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Revista Pharmaciencia Vol.03. Núm.

01 (2015):04-10

Revista Pharmaciencia Facultad de Farmacia y


Bioquímica
Sitio Web: http:// http://revistas.unitru.edu.pe/index.php/farmabioq Universidad Nacional de Trujillo

Identificación de fitoconstituyentes y caracterización de flavonoides en las


inflorescencias de Brassica oleracea L. var. Botrytis “coliflor” por Cromatografía
líquida de alta resolución-Espectrometría de masas

Phytoconstituents identification and flavonoids characterization from Brassica oleracea var.


Botrytis “cauliflower” inflorescences by High performance liquid chromatography- Mass
spectrometry

Anabel González Siccha1, Carlos Sabana Gamarra2.

Recibido: 08 de junio del 2015; Aceptado: 30 de julio del 2015


RESUMEN
Objetivo: Identificar los fitoconstituyentes y caracterizar los flavonoides presentes en la
inflorescencia de Brassica oleracea L. var. Botrytis “coliflor” por cromatografía líquida de
alta resolución/Espectrometría de masas. Material biológico: Coliflor recolectada en Simbal-
Trujillo Método: Identificación cualitativa de los fitoconstituyentes por separación con
solventes de polaridad creciente (éter, etanol y agua) mediante Cromatografía líquida de Alta
Resolución (HPLC) y por el espectro de masas (MS/MS). Se caracterizaron los productos de
los flavonoides obtenidos después de hidrólisis ácida y alcalina. Resultados: Las
inflorescencias de la coliflor presentaron metabolitos secundarios como: glucosinolatos,
esteroides, saponinas, taninos y flavonoides. En el análisis de HPLC-MS/MS, se obtuvo el
tiempo de retención (Rt) de los flavonoides glicosilados, identificados como derivados
acilados (R-CO-): quercitin-3-diglucósido-7-diglucósido (Rt= 12.3) y quercitina-7-glucósido
(Rt=18.0). En hidrólisis ácida, el kaempferol-3-diglucósido-7-glucósido (Rt=15.5), produjo
kaempferol, aglicona y componentes de hidrólisis parcial: kaempferol-7-glucósido (Rt=38.1),
kampferol-3-diglucósido (Rt=34.9) y otros diglucósidos de kampferol. Con la hidrólisis
alcalina se obtuvieron flavonoides glicosilados que coinciden con kaempferol-3-diglucósido
(Rt=34.9). Conclusión: Las inflorescencias de Brassica oleracea L. var. Botrytis “coliflor”
contienen fitoconstiuyentes como: glucosinolatos, esteroides, saponinas, taninos y
flavonoides, caracterizados como kaempherol y quercitina glucosilados, siendo la quercitina
el flavonoide que se presenta en altas cantidades.

Palabras Clave: Brassica oleracea L. var. Botrytis; fitoconstituyentes; HPLC; flavonoides


glicosilados; quercitina.

ABSTRACT
Objective: To identify and characterize phytoconstituents flavonoids in the inflorescence of
Brassica oleracea L. var. Botrytis "Cauliflower" by High performance liquid chromatography
and Mass spectrometry. Biological material: Cauliflower collected in Simbal-Trujillo.
Method: Qualitative identification of phytoconstituents present in the inflorescence by
separation with increasing polarity solvents (ether, ethanol and water) by high performance
liquid chromatography (HPLC) and mass spectra (MS / MS), characterization was performed
on the products of flavonoids obtained after acid and alkaline hydrolysis. Results: The
cauliflower inflorescences presented secondary metabolites as glucosinolates, steroids,
saponins, tannins and flavonoids. In the analysis of HPLC-MS / MS was obtained retention
time (Rt) of glycosylated flavonoids, identified as acylated derivatives ( R- CO-): Quercetin -

1
Docente del Departamento de Bioquímica. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad Nacional de
Trujillo – Perú.
2
Departamento de Farmacología. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad Nacional de Trujillo – Perú.
*Autor para correspondencia: agonzalez@unitru.edu.pe
4
González A. y Sabana C. Pharmaciencia. Vol. 03, Núm. 01 (2015):4–10

3 - diglucoside -7 - diglucoside ( Rt = 12.3 ) and quercetin -7 - glucoside ( Rt = 18.0 ) . In acid


hydrolysis, kaempferol -3 - diglucoside -7 - glucoside ( Rt = 15.5) , produced kaempferol ,
aglycone and partial hydrolysis components as kaempferol -7 - glucoside ( Rt = 38.1 ) ,
kaempferol -3 - diglucoside (Rt = 34.9 ) and other di- kaempferol . With alkaline hydrolysis
was obtained glycosylated flavonoids kaempferol -3 - diglucoside ( Rt = 34.9 ). Conclusion:
The inflorescence of Brassica oleracea L. var. Botrytis "cauliflower" contains secondary
metabolites as glucosinolates, steroids, saponins, tannins and flavonoids that were
characterized as kaempherol and glucosyl quercetin being quercetin flavonoid presented in
high amounts.

Key words: Brassica oleracea L.var. Botrytis, phytoconstituents, flavonoids glycosylated,


quercitin, HPLC-MS/MS.

INTRODUCCIÓN Estudios recientes han demostrado las


Las plantas desde la antigüedad han actividades biológicas relevantes de
sido un recurso al alcance del ser humano compuestos fenólicos con actividad
para su alimentación y curaciones de sus antioxidante y lo relacionan con su
enfermedades, estas últimas denominadas estructura química que les confiere
plantas medicinales. Es frecuente, utilizar la propiedades redox6. Ellos pueden intervenir
tradición y el conocimiento acumulado en la adsorción y neutralización de especies
durante generaciones, de algunas plantas reactivas de oxígeno (ROS), como
para justificar la inocuidad y su efecto en el mecanismos de defensa contra infección y
organismo1. el daño oxidativo, sin embargo la
Las plantas producen diversos tipos de generación excesiva de ROS pueden dañar
compuestos que se han clasificado en dos el tejido o moléculas intracelulares, que
grandes grupos: metabolitos primarios, conducen a la acumulación de peróxidos de
encargados de los procesos de fotosíntesis, lípidos. Este estrés oxidativo se ha
respiración, transporte de solutos, relacionado al cáncer, el envejecimiento, la
translocación, asimilación de nutrientes y aterosclerosis, la inflamación y las
diferenciación. A este grupo pertenecen la enfermedades neurodegenerativas7.
clorofila, los aminoácidos, nucleótidos, Por su acción protectora y la
carbohidratos simples y lípidos de incapacidad del organismo humano de
membrana; y los metabolitos secundarios, producir los flavonoides, estos merecerían
los cuales no parecen tener una función ser incorporados al grupo de nutrientes
directa en el crecimiento y desarrollo de la esenciales. Se ha manifestado que la
planta y presentan una distribución coliflor, una variedad de la especie Brassica
restringida en el reino vegetal, terpenos, oleracea L. en el grupo Botrytis, contiene
compuestos fenólicos y compuestos flavonoides con propiedades antioxidantes8,
nitrogenados pertenecen a este grupo 2 anti-inflamatorias9 y anti-cancerígenas10,
En la actualidad, a varios productos importantes en la prevención de muchas
naturales, se les atribuye propiedades enfermedades ya sea cardiovasculares,
medicinales; por ejemplo, algunas oncológicas etc 3.
investigaciones manifiestan que se previene Sin embargo, los metabolitos
el cáncer con la mayor ingesta de verduras secundarios, entre ellos, los flavonoides, no
crucíferas, como coliflor, repollo y brócoli, están aún bien caracterizados, y
que son ricas en nutrientes como: comprendidos por los investigadores.
carotenoides, vitaminas C, E, K, B6, B9, Por lo cual, se hace necesario, la
minerales y flavonoides3,4. Estudios identificación de los fitoconstituyentes y los
realizados en ratas inducidas como 1,2- componentes flavonoides presentes en la
dimethylhydrazine, demostraron que el inflorescencia de la coliflor, como una
extracto de “brocóli”, contrarresta el forma de proponer subproductos que con
crecimiento y la proliferación celular, y sustento científico se le atribuya propiedades
previene la pérdida de peso corporal 5.

5
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medicinales en beneficio de las personas. var. Botrytis “coliflor”: Protocolo


Por lo expuesto, se planteó, lo siguiente: reportado por Ruiz-Reyes13.
¿Cuáles son los fitoconstituyentes y Fueron pulverizadas 100 g de
flavonoides caracterizados por HPLC- inflorescencias y colocadas en un cartucho
MS/MS que contiene la inflorescencia de de un equipo Soxhlet que contienen la
Brassica oleracea L. var. Botrytis “coliflor”? mezcla Etanol/ácido sulfúrico 10% v/v en
la proporción 1:1 durante 52 horas, y la
OBJETIVOS mezcla obtenida fue colocada en Baño
1. Identificar los fitoconstituyentes María para volatizar el etanol,
presentes en la inflorescencia de Brassica obteniéndose un extracto acuoso-ácido
oleracea L. var Botrytis “coliflor” por que fue refrigerado a 10°C por 24 horas.
separación con solventes de polaridad Luego, el extracto fue filtrado al vacío y
creciente. lavado con agua helada, midiendo el pH
2. Caracterizar los flavonoides en la hasta casi neutro; obteniéndose un
inflorescencia de Brassica oleracea L. precipitado, libre de azúcares.
var Botrytis “coliflor” por HPLC- El precipitado obtenido fue
MS/MS. purificado, colocándolo en un papel de
filtro, desecado en la estufa a 37 °C por 24
MATERIAL Y MÉTODO horas y solubilizado en etanol caliente de
Objeto de estudio: 96° Gay Lussac a 50°C con 100 ml de
 M. Vegetal: Brassica oleracea L. var. agua destilada; obteniéndose los
Botrytis “coliflor” procedentes del C.P. flavonoides, proceso que se repite por tres
Pedregal-Simbal, e identificadas según la veces. Los flavonoides recristalizados y
taxonomía reportado por Mostacero-León purificados se almacenaron en un frasco
et al. 11. de color ámbar para su protección de la
luz solar.
Medios:
 Caracterización de los flavonoides:
 De Vidrio: Uso común Laboratorio de
Fundamento: Fue realizado por
Farmacognosia y Química.
cromatografía líquida de alta resolución
 Aparataje: Uso común Laboratorio de
en fase reversa a temperatura ambiente y
Farmacognosia y Química Orgánica.
con una gradiente de solventes acoplada a
Para el HPLC, se usó la columna Athena
espectrometría de masas en línea con
C18 250X 4.6, a temperatura de 35°C,
fuente de ionización (HPLC-MS/MS), en
cuya relación en la fase móvil fue 55: 45
los productos obtenidos después de una
% v/v. Series 200 UV/Vis PDA.
hidrólisis alcalina o ácida, midiendo el
 Reactivos: fueron usados de grado tiempo de retención y según las
analítico. transiciones de los pesos moleculares sin
Métodos y técnicas: Tratamiento del vegetal fragmentar y fragmentados de cada
Brassica oleracea L. var. Botrytis compuesto, utilizando el método
 Identificación de metabolitos: Se pesaron reportado por Vallejo et al.14 y Gratacós-
1000 g de inflorescencia cruda de Cubarsí et al 15 .
coliflor, con características organolépticas 
óptimas, se lavaron y secaron a Procedimiento: Se pesaron 100 g de las
temperatura ambiente por 24 horas; luego inflorescencias de Brassica oleracea L.
fueron desecas a 40°C en la estufa. La var. Botrytis “coliflor”, se congelaron a -
identificación de los metabolitos fue 70 ◦C, se liofilizaron y molieron hasta
basada en la separación con solventes de polvo fino, almacenándose a -20 ◦C para
polaridad creciente (éter, etanol y agua) y su posterior análisis.
la identificación cualitativa con reactivos Se pesaron 70 g de muestra, y se
de coloración y precipitación12. extrajeron los subproductos por ebullición
 Obtención de flavonoides en las con 3 L de agua destilada durante 60 min.
inflorescencias de Brassica oleracea L. A continuación, este extracto acuoso se
mezcla con partículas Amberlite XAD-2,
6
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en cantidad suficiente para llenar una HCl concentrado (cambio de color


columna de 55 cm x 4 cm, agitándose concentrada hasta pH 1-2) y directamente
durante 4 h a temperatura ambiente para analizado por HPLC -DAD -MS / MS.
retener los compuestos fenólicos en la  Hidrólisis Acida: La solución
superficie de las partículas Amberlite no anteriormente obtenido por hidrólisis
iónicas. Las partículas Amberlite fueron ácida parcial se mantuvo en un tubo de
empaquetados en una columna de ensayo tapado a 75°C por 30 minutos, y
cromatografía, se lavó con agua destilada analizada por HPLC -DAD -MS / MS. La
(5 L), y los compuestos fenólicos hidrólisis ácida total se llevó a cabo
absorbidos fueron eluídos con metanol (1 mediante la adición de 1 ml de HCL 4N a
L). El extracto de metanol se llevó a 1 ml de la solución de metanol de los
sequedad y se volvió a disolver en diferentes productos aislados (v/v), en un
metanol/agua (1:1v/v) para la tubo de ensayo con tapón a 90°C durante
cromatografía en una columna Sephadex 45 minutos Los productos de la hidrólisis
LH- 20 (40 cm×3 cm), a una temperatura fueron analizados por directamente
de 35°C. La elución de las diferentes analizados por HPLC -DAD -MS / MS.
fracciones fenólicas fue seguido bajo luz  Estudio de la hidrólisis de los productos:
UV (254 y 360 nm). Las primeras Los diferentes ácidos orgánicos liberados
fracciones de elución contenían las después de la hidrólisis se identificaron
moléculas más grandes de flavonoides, por HPLC - DAD- MS comparándolos
seguidos por los de compuesto intermedio con patrones. Los azúcares se
tamaño, y terminando con los compuestos identificaron mediante TLC utilizando
naturales más pequeños. Las fracciones diferentes azúcares como normas. Las
eluidas fueron cromatografiadas por agliconas de flavonoides fueron
HPLC semipreparativa para aislar los identificados por medios espectroscópicos
diferentes constituyentes. Esto se realizó Análisis UV, utilizando alcalinos y
en una columna 25 x 1cm Lx i.d., de 5 metales reactivos y HPLC -DAD -MS.
micras Spherisorb ODS–2,  HPLC-DAD-MS / MS ESI: El sistema
isocráticamente, con diferentes mezclas de utilizado para los análisis cualitativos fue
metanol/agua. La pureza de los HPLC Agilent equipado con un detector
compuestos aislados fue seguido por de arreglo de diodos y detector de masas
HPLC analítica, usando una columna C18 en serie (Agilent Technologies,
de 25x0.4 cm i.d., 5 micras LiChroCART Waldbronn, Alemania). La HPLC
(Merck, Darmstadt, Germany) y agua consistió en una bomba binaria (G1312A),
como fases móviles + 5 % HCOOH (A) y un muestreador automático (G1313A), un
metanol (B ) con un flujo del caudal de1 desgasificador (G1322A), y un detector de
mL/min , comenzando con 10 % de B matriz de fotodiodos (G1315B). El
hasta alcanzar el 20% B después de 25 sistema de HPLC fue controlado por un
min, 50 % B en las 40 min, 50 % B en 45 software ChemStation (Agilent, v. 08,03).
min, 90 % B en 46 min y 90 % B en 50 La masa detector fue un espectrómetro de
min. trampa de iones (G2445A) con sistema de
Los Cromatogramas UV se registraron a ionización por electro spray y fue
330 nm. Los compuestos aislados se controlado con el software LCMSD
secaron por congelación para su (Agilent, v. 4.1). Las condiciones de
almacenamiento. ionización se ajustaron a 350 °C y 4 kV
 Hidrólisis Alcalina: La hidrólisis alcalina, para la temperatura y el voltaje capilar,
se realizó mediante la adición de 1 ml de respectivamente. La presión nebulizadora
NaOH 4N al extracto fenólico purificado y el nivel de flujo de nitrógeno fueron
(1 ml) y se mantuvo la mezcla durante 16 65,0 psi y 11 L/ min respectivamente. El
h a temperatura ambiente, en un tubo de análisis de masa completa varió de 200-
ensayo con tapón en atmósfera de N2. 2000 m/z. Se utilizó helio como gas de
Después de este paso, los productos de colisión para los experimentos de
hidrólisis alcalinas se acidificaron con fragmentación y la energía de colisión se
7
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ajustó al 100 %. Todos los datos de Tabla 2. Caracterización e Identificación de los


espectrometría de masas fueron flavonoides obtenidos de la inflorescencia de
registraron en el modo negativo. Brassica oleracea L.var. Botrytis “coliflor”
Total de cromatogramas de iones eran
registran como eventos de análisis Estructura del Rt [M-H]- MS2 [M- MS3 [M-
UV (nm) H]- (m/z) H]- (m/z)
automático de dos alternantes: masa Flavonoide (min) (m/z)
Quercitina-3-
análisis completo espectros (MS) y MS / diglucosido-7- 12.3 255, 266Sh, 354 787 625 462
MS para la fragmentación de los más diglucósido a
abundantes iones pseudomoleculares. Kaempferol-3-
diglucosido-7- 15.5 267,293sh,348 771 610 429
 Análisis cualitativos por espectroscopía diglucósidoa
de masas de los compuestos aislados: Quercitina-7-
18.0 252,269sh,301sh 993 831 625
Como detector de masa se utilizó un glucósido b
espectrómetro Agilent con trampa de Kaempferol -3-
34.9 268, 298sh 609 429 284
iones (Agilent Technologies, Waldbronn, diglucósido b
Kaempferol -7-
Alemania). El análisis de Espectroscopía glucósido b 38.1 265, 255sh 447 285
de Masas en los compuestos aislados fue
Fuente: Datos obtenido por el autor
realizado por infusión constante de un
sistema de ionización por electrospray. Rt: Tiempo de Retención
Los compuestos aislados se disolvieron en a Flavonoides glicosilados identificados por
agua/metanol (50:50, v/v). La velocidad HPLC-MS/MS
de flujo de la infusión constante era 10 b Productos obtenidos después de una hidrólisis
L/min. La tensión capilar y la temperatura ácida o alcalina por HPLC.
fueron 4 kV y 300 °C, respectivamente.
La presión del nebulizador fue 15 psi, y el
flujo de nitrógeno fue de 5 L/min. Los
compuestos aislados se sometieron a hasta
cinco eventos de manera secuencial,
dependiendo del peso molecular de los
compuestos (MS) para encontrar iones
pseudomolecular, (MS/MS) y para la
fragmentación del ión pseudomolecular
(MSn, n) hasta 5, en orden a los
principales iones fragmentados obtenidos
en cada paso. Figura 1: Cromatograma HPLC de los flavonoides
obtenidos de Brassica oleracea L.var. Botrytis, se
RESULTADOS muestra la presencia de Quercitina y Kaempferol,
Tabla 1. Identificación de los fitoconstituyentes siendo la quercitina el flavonoide que se encuentra en
presentes en la inflorescencia de Brassica mayor cantidad.
oleracea L. var. Botrytis “coliflor”
DISCUSIÓN
Metabolitos ENSAYO RESULTADO En la tabla 1, se muestra que las
secundarios
Mayer Negativo
inflorescencias de Brassica oleracea L. var.
Alcaloides Dragendorff Negativo Botrytis contienen fitoconstituyentes
Wagner Negativo secundarios como glucosinolatos, esteroides,
Antraquinonas Bortranger Negativo
Esteroides Lieberman- Positivo
saponinas, taninos y flavonoides. Los
Bouchardat glucosinolatos (también llamados
Flavonoides Shinoda Positivo tioglicósidos) son S-glicósidos en los que la
Glucósidos Fehling Positivo
(compuestos
glicona es b-D-tioglucosa y la aglicona es
reductores) una oxima sulfatada, son especialmente
Saponinas Espuma Positivo abundantes en la familia de las crucíferas16.
Taninos FeCl3 Positivo
Gelatina Positivo
Los glucosinolatos que cumplen la función
Fuente: Datos obtenido por el autor de defensa de las plantas son los tioglicósidos
que son derivados del ácido amino17, por

8
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hidrólisis se obtienen compuestos demostrando la presencia de quercitina y


biológicamente activos como isotiocianatos kaempferol, siendo la quercitina el
sulfuranos y tiocianatos16. Una gran variedad flavonoide que se encuentra en mayor
de esteroides, son sintetizados por las cantidad
crucíferas, algunos de ellos poseen función Gratacós-Cubarsí et al, han demostrado
hormonal y otros participan en los mediante la evaluación simultánea de los
mecanismos de defensa frente a la infección glucosinolatos intactos y compuestos
con microorganismos patógenos que fenólicos por UPLC-DAD-MS/MS que la
infectan al hombre o a los animales18. A las coliflor contiene flavonoides como:
saponinas se le atribuye propiedades quercetina-3-diglucósido-7-glucósido,
detergentes 7 y los taninos son compuestos kaempferol-3-diglucósido-7-glucósido y
fenólicos de sabor áspero y amargo, con kaempferol-3-diglucósido-7-diglucósido15.
propiedades astringentes2. Conclusión: El extracto obtenido de la
Los flavonoides representan la mayor inflorescencias de Brassica oleracea L. var.
clase de polifenoles y se sintetizan por la ruta Botrytis contiene fitoconstituyentes
del ácido shikímico 7, los cuales se le secundarios como glucosinolatos, esteroides,
atribuye propiedades antioxidantes, saponinas, taninos y flavonoides que al
antiinflamatorias, antitrombóticas, caracterizarlos por HPLC-MS/MS se
antimicrobianas, antialérgicas y encontró la presencia de kaempherol y
19
antitumorales . quercitina glucosilados; a los cuales se les
En la tabla 2, se muestra el análisis de podría atribuir las propiedades antioxidante y
los compuestos fenólicos obtenidos de la antitumoral.
inflorescencia de coliflor por HPLC/UV-
DAD, observando su espectro UV, sugiere Conflicto de interés
que son polifenoles glicosilados como No se presentan conflictos de interés.
quercitin-3-diglucósido-7-diglucósido
(Rt=12.3) y kaempferol-3-diglucósido-7- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
glucósido (Rt=15.5), al ser analizados 1. Bruneton J. Plantas tóxicas vegetales
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que se presenta en altas cantidades. 20.
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(Rt=34.9) y otros diglucósidos de kampferol. 4. Eid N, Walton G, Costabile A, Kuhnle
En la hidrólisis alcalina se produce G, Spencer J. Polyphenols,
flavonoides glicosilados que coinciden con el glucosinolates, dietary fibre and colon
kaempferol-3-diglucósido (Rt=34.9). cancer: Understanding the potential of
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flavonoides encontrados son quercetina y reduce bowel cancer progression.
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En la figura 1, se observa que el 5. Guzmán L, Irigoin S. Efecto de las
cromatograma HPLC de los flavonoides inflorescencias de Brassica oleracea var.
obtenidos en las inflorescencia de la coliflor, Itálica “brocolí” sobre cáncer de colon
9
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para ingreso a la Docencia en la Facultad
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