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Biologia Molecular da Célula Ano lectivo 2004-2005

Exercícios sobre Clonagem Molecular

1. A enzima de restrição EcoRI (5'-G^A A T T C-3’) foi usada para digerir uma molécula
de DNA linear que contém 10 locais de restrição EcoRI e uma molélula de DNA circular
que também contém 10 locais EcoRI.

a) Quantos fragmentos de DNA espera obter da digestão completa de cada uma


destas moléculas com EcoRI. Indique as extremidades de um desses fragmentos.

b) Conseguirão todos os fragmentos de cada uma destas moléculas de DNA


recircularizar? Justifique.

2. Pretende-se exprimir, em bactérias, a proteína humana codificada pelo gene YFE. Para
isso é necessário clonar a sequência num plasmídeo. Mas antes é ainda necessário
construir um vector adequado, por técnicas de DNA recombinante.

2.1. Diga, justificando, que sequências adicionaria a um plasmídeo nativo para o


transformar num plasmídeo de clonagem adequado ao seu objectivo.
a) Sequência nucleotídica com locais de restrição únicos no plasmídeo
b) Promotor
c) Gene de resistência à ampicilina
d) Gene da polimerase de DNA
e) Gene da polimerase de RNA
f) Sequência trinucleotídica ATG
2.2 Quais as principais diferenças entre o vector que construiu e um vector de clonagem?

2.3. Imagine que vai clonar o cDNA do gene YFE no vector de expressão que a seguir se
representa. Descreva a estratégia de clonagem que seguiria.

P
Bam HI
Eco RI Kpn I Pst I Sma I Eco RI
Eco RV
pRSET B
2,9 Kb
Eco RI G↓AATTC
Kpn I GGTAC ↓C
Pst I CTGCA↓G
Bam HI G↓GATCC
Eco RV GAT↓ATC
SmaI GGG↓CCC

3. Pretende clonar o cDNA do geneX no vector pBluescript para efectuar uma reacção de
transcrição e tradução in vitro. Na reacção de transcrição in vitro juntam-se num
microtubo, o vector recombinante e todos os reagentes necessários para a transcrição. O
vector pBluescript possui 2 promotores, o T7 e o T3, que são reconhecidos
respectivamente pela RNA polimerase do bacteriófago T7 e T3. Nesta reacção pretende
utilizar a RNA polimerase T7.

Fig.1 - Mapa do vector pBluescript e sequência do local de policlonagem:


Fig. 2- Mapa de restrição da região que flanqueia o gene (nenhuma destas enzimas corta
no interior do cDNA do gene X) :

5’---BssH II---SacII------HindIII-----cDNA do geneX------SmaI----XbaI---BssHII----


BstEII----3’

a) Que enzimas utilizaria nesta clonagem? Justifique.

4. Pretende-se clonar o gene X num vector de expressão procariota. A figura representa


esquematicamente o vector utilizado e o gene que se pretende clonar
Bgl II

Promotor 5’
Bam HI

Xba I
Xho I
Xba I

Nde I

Nde I
Eco RI
Bam HI
Ori Xba I
3 Kpb 3’

1 500 1500 2000

Nde I CA^TATG Xba I T^CTAGA


Eco RI G^AATTC Bgl II A^GATCT
Bam HI G^GATCC Xho I C^TCGAG

4.1 Qual a melhor estratégia de clonagem?

4.2 Represente esquematicamente os resultados obtidos por separação dos produtos


de clonagem num gel de agarose, após digestão com a enzima Nde I.
5. A figura que se segue representa esquematicamente um vector de clonagem que
pretende utilizar para clonar o gene X, cujo mapa de restrição se apresenta:

Promotor 5’

Bam HI
Bam HI

Bam HI

Xho I
Xho I

Nde I
Pst I

Pst I
Pst I
Ori Eco RI
3 Kpb 3’

1 500 1500 2000


AmpR

a) Qual a melhor estratégia para efectuar esta clonagem?

b) Após ter realizado a sua clonagem, procedeu à transformação e amplificação do


plasmídeo em E. coli. Seleccionou três clones de bactérias, isolou o DNA plasmídico e
digeriu o plasmídeo de cada clone com as enzimas Nde I e Eco RI (simultaneamente). O
esquema que se segue representa os resultados obtidos após separação dos produtos de
digestão num gel de agarose 1%. Como interpreta o padrão de bandas para cada clone?

M 1 2 3

5000 pb -

4000 pb -
3000 pb -

2000 pb -

1000 pb -

500 pb -