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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE CIENCIA BIOLOGICAS

GUIA DE PRÁCTICA

CURSO BIOLOGÍA MOLECULAR

Profesores Participantes:
Elena Arbaiza P.
Desiderio Cotos
Fanny Lazo M.
Carmen Pantigoso
Edith Rodríguez Q.
Gustavo Sandoval P.
Giovanna Sotil C.
Dan Vivas R.
Armando Yarlequé Ch.

Lima Perú
2018

Práá cticás de Biologíáá Moleculár – Semestre 2018-II

INDICE

PRACTICAS:
1. EXTRACCIÓN DE ADN
2. CARACTERIZACIÓN DEL ADN
3. ANÁLISIS BIOINFORMATICO DE SECUENCIAS
NUCLEOTIDICAS
4. AMPLIFICACION DE ADN MEDIANTE PCR
5. ÁNALISIS ELECTROFORETICO DEL ADN
6. ÁNALISIS BIOINFORMATICO DE SECUENCIAS PEPTIDICAS
7. DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEINAS
8. SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS POR CROMATOGRAFIA DE
FILTRACIÓN
9. SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS POR CROMATOGRAFIA DE
INTERCAMBIO IÓNICO
10. ANÁLISIS ELECTROFORETICO DE PROTEÍNAS
11. SEMINARIO : Mecanismo de Reparación del ADN
12. SEMINARIO : Estructura y Función Viral
13. SEMINARIO :Mecanismos de Señalización en la Apoptosis y
Cáncer
Práá cticás de Biologíáá Moleculár – Semestre 2018-II

PRACTICA N° 1

EXTRACCION DE ADN
1. MARCO TEÓRICO

Las características fisiológicas y bioquímicas de todo ser vivo están contenidas en sus respectivos
genomas. Los genomas de bacterias, hongos, plantas, animales y algunos virus están compuestos por
moléculas de ácido desoxirribonucleico: ADN, es una estructura química cuyas unidades
monomericas los nucleótidos se organizan de manera lineal generándose secuencias de información.
Las moléculas de ADN son de alto peso molecular, de modo que un peso molecular de un millón
corresponde aproximadamente a 1.5 kb.

La forma extremadamente alargada del dúplex de ADN junto a su rigidez lo hace muy susceptible
del daño mecánico fuera de protección de la célula, las fuerzas hidrodinámicas que se generan por
manipulaciones como la agitación y pipeteo rompen el ADN en pedazos relativamente pequeños,
por lo que el aislamiento de una molécula intacta de ADN requiere una manipulación cuidadosa.
Es conveniente entonces emplear métodos que permitan en una primera etapa, la separación de los
numerosos componentes celulares y luego aislarlo de las proteínas que principalmente en células
eucarióticas son sus acompañantes.

Con tal motivo, el método de extracción de ADN que utiliza cloroformo:alcohol isoamílico es
el más practico e idóneo pues no solo permitirá mantener la estructura de esta macromolécula sino
que su obtención será observable mediante la aparición de fibras típicas al adicionarse etanol.
Teniendo en cuenta la practicidad del método, es necesario indicar que el procedimiento
requiere una manipulación apropiada del material en estudio y además la inhibición de las nucleasas
que pueden degradarlo rápidamente. Esto se consigue, en el primer caso, mediante un mezclado
suave del extracto y en el segundo, agregando agentes quelantes que bloqueen la actividad de estas
enzimas.
Como se sabe el ADN es una doble hebra helicoidal constituida por bases nitrogenadas
(ATGC), la pentosa denominada desoxirribosa y una molécula de ácido fosfórico. Estos componentes
pueden ser reconocidos utilizando reactivos químicos específicos con la ayuda de la
espectrofotometría.
Para ello se requiere efectuar una hidrólisis ácida en la macromolécula o someterlo a la acción
enzimática de las nucleasas de acuerdo con los requerimientos analíticos que se establezcan. Aunque
no es un requisito indispensable para los ensayos antes propuestos, es conveniente averiguar
previamente si el ADN que vamos a examinar se encuentra en estado nativo o denaturado. Además es
conveniente acercarse al conocimiento de su grado de pureza determinándose para ello su probable
contaminación con las proteínas.
Se puede deducir entonces que el análisis de ADN es un proceso secuenciado que depende
fundamentalmente del modo en que fue extraído del contenido celular.

2. OBJETIVO
- Extraer ADN a partir de un tejido animal y vegetal.
- Determinar la absorción UV de algunas bases nitrogenadas comerciales

3. MATERIALES

- 10 g de Pisum sativum congelado - Embudos


- 2 muestras de Argopecten purpuratus - Morteros
- Sodio dodecil sulfato al 25% (SDS) - Erlenmeyer y beakers de 150ml
- Cloroformo : Alcohol isoamílico (24:1) - Gasa estéril ( 4 sobres)
- Etanol 96° frío ó isopropanol frío ( - Varillas de vidrio delgadas (4)
- Solución salina-EDTA (Sol. A ) - Centrífuga
- Solución de bases nitrogenadas (0,05M) - Espectrofotómetro
- Solución de lisis (Sol. L) - Tubos cónicos graduados
- Solución salina concentrada (Sol. B) - 5 Pipeta pasteur (plástico graduada)
- Solución de salina citratada (sol.C) - Gradilla, plumón marcador
- Tubos 13x100 (4). –Papel milimetrado
-Tubos 16x100 (6) – Papel toalla
- Guantes - Bisturí, pinza delgada, tijera de disección.
- Calculadora

Materiales por mesa de trabajo: los marcados en negrita (5- alumnos por
mesa.)

4. PROCEDIMIENTO

4.1 Espectro de Absorción de Bases Nitrogenadas: Adenina, Citosina y Guanina


–––––––––––––––––––––––––––––––––––
Muestra B 1 2 3
–––––––––––––––– –––––––––––––––––––
Adenina ---- 0,2 ---- ----
Citosina ---- ----- 0,2 ----
Guanina ---- ---- ---- 0,2
Uracilo ----- ----- ----- ----
Agua destilada 3,0 2,8 2,8 2,8
––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Registrar absorbancias de cada una de las muestras en el rango de 235- 280nm (cada 5
unidades).
Graficar en papel milimetrado el espectro de absorción de cada base.
Determinar su λ máximo de absorción; y hallar el margen de error considerando sus λ
teóricos.

4.2. Extracción del DNA de Argopecten purpuratus

1- Colocar en un mortero 0,8 -1 g. de tejido gonadal e incorporar 5 ml de solución A ,


homogenizar la muestra y pasarlo a un tubo cónico para centrifugar a 2000 rpm/5min.

2- El precipitado resuspenderlo en 10 ml de solución A para luego transvasarlo a un


erlemmeyer y adicionar 0,5 ml de SDS, agitar durante 10 min. Incorporar 2,5 ml de
solución B; continuar con la agitación durante 10min.
3- Agregar a la mezcla 13ml de cloroformo – alcohol isoamílico (24:1), tapar el recipiente
y continuar la agitación durante 30min retirando la tapa cada cierto tiempo para eliminar
los vapores del solvente. Centrifugar a 6000 rpm/20min.

4- Separar la fase acuosa superior con ayuda de una pipeta (aprox. 6ml) y colocarla en un
beaker pequeño, adicionar 2 volúmenes de etanol frío e introducir la varilla de vidrio
realizando con ella movimientos circulares para permitir la adhesión de fibras de ADN a
la varilla.

5- Colocar las fibras en un tubo de 16x150 conteniendo solución C (5mL) para su


resuspensión.

6- Dejar el tubo a temperatura ambiente (rotulado y tapado) para su evaluación en la


siguiente práctica.

4.3 Extracción del DNA de Pisum sativum

1- Homogeneizar en el mortero 8g de la muestra congelada en 20 ml de solución L


( No más de 5 minutos).
2- Trasvasar el homogenizado a un beaker e incubarlo a 58°C por 15 min para lisar al
máximo las membranas y liberar al ADN.

3- Colocar el beaker en frío por 10 min.

4- Filtrar la solución utilizando gasa estéril


5- Precipitar el DNA de la solución recuperada empleando 2 volúmenes de etanol ó
isopropanol frío para ello la incorporación del alcohol debe realizarse en forma lenta por
las paredes del beaker. En la fase superior estará el alcohol y en la interfase con la
solución acuosa se observará el ADN en forma de filamentos los que serán recuperados
con ayuda de una bagueta delgada girando en sentido horario.

6- La muestra presente en la bagueta transferirla a un tubo 16x150mm conteniendo


solución C (5mL) para su resuspensión.

7- Dejar el tubo a temperatura ambiente (rotulado y tapado) para su evaluación en la


siguiente práctica.

5. PROBLEMAS:
1- Una muestra de ADN purificado de E. coli contiene 13.1% de la base adenina. Cuáles son los
porcentajes de los otras bases?

2- El ADN del bacteriófago M13 tiene la siguiente composición de bases: 23% A, 36% T, 21% G,
20% C. ¿Qué puede deducir del ADN de este fago?

3- Calcular la longitud de un duplex de ADN cuyo peso molecular es de 3x10 7. Cuál es el volumen
ocupado por una molécula de ese ADN. Cuantas vueltas helicoidales contiene ese ADN.
4- El peso molecular del ADN del bacteriofago T4 de doble cadena es 1.3x10 8 a) cuantos
aminoácidos puede ser codificado por ADN de T4 b) Cuantas proteínas diferentes de peso molecular
55,000 puede ser codificado por ADN T4.

5- El ARN ribosomal 23s de E. coli tiene un peso molecular de 1.1x106. Aproximadamente 0.3% del
ADN total de E. coli hibridiza con el ARNr 23s. El peso molecular de ADN de E. coli es 2.2x109
(cromosoma). Cuantas copias del gen de RNAr tiene el cromosoma de E. coli?

Prof. Edith Rodríguez