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Aplicaciones de la biotecnología a la Mejora de Plantas

3.4. QTLs y selección asistida por marcadores

Laura Pascual Bañuls

Madrid, 6 de noviembre de 2017


QTLs y selección asistida por marcadores

1. Identificación de la región que controla un carácter.


1.1 Concepto general.
1.2 SMA, Single Marker Analysis
1.3 BSA, Bulk Segregant Analysis
1.4 Cartografiado de QTLs
1.5 Mapeo por asociación

2. Selección asistida por marcadores


2.1 Selección asistida por marcadores (MAS). Concepto
2.2 Elección de marcadores
2.3 Selección tras retrocruce
2.4 Selección para el desarrollo de líneas puras
2.5 Selección simultanea para varios caracteres, o para QTLs.
2.6 Aplicación de nuevas tecnologías. Selección genómica.

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QTLs y selección asistida por marcadores – concepto general

La mayoría de los caracteres de interés en la mejora vegetal son cuantitativos o


poligénicos, como el rendimiento, altura de la planta, la resistencia a distintos tipos de
estrés abiótico o el índice de gluten de la harina.

Para identificar la región o regiones cromosómicas (QTLs) que controlan la expresión de


un carácter, se buscan asociaciones entre los valores fenotípicos y genotípicos.

Se trata de encontrar marcadores que expliquen una parte sustancial de la variación


fenotípica de un carácter

a) Fenotipar la población para el carácter de interés.

b) Genotipar la población mediante marcadores moleculares

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QTLs y selección asistida por marcadores – SMA

SMA

 Método más simple


 No hace falta mapa genético
 Test estadístico: ANOVA, t-student,
regresión lineal

Poca resolución depende mucho del


número de marcadores analizados, tiene
poca fuerza estadística y aparecen muchos
falsos positivos.

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QTLs y selección asistida por marcadores – BSA

BSA
Comparación de dos muestras cada una de las cuales está formada por la mezcla del ADN de diferentes individuos (pool) procedentes
de una población segregante originada desde un cruzamiento simple.

El polimorfismo entre los parentales de esa población y que esté estrechamente ligado a un QTL que regule un carácter particular co-
segregará con él. Así, si los individuos están agrupados acorde a los grupos extremos de expresión del carácter, la frecuencia de los dos
alelos del marcador presentes en cada uno de los dos grupos debería desviarse significativamente de la proporción debida al azar.

Genotipado de sólo 2 muestras

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QTLs y selección asistida por marcadores – Cartografiado de QTLs

CARTOGRAFIADO DE QTLs

El proceso de identificación de QTLs requiere realizar una serie de pasos:

a) Obtener una población de mapeo adecuada.

b) Fenotipar la población para el carácter de interés.

c) Genotipar la población mediante marcadores moleculares.

d) Elaborar un mapa genético.

e) Emplear un método de detección de QTLs.

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QTLs y selección asistida por marcadores – Cartografiado de QTLs

Ejemplo práctico de identificación de QTLs

a) Líneas puras que difieren en la densidad de los tricomas.

b) F1: línea con densidad intermedia.

c) Cada F2 se autofecunda durante 6 generaciones para obtener


RILs. Cada RIL será homocigota para un fragmento determinado
de los cromosomas parentales. Las RILS se genotipan para
varios marcadores y para el fenotipo de densidad de tricomas.
La flecha indica una región del cromosoma que deriva del
parental de baja densidad, las hojas de los individuos que
portan esa región siempre mostraban una baja densidad de
tricomas, indicando la presencia de un QTL en esa región para
dicho carácter.

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QTLs y selección asistida por marcadores – Cartografiado de QTLs

Métodos de localización de un QTL en un mapa genético

•Mapeo de intervalos: (IM, Interval mapping): Este modelo estadístico emplea el método de máxima verosimilitud y tiene
en cuenta que el QTL a estimar está localizado entre dos marcadores flanqueantes. Se basa en la cosegregación entre el
supuesto QTL y los marcadores flanqueantes. La localización se realiza con precisión cuando los efectos del QTL son muy
grandes.

•Regresión lineal múltiple: También es un mapeo de intervalos pero empleando un análisis de regresión lineal. Tiene la
ventaja frente al método anterior de que el modelo matemático es más sencillo de programar y la posibilidad de integrar
factores externos, como el diseño experimental, en el análisis. Si el mapa genético del que se parte es bastante denso,
puede dar resultados muy buenos.

•Mapeo de intervalos compuesto: (CIM, Composite interval mapping): Este modelo combina la regresión múltiple y el
método de máxima verosimilitud y permite localizar mejor la posición del QTL en el intervalo de mapeo. En la actualidad es
el método más utilizado, ya que se considera el más informativo, eficiente y de mayor resolución.

Todos los modelos son muy complejos a nivel estadístico, lo que ha provocado el desarrollo de numerosos programas
informáticos adaptados al mapeo de QTLs como el MAPQTL, QTL Cartographer o QGene.

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QTLs y selección asistida por marcadores – Cartografiado de QTLs

Ejemplo de identificación de QTLs por IM

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QTLs y selección asistida por marcadores – Cartografiado de QTLs

FACTORES A TENER EN CUENTA

Características genéticas del QTL

Ambiente

Tamaño y tipo de población

Número y tipo de marcadores

Error experimental

Validación del QTL

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QTLs y selección asistida por marcadores – Cartografiado de QTLs

¿Los QTLs son ciertos?

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QTLs y selección asistida por marcadores – Mapeo por asociación

FACTORES A TENER EN CUENTA

Genotipado

Elección de la población LD

Estructura poblacional

K=9

Dic Dur Dur Dur Dur Dur Tur Dur Dur


Tur Tur
Dic
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QTLs y selección asistida por marcadores – Mapeo por asociación

Limitaciones del mapeo de QTLs en poblaciones segregantes:

 Extrapolación de los resultados: las líneas parentales no


cubren toda la variabilidad

Melon diversity

SC

PS
LGXII

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QTLs y selección asistida por marcadores – Mapeo por asociación

Limitaciones del mapeo de QTLs en poblaciones segregantes:

 Grado de ligamiento del marcador con el carácter

Nº limitado de meiosis
Pueden existir otros QTLs en la población no
representados en los dos parentales selaccionados

Durante n generaciones (meiosis) la recombinación


eliminará asociaciones entre un QTL y un marcador
a no ser que esté estrechamente ligado con él

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QTLs y selección asistida por marcadores – Mapeo por asociación

Variación fenotípica observable

Simple-monogénico
Control genético
Complejo-poligénico
Paneles de asociación genética:
población constituida por un conjunto de
Variedades, razas locales o líneas silvestres. Originally developed for human genetics (Bodmer 1986; Thomas et
al.2005),

Ventajas:
Mayor diversidad genética
Mayor resolución: Identificación de marcadores estrechamente MUY IMPORTANTE - Elección de la población
ligados al carácter de interés Estudio previo de la diversidad
Mucho más rápido (desarrollar una poblacion biparental son Líneas muy homogéneas genéticamente
años) y económico representan un problema
Una población puede ser utilizada para muchos caracteres
Hay mucha información fenotípica acumulada por el desarrollo
de variedades
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QTLs y selección asistida por marcadores – Mapeo por asociación

GENOTIPADO

Desarrollo de plataformas de genotipado masivo


SNPs
NGS

Cuidado con los SNPs poco polimórficos (<5%)!!!!


Tienden a dar falsos positivos (asociaciones estadísticas positivas pero
genéticamente falsas). Provienen de grupos reducidos de líneas genéticamente
muy similares, aunque el SNP no esté ligado, sus frecuencias van a estar
correlacionadas con las diferencias fenotípicas de ese grupo.

Tener los marcadores mapeados no es imprescindible para hacer el estudio


de asociación, pero es aconsejable y facilita algunas cosas

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QTLs y selección asistida por marcadores – Mapeo por asociación

Desequilibrio de ligamiento (LD)

La propiedad de alelos de loci diferentes de no segregar de forma independiente


en una población de mapeo, etc…
Linkage disequilibrium (LD) is defined as a nonrandom association of alleles at separate loci located on the same chromosome
(M&P, 2007)

Depende del Tipo de población


En una población biparental, el LD se debe al ligamiento en el mismo
cromosoma. El valor de LD es inversamente proporcional a r
El LD persiste a grandes distancias (genéticas y físicas)
Es posible detectar asociaciones entre marcadores muy alejados
En poblaciones naturales, el LD es el producto de la historia evolutiva de la
población. Se calcula mediante el análisis de correlación entre los alelos de los
marcadores.
Por lo general, el LD se diluye rápidamente con la distancia
Esto implica que hay que usar más marcadores

Colección de landraces: están históricamente más separadas, más eventos de


recombinación 16
QTLs y selección asistida por marcadores – Mapeo por asociación

Región cromosómica Zonas pericentroméricas vs zonas teloméricas

Alógamas o autógamas: El LD es mayor en autógamas


Factores que contribuyen a aumentar el LD: pequeño tamaño de la
población, deriva, aislamiento o subdivisión de la población, bajas
tasas de recombinación, epistasias.

Siempre hay que


determinar el LD en
nuestra población de
estudio. Determina el
número de marcadores
necesarios

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QTLs y selección asistida por marcadores – Mapeo por asociación

El problema de la estructura de la población


STRUCTURE
Ej: carácter altura DARwin
Población formada por hispanos y nórdicos

Asociaciones falsas (pero estadísticamente


verdaderas) ligadas a características K=9
inherentes a cada subgrupo: color de ojos,
color de pelo, etc… Dic Dur Dur Dur Dur Dur Tur Dur Dur
Tur Tur
Dic

M1 M2 M3 M4 M5 M6 ---
M1 2
Relaciones de parentesco: kinship. Matriz K M2 0.34 2
La probabilidad de que dos alelos cogidos en M3 0.56 0.03 2
dos individuos al azar sean idénticos por M4 1.23 2 0.55 2
descendencia. M5 1.23 1.22 0.08 0.44 2
M6 0.67 0.99 0.34 0.76 1.54 2
--- 0.11 1.10 0.56 0.33 1.98 0.55 2

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QTLs y selección asistida por marcadores – Mapeo por asociación

Mapeo de QTLs por asociación

Análisis de regresión del fenotipo frente a los alelos


segregantes de cada locus

Sólo si la población no está estructurada (MAGIC)

Si hay que tener en cuenta la estructura…. Utilizar programas que tengan en


cuenta las relaciones de parentesco entre individuos (GLMM)
Genstat, R,
TASSEL
GLM: General Linear Model: Incluye como covariable la estructura Candidate Gene Association Mapping of Arabidopsis
MLM: Mixed Linear Model: Incluye también la matriz kinship Flowering TimeGenetics, 2009Ehrenreich et al.

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QTLs y selección asistida por marcadores - Concepto

La selección asistida por marcadores (MAS) es un proceso indirecto mediante el cual un carácter de interés se
selecciona en base a un marcador estrechamente ligado.

Ventajas:
 Cantidad de marcadores disponibles
 Independientes de efectos ambientales
 Independientes del estadio de desarrollo
 Fáciles de ensayar
 Posibilidad de detectar heterocigotos
 Posibilidad de aumentar tamaño poblacional
 Posibilidad de selección múltiple Fenotipo
Marcador ligado

Inconvenientes:
 Identificación de marcador ligado
 Recombinación
 Necesidad de verificar utilidad para diversos materiales http://barleyworld.org/oregonwolfe

 Efecto del fondo genético


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QTLs y selección asistida por marcadores - Concepto

Esquema del proceso de MAS

Identificación de marcadores ligados

Desarrollo de población segregante

Caracterización de los marcadores


X generaciones
Nuevas generaciones

Confirmación mediante evaluación fenotípica

La selección asistida por marcadores puede ser en dos sentidos:

 Selección positiva se seleccionarán los materiales que llevan un determinado alelo, puesto que este
alelo esta en acoplamiento con le fenotipo deseado
 Selección negativa se rechazan los materiales que llevan un determinado alelo si este está en fase de
repulsión con el fenotipo deseado
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Marcadores moleculares – Selección asistida por marcadores
3.2 Elección de marcadores

Cuando se conoce al ubicación del gen de interés, tenemos dos posibilidades:

1. Marcador intragénico (polimorfismo causal)


 Ausencia de recombinación
 Exportable a cualquier material
 Necesidad de diseñar un nuevo marcador

2. Marcadores ligados
 Dos marcadores flanqueantes (5cM)
 Codominantes
 Verificar segregación en diversos materiales

Se debe considerar siempre el coste, el tiempo del ensayo y la infraestructura para la elección del marcador.

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QTLs y selección asistida por marcadores – Elección de marcadores

Identificación de QTLs

“ETIQUETADO DE GENES”

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QTLs y selección asistida por marcadores – Selección tras retrocruce

La selección tras retrocruce se emplea cuando se desea introgresar un carácter de interés en una variedad de
elite:

 Mantener el carácter de interés (Resistencia a patógeno)


 Conservar el fondo genético de elite

Selección asistida por marcadores:

 Selección positiva-marcador ligado al carácter de interés


 Selección negativa-marcadores del parental donante

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QTLs y selección asistida por marcadores – Selección tras retrocruce

Efectos de la selección tras el retrocruce:

 Fenotipo recesivo, usar heterocigotos


 Aumentar el número de individuos
 Seleccionar el fondo genético
 Disminuir el número de generaciones

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QTLs y selección asistida por marcadores – Selección para el desarrollo
de líneas puras

Como en el caso de la introgresión los marcadores moleculares también pueden ser utilizados para el desarrollo
de líneas puras:

 Monitorizar efectos de autofecundación


 Determinar la heterocigosidad residual
 Seleccionar los descendientes homocigotos
 Reducir el número de generaciones

Esta aproximación es especialmente útil:

 Trabajar con especies con un largo periodo juvenil.


 Desarrollo de RILs

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QTLs y selección asistida por marcadores – Selección simultanea para
varios caracteres o para QTLs

La selección para apilar diversos caracteres en la misma línea requiere el empleo de un número muy grande de
descendientes. La selección por marcadores permite reducir el tiempo de mantenimiento de individuos no
portadores de caracteres de interés.

1/16 de los descendientes


portadores de los dos caracteres

MAS

Reducción de 93.74% en semillero

A mayor número de genes, mayor beneficio de la selección asistida por marcadores.


http://articles.extension.org/pages/32465/gene-pyramiding-using-molecular-markers
J. Liu, D. Liu, W. Tao, W. Li, S. Wang, P. Chen, S. Cheng, D. Gao Molecular marker-facilitated pyramiding of different genes for powdery mildew resistance in wheat. Plant breeding 2008.
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QTLs y selección asistida por marcadores – Selección simultanea para
varios caracteres o para QTLs

Algunos caracteres, sobretodo los cuantitativos están controlados por diversos genes. Si se conocen los QTLs que
contribuyen al carácter la selección asistida es muy efectiva. Puede permitir seleccionar individuos que lleven un
mayor número de alelos favorables e ir incorporando el resto de alelos secuencialmente.

Mejora clásica

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QTLs y selección asistida por marcadores – Selección genómica

El desarrollo de las nuevas plataformas de genotipado ha permitido desarrollar nuevos métodos de selección
que tienen en cuenta la totalidad del genoma de los individuos, es lo que se conoce como Selección genómica
(GS):
1. Estudio de marcadores en una población de referencia
2. Elaboración de un modelo predictivo
3. Aplicación a una población candidata

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