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FILIAL LA MERCED

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

E. F. P. EN ING

ENIERIA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

PRACTICA N° 01

RECUENTO DE MOHOS y LEVADURAS

CATEDRA:

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

CATEDRA:

Blgo: IBAÑEZ OJEDA, Julio

ALUMNO:

MUÑOZ CISNEROS, Diana

SEMESTRE :

“VI”

LA MERCED – CHANCHAMAYO

2018
RECUENTO DE MOHOS y LEVADURAS

I. INTRODUCCIÓN

Se estima que existe más de un millón de especies de hongos en el planeta, pero tan sólo
unas 70,000 de ellas han sido descritas por los especialistas, lo cual hace evidente la
necesidad de contar con más científicos (micólogos o micetólogos) que estudien estos
organismos. Mientras tanto, muchas especies de hongos se han extinguido y otras se
encuentran amenazadas en todo el mundo. Esto es particularmente cierto en países
tropicales ricos en diversidad biológica como Colombia.

Los hongos tienen distintos hábitos de vida. Los hongos saprófitos, es decir
descomponedores de materia orgánica, cumplen una función ecológica de la mayor
relevancia pues garantizan el reciclaje de la materia muerta y, por lo tanto, la recirculación
de sustancias nutritivas en los ecosistemas. Los hongos parásitos, que viven sobre o dentro
de otros seres vivos, obtienen su alimento de éstos y llegan a producir enfermedad en su
hospedero. Los hongos simbiontes que se asocian de manera mutualista con otros
organismos constituyen alianzas vivas de beneficio mutuo como por ejemplo los líquenes
(asociación de hongo y alga) y las micorrizas (asociación de hongo y raíz de una planta),
simbiosis estas de gran importancia en la naturaleza en procesos de colonización de hábitats
y de circulación de nutrientes.

En tal sentido, los hongos y levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en la


naturaleza y pueden ser encontrados como parte de la flora normal de un alimento, de un
equipo inadecuadamente sanitizado o como contaminantes del aire. Ciertas levaduras y
hongos son utilizados en la manufactura de varios alimentos, tal es el caso de algunos
quesos madurados. Sin embargo, ellos también pueden ser responsables del deterioro de
muchos alimentos. Otros pueden ocasionar problema a través de la síntesis de metabolitos
tóxicos resistentes al calor, a la congelación, a los antibióticos o a la irradiación. Asimismo,
pueden dar lugar a la formación de olores y sabores desagradables y decoloración de la
superficie del alimento.
OBJETIVO
El objetivo que persigue la práctica siguiente es:

 Conocer los diversos géneros de mohos y levaduras asociados a los alimentos de consumo
humano, a través del uso del microscopio óptico y en medios de cultivo.
 Determinar el recuento de mohos y levaduras en muestra de alimentos llevadas a medios
de cultivos.
 Comparar las diversas muestras biológicas de hongos encontrados en los alimentos con las
gráficas presentes en la bibliografía y determinar el género correspondiente.

II. REACTIVOS y MATERIALES:


- Muestra: Alimentos contaminados con hongos (frutas, hortalizas, granos, etc)
 Microscopio Compuesto
 Láminas porta y cubre objeto
 Agua destilada
 Agar Papa Dextrosa (PDA), Agar Saboraund, Agar Caso, Agar Glucosa Oxitetraciclina
(OGA), Agar Diclorán Rosa de Bengala con Cloranfenicol,
Agar Diclorán 18% Glicerol, Agar Cloranfenicol Dextrosa Extracto de Levadura (usar
Solución de Cloranfenicol u Oxitetraciclina al 0,1%.).
 Placas Petri
 Cristal violeta-lactofenol, lacto-fucsina o Azul de Metileno 10%
 Asa Koll , estilete y Espátula de Drigalski
 Tubos de ensayos
 Probetas, pipetas y matraces
 Tubérculos de papa (para preparar PDA).
 Ácido tartárico 10%
 Autoclave
 Reactivos tinción Gram y tinción simple.
 Cocina eléctrica - Aceite de inmersión - Mechero de alcohol.
 PROCEDIMIENTO

B. Siembra por Estrias en Agar PAPA Dextrosa (PDA)


Se puede preparar el PDA a partir de cada uno de los componentes y concentración
correspondientes. El agar Papa - Dextrosa se emplea para la identificación, el cultivo y
recuento de levaduras y hongos en general.
Su composición es:
Infusión de papa*.................. 200 g.
Agar agar...........................15 g.
Dextrosa...............................20g.
Agua destilada…………….. 1,0 lt. * 4,0 gr. de extracto de papa es equivalente a 200 g de
infusión de papas. pH final 5.6

En medios PDA para Preparar:


a. Un tubérculo de papa llevarlo a cocción en una cocina eléctrica
b. Luego, filtrar el tubérculo cocido a través de un tamiz
c. El filtrado deberá pesarse y formular según la composición citada arriba.
d. Seguidamente proceda según los pasos del PDA formulados comercialmente, citado
líneas abajo.

En medios PDA Formulados Comercialmente:


a. La formulación es 39 g/L de agua destilada (según indicaciones del producto). Si se
desea preparar un volumen menor, se saca la proporción correspondiente.
b. Se mezcla bien, agitando frecuentemente.
c. Se esteriliza en autoclave a 121°C a 15 Ibs. de presión durante 15 minutos.
d. Añada 14 ml. de solución esterilizada de ácido tartárico al 10% por cada litro del
medio esterilizado, fundido y enfriado a unos 45°C.
e. Añada de 15 a 20 ml de medio de cultivo esteril a cada placa Petri esteril. Enfriar.
f. Con el asa kool, efectuar siembra en estrías de alguna muestra de alimento
sospechosa.
g. Incubar las placas a 20 - 24ºC, desde 3 a 5 días. Luego observe la morfología de las
colonias.
h. Dibuje y compare resultados según el Método de Reconocimiento Directo.
Siembra por Difusion (en profundidad) e Incubación
a. Pipetear por duplicado a placas Petri estériles alícuotas de 1 mL de la muestra (si es
producto líquido) o 1 mL de la dilución 10-1 (en el caso de otros productos) (Figura 1-
1).
b. Tomar otras dos placas de Petri estériles. Transferir a cada placa utilizando otra pipeta
estéril, 1 mL de la dilución 10-1 (en el caso de muestras líquidas) o 1mL de la dilución
10-2 (en el caso de otros productos).
c. Si es necesario, repetir la operación utilizando diluciones decimales mayores.
d. Agregar 15 a 20 mL de agar fundido y temperado entre 47ºC ± 2ºC. Evitar verter el
medio directamente sobre el inóculo.
e. Mezclar el inóculo con el medio fundido, inclinando y girando las placas. Se efectua de
la siguiente forma: Mover la placa con movimientos de vaivén 5 veces en una dirección,
hacerla girar 5 veces en el sentido de las agujas del reloj, mover con movimientos de
vaivén en una dirección que forme ángulo recto con la primera y hacerla girar 5 veces
en el sentido contrario a las agujas del reloj.
f. Una vez solidificado el agar, NO INVERTIR las placas.
g. Incubar a 22 - 25ºC durante 3 a 5 días.

Recuento y selección de las colonias


a. Después de la incubación, examinar las placas (Figura 1-1):
- Colonias típicas de hongos filamentosos: colonias de aspecto algodonoso de diverso
tamaño y color. Se desarrollan más tardiamente que las levaduras.
- Colonias típicas de levaduras: colonias convexas, suelen ser brillantes y de color
crema o rosa pálido. Se presentan en forma de colonias opacas, blancas o amarillas.
Realizar Tinción de Gram o microscopía al fresco para las colonias sospechosas de
levaduras para confirmar su presencia. Levaduras son Gram positivas (color azul).
b. Seleccionar sólo las placas que contiene por lo menos 10 y no más de 150 colonias.
c. Si parte de las placas está cubierta por mohos, o si es difícil el recuento de colonias
aisladas, contar las colonias de las placas de la siguiente dilución, aunque su número
sea menor que 10.
d. No contar las placas antes de 3 días de incubación, la manipulación podría provocar
colonias secundarias por dispersión de esporas.
e. El contaje debe hacerse por separado, levaduras como mohos.

Expresión de los resultados


a. Calcular el número de Unidades Formadoras de Colonias por gramo o mililitro
(UFC/mL o g.), según la siguiente expresión:

Donde:
N = Numero de UFC/mL o UFC/g.

ΣC = Suma de todas las colonias contadas en todas las placas de las dos diluciones
consecutivas. n1 = Numero de placas contadas en la primera dilución (menor
dilución) n2 = Numero de placas contadas en la segunda dilución (dilución
consecutiva) d = Nivel de dilución correspondiente a la primera dilución.

b. En el caso de que haya más de dos diluciones cuyo recuento se encuentre entre 10 y 150
colonias la fórmula deberá ser modificada teniendo en cuenta la dilución adicional. Para
tres diluciones la fórmula es:

n3: es el número
de placas seleccionadas de la tercera dilución que tienen entre 10 y 150 colonias.

c. El resultado calculado se redondea a dos cifras significativas.


d. Cuando se realiza la operación, si la tercera cifra es inferior a 5, no se modifica la cifra
anterior; si la tercera cifra es igual ó superior a 5, la cifra anterior se incrementa en una
unidad.
e. El resultado se expresa como UFC de mohos y/o levaduras por ml ó por gr del producto,
tomando como resultado un número entre 1.0 y 9.9 multiplicado por la potencia de 10
adecuada.
Ejemplo:
- Para la primera dilución seleccionada (10-2), 83 y 97 colonias.
- Para la segunda dilución seleccionada (10-3), 33 y 28 colonias.

f. Redondeando los resultados: a dos cifras significativas. Si el tercer dígito es 6, 7, 8 o 9


adicionar una unidad al segundo dígito. Si el tercer dígito es 1, 2, 3 o 4 considerar
solamente los dos primeros dígitos. Cuando el tercer dígito es 5, agregar una unidad al
segundo dígito si este es impar y mantener el segundo dígito si este es par. Usar ceros
para los demás dígitos hacia la derecha.
g. En el ejemplo dado se expresa de la siguiente manera: 11.000 ó 1.1 x 104 UFC de mohos
y/o levaduras por gr ó ml del producto.
h. Si todas las placas de ambas diluciones no presentan crecimiento o desarrollo, informar
como menor de uno por el valor recíproco de la dilución menor por g o mL.< 1 x 1/ dm
, donde dm = menor dilución
i. Si las dos placas correspondientes a la muestra analizada (producto líquido) ó a la
suspensión inicial (otros productos) contienen menos de 10 colonias, se informa el
resultado de la siguiente manera:
- Menor a 10 UFC de mohos y/o levaduras por ml. (productos líquidos).
- Menor a 10 x 1/d UFC de mohos y/o levaduras por gr (otros productos), siendo
d el factor de dilución de la suspensión inicial.
j. Si sólo hay placas conteniendo más de 150 colonias se realiza un recuento estimativo
de las placas que contienen alrededor de 150 colonias y se multiplica el número
estimado por la recíproca del valor que corresponde a la dilución más alta. Se expresa
el resultado como ―número estimado de UFC de mohos y/o levaduras por gr ó por ml
del producto‖.
III. RESULTADOS Y DISCUSION:
PASOS:
1º Antes de empezar la práctica debemos contar nuestra indumentaria completa, luego
esterilizar los cosas que se utilizara debemos contar con mechero y alcohol esterilizar
siempre todo lo que vas utilizando. Después procedimos a pesar y medir los reactivos que
se utilizara y tapar con el papel aluminio y papel kraft todos los materiales que se llevara
a esterilizar en autoclave a 121ºC a 15lb.
2º Realizamos los siguientes controles:
- Cuando llega a 30ºC la válvula se abre.
- Cuando llega a 90ºC se cierra.
- Luego cierro el control de presión.
- Se espera llegar a 121ºC en el termómetro y 15 lb de presión durante 15 minutos.
- Y pasado el tiempo se abre la llave para que salga el vapor y presión llegue a 0.

 PESADO DE LAS MUESTRAS.


Infusión de papa*.................. 200 gr. papa dextrosa
 200 gr. …. 1000 ml - 65gr. ……..1000 ml
x……….100 ml x………. 150 ml
X= 20gr. X = 9,75
Agar agar...........................15 g.
 15 gr. ……. 1000 ml
x…………..100 ml
X= 1,5 gr.
Dextrosa...............................20g.
 20 gr ……. 1000 ml
X ……. 100 ml
X= 2 gr.

20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml

30 de merma
6 x 20 = 120 + 30 = 150 ml de agua de agar
1,5 de Agar
2 gr. de dextrosa

20 gr. de papa 150 ml de agua


en cuadritos

0,12 pectona
9.75 gr. de 100 ml de agua 120 ml de agua
papa
dextrosa
En medios PDA para Preparar:
e. Un tubérculo de papa llevarlo a cocción en una cocina eléctrica
f. Luego, filtrar el tubérculo cocido a través de un tamiz
g. El filtrado deberá pesarse y formular según la composición citada arriba.
h. Seguidamente proceda según los pasos del PDA formulados comercialmente, citado
líneas abajo.

En medios PDA Formulados Comercialmente:


i. La formulación es 39 g/L de agua destilada (según indicaciones del producto). Si se
desea preparar un volumen menor, se saca la proporción correspondiente.
j. Se mezcla bien, agitando frecuentemente.
k. Se esteriliza en autoclave a 121°C a 15 Ibs. de presión durante 15 minutos.
l. Añada 14 ml. de solución esterilizada de ácido tartárico al 10% por cada litro del
medio esterilizado, fundido y enfriado a unos 45°C.
m. Añada de 15 a 20 ml de medio de cultivo esteril a cada placa Petri esteril. Enfriar.
n. Con el asa kool, efectuar siembra en estrías de alguna muestra de alimento
sospechosa.
o. Incubar las placas a 20 - 24ºC, desde 3 a 5 días. Luego observe la morfología de las
colonias.
p. Dibuje y compare resultados según el Método de Reconocimiento Directo.
IV. CONCLUSIONES
V. BIBLIOGRAFIA
VI. ANEXOS
VII. CUESTIONARIO
1. ¿Qué diferencias morfológicas existen entre mohos, levaduras y falsas levaduras?
2. ¿Cuáles son las variedades de reproducción que tienen los hongos? Detalle.
3. ¿Qué diferencias existen entre hongos saprofitos y parásitos?
4. Mencione Ud. 5 ejemplos de hongos que tienen interés alimentario directo.
5. Describa Ud. las diversas micotoxina que producen los hongos, así como el efecto
que ocasionan al hombre a través de los alimentos.
Figura 1-1: Recuento Mohos y Levaduras Tecnica Recuento en Placa por Siembra en Profundidad.
Fuente: ISP (2008).