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AVALIAÇÃO IN VITRO DA CAPACIDADE CITOTÓXICA E DA ATIVIDADE

ANTIPROLIFERATIVA DO EXTRATOS VEGETAIS SOBRE CÉLULAS DO TUMOR DE


EHRLICH

Bolsista PIBC Jr: Patrícia Soares Mesquita

Orientadora: Prof. Dra. Rosy Iara M. de A. Ribeiro

Unidade administrativa: Campus Centro Oeste

Observação: Como esse trabalho é de bolsista de Iniciação científica Jr, é parte do relatório
apresentado pela bolsista FAPEMIG Thais Barbosa. As duas alunas redigiram o trabalho juntas.

RESUMO

As neoplasias malignas representam a segunda maior causa de mortes no mundo, assim


várias metodologias são utilizadas a fim de se desenvolver novos fármacos, entre elas a
cultura de células de tumor de Ehrlich, para testar a citotoxicidade de extratos vegetais e a
viabilidade celular, sendo essa empregada em nosso estudo, que ainda contou com a
obtenção do extrato bruto e suas frações a partir de testes fitoquímicos e análise
zimografica da inibição de metaloproteinases 2 e 9. O extrato bruto da Xylopia aromatica
mostrou efeito citotóxico satisfatório, já as frações 35 hidroalcólica, 24 e 25 acetato de
etíla não demonstraram potenciais citotóxicos relevantes, possivelmente por não
apresentarem compostos bioativos em quantidade suficiente que possa inibir o
crescimento tumoral.

INTRODUÇÃO

O câncer é definido como um conjunto de doenças onde o controle do ciclo celular


é perdido e assim as células passam a se proliferar descontroladamente e invadem os
tecidos adjacentes pela via linfática ou sanguínea (AMERICA CANCER SOCIETY, 2014).
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As neoplasias malignas representam a segunda maior causa de mortes no mundo,
ficando atrás somente das doenças cardíacas. O número de casos destas patologias vem
aumentando consideravelmente durantes os últimos anos (MARQUES, PIERIN, 2008).

O tumor de Erlich é uma neoplasia experimental transplantável e, se estabelece em


inúmeras linhagens de camundongos sob duas principais formas: ascítica quando
inoculado intraperitonealmente ou sólido quando inoculado no subcutâneo ou coxim
plantar. É um excelente modelo para estudo de componentes sobre a angiogênese e
crescimento de células tumorais (FREITAS et AL, 2006).

Por ser de fácil manejo o modelo experimental do tumor de Ehrlich é amplamente


utilizado no estudo de mecanismos de ação antitumoral (Oliveira et AL, 2010). Trata-se de
uma neoplasia oriunda de carcinoma mamário de camundongos fêmeas descrito em 1906
por Paul Ehrlich (AZEVEDO, 2007).

Dentro da família Annonaceae, o gênero Xylopia é o que abriga o maior número de


espécies. No Brasil há 32 espécies de Xylopia catalogadas, uma delas é a Xylopia
aromática que se apresenta como uma árvore de altura entre 2 a 8 metros de
reconhecimento fácil com seus ramos e folhas pendentes, sua ocorrência natural é
descrita nas regiões Norte, Nordeste, Centro-Oeste, Sul e Sudeste, seus frutos podem ser
coletados durante todo o ano. Em Minas Gerais a X. aromatica é popularmente conhecida
como pimenta-de-macaco, pindaíba-do-campo, pimenta-dosertão, imbiriba e pindaíba-de-
macaco ( OLIVEIRA,2012).

As plantas do gênero Xylopia representam uma relevante fonte de substâncias


boiativas segundo estudos de caracterização fitoquímica, que identificaram a presença de
alcalóides, esteróides, flavonóides, óleos essenciais, diterpenos e saponinas em seus
frutos (ELHASSAN et AL, 2010). Às acetogeninas e alcalóides das folhas e cascas de
espécies de Xylopia têm sido atribuídas capacidades citotóxicas e antitumorais in vitro
(SUFFREDINI et AL, 2007).

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A literatura é carente de estudos farmacológicos e biológicos para avaliar o
potencial terapêutico da X. aromatica ( OLIVEIRA, 2012). Sua abundância no cerrado
mineiro associada à potencial fonte de suas substâncias bioativas e à falta de estudos
sobre as mesmas, despertaram o interesse de avaliar a capacidade citotóxica e
antiproliferativa in vitro dos seus extratos sobre células do tumor de Ehrlich.

Figura 1 – Xylopia aromatica. Fonte: Arquivos LAPATEX

OBJETIVO

Avaliar a ação de extrato bruto e frações isoladas de X. aromatica sobre cultura de


células de tumor de Ehrlich.

MATERIAIS E MÉTODOS

1. Obtenção dos extratos e origem da planta e pré-seleção das frações.

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Amostras de X. aromatica foram coletados em uma região de cerrado, próxima ao
Município de Ituiutaba, (Latitude S 18º 58' 08" e Longitude W 49º 27' 54"), Minas Gerais
(Brasil) e exsicatas e enviadas para o Herbário da Universidade Federal de Minas Gerais
(UFMG) sob número 143397.

Esta planta foi submetida à processos de extração e foram produzidos extratos


brutos, posteriormente partidos, novamente testados em zimograma e então, foram
selecionados de acordo com sua ação antigelatinolítica (LONGATTI et al., 2011).

Após os testes de atividade acima mencionados, as partições do extrato


selecionadas foram submetidas à fracionamento em cromatografia por coluna, utilizando-
se solventes de diversas polaridades. A escolha destes solventes a serem eluídos se deu
a partir de investigação de polaridade por cromatografia em camada delgada (CCD),
iniciando pelo solvente de menor polaridade capaz de eluir algum composto da amostra.
Para isso, aproximadamente 15g de sílica gel para cromatografia em coluna (0,05-
0,20mm) foram adicionadas a uma bureta previamente tampada com uma porção de
algodão. A partição liofilizada foi adicionada à metanol até completa solubilização, sendo
esta solução em seguida misturada à 2cm de sílica da bureta. Após evaporação do
metanol, a sílica contendo a partição foi adicionada à coluna. Sob gotejamento constante,
as frações, coletadas em frascos de 50 mL, foram monitoradas por CCD e agrupadas de
acordo com os perfis fitoquímicos. Posteriormente, foram congeladas, liofilizadas e
utilizadas nos tratamentos.

2. Cultura de Células em Tumor de Ehrlich

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Utilizou-se o meio DMEM em pó contendo 100 mg/mL de estreptomicina, 100 U/mL
de penicilina G e 2mM de L-glutamina. Este meio foi diluído em 1L de água miliQ
autoclavada. O pH foi ajustado para 7.4, sendo adicionados 10% de soro fetal bovino
(SFB) antes da utilização do meio de cultura.

Camundongos com sete dias de evolução do tumor ascítico de Ehrlich foram


eutanasiados e foram retirados três mL de fluído ascítico para obtenção das células
neoplásicas. Esse fluido foi transferido para um tubo Falcon com mL de solução salina e o
conteúdo foi três vezes a 1500rpm por cinco minutos e lavado com soro fisiológico até a
obtenção de um líquido denso e claro, correspondente a uma suspensão celular com o
mínimo de fibrina e hemácias. O sobrenadante foi descartado e as células foram
ressuspensas no meio de cultura preparado.

Em seguida, após a determinação da concentração, as células do tumor de Ehrlich


foram semeadas em placa de cultivo estéril com 24 poços. Foram distribuídas 1x105
células por poço, sendo cada grupo composto por seis poços. Os tratamentos foram: A -
controle, B- 0.005mg/ml, C- 0.0007mg/ml e D-0.0003mg/ml de extrato bruto; os extratos
brutos foram diluídos em DMEN.

Os tratamentos foram mantidos em estufa de CO2 a 5%, a 37ºC durante todo o


experimento. A contagem de células do tumor de Ehrlich nos poços foi realizada a cada 2
horas após a aplicação do tratamento e uma contagem ao final das 24 horas. Todas as
contagens foram realizadas em triplicata.

O método para se verificar a viabilidade celular foi a exclusão por meio do azul de
trypan. Para isso, 10 µl da suspensão celular foram retiradas da placa, esta suspensão foi
diluída em 90 µl de solução salina e misturadas a 100 µl de solução de azul de trypan. A
solução resultante foi agitada por 5min, e procedeu-se a contagem das células viáveis em
câmara de Neubauer. Esta técnica é qualitativa e indica se a célula está viva ou não. As

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células vivas aparecem translúcidas e brilhantes na presença do azul de trypan, já nas
células mortas uma coloração roxa predomina como mostrada na figura 2.

Figura 2 – Células observadas durante o procedimento de contagem em câmara de Neubauer.


Células vivas (A, B) e célula morta corada em azul (seta). Aumento 400x. Fonte: Adaptado de
VIREQUE et al, 2013.

3. Cultura Celular e Viabilidade Celular em Tumor de Ehrlich

A viabilidade celular após tratamento com substâncias isoladas de espécies


vegetais em culturas de células de tumor de Ehrlich foi avaliada por análise colorimétrica
baseada na incubação por 2 horas de corante supravital do composto tetrazólio (MTS). O
MTS é solúvel no meio de cultura e este é modificado pelas células, sendo um composto
solúvel. A partir da coloração foram feitas analises por espectrofotometria do corante
incorporado (TADDEI et al., 2007).

Para essa análise, 2,5x105 células/poço foram semeadas em triplicata em placas


de 96 poços em meio de cultura RPMI e em seguida aplicados os tratamentos controle,
fração 24, 25 acetato de etíla e fração 35 hidroalcóolica nas concentrações de

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0,0006mg/ml e 0,00006mg/ml e incubadas em estufa de CO2 5%. Durante 24 horas foram
realizadas leituras de 6 em 6 horas para ver a viabilidade celular.

Figura 3 – Placas após 24 horas de leitura. Fonte: Arquivos LAPATEX.

As placas incubadas foram acrescidas de MTS a cada 4 horas e realizada a


leitura.. Após este período foi efetuada a leitura das placas em um leitor de placas
(espectrofotômetro) utilizando filtro de 490 ηm (Gen5 Data Analysis Software).

Visto que, através da leitura os dados foram obtidos em valores de absorbância, foi
realizado um cálculo do índice de viabilidade celular VC (%). Para tanto foi obtida a média
das absorbâncias (sextuplicatas) para cada tratamento e para o branco.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

1. Cultura de Células em Tumor de Ehrlich e Viabilidade Celular

No tratamento in vitro, todas as concentrações do extrato bruto vegetal foram


citotóxicas para as células do tumor de Erlich in vitro. Na avaliação da sobrevida das
células tumorais, observou-se que, com o decorrer do tempo a quantidade de células
neoplásicas foi decaindo. Os tratamentos propiciaram sobrevida menor que a do grupo
controle (figura 2). Pode-se observar que o grupo que recebeu tratamento na
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concentração 0,005mg/ml apresentou melhor resultado nas primeiras horas. Porém, após
a sétima hora, os resultados dos tratamentos 0,005mg/ml e 0,0007mg/ml se mostraram
iguais, ambas as concentrações apresentaram a mesma curva. Houve redução do
número de células de forma dose dependente.

Figura 4 - Sobrevida das células tratadas com extrato de X. aromatica durante 24 horas. A
contagem foi realizada utilizando-se o método de exclusão pelo azul de trypan.

O presente trabalho teve por finalidade avaliar o efeito citotóxico e antiproliferativo


de extratos vegetais em células de tumor de Ehrlich in vitro, a fim de contribuir para
futuras pesquisas cujo objetivo é descobrir tratamentos mais seletivos contra o câncer e,
consequentemente menos agressivos aos pacientes. Porque, para que uma droga seja
considerada seletiva, ela deve possuir pouco ou nenhum efeito citotóxico contra as
células (sadias do indivíduo ou fisiológicas), e efeito tóxico contra células tumorais
(CARLI, 2012).

Observamos que todas as concentrações do extrato apresentaram alguma


citotoxicidade sob a incubação de 24 horas, sendo que a de 0,005mg/mL se mostrou mais
eficaz durante o tratamento.

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2. Viabilidade Celular

As frações 24 e 25 D, e 35 A não demonstraram potenciais citotóxicos relevantes,


ao contrário as frações 25 D e 35 A, levaram a proliferação celular, pois as células
tratadas com ambas as concentrações das frações apresentaram a capacidade de reduzir
o MTS pouco alteradas, (KVIECINSKI, 2013), o que foi constatado pela leitura das placas
utilizando o comprimento de onda de 490 ηm (Gen5 Data Analysis Software).

Figura 5 - Viabilidade das células tratadas com fração 24D acetato de etila de X. aromatica
durante 24 horas.

Figura 6 - Viabilidade das células tratadas com fração 25D acetato de etila de X. aromatica
durante 24 horas.

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Figura 7 - Viabilidade das células tratadas com fração 35A hidroalcólica de X. aromatica durante
24 horas.

CONCLUSÃO

A cultura de células é um modelo útil para estudar o desenvolvimento de um


tumor, nela muitas variáveis podem ser analisadas separadamente, livres de
interferências do ambiente. Mas, devemos levar em consideração que o metabolismo de
uma célula em cultura pode funcionar de maneira diferente de uma célula no organismo,
que interage com um microambiente que não pode ser reproduzido in vitro (COSTA,
2012).

AGRADECIMENTOS

A Universidade Federal de São João Del- Rei pela oportunidade e a agência


financiadora FAPEMIG pelo financiamento do projeto e pela bolsa de estudos.

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