Actividad antidermatofítica in vitro de aceites

esenciales
Lic. Lizet Hernández Díaz,1 Dra Mayra Rodríguez Jorge,2 Lic. Dinah García3 y Lic.
Jorge Pino Alea4

RESUMEN

Se evaluó la actividad antidermatofítica in vitro de las especies Ocimum gratissimum L.,

Ocimum tenuiflorum L., Pimenta dioica L y Piper auritum H.B.K. El estudio de esta
actividad biológica se realizó mediante la determinación de las concentraciones
mínimas inhibitorias con el empleo del método de diluciones en medio caldo sabouraud
dextrosa. Se trabajaron muestras de aceites esenciales obtenidos en la Estación
Experimental de Plantas Medicinales "Dr. Juan Tomás Roig" y se empleó una batería
microbiana integrada por los dermatofitos Microsporum canis, Trichophyton
mentagrophytes y Trichophyton rubrum, todos provenientes de aislamientos clínicos. La
cinética de la actividad fungicida, así como la caracterización química cualitativa y
cuantitativa de los componentes volátiles también se valoraron. Los resultados
demostraron la presencia de actividad en los aceites sobre las especies fúngicas
estudiadas. Se destacó en tal sentido la susceptibilidad de M.canis frente al Ocimum
tenuiflorum L, el cual presentó una concentración mínima inhibitoria de 0,15 mg/mL.
Los estudios cinéticos corroboraron los resultados de la actividad antimicrobiana y se
encontraron como componentes mayoritarios responsables de dicha actividad en los
aceites, al eugenol presente en la Pimenta dioica L. y en Ocimum tenuiflorum L.; el
timol, presente en Ocimum gratissimum L. y el safrol, presente en Piper auritum H.B.K.

DeCS: ARTHRODERMATACEAE; ACEITES VOLÁTILES; EUGENOL; TIMOL;

TEST DE SENSIBILIDAD MICROBIANA.

Summary

The in vitro antidermatophytic activity of the Ocimum gratissimum L, Ocimum

tenuiflorum L, Pimenta dioica L and Piper auritum H.B.K. species was evaluated. The
study of this biological activity was conducted by the determination of the minimum
inhibitory concentrations using the method of dilutions in Sabouraud dextrose broth
medium. Samples of essential oil obtained at "Dr. Juan Tomás Roig" Experimental
Station of Medicinal Plants were used and a microbial battery composed of
Microsporum canis, Trichophyton mentagrophytes and Trichophyton rubrum
dermatophytes, all of them from clinical isolations, was utilized. The kinetics of the
fungicidal activity, as well as the qualitative and quantitative chemical characterization
of the volatile components were also assessed. The results showed the presence of
activity in the oils on the studied fungal species. It was stressed the susceptibility of M.
Canis against Ocimum tenuiflorum L., which had a minimum inhibitory concentration
of 0.15 mg/mL. The kinetic studies corroborated the results of the antimicrobial activity.
The largest components responsible for this activity in the oils were: eugenol, present in
Pimenta dioica L. and in Ocimum tenuiflorum L.; timol, present in Ocimum
gratissimum L.; and safrol, present in Piper auritum H.B.K.
Subject headings: ARTHRODERMATACEAE; OILS, VOLATILE; EUGENOL;
TIMOL; MICROBIAL SENSITIVITY TESTS.

Las enfermedades infecciosas ocupan un lugar importante en los países del tercer
mundo. Son causa de enfermedades debilitantes, agudas, crónicas y en ocasiones
mortales. Pueden predisponer a otras enfermedades, contribuir a la disminución de la
capacidad física y mental del individuo y comprometer su productividad. Tienen por
tanto importancia no sólo desde el punto de vista médico, sino también social y
económico.

Teniendo en cuenta la existencia en Cuba de una flora muy rica y el arraigo popular de
la Medicina Natural y Tradicional se ha venido trabajando en investigaciones científicas
que garanticen el conocimiento y disposición de fitofármacos rigurosamente estudiados,
que posibiliten la obtención de principios activos de bajo costo con efectos tóxicos
inferiores a los existentes.

Por estas razones, el objetivo de esta investigación fue, evaluar la actividad

antidermatofítica in vitro de 4 aceites esenciales de plantas pertenecientes a la flora
cubana mediante la determinación de las concentraciones mínimas inhibitorias (CMI).
Además se abordaron otros aspectos como la cinética de la actividad fungicida y la
determinación química cualitativa y cuantitativa de los componentes volátiles de los
aceites.

Métodos

Muestras

Se trabajaron muestras de aceites esenciales de las especies Ocimum gratissimum L.

Ocimum tenuiflorum L. Pimenta dioica L y Piper auritum H.B.K. provenientes de la
Estación Experimental de Plantas Medicinales " Dr. Juan Tomás Roig", ubicada en la
provincia de La Habana, además eugenol y timol como componentes puros. Los aceites
esenciales fueron obtenidos por hidrodestilación en un equipo Clevenger a partir de 40 g
de material vegetal seco. Los datos generales de las especies vegetales utilizadas se
muestran en la tabla 1.

Tabla 1. Datos generales de las especies vegetales utilizadas.

No. de Fecha de
Especie vegetal Parte destilada
herbario recolección
Pimenta dioica 4609 5/94 Hojas
Hojas y
Ocimun
0132 7/94 sumidades
gratissimum
floridas
Ocimum
0019 9/93 Follaje
tenuiflorum
Piper auritum 4662 7/95 Hojas
Microorganismos

Los microorganismos utilizados fueron Microsporum canis, Trichophyton

mentagrophytes y Trichophyton rubrum, todos provenientes de aislamientos clínicos y
agentes comunes de dermatofitosis en el hombre. Las suspensiones fueron preparadas
en solución salina y mantenidas a 4 °C hasta ajustárseles la concentración a 104
unidades formadoras de colonias/mL(ufc/mL.)

Determinación de la actividad antidermatofítica

La evaluación de la actividad antidermatofítica se realizó mediante la determinación de

las CMI empleando el método de diluciones en medio líquido,1 para lo cual se usó
caldo sabouraud dextrosa como medio de cultivo. La CMI se definió como la menor
concentración a la cual el agente antimicrobiano es capaz de inhibir el crecimiento.
Todos los tubos fueron incubados a 28 °C durante 15 días y se evaluó visualmente la
inhibición del crecimiento microbiano.

Debido a la insolubilidad de los aceites en agua se utilizó etanol absoluto como

solvente, por lo que fue necesario realizar paralelamente una serie blanco o control y se
empleó el mismo procedimiento que con los aceites esenciales.

Análisis de la composición química de los aceites esenciales

El análisis de la composición química de los aceites esenciales se realizó por

cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-EM) en un equipo Jeol JMS-DX
300 con una columna de cuarzo del tipo BP-1 y con helio como gas portador. La
identificación de los componentes individuales se efectuó mediante sus espectros de
masas a 70 eV comparándolos con los espectros informados en la literatura por Adams
en 1995 y publicados por la Corp. Carol Stream, EE.UU. y en la base de datos IDENT
desarrollada para compuestos volátiles por el IIIA. El análisis cuantitativo se realizó
mediante la relación de las áreas medidas de los picos individuales con el área total de la
cromatografía iónica reconstruida que se obtuvo en el sistema CG-EM.

Estudio cinético

Para realizar el estudio cinético se obtuvieron las curvas de crecimiento para cada
microorganismo ploteando los valores promedios de peso seco en el tiempo. Se
determinó en cada caso el momento en el cual se alcanzó la fase de crecimiento
logarítmico. T. mentagrophytes y M. canis fueron las especies empleadas para este
estudio.

A cultivos en zaranda se le añadieron cantidades prefijadas de los aceites

correspondientes a los valores de CMI, 1/2 CMI y 2 CMI con el objetivo de conocer
como ocurriría la acción fungicida en el tiempo. Adicionadas estas, se siguió el
crecimiento tomando alícuotas de los cultivos a diferentes tiempos.
Los valores obtenidos de peso seco se plotearon contra el tiempo y las curvas obtenidas
se compararon con la curva de crecimiento del microorganismo sin adición del aceite
esencial.

Resultados

Los resultados obtenidos al evaluar la actividad antidermatofítica se muestran en la tabla

2.

Tabla 2. Valores de CMI expresada en mg/mL obtenidos para los diferentes

antifúngicos sobre cada uno de los dermatofitos estudiados.

Muestras M. canis T. mentagrophytes T. rubrum

Pimenta dioica 0,31 0,31 0,31
Ocimum tenuiflorum 0,15 0,62 0,62
Ocimum gratissimum 0,62 0,62 0,62
Piper auritum 1,25 0,31 1,25
Eugenol 0,33 0,33 0,16
Timol 0,10 0,10 0,05

De las especies vegetales estudiadas el Ocimum tenuiflorum L. frente a M. canis

presentó el menor valor de CMI (0,15 mg/mL) mientras que Piper auritum H.B.K. para
este mismo germen fue la especie que mostró el mayor valor de CMI. Esta última
especie vegetal fue también la de mayor valor de CMI frente al T. rubrum (1,25
mg/mL). Pimenta dioica L. y Ocimum gratissimum L. presentaron los mismos valores
de CMI frente a cada uno de los tres dermatofitos (0,31 mg/mL y 0,62 mg/mL),
respectivamente.

Al realizarse la evaluación de la actividad antidermatofítica al eugenol y al timol se

observó que frente a T. rubrum ambos presentaron los menores valores de CMI y para
el resto de los microorganismos los valores coincidieron (0,33 mg/mL el eugenol y 0,10
mg/mL el timol).

En las curvas de crecimiento en cultivos agitados obtenidas para las especies de M.

canis y T. mentagrophytes en medio caldo Sabouraud dextrosa (figuras 1-3) se
comprobó que el inicio de la fase de crecimiento logarítmico se alcanzó alrededor del
5to día post inoculación, momento que constituyó el tiempo 0 de los estudios y tiempo a
partir del cual una vez añadido el antifúngico comenzaron a observarse desviaciones del
crecimiento normal de estas especies fúngicas.
 Fig 1. Cinética de crecimiento de M.canis con Ocimum tenuiflorum L.

Fig 2. Cinética de crecimiento de T. mentagrophytes con Pimenta dioica L.

Fig 3. Cinètica de crecimiento de T. mentagrophytes con Piper auritum H.B.K.

Los resultados obtenidos en el análisis de la composición química cualitativa y

cuantitativa de los aceites se muestran en las tablas.3-6 Como componentes
mayoritarios se obtuvieron el eugenol, presente en los aceites de Pimenta dioica L. y
Ocimum tenuiflorum L, el timol en Ocimum gratissimum L. y el safrol en Piper auritum
H.B.K.

Tabla 3. Composición química del aceite esencial de O. gratissimum L.

Componentes Porcentaje Componentes Porcentaje Componentes Porcentaje

terpinen-4-ol + cis-
Tricicleno 0,13 4,4 p-cimeno 9,30
hidrato de sabineno
-tujeno 2,58 -terpineol 0,13 cis--ocimeno 0,30
p-cimen-8-ol-
-pineno 1,32 1,16 limoneno 2,12
metileter
trans--
Tolueno 0,05 carvona 0,09 0,23
ocimeno
Camfeno 0,21 timol 32,60 -terpineno 5,84
trans-hidrato
Sabineno 0,86 carvacrol 2,09 1,05
de sabineno
 -p-
-pineno 0,72 eugenol 0,82 1,65
dimetilestireno
Mirceno 3,30 -cubebeno 0,3 terpinoleno 0,31
-felandreno 0,46 metil-eugenol 0,09 linalol 0,81
Car-3-eno 0,4 -copaeno 0,43 borneol 0,21
-terpineno 0,15 -bourboneno 0,22 -bourboneno 0,22
-elemeno 0,41 -gurjuneno 0,03 -cariofileno 4,49
cis--
-muroleno 0,06 trans-b-bergamoteno 1,1 0,06
farneseno
3,4-
-humuleno 1,02 1,62 -amorfeno 0,12
dimetoxiacetofenona

Tabla 4. Composición química del aceite esencial de O. tenuiflorum L.

Componentes Porcentaje Componentes Porcentaje Componentes Porcentaje

- tujeno 0,02 - elemeno 18,01 -pineno 0,03
-cariofileno 23,07 canfeno 0,03 -elemeno 0,07
sabineno 0,01 -humuleno 2,04 -pineno 0,02
-amorfeno 0,11 mirceno 0,06 -muruleno 0,
p-cimeno 0,30 -selineno 0,47 1,8-cineol 0,06
trans,trans- 
0,12 limoneno 0,20 -bulneseno 2,25
-ferneseno
trans-  -
0,07 -chamigreno 2,51 -terpineno 0,14
ocimeno
,p-
-bisaboleno 1,14 0,02 calameneno 0,15
dimetilestireno
linalol 0,21 -cadineno 0,29 isomentona 0,2
-cadineno 0,08 borneol 0,3 elemol 0,89
óxido de
mentol 0,15 3,79 terpinen-4-ol 0,12
cariofileno
cubenol 0,11 -terpineol 0,04 trans-cadinol 0,21
timol 2,37 -eudesmol 0,10 eugenol 34,26

Tabla 5. Composición química del aceite esencial de P. dioica L.

Componentes Porcentaje Componentes Porcentaje

- pineno 0,56 - humuleno 10,12
 mirceno 0,19 - amorfeno 2,77
-felandreno 1,12 -muuruleno 1,76
calameneno +- -
p-cimeno 1,87 1,12
cadineno
1,8 cineol 14,69 -cadineno 5,49
-terpineno 0,56 terpinoleno 1,38
cadina-1,4-dieno 0,49 mentol 0,56
-calacoreno 1,23 eugenol 31,14
óxido de
2,69 alloaromadendreno 2,13
cariofileno
-eudesmol 0,52 -eudesmol 0,82

Tabla 6. Composición química del aceite esencial de P. auritum H.B.K.

Componentes Porcentaje Componentes Porcentaje

-tujeno 0,08 longifoleno 0,64
-pineno 0,97 cipereno 0,07
canfeno 0,05 -cariofileno 4,65
cis-murola-4(14)-5-
sabineno 0,08 0,12
dieno
-pineno 1,45 -humuleno 0,47
mirceno 0,30 germacreno D 3,11
-felandreno 0,05 biciclogermacreno 1,26
-terpineno +p-
1,79 -muroleno 0,60
cimeno
limoneno 0,20 -bisaboleno 0,98
cis- - ocimeno 0,16 -cadineno 0,79
trans- -ocimeno 0,27 cadina-1,4-dieno 0,05
elemicina 0,10 -terpineno 2,19
cis-nerolidol 2,80 terpinoleno 1,87
óxido de
1,06 linalol 2,29
cariofileno
4-alilsiringol 0,33 canfor 0,02
1-epi-cubenol 0,13 terpinen-4-ol 0,08
-copaen-4 -ol 0,07 safrol 64,50
cubenol 0,16 timol 0,11
-munrolol 0,16 eugenol 0,29
 -cadinol 0,17  cubebeno 0,14
14-hidroxi- -
0,05 -patchuleno 2,00
muroleno
Ácido
0,30 metil eugenol 0,04
hexadecanoico
1-octadecanol 0,03 -bourboneno 0,17
-terpineol 0,17

Discusión

Los resultados de la actividad antidermatofítica de los aceites esenciales de Ocimum

gratissimum L. Ocimum tenuiflorum L. Pimenta dioica L. y Piper auritum H.B.K
pusieron de manifiesto la actividad presentada por los mismos frente a las especies M.
canis, T. mentagrophytes y T. rubrum, actividad que en todos los casos fue debida a un
daño letal que ocasionó el aceite sobre la célula fúngica. Los valores obtenidos de CMI
fluctuaron entre 0,15 mg/mL y 1,25 mg/mL.

El aceite esencial de Ocimum tenuiflorum L. frente a M. canis fue el que presentó la

mayor actividad antidermatofítica mientras que P. auritum para este mismo germen
mostró la menor actividad. En general de los 4 aceites evaluados, el de Pimenta dioica
L. resultó ser el más activo contra M. canis, T. mentagrophytes y T. rubrum empleados.

No se observó en ningún caso efecto del solvente sobre las células microbianas, por lo
que los resultados son sólo imputables a los aceites.

Varios investigadores estudiaron la actividad frente al dermatofito T. mentagrophytes de

diferentes aceites esenciales, entre ellos una especie del género Piper (Piper aduncum)
y observaron una actividad antidermatofítica bien definida de dicha especie vegetal,2
también se ha encontrado al safrol como principal componente de este aceite esencial.3
lo cual coincidió con los resultados de esta investigación. En la especie vegetal Piper
betle también se ha detectado actividad antifúngica sobre los dermatofitos Microsporum
gypseum y T. Mentagrophyte.4,5

Los estudios sobre la composición química cualitativa y cuantitativa de los aceites

evaluados indicaron la presencia de compuestos a los que se les atribuyen propiedades
antimicrobianas, 6-10 entre ellos se incluyen terpenos como el eugenol, safrol, timol,
1,8 cineol, - humuleno, - cadineno, amorfeno,- cariofileno, - elemeno,
germaeieno, -cimeno, - terpineno, cis- sabineno hidrato, - muroleno, mirceno, entre
otros, algunos de los cuales se encuentran en proporción considerable.

En 1988, Janssen y colaboradores evaluaron la actividad de 4 especies de Ocimum

(Ocimum canum, Ocimum trichodon, Ocimum gratissimum y Ocimum urticifolium)
frente al dermatofito T. mentagrophytes y encontraron que la mayor actividad
correspondía al aceite de Ocimum gratissimum L. el cual tenía como constituyente
mayoritario al timol presente en un 46,7 %6, similar a los resultados de esta
investigación.
Se encontró, en este trabajo, que la especie de Pimenta dioica L contiene como
componente mayoritario al eugenol al igual que Ocimum tenuiflorum L. Estos
resultados coincidieron con los publicados por Nabney y colaboradores11 para la
Pimenta dioica L. y Lawrence y colaboradores12 para Ocimum tenuiflorum L. En dos
de los aceites se identificaron más del 90 % de los componentes (Piper auritum H.B.K.,
97,24% y Ocimum tenuiflorum L., 93,92 %) mientras que en los dos restantes sólo
alrededor del 80 % (Ocimum gratissimum L., 83,06 % y Pimenta dioica L., 81,21 %).

Los resultados de la actividad del timol pusieron de manifiesto que solo, presenta una
actividad antifúngica mucho mayor que cuando aparece como componente del aceite de
Ocimum gratissimum L., lo que puede ser debido a la presencia de otros constituyentes
que antagonizan su actividad. En el caso del eugenol la CMI obtenida para la Pimenta
dioica L. hace suponer que el mismo es el responsable de dicha actividad. En 1998, Lis-
Balchin y colaboradores informaron una fuerte bioactividad de aceites esenciales contra
hongos filamentosos cuando el componente mayoritario en los mismos fue el eugenol y
mucho menos pronunciado cuando el geraniol, el citronelol y el linalol fueron los
componentes principales de los aceites.13 Al parecer en el aceite de Ocimum
tenuiflorum L. existen otros constituyentes que potencian la acción del mismo.

El daño causado por los aceites en la célula microbiana varió en dependencia de la

concentración añadida del agente. Se apreció como la correspondiente a ½ CMI
ocasionó en estos hongos una acción fungistática, pues aunque inicialmente ocurrió una
disminución del crecimiento microbiano, expresada a través de la disminución del peso
seco de los cultivos, posteriormente se produjo un aumento, detectado entre el 10 y 11
día en el T. mentagrophytes y a partir del 7mo.día en el M. canis.

Este comportamiento fue diferente para un mismo microorganismo en dependencia del

aceite, pues se observó que en Piper auritum H.B.K. la disminución y luego el aumento
del crecimiento fue mucho más marcado que en la Pimenta dioica L., lo que debe estar
relacionado con la composición química de los aceites, la cual difiere cualitativa y
cuantitativamente.

Cuando se adicionaron las concentraciones de los aceites correspondientes a los valores

de CMI y al doble de esta se observó la misma tendencia en el comportamiento, una
disminución inicial del peso seco, seguida por un aumento y ya a partir del día 12 en el
M. canis y del 13 en el T. mentagrophytes fue que ocurrió la disminución final del
crecimiento debido a la acción fungicida del aceite.

A concentraciones superiores a la CMI no se observó ningún incremento en el efecto

antimicrobiano, sino que se encontró un comportamiento similar al que se obtuvo
cuando se añadieron concentraciones del agente correspondientes con las mínimas
inhibitorias. Los resultados de estos estudios cinéticos se correspondieron con los
publicados en diferentes artículos.2,6,8,14.
Finalmente se puede concluir que los 4 aceites evaluados tuvieron actividad
antidermatofítica frente a los microorganismos utilizados pero fue el de P. dioica el más
activo de todos.

Referencias bibliográficas
 1. Vanden Berghe DA, Vlietinck AJ. Screening methods for antibacterial and
antiviral agents from higher plants. Methods Plant Biochem 1991;6:47-9.
2. Habtemariam S, Gray AI, Waterman PG. Flavonoids from three Ethiopian
species of Premna. Z Naturforsc 1992;47:144-8.
3. Gupta MP, Arjas TD, Williams NH, Bos R, Tattje DHE. Safrole, the main
component of the essential oil from Piper auritum Panamá. J Nat Prod 1985;48 :
330-6.
4. Garg SC, Jain R. Biological activity of the essential oil of Piper betle. J
Essential Oil Res 1992;4:601-7.
5. Baby P, Alankararao GSJG, Prassad YR. Leaf oil of Piper betle L. The in vitro
antimicrobial studies. Indian Perfumer 1993; 37:91-9.
6. Janssen AM, Scheffer JC, Ntezurubanza L, Baerheim AW. Antimicrobial
activity of some Ocimum species grown in Rwanda. Ethnopharmacology
1988;26:57-61.
7. Ntezurubanza L, Scheffer JJC, Baerheim Svendsen A. Composition of the
essential oil of Ocimum gratissimum grown in Rwanda. Planta Medica
1987;53:395-8.
8. Claeson P, Radstrom P, Skold O. Bactericidal effects of sesqiterpene T-cadinol
on S. aureus. Phytoterapy Res 1992;6:94-7.
9. Duy Cuong N, Thi Xuyen T, Mott O, Stronsky K, Presslova J, Jelicková Z, et al.
Antimicrobial properties of vietnamese Cajaput oil. J Essential Oil Res
1994;6:63-7.
10. Marotti M, Piccaglia R, Giovanelli E. Effects of variety and ontogenic stage on
the essential oil composition and biological activity of Fennel (Foeniculum
vulgare Mill). J Essential Oil Res 1994 6:57-61.
11. Nabney J, Robinson FV. Constituents of pimento berry oil (Pimenta dioica).
Flavour Ind 1972;3: 50-5.
12. Lawrence BM, Hogg JW, Terhuene SJ, Pechitakue N. Essential oils and their
constituents. IX. Oils of Ocimum tenuiflorum and Ocimum basilicum from
Thailand. Flavour Ind 1972; 3:47-52.
13. Lis-Balchin M, Deans SG, Eaglesham E. Relationship between bioactivity and
chemical composition of commercial essential oils. Flavour Frag J 1998;13:98-
104.
14. Himejina M, Kubo I. Fungicidal activity of poligodial in combination with
anethole and indole against Candida albicans. J Agric Food Chem
1993;41:1776-80.

Recibido: 26 de febrero del 2003. Aprobado: 31 de marzo del 2003.

Lic. Lizet Hernández Díaz. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos
(CIDEM)
Ave. 26 No. 1605 entre Boyeros y Puentes Grandes, Plaza, Ciudad de La Habana.

http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1028-47962003000200004