Modelos de farmacóforos y aplicaciones en el descubrimiento de fármacos: desafíos y avances recientes

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https://doi.org/10.1016/j.drudis.2010.03.013Obtener derechos y contenido

Los enfoques de farmacóforo se han convertido en una de las herramientas principales en el descubrimiento

de fármacos después del desarrollo del siglo pasado. Se han desarrollado varios métodos basados en

ligandos y basados en estructuras para mejorar el modelado de farmacóforos y se han aplicado de manera
exitosa y extensa en el cribado virtual, el diseño de novo y la optimización del plomo. A pesar de estos éxitos,

los enfoques de farmacóforo no han alcanzado su plena capacidad esperada, particularmente al enfrentar la

demanda de reducir el costoso costo global actual asociado con el descubrimiento y desarrollo de

fármacos. Aquí, se discuten los desafíos del modelado de farmacóforos y las aplicaciones en el

descubrimiento de fármacos, y se describen avances recientes y últimos desarrollos, que proporcionan pistas

útiles para un mayor desarrollo y aplicación de los enfoques de farmacóforo.

Introducción
El concepto de farmacóforo se introdujo por primera vez en 1909 por Ehrlich [1] , quien definió el farmacóforo
como "un marco molecular que lleva ( phoros ) las características esenciales responsables de la actividad
biológica de un fármaco ( farmacon )". Después de un siglo de desarrollo, el concepto básico de farmacóforo
permanece sin cambios, pero su significado intencional y rango de aplicación se han ampliado
considerablemente. De acuerdo con la definición muy reciente de IUPAC [2], un modelo de farmacóforo es "un
conjunto de características estéricas y electrónicas que es necesario para asegurar las interacciones
supramoleculares óptimas con un objetivo biológico específico y para activar (o bloquear) su respuesta
biológica". Además de esta definición oficial, algunas otras definiciones similares, así como comentarios, se
han descrito en la literatura 3 , 4 , 5 . El desarrollo general y la historia del concepto de farmacóforo durante el
siglo pasado han sido revisados por Günd [3] y Wermuth [4] .
Un modelo de farmacóforo se puede establecer de forma ligada, superponiendo un conjunto de moléculas
activas y extrayendo características químicas comunes que son esenciales para su bioactividad, o de una
manera estructural, probando posibles puntos de interacción entre el objetivo macromolecular y ligandos. Los
enfoques de farmacóforos se han utilizado ampliamente en el cribado virtual, el diseño de novo y otras
aplicaciones, como la optimización del plomo y el diseño de medicamentos de múltiples objetivos ( figura
1 ). Una variedad de herramientas automatizadas para el modelado de
farmacóforos y aplicaciones apareció constantemente después de los
avances en química computacional en los últimos 20 años; estas
herramientas de modelado de farmacóforos, junto con su (s) inventor (es)
y características típicas, se resumen enTabla Suplementaria S1 . Muchas
historias exitosas de enfoques de farmacóforos para facilitar el
descubrimiento de fármacos se han reportado en los últimos
años 6 , 7 . El enfoque farmacóforo, sin embargo, todavía enfrenta
muchos desafíos que limitan su capacidad para alcanzar su potencial
esperado, particularmente con la demanda de reducir el alto costo actual
asociado con el descubrimiento y desarrollo de un nuevo
medicamento. Este artículo analiza los desafíos del modelado de
farmacóforos y las aplicaciones en el descubrimiento de fármacos y
revisa los avances más recientes en el tratamiento de estos desafíos.

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Figura 1 . El marco completo de la arquitectura de farmacóforo.
Modelado farmacológico basado en ligandos
El modelado farmacológico basado en ligandos se ha convertido en una estrategia computacional clave para
facilitar el descubrimiento de fármacos en ausencia de una estructura objetivo macromolecular. Generalmente
se lleva a cabo mediante la extracción de características químicas comunes de estructuras tridimensionales
de un conjunto de ligandos conocidos representativos de las interacciones esenciales entre los ligandos y un
objetivo macromolecular específico. En general, la generación de farmacóforos a partir de ligandos múltiples
(generalmente llamados compuestos de conjuntos de entrenamiento) implica dos pasos principales: crear el
espacio conformacional para cada ligando en el conjunto de entrenamiento para representar la flexibilidad
conformacional de los ligandos y alinear los ligandos múltiples en el conjunto de entrenamiento y determinar la
características químicas comunes esenciales para construir modelos de farmacóforos. El manejo de la
flexibilidad conformacional de los ligandos y el alineamiento molecular representan las técnicas clave y
también las principales dificultades en el modelado de farmacóforos basados en ligandos. Actualmente, se
han desarrollado varios generadores de farmacóforos automatizados, incluido el software disponible
comercialmente, como HipHop.[8] , HypoGen [9] (Accelrys Inc., http://www.accelrys.com ), DISCO [10] ,
GASP [11] , GALAHAD (Tripos Inc., http://www.tripos.com ) , FASE [12] (Schrödinger
Inc., http://www.schrodinger.com ) y MOE (Chemical Computing Group, http://www.chemcomp.com ) - y varios
programas académicos. Estos programas difieren principalmente en los algoritmos utilizados para manejar la
flexibilidad de los ligandos y para la alineación de las moléculas, que se describen en la Tabla S1
complementaria . Hay algunas referencias en la literatura, como Refs. 5 , 13 , 14, mostrando las diferencias,
ventajas y desventajas de estos programas; sin embargo, describir y analizar los diferentes programas no es
nuestro objetivo aquí.
A pesar de los grandes avances, todavía existen varios desafíos clave en el modelado de farmacóforos
basados en ligandos. El primer problema desafiante es el modelado de la flexibilidad del ligando. Actualmente,
se han utilizado dos estrategias para tratar este problema: la primera es el método de enumeración previa, en
el que se precalculan y se guardan en una base de datos múltiples conformaciones para cada
molécula [13] . El segundo es el método sobre la marcha, en el que el análisis de conformación se lleva a
cabo en el proceso de modelado de farmacóforos [13]. El primer enfoque tiene la ventaja de un menor costo
de cálculo para realizar la alineación molecular a expensas de una posible necesidad de una capacidad de
almacenamiento masivo. El segundo enfoque no necesita almacenamiento masivo, pero podría requerir un
mayor tiempo de CPU para realizar una optimización rigurosa. Se ha demostrado que el método de
enumeración previa supera el enfoque de cálculo sobre la marcha [15] . Actualmente, se ha establecido una
cantidad sustancial de algoritmos avanzados para muestrear los espacios conformacionales de moléculas
pequeñas, que se enumeran en la Tabla S2 complementaria . Algunos de estos algoritmos, como las
restricciones de poling [16] , las redes de torsión sistemáticas [17] , el tweak dirigido [18] , los algoritmos
genéticos [19]y Monte Carlo [20] , se han implementado en varios programas de modelado de farmacóforos
comerciales y académicos. Sin embargo, un buen generador de conformación debe cumplir las siguientes
condiciones: (i) generar de manera eficiente todas las supuestas conformaciones unidas que adoptan las
moléculas pequeñas cuando interactúan con macromoléculas, (ii) mantener la lista de conformaciones de baja
energía lo más corta posible para evitar el problema de explosión combinacional y (iii) menos tiempo para los
cálculos conformacionales. Varias herramientas nuevas o modificadas desarrolladas recientemente para la
generación conformacional parecen superar los algoritmos previos en algunos aspectos. MED-3DMC,
desarrollado por Sperandio et al. [21], utiliza una combinación del algoritmo de Metropolis Monte Carlo,
basado en un mapeo SMARTS del enlace rotacional, y el término de energía de MMFF94 van der Waals. Se
ha informado que MED-3DMC supera a Omega cuando se aplica a ciertas moléculas con un número bajo o
medio de enlaces giratorios [21] . Liu et al. [22]desarrolló un método de muestreo de conformación llamado
'Cyndi', que se basa en un algoritmo de evolución multiobjetivo. Cyndi fue validado para ser notablemente
superior a otros generadores de conformación en la reproducción de las conformaciones bioactivas contra un
conjunto de 329 estructuras de prueba [22] . CAESAR [23]es otro generador de conformador, que se basa en
un enfoque de acumulación de conformer recursivo y divide y vencerás. Este enfoque también tiene en cuenta
la simetría rotacional local para permitir la eliminación de duplicados confórmeros debido a la simetría
topológica en la búsqueda sistemática. Se ha demostrado que CAESAR es consistentemente 5-20 veces más
rápido que Catalyst / FAST. 1 La aceleración es aún más notable para moléculas con alta simetría topológica o
para moléculas que requieren una gran cantidad de muestreos conformacionales.
La alineación molecular es el segundo problema desafiante en el modelado farmacológico basado en
ligandos. Los métodos de alineación se pueden clasificar en dos categorías en términos de su naturaleza
fundamental: enfoques basados en puntos y basados en propiedades [15] . Los puntos (en el método basado
en puntos) se pueden diferenciar más como átomos, fragmentos o características químicas [5]. En los
algoritmos basados en puntos, pares de átomos, fragmentos o puntos de características químicas se
superponen usualmente usando un ajuste de mínimos cuadrados. La mayor limitación de estos enfoques es la
necesidad de puntos de anclaje predefinidos porque la generación de estos puntos puede volverse
problemática en el caso de ligandos diferentes. Los algoritmos basados en propiedades hacen uso de
descriptores de campo moleculares, usualmente representados por conjuntos de funciones gaussianas, para
generar alineamientos. La optimización de alineación se lleva a cabo con alguna variante de medida de
similitud de la superposición intermolecular de los gaussianos como la función objetivo. Los algoritmos de
alineación molecular convencionales se han revisado ampliamente en otros lugares [15]. Los nuevos métodos
de alineación continúan desarrollándose activamente. Los métodos recientemente desarrollados incluyen la
inclusión estocástica de proximidad [24] , los campos de propiedad atómica [25] , el reconocimiento de
patrones difusos [26] y las energías de interacción basadas en la cuadrícula [27] .
Otro problema desafiante radica en la tarea práctica de la selección adecuada de compuestos del conjunto de
entrenamiento. Este problema, aparentemente simple y no técnico, a menudo confunde a los usuarios, incluso
a los experimentados. Se ha demostrado que el tipo de moléculas de ligando, el tamaño del conjunto de datos
y su diversidad química afectan considerablemente el modelo de farmacóforo final generado [13]. En algunos
casos, modelos de farmacóforos completamente diferentes de ligandos que interactúan con el mismo objetivo
macromolecular podrían generarse a partir del mismo algoritmo y programa que utiliza diferentes conjuntos de
entrenamiento. Por ejemplo, Hecker et al. [28] , Toba et al. [29] y Vadivelan et al. [30]han generado
independientemente tres modelos de farmacóforos de inhibidores de la cinasa 2 dependientes de ciclina
(CDK2). Usaron el mismo programa, Catalyst, pero diferentes conjuntos de entrenamiento. Los tres modelos
de farmacóforos son totalmente diferentes entre sí en términos de categorías de características, así como de
las limitaciones de ubicación de las características ( figura 2 a ), para lo cual se presenta una discusión
adicional en una sección posterior de esta revisión.

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Figura 2 . Modelos de farmacóforo de inhibidores de la cinasa 2 dependientes de ciclina (CDK2). (a)Modelos
de farmacóforos de inhibidores de CDK2 desarrollados usando Catalyst por Hecker et al. [28] , Toba et
al. [29] y Vadivelan et al. [30] . (b) El proceso básico para la generación de un mapa de farmacóforos completo
basado en multicomplejos de inhibidores de CDK2. Las características químicas están codificadas por colores:
verde, aceptador de enlaces de hidrógeno; magenta, donador de enlaces de hidrógeno; luz azul, característica
hidrofóbica; naranja, anillo aromático.

Modelado farmacológico basado en estructuras

El modelado farmacológico basado en estructuras trabaja directamente con la estructura 3D de un objetivo
macromolecular o un complejo macromolécula-ligando. El protocolo de modelización de farmacóforos basada
en la estructura implica un análisis de las características químicas complementarias del sitio activo y sus
relaciones espaciales, y un posterior montaje del modelo de farmacóforo con características
seleccionadas. Los métodos de modelado de farmacóforos basados en la estructura se pueden clasificar en
dos subcategorías: basada en macromolécula-ligando-complejo y macromolécula (sin ligando). El enfoque
basado en complejo macromolécula-ligando es conveniente para localizar el sitio de unión al ligando del
objetivo macromolecular y determinar los puntos de interacción clave entre los ligandos y la
macromolécula. LigandScout [31]es una excelente representación que incorpora el esquema basado en
macromolécula-ligando-complejo. Otros programas de modelado de farmacóforos basados en
macromoléculas y complejos de ligandos incluyen Pocket v.2 [32] y GBPM [33] . La limitación de este enfoque
es la necesidad de la estructura tridimensional del complejo macromolécula-ligando, lo que implica que no se
puede aplicar a casos en los que no se conocen compuestos dirigidos al sitio de unión de interés. Esto se
puede superar mediante el enfoque basado en macromoléculas. El método 2 de farmacóforo basado en la
estructura (SBP) implementado en Discovery Studio 3 es un ejemplo típico de un enfoque basado en
macromoléculas. SBP convierte LUDI [34]mapas de interacción dentro del sitio de unión a proteínas en las
características farmacofónicas de catalizador: aceptor de enlaces H, donante de enlaces H e hidrofóbico. La
principal limitación del diagrama de flujo SBP es que los mapas de interacción derivados generalmente
consisten en un gran número de características Catalyst no priorizadas, lo que complica su aplicación en
tareas tales como búsquedas en bases de datos 3D. Para superar este problema, Barillari et al. [35] propuso
recientemente un enfoque rápido basado en el conocimiento, farmacóforos basados en receptores guiados
por puntos calientes (HS-Pharm). Este enfoque permite la priorización de los átomos de la cavidad que deben
dirigirse a la unión del ligando, mediante el entrenamiento de algoritmos de aprendizaje de la máquina con
huellas dactilares basadas en átomos de bolsillos de unión al ligando conocidos. Tintori et al. [36]también
informaron otro enfoque basado en la apoproteína. Con este enfoque, los campos de interacción
molecular GRID [37] (MIF) se calculan primero mediante el uso de diferentes sondas para el sitio de unión de
interés, seguido de la selección y conversión posterior de los puntos de mínimo de MIF en características
farmacofóricas.
Un problema frecuente para el modelado farmacológico basado en estructuras, no solo el enfoque basado en
macromoléculas, es que pueden identificarse muchas características químicas (generalmente no priorizadas)
para un sitio de unión específico del objetivo macromolecular. Sin embargo, un modelo de farmacóforo
compuesto de demasiadas características químicas (por ejemplo,> 7 características químicas) no es
adecuado para aplicaciones prácticas, como el análisis de bases de datos 3D. Por lo tanto, es necesario
seleccionar un número limitado de características químicas (típicamente de tres a siete características) para
construir una hipótesis de farmacóforo práctica, aunque esta no es una tarea fácil en muchos casos. Otro
problema es que la hipótesis de farmacóforo obtenida no puede reflejar la relación estructura-actividad
cuantitativa (QSAR) porque el modelo se deriva solo en base a un complejo macromolécula-ligando único o a
una sola macromolécula. En un intento de superar estos problemas, en un estudio reciente, hemos sugerido
utilizar un mapa integral multicomplejo y el modelo de farmacóforo más frecuente.[38] . En ese estudio, se
utilizó un método multicomplejo para generar un mapa de farmacóforo integral de CDK2 basado en una
colección de 124 estructuras cristalinas del complejo inhibidor de CDK2 humano. Las características químicas
de cada complejo primero fueron identificadas por LigandScout, seguidas de la agrupación de todas las
características para formar un mapa de farmacóforo completo. El mapa de farmacóforo establecido contiene
casi todas las características químicas importantes para las interacciones inhibidoras de CDK2 ( figura
2 b). Encontramos que, con la excepción de una característica del anillo aromático (naranja) en el modelo de
Hecker, cada característica de farmacóforo en los modelos basados en ligandos informados (modelo de
Hecker, modelo Toba y modelo Vadivelan; Fig. 2a) puede coincidir con una característica de nuestro mapa
integral, lo que sugiere que estos modelos basados en ligandos son subgrafos de nuestro mapa completo. La
única excepción (la característica de anillo aromático en el modelo de Hecker) parece ocurrir en los andamios
de ligando. Una característica química ocurrida en los andamios moleculares pequeños, que debería ser una
característica de pseudo-farmacóforo porque no representa una interacción ligando-macromolécula, no puede
detectarse mediante un enfoque de modelado farmacológico basado en la estructura. Debido a que el mapa
completo de farmacóforos es demasiado restrictivo y no es adecuado para el cribado virtual, se necesita un
modelo reducido para una aplicación real. Una solución factible es seleccionar las características más
frecuentes que se reconocieron como las características importantes para la actividad de los inhibidores de
CDK2. Por lo tanto, las siete características mejor clasificadas, que están presentes en los 124 complejos con
más del 25% de probabilidad, han sido seleccionados y combinados para formar un modelo de farmacóforo
con la característica más frecuente. Los estudios de validación del modelo de características más frecuentes
han demostrado no solo que puede discriminar con éxito entre los inhibidores de CDK2 conocidos y las
moléculas de los conjuntos de datos inactivos, sino también que es capaz de predecir correctamente las
actividades de una amplia variedad de inhibidores de CDK2 en un conjunto de datos activos externos[38] .

Prueba virtual basada en el modelo de farmacóforo

Una vez que se genera un modelo de farmacóforo ya sea mediante el enfoque basado en ligando o basado en
la estructura, se puede utilizar para consultar la base de datos químicos 3D para buscar ligandos potenciales,
lo que se denomina "detección virtual basada en farmacóforos" (VS) . Los VS basados en farmacóforos y los
VS basados en anclaje representan la corriente principal de las herramientas VS en este momento. A
diferencia de su homólogo, el método VS basado en acoplamiento, VS farmacóforos reduce los problemas
derivados de una consideración inadecuada de la flexibilidad proteica o el uso de funciones de puntuación
optimizadas o insuficientemente diseñadas introduciendo un radio de tolerancia para cada característica
farmacofónica.
En el enfoque de VS basados en farmacóforos, se toma como plantilla una hipótesis de farmacóforo. El
objetivo del cribado es encontrar moléculas (visitas) que tengan características químicas similares a las de la
plantilla. Algunos de estos éxitos pueden ser similares a los compuestos activos conocidos, pero algunos otros
pueden ser completamente nuevos en el andamio. La búsqueda de compuestos con diferentes andamios,
mientras se comparte una actividad biológica, generalmente se llama 'andamio' [39].. El proceso de selección
implica dos técnicas y dificultades clave: el manejo de la flexibilidad conformacional de moléculas pequeñas y
la identificación del patrón farmacóforo. Las estrategias para manejar la flexibilidad de moléculas pequeñas en
VS basadas en farmacóforos son muy similares a las que se usan en el modelado de farmacóforos. De nuevo,
la flexibilidad de las moléculas pequeñas se maneja ya sea enumerando previamente las conformaciones
múltiples para cada molécula en la base de datos o el muestreo conformacional en el momento de la
búsqueda. La identificación de patrón de farmacóforo, generalmente llamada "búsqueda de subestructura", es
en realidad para verificar si una consulta de farmacóforo está presente en un confórmero dado de una
molécula. Los enfoques utilizados frecuentemente para la búsqueda de subestructuras se basan en la teoría
de grafos, que incluye Ullmann [40] , el algoritmo de retroceso[41] , y el algoritmo GMA [42] .
El VS basado en farmacóforo puede consumir mucho tiempo, especialmente en los casos de cribado de
grandes bases de datos químicas con moléculas flexibles, que actualmente es un desafío clave en VS
basados en farmacóforos. Un método comúnmente utilizado para acelerar el proceso de selección es el
enfoque de búsqueda multinivel [5] . En este enfoque, se aplican una serie de filtros de selección a las
moléculas en un orden creciente de complejidad para que los primeros filtros sean rápidos y simples, mientras
que los sucesivos consumen más tiempo, pero se aplican solo a un pequeño subconjunto de la base de datos
completa. .
Sin embargo, el problema más desafiante para los VS basados en farmacóforos es que, en muchos casos,
pocos porcentajes de aciertos virtuales son realmente bioactivos; en otras palabras, los resultados del cribado
conllevan una tasa de "falsos positivos" más alta y / o una tasa de "falsos negativos" más alta. Muchos
factores pueden contribuir a este problema, incluida la calidad y la composición del modelo de farmacóforo y si
está involucrada la información objetivo macromolecular y en qué medida. Primero, el factor más aparente
está asociado con la deficiencia de una hipótesis de farmacóforo. Para abordar este problema, se requiere
una validación y optimización exhaustiva del modelo de farmacóforo. Se han sugerido varios métodos de
validación, como la validación cruzada y el método del conjunto de pruebas, que fueron revisados
recientemente por Triballeau et al. [43]. El proceso de validación generalmente está asociado con la
optimización del modelo. Últimamente, Sun et al. [44] han desarrollado un programa de optimización de
consultas de farmacóforos guiados por algoritmos genéticos, en el que la optimización se lleva a cabo
ajustando automáticamente la posición y el radio de tolerancia de cada característica farmacofónica. La
consulta final ha sido validada mediante el uso de un método de conjunto de pruebas, que muestra una tasa
de aciertos considerablemente mejorada. En segundo lugar, dado que el modelo de farmacóforo utilizado para
la consulta 3D es generalmente uno de los subgrafos del mapa de farmacóforo completo, el cribado con esta
consulta de farmacóforo podría no recuperar moléculas que coincidan con otros subgrafos excepto el
seleccionado, que es probablemente una razón importante para el mayor Tasa de falsos negativos en algunos
estudios ( Fig. 3) En tercer lugar, la flexibilidad de la macromolécula objetivo en los enfoques de farmacóforo
se maneja mediante la introducción de un radio de tolerancia para cada característica farmacofórica, que es
poco probable que responda por completo a la flexibilidad macromolecular en algunos casos. Algunos intentos
recientes 45 , 46 de incorporar simulaciones de dinámica molecular en el modelado de farmacóforos han
sugerido que los modelos de farmacóforos de dinámica generados a partir de trayectorias de simulación MD
muestran una representación considerablemente mejor de la flexibilidad del farmacóforo.

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Figura 3 .Representación esquemática de la relación entre el mapa de farmacóforo completo identificado por
el enfoque basado en la estructura y los modelos de farmacóforo establecidos por el método basado en
ligandos. La parte superior muestra esquemáticamente las características químicas en el sitio de unión al
ligando de un objetivo macromolecular. El medio indica los diversos modelos de farmacóforos establecidos
mediante un método de modelado farmacológico basado en ligandos. El inferior representa
esquemáticamente varios casos posibles en el cribado virtual basado en farmacóforos. Una marca (√) significa
que la molécula seleccionada se ajusta a los requisitos de farmacóforo y la forma del sitio de unión al
ligando. Una cruz (×) indica que la molécula seleccionada no satisface los requisitos de cualquiera de los
farmacóforos o la forma del sitio de unión del ligando (debido a los golpes atómicos).
Otro factor que podría conducir a la alta tasa de falsos positivos es que la restricción estérica por el objetivo
macromolecular no se considera suficientemente en los modelos de farmacóforo, aunque se cuenta
parcialmente por la consideración de los volúmenes excluidos. Además, la mayoría de las interacciones entre
el ligando y la proteína son sensibles a la distancia, particularmente las interacciones de corto alcance, como
la interacción electrostática, para la cual es difícil explicar un modelo de farmacóforo. Un enfoque eficiente es
la combinación sinérgica de VS basados en farmacóforos y VS basados en anclaje. Debido a que las
limitaciones inherentes de cada una de estas técnicas de detección no se resuelven fácilmente, su
combinación en un protocolo híbrido puede ayudar a compensar mutuamente estas limitaciones y capitalizar
sus fortalezas mutuas.et al. [47] , Kirchmair et al. [48] y Muegge [49] . Este enfoque también se ha utilizado de
forma rutinaria en nuestro grupo, con el que hemos obtenido con éxito varios éxitos reales validados
experimentalmente para la inhibición frente a las proteínas quinasas Aurora-A [50], Syk [51] y ALK5 [52] .

Diseño de novo basado en farmacóforos

Además del VS basado en farmacóforo descrito anteriormente, otra aplicación de farmacóforo es el diseño de
novo de ligandos. Los compuestos obtenidos a partir de VS basados en farmacóforos generalmente son
productos químicos existentes, que pueden estar protegidos por patente. A diferencia de los VS basados en
farmacóforos, el enfoque de diseño de novo puede usarse para crear estructuras candidatas completamente
nuevas que se ajusten a los requisitos de un farmacóforo dado. El primer programa de diseño de novo basado
en farmacóforos es NEWLEAD [53], que utiliza como entrada un conjunto de fragmentos moleculares
desconectados que son consistentes con un modelo de farmacóforo, y los conjuntos seleccionados de
fragmentos de farmacóforos desconectados se conectan posteriormente usando enlazadores (tales como
átomos, cadenas o restos de anillo). En realidad, NEWLEAD solo puede manejar los casos en los que las
características del farmacóforo son grupos funcionales concretos (no características químicas
abstractas). Otras deficiencias del programa NEWLEAD incluyen que la región estéricamente prohibida del
sitio de unión no se considera y que, como en los programas de diseño tradicionales de novo , los compuestos
creados por el programa NEWLEAD podrían ser difíciles de sintetizar químicamente. Otros programas como
LUDI 4 y BUILDER [54]también se puede usar para combinar la identificación del farmacóforo basado en la
estructura con el diseño de novo . Sin embargo, necesitan el conocimiento de las estructuras 3D de los
objetivos macromoleculares.
Para superar los inconvenientes de la corriente basado en farmacóforo de novo software de diseño, hemos
desarrollado un nuevo programa, PHDD (basada en un farmacóforo de novométodo de diseño de moléculas
similares a las drogas) [55]. El PhDD puede generar automáticamente moléculas similares a las drogas que
satisfacen los requisitos de una hipótesis de farmacóforo de entrada. El farmacóforo utilizado en PhDD puede
estar compuesto por un conjunto de características químicas abstractas y volúmenes excluidos que son la
región estéricamente prohibida del sitio de unión. PhDD primero genera un conjunto de moléculas nuevas que
se ajustan por completo a los requisitos del modelo de farmacóforo dado. Luego se lleva a cabo una serie de
evaluaciones de las moléculas generadas, que incluyen evaluaciones de la semejanza de los medicamentos,
la bioactividad y la accesibilidad sintética. El PhDD se probó en tres ejemplos típicos: hipótesis de
farmacóforos de histona deacetilasa, CDK2 e inhibidores de la integrasa del VIH-1. Los resultados de la
prueba mostraron que el PhDD fue capaz de generar moléculas con andamios completamente nuevos.

Observaciones finales
Los enfoques de Pharmacophore han evolucionado para ser uno de los conceptos más exitosos en química
médica a través de los esfuerzos colectivos de muchos investigadores en el siglo pasado. En particular, el
progreso considerable de la tecnología de farmacóforos en las últimas dos décadas ha hecho que los
enfoques de farmacóforo sean una de las herramientas principales en el descubrimiento de fármacos. A pesar
de los avances en las técnicas clave de modelado de farmacóforos, todavía hay margen de mejora para
derivar modelos de farmacóforos más precisos y óptimos, que incluyen un mejor manejo de la flexibilidad del
ligando, algoritmos de alineación molecular más eficientes y una optimización del modelo más precisa. Una
menor eficiencia (costo de tiempo computacional) y un efecto pobre (menor tasa de aciertos) de los VS
basados en farmacóforos obstruye seriamente las aplicaciones de farmacóforo en el descubrimiento de
fármacos. El primero, sin embargo, se reducirá y disminuirá aún más por la creciente capacidad y la reducción
del costo del hardware de la computadora. La combinación "sinérgica" del método del farmacóforo y otros
métodos de modelado molecular, como el acoplamiento, es una buena estrategia para mejorar aún más el
efecto. En comparación con los VS basados en farmacóforos, basados en farmacóforosEl diseño de
novo muestra una ventaja única en la construcción de compuestos de impacto completamente
nuevos. Además del cribado virtual y el diseño de novo , las aplicaciones de farmacóforos también se han
extendido a la optimización del plomo [56] , el diseño de fármacos multiorrestato [57] , el perfil de
actividad [58] y la identificación del objetivo [59] . Los crecientes rangos de aplicación de farmacóforo, junto
con las historias de éxito en el descubrimiento de fármacos, permiten un mayor enriquecimiento del concepto
de farmacóforo y promueven el desarrollo y la aplicación de enfoques de farmacóforo.
N- (2-hidroxifenil) -2-propilpentanamida, un derivado de ácido valproico arilo diseñado en
silico con actividad antiproliferativa mejorada en HeLa, rabdomiosarcoma y células de cáncer
de mama

Las alteraciones epigenéticas están asociadas con el cáncer y su orientación es un enfoque prometedor para
el tratamiento de esta enfermedad. Entre los fármacos epigenéticos actuales, los inhibidores de la histona
deacetilasa (HDAC) inducen cambios en la expresión génica que pueden conducir a la muerte celular en
tumores. El ácido valproico (VPA) es un inhibidor de HDAC que tiene actividad antitumoral en el rango de
mM. Sin embargo, se sabe que el VPA es un medicamento hepatotóxico. Por lo tanto, el objetivo de este
estudio fue diseñar un conjunto de derivados de VPA añadiendo el núcleo de arilamina del ácido
suberoilanilida hidroxámico (SAHA) con diferentes sustituyentes en su grupo carboxilo. Estos derivados se
enviaron a simulaciones de acoplamiento para seleccionar el compuesto más prometedor. El
compuesto 2 ( N- (2-hidroxifenil) -2-propilpentanamida) fue el mejor candidato para ser sintetizado y
evaluado in vitro como un agente anti-cáncer contra HeLa, rabdomiosarcoma y líneas celulares de cáncer de
mama. Compuesto 2mostró un mejor IC 50 (rango M) de VPA (rango mM) en estas células de cáncer. Y
también, 2 fue particularmente efectivo en células de cáncer de mama triple negativas. En conclusión, 2 es
un ejemplo de fármacos diseñados en silico que muestran propiedades biológicas contra el cáncer humano
difíciles de tratar como cáncer de mama triple negativo.

Palabras clave: acoplamiento flexible , inhibidores de la histona deacetilasa , modelado molecular , ácido
valproico , estructura de rayos X.

Introducción

Se cree que en la génesis del cáncer hay una pérdida de capacidad para controlar la proliferación celular,
que es secundaria a material genético alterado o una interrupción de los procesos
epigenéticos 1Lopez J , Percharde M , Coley HM , y col. El contexto y el potencial de la epigenética en
oncología. Br J Cancer 2009 ; 100: 571 - 7[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google Scholar] . El
cáncer es una causa importante de mortalidad, en 2012 hubo aproximadamente 14 millones de nuevos
casos y 8 millones de muertes relacionadas con el cáncer, que afectaron a las poblaciones de todos los
países y todas las regiones. Estas estimaciones corresponden a tasas de incidencia y mortalidad
estandarizadas por edad de 182 y 102 por 100 000, respectivamente 2Stewart BW , Wild CP. World Cancer
Report 2014. Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer. Ginebra : WHO [Google Scholar] ,
siendo 3% niños3Birch JM , Marsden HB , Morris Jones PH , y col. Mejoras en la supervivencia del cáncer
infantil: resultados de una encuesta poblacional de más de 30 años. Br Med J (Clin Res Ed) 1988 ;
296: 1372 - 6[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google Scholar] . Cada año, más de 160 000 niños
menores de 20 años son diagnosticados con cáncer en los países desarrollados, de los cuales 60%
mueren 4Boschmonar MG , Alvarez YG , García AM , et al. La supervivencia del cáncer infantil en Cuba. Eur J
Epidemiol 2000 ; 16: 763 - 7[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google Scholar] . La leucemia
pediátrica representa el 30% del cáncer pediátrico en el que la leucemia linfoblástica aguda (LLA) ha tenido
mejorías en el tratamiento, lo que da como resultado una tasa de supervivencia (90% en los últimos
estudios) contraria a la leucemia mieloide y otras ALL 5Madhusoodhan PP , Carrol WL , Bhatla T. Progreso y
perspectivas en la leucemia pediátrica. Curr Probl Pediatr Adolesc Health Care 2016 ; 16: 30015 - 23 [Google
Scholar] . Debido a la gran cantidad de pacientes pediátricos que mueren como consecuencia de la
enfermedad del cáncer y debido a que existen varios factores desconocidos asociados a estas
enfermedades, la regulación pediátrica europea ha invitado a desarrollar medicamentos enfocados a la
población pediátrica junto con programas de investigación para adultos. Sin embargo, existen varios factores
genéticos y epigenéticos que podrían representar un proyecto genómico importante para encontrar un
posible tratamiento o tratamiento en este tipo de pacientes6Pearson AD , Herold R , Rousseau R , y
col. Implementación del mecanismo de acción impulsado por la biología del desarrollo temprano de
medicamentos para niños con cáncer. Eur J Cancer 2016 ; 62: 124 - 31[Crossref] , [PubMed] , [Web of
Science ®] , [Google Scholar] .

Las histonas son proteínas octaméricas formadas por dímeros de las subunidades 2A, 2B, 3 y 4. En las
histonas, el material de ADN está unido y, por lo tanto, las interacciones entre las histonas facilitan o limitan
el acceso a los genes promotores en el ADN, que inducen o inhiben la transcripción de
genes 7Gunjan A , Paik J , Verreault A. Regulación de síntesis de histonas y ensamblaje de
nucleosomas. Biochimie 2005; 87: 625 - 35[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google Scholar] . Los
mecanismos incluyen cambios conformacionales, ya sea de ADN o histonas debido a sus modificaciones
postraduccionales, tales como acetilación de histonas, metilación, fosforilación, ubiquitinación, etc., lo que
permite que el ADN pueda ser alcanzado por factores de transcripción.

La acetilación y desacetilación de los residuos de Lys N-terminal de histona son los principales reguladores
de las interacciones entre las histonas, así como entre las histonas y el ADN. Estos cambios químicos se
logran mediante enzimas llamadas histonas acetiltransferasas (HAT) e histonas desacetilasas
(HDAC) 8Biel M , Wascholowski V , Giannis A . Epigenética: epicentro de la regulación génica: histonas y
enzimas modificadoras de histonas . Angew Chem Int Ed Engl 2005 ;
44: 3186 - 216[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google Scholar] . Los HAT y HDAC son capaces de
controlar genes activándolos o silenciandolos en procesos dinámicos 9Jones PL , Veentra GJ , Wade PA. El
ADN metilado y MeCP2 reclutan histona desacetilasa para reprimir la transcripción. Nat Genet 2010 ;
19: 187 - 97[Crossref] , [Web of Science ®] , [Google Scholar]. Los HDAC constituyen una familia de enzimas
dependientes de zinc involucradas en los procesos anteriores que se dividen en cuatro grupos principales. El
Grupo I está compuesto por las isoformas 1, 2, 3 y 8, el segundo conjunto incluye las isoformas 4, 5, 6, 7, 9 y
10 que se distribuyen dentro del citoplasma o del núcleo; el tercer grupo (o sirtuinas) se caracteriza por usar
NAD como cofactor en lugar de zinc; finalmente, el grupo 4 contiene la isoforma 11, que comparte
homología con el grupo 2. El sitio catalítico del grupo 1 está altamente conservado, contiene principalmente
aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr y Trp), un aminoácido ácido (Asp) y un zinc ion (Zn  +  2)); la misma
composición se encuentra en el grupo 2 que da grandes diferencias estructurales como el alto volumen del
sitio catalítico. El mecanismo de eliminación del grupo ɛ-amino acetilo de los residuos de Lys de las histonas
nucleosómicas 10Finnin MS , Donigian JR , Cohen A , et al. Estructuras de un homólogo de histona
deacetilasa unido a los inhibidores de TSA y SAHA. Nature 1999 ; 401: 188 - 93[Crossref] , [PubMed] , [Web
of Science ®] , [Google Scholar] está ampliamente descrito.

Sin embargo, existen diferencias entre los patrones de cambios epigenéticos que son específicos de la
isoforma HDAC. Por lo tanto, a pesar de su sitio catalítico altamente conservado, hay diferentes residuos
que cambian sus entradas de proteínas 11Sixto-López Y , Gómez-Vidal JA , Correa-Basurto J.Exploración de
los posibles sitios de unión de algunos inhibidores de HDAC conocidos en algunos confórmeros HDAC8
mediante estudios Docking. Appl Biochem Biotechnol 2014 ; 173: 1907 - 26[Crossref] , [PubMed] , [Web of
Science ®] , [Google Scholar] , también, debido a su localización celular que modifica sus diferencias de
sustrato natural 12Cameron EE , Bachman KE , Myohanen S , et al. Sinergia de desmetilación e inhibición de
la histona deacetilasa en la reexpresión de genes silenciados en el cáncer. Nat Genet 1999 ;
21: 103 - 7[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google Scholar] . Los inhibidores de HDAC pueden
suprimir la actividad de varios HDAC al aumentar la expresión de genes específicos relacionados con la
morfología celular, metabolismo, detención del crecimiento, detención del ciclo celular, diferenciación,
apoptosis y diferenciación celular, entre otros 13Zhu WG , Otterson GA. La interacción de los inhibidores de
la histona deacetilasa y los inhibidores de la ADN metiltransferasa en el tratamiento de las células
cancerosas humanas. Curr Med Chem Anticancer Agents 2003 ; 3: 187 - 99[Crossref] , [PubMed] , [Google
Scholar] , 14Lindemann JRK , Gabrielli B , Johnstone RW. Inhibidores de histona-desacetilasa para el
tratamiento del cáncer. Cell Cycle 2004 ; 3: 779 - 88[Taylor & Francis Online] , [Web of Science ®] , [Google
Scholar] . Estos inhibidores HDAC se pueden agrupar en compuestos naturales y sintéticos. Los compuestos
naturales incluyen tricostatina A (TSA), apicidina, butirato de sodio, depudecina. Algunos compuestos
sintéticos son piroxamida, análogos de TSA, oxamflatina, sulfonamida, ácido hidroxámico, escriptaide,
derivados de fenilbutirato y ácido valproico (VPA) 15Johannessen CU , Johannessen SI. Valproate: pasado,
presente y futuro. CNS Drug Rev 2003 ; 9: 199 - 216[Crossref] , [PubMed] , [Google Scholar] . Uno de los
HDAC más específicos es la isoforma 8, que es bien conocida su papel en el cáncer asociado a cambios
epigenéticos 16Chakrabarti A , Oehme I , Witt O , y col. HDAC8: un objetivo multifacético para
intervenciones terapéuticas. Trends Pharmacol Sci 2015 ; 36: 481 - 92[Crossref] , [PubMed] , [Web of
Science ®] , [Google Scholar] . Eyal et al. 17Eyal S , Yagen B , Shimshoni J , inhibición de Bialer M.histona
deacetilasas y citotoxicidad de las células tumorales por los isómeros y derivados constitucionales del VPA
activo CNS. Biochem Pharmacol 2005 ; 69: 1501 - 8[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google
Scholar] determinaron la inhibición no selectiva de HDAC utilizando isómeros estructurales de
VPA. Encontraron que los isómeros 4-eno-valproicos y 2-eno-valproicos mostraronvalores deCI50de 1.5 mM
y 2.8 mM, respectivamente, en comparación con un IC50de 1.5 mM para
VPA 17Eyal S , Yagen B , Shimshoni J , inhibición de Bialer M.histona deacetilasas y citotoxicidad de las
células tumorales por los isómeros y derivados constitucionales del VPA activo CNS. Biochem
Pharmacol 2005 ; 69: 1501 - 8[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google Scholar] . Del mismo
modo, se encontró una relación entre la inhibición de HDAC y la citotoxicidad en células
tumorales 18Dowdell SKC , Pesnicak L , Hoffmann V , y col. El ácido valproico (VPA), un inhibidor de la
histona deacetilasa (HDAC), disminuye la linfoproliferación en el modelo murino MRL / lpr (- / -) murino
deficiente del síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS). Exp Hematol 2009;
37: 487 - 94[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google
Scholar] , 19Krämer OH , Zhu P , Ostendorff HP , y col. El inhibidor de la histona deacetilasa ácido valproico
induce selectivamente la degradación proteasomal de HDAC2. Embo J 2003 ;
22: 3411 - 20[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google Scholar] . Esto hizo que los investigadores
siguieran buscando la efectividad del VPA explorando la inhibición del crecimiento celular bajo apoptosis en
células de cáncer endometrialin vitroy en modelos de ratones sin encontrar efectos
adversos 20Takai N , Desmond JC , Kumagai T , y col. Los inhibidores de histona deacetilasa tienen una
actividad antigrowth profunda en células de cáncer de endometrio. Clin Cancer Res 2004 ;
10: 1141 - 9[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google Scholar] . Además, se ha explotado el
objetivo farmacológico de VPA en procedimientos experimentales al comparar este fármaco con otros
inhibidores de HDAC más potentes, estas últimas limitaciones de la demostración tales como toxicidad,
semivida corta y baja biodisponibilidad 21Göttlicher M. Ácido valproico: un antiguo fármaco recientemente
descubierto como inhibidor de las histonas desacetilasas. Ann Hematol 2004 ;
83: S91 - 2[PubMed] , [Google Scholar] .

Por otro lado, el ácido suberoilanilida hidroxámico (SAHA) fue el primer inhibidor HDAC aprobado por la FDA
como agente anticáncer que puede inducir la diferenciación y / o muerte celular apoptótica de células
transformadas in vitro e in vivo 22De Souza C , Chatterji BP. Inhibidores de HDAC como nuevas terapias
contra el cáncer. Reciente Pat Anticancer Drug Discov 2015 ; 10: 145 - 62[Crossref] , [PubMed] , [Web of
Science ®] , [Google Scholar] . Además, se conoce el papel de HDAC8 y su relación con varias enfermedades
del cáncer, incluido el cáncer de mama 23Wang ZT , Chen ZJ , Jiang GM , y otros Los inhibidores de la histona
deacetilasa suprimen la transcripción de p53 mutante a través de señales HDAC8 / YY1 en células de cáncer
de mama triple negativas. Cell Signal 2016 ; 28: 506 - 15[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google
Scholar] , 24Hsieh CL , Ma HP , Su CM , y col. Las alteraciones en la histona deacetilasa 8 conducen a la
migración celular y al mal pronóstico en el cáncer de mama. Life Sci 2016 ;
151: 7 - 14[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google Scholar] .

El objetivo del presente estudio fue diseñar un conjunto de derivados de arilo de VPA que mantienen el
núcleo de SAHA (resto arilo) en un intento de mejorar el efecto inhibidor deseado con baja toxicidad en
células no tumorigénicas. En primer lugar, se logró un estudio in silico dirigido a HDAC8 en modelo
tridimensional (3D) para seleccionar aquellos compuestos que alcanzaron el sitio catalítico presentado por
el átomo de Zn 2+  y mostraron los mejores valores de energía libre de unión en comparación con
VPA. Obtuvimos un compuesto prometedor llamado N - (2-hidroxifenil) -2-propilpentanamida ( 2 )
( Esquema 1 ), que se caracterizó químicamente por punto de fusión, espectroscopía infrarroja (IR),
espectroscopía de resonancia magnética nuclear ( 1 H y 13C NMR), espectrometría de masas (MS) y estudios
de rayos X. Posteriormente, este compuesto se probó como un agente antiproliferativo en cáncer de cuello
uterino (células HeLa), rabdomiosarcoma y células de cáncer de mama, donde mostró una actividad más alta
que VPA.

Experimental

Modelado molecular

Simulaciones de acoplamiento y dinámica molecular

Con el fin de evaluar el posible reconocimiento molecular de 2 sobre HDAC8 y los posibles inhibidores aquí
propuestos, se llevaron a cabo estudios de acoplamiento 25Rosales-Hernández MC , Bermudez-
Lugo J , García JA , et al. Modelado molecular aplicado al desarrollo de fármacos contra el cáncer,
anticancerígeno. Agentes Med Chem 2009 ; 9: 230 - 8[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google
Scholar] . En primer lugar, todas las estructuras químicas 2D se dibujaron con el programa IsisDraw
(http://mdl-isis-draw.updatestar.com/es), sometieron estas estructuras a una pre-optimización previa de la
geometría y la energía en el nivel semiempírico AM1 , empleando el software HyperChem
(http://www.hyper.com/); la optimización geométrica y energética completa de los ligandos se logró a nivel
B3LYP6-31 con el paquete Gaussian 98 26Frisch MJ , Trucks GW , Schlegel HB , y col. Gaussian 98, Revisión
A.9. Pittsburgh, PA : Gaussian, Inc ; 1998 [Google Scholar] , las salidas Z-matrix se convirtieron en un archivo
de entrada .pdb para acoplar con el programa Molekel (http://ugovaretto.github.io/molekel/). Se
recuperaron dos estructuras cristalinas HDAC8 de RCSB-PDB (ID: 1W22 y 2V5W), que fueron enviadas a un
proceso de refinamiento antes de las simulaciones de acoplamiento. Brevemente, las estructuras cristalinas
se despojaron de moléculas adicionales manteniendo el átomo metálico Zn2+requerido para el proceso del
catalizador en el sitio de unión ortostérico. Posteriormente, las estructuras de proteínas se enviaron a
simulaciones de Molecular Dynamics con NAMD2.827Phillips JC , Braun R , Wang W , y col. Dinámica
molecular escalable con NAMD. J Comput Chem 2005 ; 26: 1781 - 802[Crossref] , [PubMed] , [Web of
Science ®] , [Google Scholar] ejecutando 10 ns de simulación total en condiciones estándar considerando
una temperatura de 310 K y 1 presión ATM, que se mantuvieron constantes con un paso de tiempo de 2 fs
usando el algoritmo Shake 28Ryckaert JP , Ciccotti G , Berendsen HJC. Integración numérica de las
ecuaciones de movimiento cartesianas de un sistema con restricciones: dinámica molecular de n-alcanos. J
Comput Phys 1977 ; 23: 327 - 41[Crossref] , [Web of Science ®] , [Google Scholar] para todos los átomos de
hidrógeno. El análisis de acoplamiento se realizó con
AutoDock4.0.1 29Morris GM , Goodsell DS , Halliday RS , y col. Conexión automática utilizando un algoritmo
genético lamarckiano y una función empírica de energía libre de enlace. J Comp Chem 1998 ;
19: 1639 - 62[Crossref] , [Web of Science ®] , [Google Scholar] y los parámetros utilizados fueron los
siguientes: procedimiento de acoplamiento ciego con un cuadro de malla de 126 × 126 × 126 Å3cubriendo
todo el sitio de unión ortostérico en la proteína, espaciando entre cada punto de cuadrícula de 0,375 Å, ya
que el muestreo de puntaje del algoritmo genético lamarckiano se seleccionó considerando una población
inicial aleatorizada de 100 individuos y un 1 × 10 7ciclos como cantidad máxima de evaluaciones de energía .

Síntesis

materiales y métodos

Todos los productos químicos (Sigma-Aldrich Química, SA de CV, Toluca de Lerdo, México) y los solventes
(Tecsiquim, SA de CV, Ciudad de México, México) eran de grado reactivo y se utilizaron tal como se
recibieron. Los puntos de fusión (pf) se determinaron en un aparato Electrothermal IA 91000
(Electrothermal, Bibby Scientific, Staffordshire, Reino Unido), estos no están corregidos. Los espectros IR se
registraron en un espectrómetro FT-IR Perkin Elmer Frontier (PerkinElmer, Shelton, CT). Los valores de
absorción se expresan como el número de ondas (cm -1 ), y en el presente informe solo se incluyen las
bandas de absorción significativas. Se obtuvieron espectros de 1 H y 13 C NMR en un espectrómetro Varian
Mercury 300 MHz (Varian, Inc., Palo Alto, CA) a 300 y 75,4 MHz, respectivamente, usando dimetilsulfóxido
deuterado (DMSO-d 6) como solvente. La MS de alta resolución de ionización por electrospray (ESI) se
realizó con un instrumento Bruker micrOTOF-Q II (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania).

N- (2-hidroxifenil) -2-propilpentanamida ( 2 )

Se añadió cloruro de oxalilo (3,71 ml, 34,6 mmol) gota a gota a VPA (5 g, 34,6 mmol) a 0ºC. La mezcla de
reacción se agitó durante 8 ha la misma temperatura; luego, se dejó calentar a temperatura ambiente bajo
nitrógeno para dar cloruro de 2-propilpentanoilo (A) ( Esquema 2 ). El flujo de nitrógeno se continuó durante
15 minutos y se suspendió durante 15 minutos; este proceso alternado se llevó a cabo durante 3 h, seguido
de enfriamiento a -5 ° C. Hexano (3 ml) y ortohidroxianilina (3,74 g) y la mezcla se agitó durante 12 h antes
de añadir hexano (10 ml) y bicarbonato sódico (3 g); posteriormente, la mezcla se agitó durante 3 h. El
compuesto se obtuvo por extracción con hexano destilado y el sólido formado se filtró y se lavó con
hexano. La síntesis del compuesto se controló mediante cromatografía de capa fina usando una mezcla de
hex / AcOEt (8: 2) como eluyente, obteniendo 2 como un sólido blanco con un rendimiento del 85%.

Sólido blanco, Rf  = 0,45 (Hex / AcOEt 8: 2), pf = 56 ± 2 ° C. FT IR (ATR) v _ { máx} 3260, 3128, 3071, 2959,
2930, 2866, 1631, 1545, 1499, 752 cm ^ {- 1} . 1 H RMN (300 MHz, DMSO- d 6 ) delta 9,73 (br, 1H, OH), 9,37
(s, 1H, NH), 7,60 (d, J  =  3 Hz, 1H, H-6 '), 6,95 ( t, J  =  3 Hz, 1H, H-5 '), 6,85 (d, J  =  6 Hz, 1H, H-3'), 6,76
(t, J  =  6 Hz, 1H, H-4 '), 2,58 (q, J  =  3 Hz, 1H, H-2), 1.55-1.50 (m, J  =  3 Hz, 2H, H-3), 1.36-1.24 (m, 6H, H-3,
2H-4), 0,87 (t, J  = 3 Hz, 6H, 2H-5). 13 C RMN (75,4 MHz, DMSO- d 6 ) δ 175,5 (C-1), 148,7 (C-2 '), 126,8 (C-1'),
125,4 (C-4 '), 123,1 (C-6' ), 119,5 (C-5 '), 116,7 (C-3'), 46,0 (C-2), 35,5 (2C-3), 20,7 (2C-4), 14,5 (2C-5). ESI-MS
calculado para C 14 H 21 NO 2 : [M + Na] +  258.1470. Encontrado: 258.1482.

difracción de rayos X

El cristal único de 2 se trituró por cristalización lenta a partir de hexanos. Los datos de rayos X se recogieron
en un difractómetro Bruker D8 Venture (Bruker AXS GmbH, Karlsruhe, Alemania) equipado
con radiación Mo- K α (λ = 0,71073 Å). Los marcos se integraron con el paquete de software Bruker SAINT
utilizando un algoritmo de marco estrecho. Los datos se corrigieron para efectos de absorción utilizando el
método de exploración múltiple SADABS 30Sheldrick G , Bendición RH . Una corrección empírica para la
anisotropía de absorción. Acta Cryst 1995 ; A51: 33 - 8 [Google Scholar] . Los mínimos cuadrados de matriz
completa anisotrópicos finales refinan en F2. La estructura se resolvió mediante métodos directos utilizando
SHELXS-201331Sheldrick GM. Una breve historia de SHELX . Acta Cryst 2008 ;
64: 112 - 22[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google Scholar] del paquete
WINGX 32Farrugia LJ. Suite WinGX para cristalografía de un solo cristal de molécula pequeña. J Appl
Cryst 1999 ; 32: 837 - 8[Crossref] , [Web of Science ®] , [Google Scholar] . El refinamiento final se realizó
mediante métodos de mínimos cuadrados de matriz completa utilizando SHELXL-2013 31Sheldrick GM. Una
breve historia de SHELX . Acta Cryst 2008 ; 64: 112 - 22[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google
Scholar] programa. Los datos de cristal, los parámetros de recopilación y refinamiento se dan en laTabla
1. Los átomos de H en C, N y O se colocaron geométricamente y se trataron como átomos de conducción
con: C-H 0,95-0,99 Å, Uiso (H) = 1,2 eq (C) o 1,5 eq (C); O-H = 0,84 Å, Uiso (H) = 1,5 eq (O); N-H = 0,88 Å, Uiso
(H) = 1,2 eq (N). Platon 33Spek AL. PLATON, versión de marzo de 2002. Heidelberglaan, Países
Bajos : Universidad de Utrecht ; 2002 [Google Scholar] y Mercury34Macrae CF , Edgington PR , McCabe P , y
col. Mercurio: visualización y análisis de estructuras cristalinas. J Appl Crystallogr 2006 ;
39: 453 - 7[Crossref] , [Web of Science ®] , [Google Scholar] se usaron para preparar el material para su
publicación. La recopilación de datos y los parámetros de refinamiento, las coordenadas de los átomos, las
longitudes de los enlaces y los ángulos de enlace se han depositado en el Centro de Datos Cristalográficos de
Cambridge. El número de deposición de CCDC es 1429149.

Tabla 1. Datos de rayos X, parámetros de recopilación y refinamiento para 2.

Evaluación biológica

Culturas celulares

Las líneas celulares de cáncer HeLa (cáncer de cuello uterino), MCF-7, MDA-MB-231, SKBr3, MCF-10A
(mama), A204 (rabdomiosrcoma) se obtuvieron de ATCC, mientras que las células endoteliales de vena
umbilical humana (HUVEC) fueron de cultivo primario . HUVEC se aislaron del cordón umbilical de acuerdo
con un procedimiento descrito anteriormente 35Jaffe EA . Cultivo e identificación de células endoteliales de
grandes vasos. Biología de células endoteliales. Boston, MA : Martinus Nijhoff ; 1984 : 1 - 13 [Google
Scholar] . Las células se cultivaron en medios M199 con 1% de suplemento de crecimiento de células
endoteliales, heparina y 15% de suero bovino fetal. El donante de cordón umbilical fue reclutado en el
Hospital Juárez de México. El Comité de Ética e Investigación del Hospital Juárez de México aprobó la
participación del donante y obtuvo un consentimiento informado por escrito.

Las células HeLa y A204 se cultivaron en medio DMEM (Gibco Lab, Grand Island, NY) en suero fetal bovino al
5%. Las células MCF-7 y MDA-MB-231 se conservaron en medio DMEM de glucosa alta (4,5 g / l) con rojo de
fenol, suero fetal bovino al 5% y antibiótico 1X (estreptomicina / penicilina 10000 U / ml, Gibco Lab, Grand
Island, NUEVA YORK). Las células MCF-10A se cultivaron en medio DMEM / F12 sin rojo de fenol y se
cultivaron SKBR3 en DMEM / F12 con suero fetal bovino al 10%. Las células se incubaron a 37 ° C en una
atmósfera húmeda de 5% de CO 2 , manteniendo el medio ambiente a pH fisiológico.

Para corroborar los efectos biológicos del VPA (control positivo) y explorar los de 2 , se usaron cultivos
celulares para estudiar la citotoxicidad. Para este propósito, se evaluó 2 en células HeLa a las mismas
concentraciones informadas para VPA en esta línea celular.

Ensayos de actividad antiproliferativa celular

Línea celular de cáncer de cuello uterino (HeLa) y rabdomiosarcoma (A204). El efecto de 2 y VPA sobre la
proliferación celular se midió con la sal de tetrazolio WST-1. En primer lugar, 10 4 células se sembraron en
placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h (37 ° C, 5% de CO 2 ) para permitir que se adhieran a la
placa. A continuación, se prepararon diferentes concentraciones de las soluciones de fármaco ( 2 y VPA) (a
partir de la solución madre) y se añadieron al medio de cultivo para tratar las células durante 24
h. Posteriormente, se aspiró el contenido de cada placa y se añadieron 100 μl de medio de cultivo y 10 μl de
WST-1, seguido de incubación durante 4 h. Luego, las placas se leyeron con un lector de placas ELISA a 520
nm. El IC 50se calculó mediante la prueba de diferentes concentraciones de fármaco-respuestas, trazando
los valores, y haciendo una curva en el servidor de la Universidad de Tokio ( http://bsmdb.tmd.ac.JP 3000 /)
a través de un análisis logarítmico de cuatro variables.

Además, la proliferación celular se midió mediante el ensayo del bromuro de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-
difeniltetrazolio (MTT). Las células se trataron como se mencionó anteriormente y al final del período
experimental el medio se retiró y se reemplazó con 100 μL de medio con MTT (0,5 mg / mL), pero sin rojo de
fenol, y se incubó durante 2,5 h. Luego, el medio se eliminó y se reemplazó con 150 μL de DMSO. La
densidad óptica se midió a 550 nm en un espectrofotómetro (Sinergy Biotek Instruments, Winooski, VT).

Líneas celulares de cáncer de mama. Las concentraciones iniciales utilizadas en este estudio se
determinaron en base a los resultados previos obtenidos a partir de la curva logarítmica. Se preparó
una solución stock de 25 mM de 2 en dimetilsulfóxido (DMSO) y una solución stock 25 mM de VPA en
solución tampón de fosfato (PBS). MCF-7 (ER +, PR + y HER2 +), MDA-MB-231 (ER-, PR- y HER2), células
SKBr3 (ER-, PR-, HER2 +, GPER +) y MCF-10A (benignas) se trataron con 800 μL de tripsina al 0.05%
(Invitrogen, Waltham, MA) y contados con una cámara Neubauer.

Cada línea celular se colocó en placas de 96 pocillos a una densidad de 1x10 4 células por pocillo y se incubó
durante la noche. Se prepararon siete concentraciones diferentes por dilución de la solución madre: 100
μM, 150 μM, 200 μM, 250 μM, 300 μM, 350 μM y 400 μM. Las células se trataron a cada concentración
durante 24, 48 y 72 h. Cada concentración / tiempo se probó por cuadruplicado. El ensayo para la
determinación de IC 50se realizó por triplicado.

El IC 50 se calculó mediante pruebas de diferentes drogas de concentración-respuesta, el trazado de los

valores, y la construcción de una curva en Prism Gráfico V.6.0 programa, a través de un análisis logarítmico
de cuatro variables. El análisis estadístico se realizó con t de student test, considerando valores de p de 0.05
significancia estadística de diferencia, para efecto antiproliferativo comparativo entre compuesto 2 y VPA.

Resultados y discusión

Modelado molecular

Simulaciones de acoplamiento de derivados de arilo de VPA en HDAC8

Los estudios teóricos muestran varias ventajas durante el desarrollo de nuevas entidades químicas con
actividad biológica potencial en un objetivo determinado, como los implicados en el cáncer. Basándose en el
conocimiento químico de los ligandos y / o sus objetivos, es posible diseñar moléculas que combinen
diferentes farmacóforos capaces de alcanzar diferentes sitios de la misma proteína o proteínas distintas
(compuestos bi-objetivo o multiobjetivo), lo que podría mejorar el efecto antiproliferativo in situ y, en
consecuencia, en la mejora de la eficacia del tratamiento 36Achenbach J , Klinger FM , Blöcher R , y
col. Explorando el espacio químico de los ligandos multitarget usando mapas alineados de
autoorganización. ACS Med Chem Lett 2013 ; 4: 1169 - 72[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science
®] , [Google Scholar] .

En este trabajo, nos centramos en el diseño y evaluación de un conjunto de derivados de arilo VPA con el
objetivo de aumentar la potencia biológica de este fármaco, por lo que se incluyó un resto arilo en el grupo
carboxilo de VPA para obtener cierta similitud con el núcleo de arilo de la molécula de SAHA ( Esquema 1

Esquema 1. Diseño de derivados de VPA-arilo (centro) mediante la mezcla de ácido valproico (VPA,
izquierda) con el núcleo de arilamina del ácido suberoilanilida hidroxámico (SAHA) con diferentes
sustituyentes (derecha).

Esquema 2. Síntesis del compuesto objetivo 2 . Inicialmente, VPA reaccionó con cloruro de oxalilo para
formar un grupo amida mediante la adición de la orto hidroxianilina. Reactivos y condiciones: (1) cloruro de
oxalilo y (2) o -aminofenol.
), siendo el objetivo común de estos farmacóforos el HDAC8, ya que se ha demostrado que esta proteína
tiene varios sitios de unión de reconocimiento 21Göttlicher M. Ácido valproico: un antiguo fármaco
recientemente descubierto como inhibidor de las histonas desacetilasas. Ann Hematol 2004 ;
83: S91 - 2[PubMed] , [Google Scholar] . Una vez que se diseñaron los ligandos, se sometieron a
simulaciones de acoplamiento en estructuras HDAC8 informadas previamente (código PDB: 1W22 y 2V5W),
y utilizando la metodología previamente informada para explorar el patrón de reconocimiento de VPA en las
conformaciones de HDAC8 37Bermúdez-Lugo JA , Pérez-González O , Rosales-Hernández MC , et
al. Exploración del sitio de unión del ácido valproico en la histona deacetilasa 8 utilizando simulaciones de
acoplamiento y dinámica molecular. J Mol Model 2012 ; 18: 2301 - 10[Crossref] , [PubMed] , [Web of
Science ®] , [Google Scholar] . Por lo tanto, los parámetros utilizados para seleccionar los mejores
compuestos fueron los valores de energía libre (Tabla 2) y la postura de enlace. La interacción de los
derivados de arilo de VPA en HDAC8 en las simulaciones de acoplamiento mostró que los
compuestos2,18 , 19 , 20 y 21 tenían los mejores valores de afinidad ( Figura 1 ), que se vieron favorecidos
por ciertos tipos de sustituyentes químicos y su conformación estructural adoptada a través del
acoplamiento. Además, estos parámetros han demostrado cierta relación con los datos experimentales ( K i
de HDAC1: 0,4 mM) 38Phiel CJ , Zhang F , Huang EY , y col. La histona deacetilasa es un objetivo directo del
ácido valproico, un potente anticonvulsivo, estabilizador del estado de ánimo y teratógeno. J Biol
Chem 2001 ; 276: 36734 - 41[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google Scholar] .

Figura 1. Relación de la energía de enlace (kcal / mol) de cada compuesto probado en las dos estructuras
cristalinas de HDAC8.

Mostrar tamaño completo

Tabla 2. Valores de energía libre de los derivados de arilo de VPA acoplados a dos estructuras cristalinas de
HDAC8 recuperadas del banco de datos de proteínas (AP) obtenidas mediante estudios de acoplamiento.
 Decidimos realizar una búsqueda de las
propiedades de unión de VPA con una región
de la proteína HDAC que Vannini et
al. descrito en 2007 como el sitio de
transporte de acetilo (ASL), que se eliminó
durante la
catálisis 39Vannini A , Volpari C , Gallinari P ,
y col. El sustrato se une a las histonas
desacetilasas según lo revela la estructura
cristalina del complejo HDAC8-
sustrato. EMBO Rep 2007 ;
8: 879 - 84[Crossref] , [PubMed] , [Web of
Science ®] , [Google Scholar] . Esta región
está cerca del sitio esteárico, en conexión
con ella a través de un pasaje estrecho que
probablemente sea responsable de eliminar
el producto de reacción. En esta búsqueda,
encontramos que había una tendencia de
VPA a tener mayor afinidad por este sitio ASL que por el sitio catalítico en HDAC8 .Bermúdez-Lugo JA , Pérez-
González O , Rosales-Hernández MC , et al. Exploración del sitio de unión del ácido valproico en la histona
deacetilasa 8 utilizando simulaciones de acoplamiento y dinámica molecular. J Mol Model 2012 ;
18: 2301 - 10[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google Scholar]y viceversa cuando se probó el
VPA con HDAC1, 2 y 3. Para los miembros de la Clase II, la ubicación o existencia de este sitio de liberación
de acetato no está clara. Con base en este análisis, procedimos a buscar en la biblioteca de medicamentos
otra actividad contra HDAC8. Consideramos el resto arilo del SAHA debido a su estabilidad estructural en el
entorno aromático HDAC8, en los que Tyr100 sirve para acoplar el ligando en el sitio de unión de
proteína- 40Zang LL , Wang XJ , Li XB , y col. Nuevo diseño de inhibidor HDAC basado en SAHA por método
de salto de núcleo. J Mol Graph Model 2014 ; 54: 10 - 18[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google
Scholar] , 41Vannini A , Volpari C , Filocamo G , y col. Estructura cristalina de una histona desacetilasa
eucariota dependiente de Zn, humana HDAC8, complejada con un inhibidor de ácido hidroxámico. Proc Natl
Acad Sci USA 2004 ; 101: 15064 - 9[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google Scholar] .

Como se puede ver, independientemente de la sustitución en cada compuesto, la orientación en el espacio

del sitio catalítico es muy similar ( Figura 2 , a continuación). Esto se debe a que las cadenas alifáticas
estabilizan el compuesto en la entrada de la garganta del sitio catalítico en todos los casos, mientras que el
resto aromático alcanza ciertos residuos (como ocurre por ejemplo con SAHA). La diferencia en los valores
de afinidad depende del tipo y la cantidad de interacciones débiles causadas por el grupo químico sustituido,
que interactúa electrostáticamente con el átomo de zinc en HDAC8, proporcionando así a esta proteína una
carga negativa parcial ( Figura 2 , izquierda). En la contribución actual, los derivados de arilo de VPA
muestran un comportamiento de postura de unión diferente al observado para el compuesto de
plomo 37Bermúdez-Lugo JA , Pérez-González O , Rosales-Hernández MC , et al. Exploración del sitio de
unión del ácido valproico en la histona deacetilasa 8 utilizando simulaciones de acoplamiento y dinámica
molecular. J Mol Model 2012 ; 18: 2301 - 10[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google
Scholar] . Esto significa que la adición de arilo indujo un reconocimiento del sitio de unión de SAHA, lo que
explica las mejores afinidades para los derivados en comparación con el observado para el VPA.

Figura 2. Interacciones de los compuestos 2, 18, 19, 20 y 21, (A) todos los ligandos son capaces de adoptar la
misma pose de unión. (B) 2 está haciendo una coordinación con Zn + 2Stewart BW , Wild CP. World Cancer
Report 2014. Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer. Ginebra : WHO [Google Scholar] . (C) y
(D) muestran la cavidad de HDAC8 alcanzada por los ligandos objetivo.
Por lo tanto, en base a los resultados de acoplamiento, se demostró que el compuesto N- (2-hidroxifenil) -2-
propilpentanamida ( 2 ) es uno de los compuestos más promisorios de acuerdo con sus valores de energía
libre y las interacciones sin enlaces.

Química

El compuesto 2 se sintetizó con éxito con un rendimiento del 85% por cloración de ácido valproico (VPA) con
cloruro de oxalilo para formar cloruro de 2-propilpentanoilo ( A ) y posterior amidación con orto
hidroxianilina ( Esquema 2 ). Los datos analíticos están de acuerdo con la estructura propuesta, en
particular, amida NH y fenólica se observan OH en 9,37 y 9,73 ppm en 1 H RMN aparece espectro y carbonilo
a 175,5 ppm y a 1631 cm -1 en 13 C RMN y espectros de IR, respectivamente .

El Compuesto 2 dio monocristales adecuados para el análisis por difracción de rayos X, la estructura
correspondiente se muestra en la Figura 3 y los parámetros geométricos seleccionados se enumeran en los
subtítulos. Las longitudes y ángulos de enlace son características del enlace de amida. La estructura de 2en
el cristal es muy similar a la adoptada en la conformación de alta afinidad de HDAC obtenida del
acoplamiento. En ambos casos, el grupo amida está fuera del plano de fenilo medio con O (17) C (8) N (7) C
(1) y C (2) C (1) N (7) C (8) ángulos de torsión de 11.1 (4) y -44.2 (3) en el cristal y 0.06 y -82.01 en la
conformación acoplada, respectivamente. En este último, el grupo OH se retuerce al anti-confórmero
mediante un enlace de hidrógeno con Tyr306 del sitio de unión HDAC, mientras que en el cristal el OH se
sincroniza con el anillo de benceno. El enlace de hidrógeno OH ··· O entre el donante fenólico y el aceptor de
amida de carbonilo, da forma a una estructura tipo hélice en el cristal.

Figura 3. Estructura molecular del compuesto 2. Parámetros geométricos seleccionados: longitudes de

enlace (Å): O (2) -C (2) 1.366 (3), O (17) -C (8) 1.245 (2), N (7 ) -C (1) 1,426 (3), N (7) -C (8) 1,337 (3); ángulos
de enlace (°): C (1) -N (7) -C (8) 127.36 (17), O (2) -C (2) -C (1) 123.3 (2), O (2) -C (2) -C (3) 117.7 (2), O (17) -C
(8) -N (7) 122.0 (2), O (17) -C (8) -C (9) 120.81 (19) , N (7) -C (8) -C (9) 117.23 (17); ángulos de torsión (°): C (2)
-C (1) -N (7) -C (8) -44.2 (3), N (7) -C (1) -C (2) -O (2) -3.3 (3), O (17) -C (8) -N (7) -C (1) 11.1 (4), C (9) -C (8) -N
(7) -C (1) - 167.9 (2), O (17) -C (8) -C (9) -C (10) -59.7 (3), O (17) -C (8) -C (9) -C (13) 65.4 (3), N (7) -C (8) -C (9) -
C (13) -115,6 (2).
Actividad biológica

Actividad antiproliferativa in vitro de 2 en células de cáncer de cuello uterino (HeLa)

Después de estandarizar el manejo de la línea celular, procedimos a obtener información del efecto
de 2comparando esto con el de VPA. Una curva de respuesta a la concentración fue construido bajo
unidades logarítmicas (100 mM a 1 x 10 -3  mM para VPA, 10 mM a 1 × 10 -4  mM para 2 ) midiendo el
porcentaje de viabilidad celular. Las curvas sigmoideas reflejan el efecto dependiente de la concentración de
ambos compuestos en base a la disminución de la viabilidad celular determinada por el ensayo de MTT
( Figura 4A ). El Compuesto 2 demostró ser 10 veces más potente que el VPA. Con la curva, era posible
calcular la IC 50 en células HeLa para cada compuesto, resultando en 0,92 mM para 2y 9.12 mM para VPA. El
IC 50 valor de VPA se calculó como se informó anteriormente usando una concentración de 3
mM 42Dejligbjerg M , Grauslund M , Litman T , y col. Efectos diferenciales del agotamiento de la histona
deacetilasa de la isoforma de la clase I y la inhibición enzimática por el ácido belinostat o valproico en las
células HeLa. Mol Cancer 2008 ; 7: 1 - 12[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google Scholar] .

Figura 4. (A) Curva de concentración-respuesta de VPA y 2 en células HeLa. (B) Curva de concentración-
respuesta de VPA y 2 en la línea celular A204. Todos los datos sobre la proliferación celular después del
tratamiento se expresan como el porcentaje de crecimiento celular de las células tratadas frente a las no
tratadas (control). Todos los ensayos fueron determinados por WST.

Una vez que la obtención de la IC 50 para cada fármaco, se sembraron 1 x 10 6 células en 25 matraces de
cultivo ml, cada uno con 5 ml de medio DMEM (solo o en combinación con el IC 50 de uno de los
fármacos). Hicimos un seguimiento fotográfico de tiempo y efecto. Mientras que hubo un aumento en el
número de células en el control, las células en los matraces con 2y VPA mantuvo el mismo nivel de 0 a 24 h
(datos no mostrados). Esto se puede explicar por un efecto citostático o un cierto grado de apoptosis
inducida por las drogas. Posteriormente, se realizó un ensayo para detectar apoptosis con el fin de aclarar el
tipo de muerte celular que causó cada fármaco. Usamos un kit de detección de apoptosis (Takara Inc.) para
evaluar el ADN celular cortado por endonucleasas (típico del proceso apoptótico pero no de la necrosis). El
ADN fragmentado se identifica mediante la adición de TdT (desoxinucleótido transferasa terminal), que
complementa las cadenas en cualquier 3'OH encontrado. Los nucleótidos utilizados se marcan con
fluoresceína y luego se estimulan con luz UV. Las células de control (células no tratadas) se observaron en
rojo, no mostrando fluorescencia. Mientras que algunas células ligeramente positivas se encontraron
cuando se usó el IC 50 de2 y VPA (en una tendencia dependiente del tiempo: 24 h <48 h), la fluorescencia
fue intensa (se observó más en el núcleo) cuando la concentración de IC 99 se empleó durante 4 h, lo que
indica una fuerte respuesta apoptótica (datos no mostrados) .

Actividad antiproliferativa in vitro de 2 líneas celulares de rabdomiosarcoma (A204)

Los ensayos se realizaron con la línea celular rabdomiosarcoma (A204) para identificar la actividad de 2 y
VPA. Como se sabe que la doxorrubicina tiene actividad contra este tipo de tumor, se agregó como control
positivo. El compuesto 2 y la doxorrubicina tenían un perfil similar en la inhibición del crecimiento celular,
mientras que el VPA mostró aproximadamente 100 veces menos potencia ( Figura 4B ). Las curvas de
concentración-respuesta se crearon con el servidor de la Universidad de Tokio obtener el IC 50 de
concentración para cada compuesto: 36,42 M durante 2 , 12,25 mM para VPA, y 12,22 M para la
doxorrubicina.

Actividad antiproliferativa in vitro de 2 en líneas celulares de cáncer de mama

MCF-7, MDA-MB-231, SKBr3, endoteliales (células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) y células
MCF-10A no se trataron o se trataron con diferentes concentraciones de 2 y VPA durante 72 h (0-350 μM).
esta vez, se encontró que las concentraciones de 2 que se emplearon suprimieron la proliferación de células
MCF-7 de una manera dependiente de la concentración, con la concentración más alta que disminuye la
célula al 20,8% de la encontrada en las células control ( Figura 5A ; p  = 0,001 Sin embargo, con la
proliferación de células VPA se mantuvo en aproximadamente el 100% independientemente de la
concentración. Se observó un efecto similar en las células MDA-MB-231 tratadas durante 72 h ( Figura 5B ),
con 400 μM de 2disminución de la proliferación celular a 8.7% ( p  = 0.003), y VPA que prácticamente no
muestra ningún efecto.

Figura 5. Efecto de 2 y VPA sobre la proliferación celular en: (A) células MCF-7 (concentración 0-350 μM de
los compuestos), (B) células MDA-MB-231 (concentración 0-450 μM de los compuestos) , (C) MCF-10A y
células endoteliales (0-400 μM concentración de células 2, y (D) SKBr3 (concentración 0-250 μM de los
compuestos). Todos los datos sobre la proliferación celular después del tratamiento se expresan como el
porcentaje de células crecimiento de células tratadas frente a no tratadas (control). Todos los ensayos se
determinaron mediante MTT. Los resultados se expresan como la media ± SD de tres experimentos
independientes ( n  = 4).
Se usaron líneas celulares endoteliales y MCF-10A (no tumorigénicas) como control porque se consideran
células epiteliales normales. El efecto de 2 se ensayó a las mismas concentraciones utilizadas
previamente. Con 250? M de compuesto 2 (IC 50  =  213,7 M), a las 72 h de la proliferación celular
tratamiento disminuyó a 11,3% de la encontrada en las células de control ( Figura 5C ). Este resultado indica
que las células mamarias normales eran más sensibles que las líneas celulares de cáncer de mama.

Cuando tratamos las células SKBr3 con 2 , se encontró un efecto inhibidor más alto sobre la proliferación
celular que con las otras líneas celulares. Por lo tanto, hemos utilizado concentraciones más bajas (0-250
mM) para encontrar el IC 50 . VPA no tuvo ningún efecto inhibitorio. Por el contrario, observamos un ligero
aumento en la proliferación celular a las concentraciones más altas utilizadas ( Figura 5D ).

Los IC 50 valores de 2 fueron los siguientes: 192,4 M para las células MCF-7, 283,0 M para las células MDA-
MB-231, 213,7 M para las células MCF-10A, y 142,0 M para las células SKBR3. Como se informa en la Tabla
3, 2 exhibe actividad citotóxica en todas las líneas celulares. Este compuesto mostró actividad en
concentraciones que podrían considerarse clínicamente aceptables. En contraste, a las mismas
concentraciones VPA no fue capaz de ejercer un efecto sobre las líneas celulares de cáncer de mama. Estos
resultados sugieren que 2 es capaz de inhibir el crecimiento celular de células sensibles a estrógenos, con el
mayor efecto encontrado en la línea celular SKBr3.

Tabla 3. IC 50 para 2 en líneas celulares de cáncer de mama y las células no tumorigénicas.

Se sabe que hay informes en los que el VPA ejerce su actividad inhibidora de HDAC a concentraciones
superiores a las que se encuentran en este documento. En 2007, Fortunati et al. informado de un IC 50 de
0,74 mM para VPA en células MCF-7 y de 1,58 mM para este fármaco en las células MDA-MB-231 (usando 3
× 10 3 células durante ocho días) 43Fortunati N , Bertino S , Costantino L , y col. El ácido valproico es un
agente antiproliferativo selectivo en células de cáncer de mama sensibles a estrógenos. Cancer Lett 2008 ;
259: 156 - 64[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google Scholar] . Además, este grupo demostró
que el VPA induce fuertemente la apoptosis en células MCF-7 al activar la caspasa
8 43Fortunati N , Bertino S , Costantino L , y col. El ácido valproico es un agente antiproliferativo selectivo en
células de cáncer de mama sensibles a estrógenos. Cancer Lett 2008 ;
259: 156 - 64[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google Scholar] . En el presente estudio los
IC50valores son inferiores a los indicados por Fortunati, lo que sugiere que2tiene un mayor efecto en ambas
líneas celulares que el VPA debido a su capacidad de alcanzar el sitio SAHA en HDAC8, o al actuar sobre
GPR30 / GPER (un objetivo promisorio en el diseño de fármacos para la quimioterapia actual) si el
compuesto se metabolizara por el CYP450 dando como resultado un resto arilo dihidroxilado capaz de
interactuar con el sitio de unión en GPER / GPR30. En 2012, Li et al. demostraron que las concentraciones de
hasta 3,2 mM de VPA no tuvieron ningún efecto sobre la proliferación celular de las células MDA-MB-231,
aunque se observó inhibición de la migración celular 44Li GF , Qian TL , Li GS , y col. El valproato de sodio
inhibe la migración de células de cáncer de mama MDA-MB-231 al regular positivamente la expresión de
NM23H1. Genet Mol Res 2012 ; 11: 77 - 86[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google
Scholar] . Esto podría explicar por qué no encontramos ningún cambio en la proliferación de las células aquí
tratadas con AVA.

En 2011, Park et al. encontraron que la expresión de HDAC4, 6 y 8 es mayor en células MDA-MB-231 que en
células MCF-7, y que estas isoformas se correlacionan con una expresión aumentada de metaloproteinasa 9
(MMP-9), que se asocia con invasión celular 45Park SY , Jun JA , Jeong KJ , et al. Las histonas desacetilasas 1,
6 y 8 son fundamentales para la invasión del cáncer de mama. Oncol Rep 2011 ;
25: 1677 - 81[PubMed] , [Web of Science ®] , [Google Scholar] . Observamos que2tuvo un efecto
significativo sobre la disminución de la proliferación celular de MDA-MB-231, cuyas características son más
agresivas que las células MCF-7.

Mediante el uso de ensayos in silico demostramos que 2 se une a HDAC8 con mayor afinidad que VPA,
evidenciada por la Kd de 0.33 μM versus 4.63 μM ( 2 versus VPA, respectivamente), calculada a partir de sus
valores de energía libre ( Tabla 2 ). Estos datos teóricos podrían explicar la disminución en la proliferación de
células cancerígenas usadas actualmente.

El VPA es clínicamente relevante porque su actividad antiproliferativa como inhibidor de HDAC se ha

descrito recientemente en pacientes con cáncer de mama, encontrando una concentración plasmática
media de 86,3 mg / ml .Candelaria M , Gallardo-Rincón D , Arce C , et al. Un estudio de fase II de terapia
epigenética con hidralazina y valproato de magnesio para superar la resistencia a la quimioterapia en
tumores sólidos refractarios. Ann Oncol 2007 ; 18: 1529 - 38[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science
®] , [Google Scholar] . En este estudio, el VPA se administró con hidralazina, un inhibidor de la
metilación 46Candelaria M , Gallardo-Rincón D , Arce C , et al. Un estudio de fase II de terapia epigenética
con hidralazina y valproato de magnesio para superar la resistencia a la quimioterapia en tumores sólidos
refractarios. Ann Oncol 2007 ; 18: 1529 - 38[Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®] , [Google Scholar] . En
2007, Münster et al. realizó un estudio de fase clínica I con 44 pacientes a los que se les administraron 160
mg / kg / día de AVP, encontrando diversos efectos adversos, como somnolencia, hiponatremia,
hipocalcemia, fatiga, alucinaciones, mareos, dolor de cabeza o
deshidratación 47Münster P , Marchion D , Bicaku E , et al. Ensayo de fase I de la inhibición de la histona
deacetilasa por el ácido valproico seguido del inhibidor de la topoisomerasa II Epirubicina en tumores sólidos
avanzados: un estudio clínico y traslacional. J Clin Oncol 2007 ; 25: 1979 - 85[Crossref] , [PubMed] , [Web of
Science ®] , [Google Scholar] . Encontraron que la dosis de estudio de fase II recomendada es de 140 mg / kg
/ día durante 48 h, seguida de 100 mg / m2de epirubicina. No hay informes clínicos en los que se administre
VPA como monoterapia para tumores sólidos. Por lo tanto, la contribución actual demuestra que la
interacción de 2 con dos dianas terapéuticas fue capaz de inhibir el crecimiento celular con una
concentración menor en comparación con la terapia de combinación informada anteriormente. Estos datos
sugieren que el compuesto 2 es un fármaco anticáncer potencial promisorio que merece un mayor
desarrollo preclínico y clínico.

Conclusiones

La sustitución química de moléculas diseñadas que inhiben la isoforma HDAC8 podría dar como resultado
una inhibición más eficaz de esta enzima que la de los compuestos de partida. En el presente estudio, se
diseñó y sintetizó el compuesto 2 , que fue el resultado de añadir un núcleo de arilo monosustituido en el
grupo carboxilo de VPA para dar un derivado de arilamida (similitud estructural con SAHA). De acuerdo con
los resultados teóricos, el compuesto 2 aparentemente se dirige a HDAC8. Adicionalmente, el compuesto
probado fue capaz de inhibir la proliferación de células tumorales in vitro a una concentración mucho más
baja que la requerida para lograr el mismo efecto con VPA.