomal
(AC), ecuatorial (EQ) o cabeza (H) y dim AC (ACdim ) Tenga en cuenta que el color en el
AC aparece en amarillo en A debido a la existencia de GFP acrosomal. Los patrones EQ o
H son evidentes antes de la fusión, mientras que el patrón ACdim se ve en los
espermatozoides fusionados, indicados por tinción de Hoechst (azul). (B-F) Se ilustra el
movimiento dinámico de IZUMO1 (círculos rojos y relleno rojo) en el momento de la fusión
espermatozoide-óvulo, según lo determinan las imágenes en vivo (Satouh et al., 2012). CD9
está representado por círculos azules. Los paneles superiores representan secciones
transversales y los paneles inferiores muestran vistas superiores de los espermatozoides.
Los espermatozoides intactos (B) muestran un patrón de AC. Los espermatozoides
competentes en Fusión (C) exhiben un patrón EQ de IZUMO1 e inician la interacción con
los huevos (amarillo). Una vez que comienza la fusión (D), el IZUMO1 en los
espermatozoides se extiende desde los espermatozoides hasta la membrana del plasma
de los huevos. Sin embargo, IZUMO1 en la membrana acrosomal interna permanece en los
espermatozoides. Los espermatozoides reaccionados con acrosoma (E) tienen una
estructura invaginada complicada, pero después de la fusión, la membrana plasmática del
espermatozoide se une con la del óvulo y forma un único plano que incluye la parte de la
cola de la membrana. Sin embargo, el área interna de la membrana acrosomal que contiene
IZUMO1 se desprende del plano de fusión original (E) y forma una estructura de membrana
independiente, dando lugar al patrón ACdim. (F) El proceso de fertilización puede separarse
en dos fases: (1) una fase marginal (C a D); y (2) una fase de separación (D a E). El primero
se puede describir como el primer evento de fusión, que se muestra aquí como un evento
de fusión célula-célula estándar que utiliza estrellas azules como puntos focales de fusión.
El último, que puede separarse del primer evento de fusión, tiene un aspecto endocitótico
y una característica topológica diferente de la primera fusión (los sitios de fusión están
indicados con estrellas rojas

Está surgiendo una nueva vista (figura 4) sobre el mecanismo de fertilización. Esta visión
incluye la disminución de la importancia de la llamada "capacidad de unión a la zona" de
los espermatozoides, una reacción acrosómica independiente de la zona y la capacidad
de penetración en la zona de los espermatozoides recuperados del espacio perivitelino.
Esta vista actualizada se basa en gran medida en las observaciones in vivo de animales
manipulados genéticamente, mientras que los modelos clásicos se centraron
principalmente en las observaciones de la fertilización in vitro (FIV). En condiciones de
FIV, los huevos deben exponerse a 105 espermatozoides por ml (que comprenden una
mezcla de espermatozoides degradados y acrosoma intactos, acrosómicamente
reaccionados). Sin embargo, solo unos pocos espermatozoides (presumiblemente
reaccionados con el acrosoma) se acercan a los huevos para la fertilización in vivo.
Además, estudios recientes han demostrado que muchos factores informados como
importantes para la fertilización in vitro pueden alterarse genéticamente con poca o
ninguna perturbación de la fertilidad (aunque consulte el Cuadro 2 para una discusión más
detallada de las posibles razones para esto). Estos estudios enfatizan que, para evitar el
entusiasmo equivocado que podría inducir a error al campo, será importante validar las
moléculas candidatas en animales manipulados genéticamente para centrarse en los
esenciales para la fertilidad. La fertilización podría ser uno de los campos de investigación
más adecuados para requerir el uso de animales manipulados genéticamente para
realizar estudios in vivo, ya que el comportamiento misterioso de los gametos es
aparentemente difícil de reproducir in vitro.
Fig. 4.
Mecanismo de fecundación: modelos antiguos y nuevos. En el esquema clásico (izquierda),
los espermatozoides tienen hialuronidasa (PH-20, también conocida como SPAM1)
(triángulos rosas) en su superficie y penetran en la capa del cúmulo y se adhieren a la zona
pelúcida (ZP). Se han postulado muchas proteínas de unión a la zona en los
espermatozoides (Tabla 2). Se informó que ZP3 es la molécula a la que los
espermatozoides se unen (o se unen) y tienen una capacidad inductora de la reacción
acrosómica. El momento de la reacción acrosómica también se propuso como importante
para la penetración de la zona porque se creía que las enzimas acrosómicas (como la
acrosina) debían liberarse al unirse a la zona. También se pensó que la fecundación
espermática funcionaba durante la fusión del huevo, con huevos que usaban la integrina
α6β1 para su homólogo. Sin embargo, ninguno de estos ratones alterados genéticamente
se volvió infértil (He et al., 2003). En el esquema moderno (derecha), los espermatozoides
penetran en la capa del cumulus con o sin la reacción acrosómica. Los espermatozoides
reaccionados con acidosoma pueden incluso penetrar el cúmulo y la zona por segunda vez
(Inoue et al., 2011). Aunque la capacidad de "unión de zonas" no se requiere para que los
espermatozoides fertilicen los óvulos, se sabe que la capacidad de "unión de zonas" es
atribuible a ADAM3 (puntos rosados) en la superficie de los espermatozoides. Si ADAM3
se volvió aberrante, los espermatozoides no pudieron migrar al oviducto y, por lo tanto, no
pudieron acercarse a los huevos. Si ADAM3 se volvió aberrante, los espermatozoides no
pudieron migrar al oviducto y, por lo tanto, no pudieron acercarse a los huevos. Sin
embargo, ADAM3 es un pseudogen en humanos (Grzmil et al., 2001). Por lo tanto, si existe
un mecanismo general entre las especies de mamíferos, aún no podríamos haber
encontrado el factor clave para la fertilización. Se demostró que IZUMO1 en los
espermatozoides y CD9 en los huevos es esencial para la fusión, pero el mecanismo
preciso de la fusión aún no se ha aclarado