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Cátedra: BIOMATERIALES II Segundo cuatrimestre de 2012

Departamento: Bioingeniería Facultad de Ingeniería


Carrera: Bioingeniería
Universidad Nacional de Entre Ríos (UNER)

INGENIERÍA DE TEJIDOS EN
VÁLVULAS CARDÍACAS
Investigación Bibliográfica

Alumnos: NICOLET, Jonathan José Carlos


SOLARI, Esteban Lucas
Director: Ing. RAMIREZ, Carlos Horacio G.

Carrera: Bioingeniería -U.N.E.R -Fac. de Ingeniería - Oro Verde - Paraná-Entre Ríos - Argentina - Febrero 2014
Nicolet, Jonathan; Solari, Esteban - Ingeniería de tejidos en válvulas cardíacas - 2014 Pág. 2

A. ÍNDICE

A. ÍNDICE...................................................................................................2

B. OBJETIVOS DEL TRABAJO................................................................4

C. ACTIVIDADES.......................................................................................5

D. RESUMEN.............................................................................................9

D. ABSTRACT..........................................................................................11

E. INTRODUCCIÓN..................................................................................12

F. CAPÍTULOS.........................................................................................13
Capítulo 1: VÁLVULAS CARDÍACAS Y PRÓTESIS...................................................13
1.1. Patologías de las válvulas cardíacas................................................................................13
1.2. Condiciones determinantes para el reemplazo de válvulas cardíacas..............................13
1.3. Tipos de prótesis valvulares cardíacas........................................................................14
1.3.1. Prótesis mecánicas........................................................................................................14
1.3.2. Prótesis biológicas......................................................................................................... 16
1.3.3. Prótesis desarrolladas por ingeniería de tejidos (TE).....................................................17
1.4. Problemas frecuentes de las prótesis valvulares..............................................................18

Capítulo 2: SCAFFOLDS UTILIZADOS EN VÁLVULAS POR TE.............................19


2.1. Tipos de scaffolds.......................................................................................................... 19
2.1.1. Scaffolds no biodegradables..........................................................................................19
2.1.2. Scaffolds biodegradables...............................................................................................21
2.2. Técnicas de fabricación.................................................................................................21
2.2.1. Técnicas de conformado y porificación..........................................................................21
2.2.2. Técnicas de mejora de las propiedades.........................................................................28
2.3. Métodos de esterilización..............................................................................................29
2.4. Materiales para scaffolds...............................................................................................30
2.4.1. Materiales no biodegradables........................................................................................30
2.4.2. Materiales biodegradables.............................................................................................30

Capítulo 3: CÉLULAS EMPLEADAS EN TE...............................................................40


3.1. Histología de las válvulas cardíacas.............................................................................40
3.1.1. Células endoteliales.......................................................................................................40
3.1.2. Células intersticiales......................................................................................................41
3.1.3. Matriz extracelular..........................................................................................................44
3.2. Embriología de las válvulas cardíacas..............................................................................49
3.3. Obtención y cultivo de células...........................................................................................51
3.4. Siembra celular...............................................................................................................55
3.4.1. Siembra in vitro.............................................................................................................. 55

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3.4.2. Siembra in situ (o in vivo)...............................................................................................56

Capítulo 4: FACTORES PARA LA CONSTRUCCIÓN DE VÁLVULAS POR TE.......60


4.1. Factores de crecimiento....................................................................................................60
4.2. Moléculas señalizadoras................................................................................................64
4.2.1. Mecanismos de señalización.........................................................................................65
4.2.2. Sustratos y acciones que desencadenan.......................................................................72
4.3. Estimulación mecánica.....................................................................................................78
4.4. Estimulación químico-biológica.........................................................................................82

Capítulo 5: VÁLVULAS CONSTRUÍDAS POR TE......................................................84


5.1. Fabricación de scaffolds biológicos decelularizados.........................................................84
5.2. Fabricación de scaffolds sintéticos...................................................................................87
5.3. Creación de válvulas sin scaffold sólido............................................................................88
5.4. Fabricación de válvulas in situ..........................................................................................90
5.5. Uso de biorreactores.........................................................................................................92
5.6. Proyecciones a futuro en la creación de válvulas.............................................................94

G. CONCLUSIONES................................................................................97

H. BIBLIOGRAFÍA...................................................................................98
H.1. Bibliografía de autor......................................................................................................98
H.2. Bibliografía de instituciones........................................................................................115

I. GLOSARIO..........................................................................................117
1.1. Glosario alfabetizado en Inglés....................................................................................117
1.2. Glosario alfabetizado en castellano............................................................................121

J. CLAVES DE BÚSQUEDA..................................................................124

K. ANEXOS............................................................................................125
K.1. Títulos y resúmenes.....................................................................................................125
K.2. Publicaciones científicas................................................................................................137

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B. OBJETIVOS DEL TRABAJO

B.1) Objetivos generales de aprendizaje cognitivo


B.1.1) Conocer y comprender las terminologías y simbologías básicas, castellanas e inglesas,
utilizadas en el tema.

B.1.2) Aplicar los conocimientos generales aprendidos durante el cursado de las asignaturas
Comportamiento Físico de Biomateriales y Biomateriales y Biocompatibilidad a una
investigación bibliográfica sobre el tema: “Ingeniería de tejidos en válvulas cardíacas”.

B.1.3) Analizar las válvulas cardíacas y prótesis existentes.

B.1.4) Analizar los conceptos que definen la Ingeniería de tejidos.

B.1.5) Analizar los materiales de soporte para válvulas cardíacas ingenieradas.

B.1.6) Analizar los factores para la construcción de válvulas por TE.

B.1.7) Analizar las válvulas construídas por TE.

B.1.8) Sintetizar lo aprendido en la realización de este trabajo a través de la realización de un


resumen.

B.1.9) Evaluar lo aprendido en la realización de este trabajo a través de la elaboración de


conclusiones.

B.2) Objetivos particulares


B.2.1) Evolucionar desde los fundamentos impartidos en las asignaturas Comportamiento
Físico de Biomateriales y Biomateriales y Biocompatibilidad a los últimos conocimientos sobre
Ingeniería de tejidos en válvulas cardíacas expresados en publicaciones de los últimos 5
años.

B.2.2) Profundizar en por lo menos un tema de la asignatura Biomateriales y


Biocompatibilidad que tenga amplias perspectivas de desarrollo en el futuro.

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C. ACTIVIDADES

2012-10-11
Biblioteca de la FI-UNER
Búsqueda en internet
Clave de búsqueda utilizada: tissue engineering of human heart valves, tissue engineering
valves
Cantidad de archivos obtenidos: 32.700, 17.200

Resultados obtenidos:
Mol, Anita: Functional tissue engineering of human heart valve leaflets. The Netherlands,
Eindhoven, Technische Universiteit Eindhoven, 2005. Disponible en:
http://alexandria.tue.nl/extra2/200510793.pdf
Mol, Anita: Tissue Engineering of Human Heart Valve Leaflets: A Novel Bioreactor for a Strain-
Based Conditioning Approach. The Netherlands, Eindhoven, Technische Universiteit
Eindhoven, 2005. Disponible en: http://www.mate.tue.nl/mate/pdfs/5648.pdf
Rieder, Erwin et al.: Decellularized Porcine and Human Valve Scaffolds Differ Importantly in
Residual Potential to Attract Monocytic Cells. Circulation, 2005;111:2712-2714.
Simionescu, Dan: Scaffolds and Stem Cells for Patient-Tailored Aortic Heart Valve Tissue
Engineering. QScience Proceedings: Vol. 2012, Heart Valve Biology and Tissue Engineering,
76.
Lanza, Robert: Principles of tissue engineering. 3era edición, Elsevier, 2011. Disponible en:
http://www.sciencedirect.com/science/book/9780123706157

2012-10-14
Biblioteca de la FI-UNER
Búsqueda en internet
Clave de búsqueda utilizada: heart valve pathologies, válvulas cardiacas protésicas
Cantidad de archivos obtenidos: 17.200, 1.230
Resultados obtenidos:

Michael, George; “Les valves cardiaques et les pathologies valvulaires“. Edward’s Lifesciences
SA, 2010. Disponible en:
http://multivu.prnewswire.com/mnr/prne/edwardslifesciences/44227/docs/44227-
understandingheartvalves-French.pdf

Hinton, Robert: Heart Valve Structure and Function in Development and Disease. Ann. Rev.
Physiol. 2011. 73:29–46. Disponible en:
http://www.annualreviews.org/doi/pdf/10.1146/annurev-physiol-012110-142145

Alvarez, Ramón Humberto: Válvulas cardíacas protésicas. Revisión actualizada. Revista de


posgrado de la VIa Cátedra de Medicina, n° 137 (pág. 19-32), 2004. Disponible en:
http://med.unne.edu.ar/revista/revista137/valvulas.htm

Steinhoff, Gustav et al.: Tissue Engineering of Pulmonary Heart Valves on Allogenic Acellular
Matrix Conduits. 2000. Disponible en: http://circ.ahajournals.org/content/102/suppl_3/III-
50.full

2012-10-25
Domicilio particular de Jonathan Nicolet
Búsqueda en internet

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Clave de búsqueda utilizada: collagen heart valve scaffold, PLGA heart valve scaffold
Cantidad de archivos obtenidos: 5.180, 1.230
Resultados obtenidos:

Chen, Qi et al.: Collagen-Based Scaffolds for Potential Application of Heart Valve Tissue
Engineering. J Tissue Sci Eng, 2012, S:11. Disponible en: http://www.omicsonline.org/2157-
7552/2157-7552-S11-003.pdf

Shangping, Wang et al.: Protein secondary structure and solvent accessibility of proteins in
decellularized heart valve scaffolds. Biomedical Spectroscopy and Imaging 1 (2012) 79–87.
Disponible en: http://iospress.metapress.com/content/562rl6728v249v5n/fulltext.pdf

Holy Chantal et al.: Optimizing the sterilization of PLGA scaffolds for use in tissue engineering.
Biomaterials (2001), Vol. 22, Issue: 1, Publisher: Elsevier Ltd, Pages: 25-31. Disponible en:
http://www.mendeley.com/catalog/optimizing-sterilization-plga-scaffolds-tissue-engineering/

Tedder, Mary et al.: Assembly and Testing of Stem Cell-Seeded Layered Collagen Constructs
for Heart Valve Tissue Engineering. Tissue Engineering Part A. January 2011, 17(1-2): 25-36.
doi:10.1089/ten.tea.2010.0138. ABSTRACT.

Wang, Shangping et al.: Freeze-Dried Heart Valve Scaffolds. Tissue Engineering Part C:
Methods. July 2012, 18(7): 517-525. doi:10.1089/ten.tec.2011.0398. ABSTRACT.

2012-10-25
Domicilio particular de Jonathan Nicolet
Búsqueda en internet
Clave de búsqueda utilizada: TE heart valves future
Cantidad de archivos obtenidos: 11.500

Resultados obtenidos:
Mol, Anita et al.: Review Article: Tissue Engineering of Semilunar Heart Valves: Current Status
and Future Developments. Tissue Engineering of Semilunar Heart Valves: Current Status and
Future Developments, Switzerland, 2006. Disponible en:
http://www.mate.tue.nl/mate/pdfs/3978.pdf

Kidane, A. et al.: Current developments and future prospects for heart valve replacement
therapy. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied BiomaterialsVolume 88B,
Issue 1, 2008. ABSTRACT.

2013-04-02
Biblioteca FIUNER
Búsqueda en internet
Clave de búsqueda utilizada: hipoxia + engineered heart valves
Cantidad de archivos obtenidos: 10.600
Resultado obtenido:
Balguid, Angelique; Mol, Anita et al., 2008, Hypoxia Induces Near-Native Mechanical
Properties in Engineered Heart Valve Tissue. Circulation, 2009, vol. 119, pp. 290-297.
Disponible en: circ.ahajournals.org/content/119/2/290.short
Clave de búsqueda utilizada: circulating endothelial progenitor cells
Cantidad de archives obtenidos: 22.300
Resultado obtenido:
Asahara, Takayuki et al., 1999, Bone Marrow Origin of Endothelial Progenitor Cells
Responsible for Postnatal Vasculogenesis in Physiological and Pathological
Neovascularization, Circulation Research, 1999, no. 85, pp 221-228

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Disponible en: http://circres.ahajournals.org/content/85/3/221.short

Deb, Arjun et al., 2005, Bone Marrow-Derived Myofibroblasts are Present in Adult Human
Heart Valves, J Heart Valve Dis, 2005, Vol. 14, pp 674-678. Disponible en:
http://www.unc.edu/~adeb/DebLab/Publications_files/J%20Heart%20Valve%20Dis
%202005%20Deb.pdf

2013-04-04
Domicilio particular de Esteban Solari
Búsqueda en internet
Clave de búsqueda utilizada: strains + tissue properties + TE
Cantidad de archivos obtenidos: 17.200
Resultado obtenido:
Boerboom, R.; Rubbens, M.; Driessen, N.; Bouten, C.; Baaijens, F., 2008, Effect of strain
magnitude of the tissue properties of engineered cardiovascular constructs. Ann. Biomed.
Eng., 2008, vol. 36, pp. 244-253.
Disponible en: http://link.springer.com/article/10.1007/s10439-007-9413-8

2013-04-10
Biblioteca FIUNER
Búsqueda en internet
Clave de búsqueda utilizada: decellularized scaffolds + heart valves
Cantidad de archivos obtenidos: 2950
Resultado obtenido:
Dijkman, Petra E. et al., 2012, Decellularized homologous tissue-engineered heart valves as
off-the-shelf alternatives to xeno- and homografts, Biomaterials, 2012, no. 33, pp 4545-4554.
Disponible en: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961212002876
Erdbrügger, Wilhelm et al., 2006, Decellularized Xenogenic Heart Valves Reveal Remodeling
and Growth Potential in Vivo, Tissue Engineering, 2006, Vol 12, no 8, pp 2059-2068.
Disponible en: http://online.liebertpub.com/doi/abs/10.1089/ten.tea.2011.0046
2013-04-11
Biblioteca FIUNER
Búsqueda en internet
Clave de búsqueda utilizada: pulsatile bioreactor
Cantidad de archivos obtenidos: 4630

Hoerstrup et al., 2000, New pulsatile bioreactor for in vitro formation of tissue engineered
heart valves, Tissue Engineering, 2000, Vol. 6, no. 1, pp. 75-59. Disponible en:
online.liebertpub.com.sci-hub.org/doi/pdf/10.1089/107632700320919

Dumont et al., 2002, Design of a new pulsatile bioreactor for tissue engineered aortic heart
valve formation, Artif. Organs, vol. 26, no. 8, pp. 703-732. Disponible en:
http://46.38.63.192/mail/lg.php?doi=10.1046/j.1525-
1594.2002.06931_3.x&url=aHR0cDovL2xpYmdlbi5vcmcvc2NpbWFnMS8xMC4xMDQ2L2ouM
TUyNS0xNTk0LjIwMDIuMDY5MzFfMy54LnBkZg%3D%3D

Hildebrand et al., 2004, Design and hydrodinamic evaluation of a novel pulsatile bioreactor
for biologically active heart valves, Ann. Of Biomedical Engineering, 2004, vol. 32, no. 8, pp.
1039-1049. Disponible en: http://46.38.63.192/mail/lg.php?
doi=10.1114/B:ABME.0000036640.11387.4b&url=aHR0cDovL2xpYmdlbi5vcmcvc2NpbWFnMy
8xMC4xMTE0L0IlMjUzQUFCTUUuMDAwMDAzNjY0MC4xMTM4Ny40Yi5wZGY%3D

2013-04-15

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Domicilio particular de Jonathan Nicolet


Búsqueda en internet
Clave de búsqueda utilizada: decellularized valve + TE
Cantidad de archivos obtenidos: 4400

Rieder et al., 2005, Tissue engineering of heart valves: Decellularized porcine and human
valve scaffolds differ importantly in residual potential to attract monocytic cells, Circulation,
2005, no. 111, pp. 2792-2797. Disponible en: http://circ.ahajournals.org.sci-
hub.org/content/111/21/2792.short

Iwai et al., 2007, Minimally immunogenic decellularized porcine valves provide in situ
recellularization as a stentless bioprosthetic valve, J. Artif. Organs, 2007, no. 10, pp. 29-35.
Disponible en: http://46.38.63.192/mail/lg.php?doi=10.1007/s10047-006-0360-
1&url=aHR0cDovL2xpYmdlbi5vcmcvc2NpbWFnMi8xMC4xMDA3L3MxMDA0Ny0wMDYtMDM
2MC0xLnBkZg%3D%3D

Erdbrügger et al., 2006, Decellularized xenogenic heart valves reveal remodeling and growth
potential in vivo, Tissue Engineering, 2006, vol. 12, no. 8, pp. 2059-2067. Disponible en:
http://46.38.63.192/mail/lg.php?
doi=10.1089/ten.2006.12.2059&url=aHR0cDovL2xpYmdlbi5vcmcvc2NpbWFnNS8xMC4xMDg
5L3Rlbi4yMDA2LjEyLjIwNTkucGRm

2013-06-05
Domicilio particular de Jonathan Nicolet
Búsqueda en internet
Clave de búsqueda utilizada: strains + tissue engineering + heart valves
Cantidad de archivos obtenidos: 20500

Mol et al., 2003, The relevance of large strains in functional tissue engineering of heart valves,
Thorac. Cardiov. Surgery, 2003, vol 51, pp. 78-83. Disponible en: http://131.155.54.17.sci-
hub.org/mate/pdfs/2816.pdf

Mol et al., 2005, Tissue engineering of human heart valve leaflets: a novel bioreactor for a
strain-based conditioning approach, Ann. Biomed. Eng., 2005, vol 33, no 12, pp 1778-1788.
Disponible en: http://link.springer.com.sci-hub.org/article/10.1007/s10439-005-8025-4

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D. RESUMEN

Las patologías valvulares son las causas más frecuentes de disfunción cardíaca. En el mundo
se realizan cerca de 250.000 intervenciones valvulares anuales, 3.500 de ellas en Argentina.
La etiología del reemplazo valvular comprende principalmente las estenosis e insuficiencias
de válvulas aórticas y las fallas agudas de cualquier válvula cardíaca. Las condiciones del
reemplazo dependen de la edad, la válvula afectada y la gravedad de la lesión. Existen tres
tipos de prótesis valvulares: las mecánicas, las biológicas y las desarrolladas por ingeniería de
tejidos (TE). En la actualidad las prótesis mecánicas de disco flotante son las más
frecuentemente indicadas, incluso más que el trasplante valvular. Sin embargo requieren
tratamientos anticoagulantes de por vida y en los mejores casos presentan una sobrevida de
20 años. El desarrollo de prótesis por TE se basa en tres pilares: soporte celular (scaffold),
células funcionales y factores de crecimiento.
Los scaffolds son estructuras encargadas de fijar las células necesarias para cumplir las
funciones de mantenimiento de la válvula. Pueden ser de 2 tipos: reabsorbibles o no
reabsorbibles. Algunas técnicas para fabricación de scaffolds son el lixiviado, liofilización,
separación de fases, espumado gaseoso, entrecruzamiento de fibras y electrospinning. Para
mejorar las propiedades mecánicas se usa el crosslinking y el photografting. Pueden
esterilizarse por plasma de argón remoto, óxido de etileno, radiación gamma o etanol al 70%.
Los scaffolds se fabrican con sustancias poliméricas. Inicialmente se usaban polímeros no
biodegradables. Actualmente se prefieren los biodegradables que son reemplazados por tejido
autólogo. Estos pueden ser naturales (como el colágeno, el quitosano o copolímeros
colágeno-elastina) o sintéticos (como el ácido poliláctico, ácido poliglicólico y sus copolímeros,
la policaprolactona y los polihidroxialcanoatos).
Las válvulas cardíacas se componen de células endoteliales (VECs), células intersticiales
(VICs) y matriz extracelular (VECM). Las VECs se encuentran en contacto con la sangre y
evitan la formación de trombos. Las VICs sintetizan la VECM y son fundamentales para el
mantenimiento de la válvula. Las válvulas se desarrollan por diferenciación de células
endoteliales en mesenquimales mediada por factores de crecimiento. Las células valvulares
provienen del endotelio, el endocardio y células sanguíneas circulantes. Las células para
válvulas ingenieradas pueden ser obtenidas del cultivo de células madre o de células
endoteliales de vasos sanguíneos. Estas son sembradas en los scaffolds por técnicas in vitro
o por recelularización in vivo.
Se utilizan factores de crecimiento para acelerar el desarrollo de las válvulas ingenieradas.
Los más importantes son los factores fibroblásticos (FGF), los factores transformadores (TGF)
y los de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Las moléculas señalizadoras permiten el
control de la proliferación y adhesión celular. Desencadenan mecanismos de señalización que
activan cascadas de reacciones citoplasmáticas, modificando la expresión génica y el
citoesqueleto. Los sustratos de señalización son sustancias sobre las que actúan enzimas o
proteínas receptoras, y pueden ser GAGs, proteínas de la VECM, anticuerpos, citoquinas,
aptameros y polímeros biológicamente activos. Las propiedades mecánicas son mejoradas
hasta en un 50% a través de la aplicación cíclica de estímulos físicos (como deformaciones,
flexiones, flujos y tensiones) y el control de variables químicas (como la concentración de O2 y
de ozono).
La fabricación de scaffolds descelularizados a partir de válvulas de cerdo incluye 3 pasos: la
selección y extracción de la válvula, la decelularización y la optimización de propiedades. Los
scaffolds sintéticos más modernos se fabrican por superposición de capas poliméricas,
imitando las propiedades de las 3 capas válvulares naturales. Las válvulas sin scaffold sólido
utilizan biopapeles y otorgan propiedades biológicas, pero pobres propiedades mecánicas. La
fabricación in situ aprovecha la respuesta inflamatoria temprana post-implantación y permite
disponer de scaffolds a demanda. El conjunto de factores de crecimiento y métodos de

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optimización del implante se pueden aplicar a través de biorreactores. Las válvulas


ingenieradas están todavía lejos de la implementación clínica, pero la fabricación in situ, las
intervenciones de un solo paso, el uso de biorreactores controlados por feedback y las
modernas modelizaciones computacionales prometen buenos resultados.
Aún no se lograron válvulas por TE clínicamente óptimas pero se realizaron grandes avances.
Estos hacen necesaria la investigación bibliográfica para comprenderlos. Tener una visión
general de la historia y las líneas actuales de investigación es imprescindible para focalizar los
esfuerzos hacia las alternativas más prometedoras.

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D. ABSTRACT

Valvular pathologies are the most frequent causes of heart diseases. Annually around 250.000
valvular interventions are performed worldwide, 3.500 of them in Argentina.
Heart valve replaces are given mainly due to aortic valve stenosis and insufficiencies or acute
failure of any heart valve. Heart valve replacement conditions depends on patient’s age, which
valve was affected and the level of damage. There are three kinds of heart valve prostheses:
mechanical grafts, biological grafts and tissue-engineered (TE) heart valves. Currently, tilting-
disc mechanical prostheses are the most frequently indicated, even more often than valvular
transplant. Nevertheless, they require life-long anticoagulant treatments and a 20-year survival
is achieved in the best-case scenario. TE grafts are based on three pillars: scaffolds, cells and
growth factors.
Scaffolds are structures which attach the cells needed for valve maintenance. There are two
kinds of scaffolds: biodegradable and non-biodegradable scaffolds. Scaffold manufacturing
processes include leaching, liophilisation, phase separation, gas foaming, fiber crosslinking
and electrospinning. Mechanical enhacement is achieved by crosslinking and photografting
techniques. Sterilization can be performed by remote argon plasma, ethylene oxide, gamma
radiation or 70% ethanol. Scaffolds are made of polymers. In the beggining non-biodegradable
polymers were proposed. Currently, biodegradable polymers that will be replaced by
autologous tissue are prefered. These can be natural polymers, such as collagen, chitosan or
collagen-elastin copolymers, or synthetic, such as polylactic acid, polyglycolic acid and their
copolymers, polycaprolactone and polyhydroxyalkanoates.
Heart valves are composed of valvular endothelial cells (VECs), valvular interstitial cells (VICs)
and extracellular matrix (VECM). VECs are in contact with the bloodstream and avoid
thrombogenesis. VICs synthesize VECM and are fundamental for heart valve maintenance.
Heart valves are developed by differentiation of endothelial into mesenchymal cells due to
growth factors. Valvular cells comes from endothelium, endocardium and blood circulating
cells. TE heart valve cells can be obtained from stem cells or blood vessel endothelial cells
cultures. They are seeded into scaffolds by in vitro techniques or by in vivo recellularization.
Growth factors are used to accelerate the development of TE heart valves. The most important
are fibroblastic growth factor (FGF), transforming growth factor (TGF) and vascular endothelial
growth factor (VEGF). Signalling molecules allow cellular proliferation and celular attachment
control. They promote signalling mechanisms which consist of cytoplasmic chain reactions that
affect gene expression and cytoskeleton structure. Signalling substrates are the substances
upon which enzymes and membrane receptors act. They can be GAGs, VECM proteins,
antibodies, cytokines, aptamers and biologically active pollymers. Mechanical properties are
enhaced up to 50% through the application of cyclic stimuli (such as strains, flexure, flow and
stresses) and the control of chemical variables (such as O2 and ozone).
Manufacturing of decellularized scaffolds from porcine valves implies 3 steps: selection and
extraction of the valve, decellularization and optimization of the valve’s properties. Modern
synthetic scaffolds are made of attached polymeric layers which mimic the 3 layer structure of
natural valves. Scaffoldless valves use biopapers which give biological properties, but bad
mechanical properties. In situ manufacturing takes advantage of early inflammatory responses
after implantation and allows on demand scaffolds. Growth factors and implant optimization
techniques can be applied in bioreactors. TE heart valves are far from clinical use, but in situ
manufacturing, one-step interventions, feedback controled bioreactors and modern computer
simulations promise good results.
There are not TE heart valves clinically available yet, but great advances have been achieved.
To understand them, a bibliographical research is needed. Knowing the history behind heart
valves and the main current research lines is quintessential to focus our efforts on the most
promising alternatives.

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E. INTRODUCCIÓN

Las patologías valvulares son una de las causas más frecuentes de disfunción cardíaca. Las
válvulas dañadas pueden mantener su funcionalidad durante un tiempo gracias a diversos
tratamientos pero a pesar de la tendencia actual de repararlas, en la mayoría de los pacientes
es necesario sustituirlas. Esto puede realizarse usando válvulas mecánicas o biológicas.
Las prótesis valvulares mecánicas tienen una gran durabilidad debido al uso de aleaciones
metálicas biocompatibles. Sin embargo, pacientes con estas prótesis pueden presentar
problemas de trombosis, embolias, endocarditis, disfunción protésica y a menudo
complicaciones por la anticoagulación a la que deben someterse. Esto justifica las
investigaciones que se desarrollan en busca de prótesis conformadas con tejido vivo.
La ingeniería de tejidos (TE – Tissue engineering) ofrece una alternativa novedosa al producir
tejido vivo compatible con el receptor. Estudios sobre tejidos musculares ingenierados
muestran que se pueden lograr propiedades biológicas y mecánicas adecuadas mediante
tratamientos pre-implantación. Estos resultados han incentivado el desarrollo de la ingeniería
de tejidos en diversos campos, como la ingeniería de válvulas cardíacas.
Sin embargo, la implantación de válvulas cardíacas fabricadas mediante descelularización de
válvulas de cerdo y posterior siembra de células autólogas puede desencadenar reacciones
inmunológicas, seguidas en la mayoría de los casos de muerte o necesidad del reemplazo de
la válvula. Las válvulas ingenieradas fabricadas sin scaffold son totalmente compatibles con el
tejido vivo, pero aún no logran las propiedades mecánicas necesarias. Los estudios actuales
se enfocan en los métodos de optimización mecánicos y químicos mediante biorreactores, el
uso de factores de crecimiento adecuados y la creación de válvulas in situ.
En esta investigación bibliográfica nos proponemos revisar la evolución de esta aplicación
tecnológica, sus posibles alcances y perspectivas a futuro.

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F. CAPÍTULOS

Capítulo 1: VÁLVULAS CARDÍACAS Y PRÓTESIS


1.1. Patologías de las válvulas cardíacas
Para comprender las propiedades que una prótesis de válvula cardíaca debe presentar, es
necesario un estudio de las patologías cardíacas que afectan a las válvulas. Éstas vienen
determinadas por una etiología diversa. En general, las causas afectan la capacidad de la
válvula de dejar pasar la sangre con la mínima resistencia posible (estenosis valvular) y su
capacidad de evitar el reflujo de sangre (insuficiencia valvular) (Téllez Peralta, 1998).
En particular, las causas más frecuentes de patologías valvulares incluyen las infecciones,
depósitos de calcio (especialmente en las valvas), reumatismo articular agudo (produce
inflamación cardíaca que deviene generalmente en estenosis mitral), enfermedades
degenerativas (generalmente genéticas, degradan el colágeno deteriorando las propiedades
mecánicas valvulares), anomalías valvulares y patologías congénitas, cardiopatías
isquémicas, endocarditis y el uso de diferentes drogas (Michael, 2010)

1.2. Condiciones determinantes para el reemplazo de válvulas cardíacas


Ciertas patologías valvulares pueden ser controladas por años sin necesidad de un reemplazo
valvular. Éstas suelen ser patologías leves, cuya cronicidad no conlleva efectos secundarios
severos con un adecuado tratamiento y modo de vida. En general, estas se producen en las
válvulas mitral y tricúspide. Esto puede deberse a la relativamente mayor incidencia de
insuficiencias en estas válvulas, a diferencia de la válvula aórtica que mayormente es afectada
por estenosis y procesos degenerativos que no permiten la reparación valvular. Por otro lado,
existen más cantidad de sustitutos valvulares aórticos con baja trombogenicidad y mayor
longevidad que para la posición mitral. Por estos motivos, en éstas válvulas suelen indicarse
tratamientos plásticos. Estos también son recomendados en adultos jóvenes, que sufrirán los
efectos de la anticoagulación a largo plazo o la baja durabilidad de las prótesis. Las
alternativas en estos casos incluyen soluciones para dilatación valvular, prolapso valvular,
estenosis y perforación (Carr, Savage, 2003)
Otras patologías, en cambio, requieren de una cirugía de reemplazo a largo plazo, y cualquier
tratamiento prescrito estará orientado a postergar lo más posible la necesidad de una cirugía
de reemplazo valvular. En algunos casos, incluso, se prescribe cirugía inmediata, ya sea por
el tipo de patología o por la severidad del estado con el que el paciente llega al control. La
mayoría de las patologías de válvula aórtica, como la estenosis aórtica relacionada con
insuficiencia (que muchas veces es asintomática hasta estados muy severos), son de este
tipo, como así también cualquier falla valvular aguda. De todos modos, el reemplazo valvular
con prótesis biológicas o mecánicas es el tratamiento principal de los estadios finales de las
enfermedades valvulares, y es incluso más ampliamente aceptado que el transplante valvular
(Bayés de Luna, 2003)
En edad pediátrica, las lesiones congénitas son la causa principal de indicación quirúrgica
valvular (Naranjo Ugalde et al., 2002). En edad adulta, en cambio, hay diversas causas de
indicación quirúrgica. Ante una estenosis mitral aguda se indica el reemplazo valvular
(retrasado hasta que los síntomas sean severos o el paciente no pueda recibir otro tipo de
ayuda). También es indicado cuando se realizó valvuloplastia sin mejoría clínica o con
insuficiencia mitral severa asociada, cuando hay complicaciones por trombo auricular, cuando
hubo reciente endocarditis y cuando se suceden embolias sistémicas recurrentes (Dominik,
Zacek, 2010).

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Ante estenosis aórtica se prescribe reemplazo valvular con las siguientes condiciones:
Pacientes clase I: pacientes con estenosis aórtica sintomática severa, pacientes con estenosis
aórtica que serán sometidos a revascularización miocárdica y pacientes con estenosis aórtica
severa por someterse a cirugía de otras válvulas cardíacas o de aorta;
Pacientes clase IIa: pacientes con estenosis aórtica moderada que se someterá a
revascularización miocárdica o cirugía cardíaca, pacientes asintomáticos con estenosis aórtica
severa y disfunción sistólica ventricular izquierda y pacientes con respuesta anormal
(hipotensión) al ejercicio;
Pacientes clase IIb: taquicardia ventricular marcada y excesiva hipertrofia ventricular izquierda
(>= 15 mm) y área valvular <0,6 cm2
Pacientes clase III: reemplazo valvular no recomendado. (Hernández-Carrillo et al., 2006)
(SAC, Estenósis aórtica, 2007)
Ante insuficiencia aórtica se indica reemplazo valvular cuando:
Pacientes clase I: pacientes sintomáticos con insuficiencia crónica aórtica severa, pacientes
con insuficiencia aórtica crónica severa asintomáticos con disfunción del ventrículo izquierdo y
pacientes con insuficiencia aórtica crónica severa que serán sometidos a cirugía cardíaca.
Pacientes clase IIa y b: pacientes asintomáticos con regurgitación auricular severa y severa
dilatación del ventrículo izquierdo.
No se recomienda reemplazo para pacientes de clase III. (SAC, Insuficiencia aórtica, 2007)
La selección de la prótesis para reemplazo valvular indicado difiere según la edad: uso de
prótesis mecánica para menores de 70 años sin contraindicación para anticoagulantes; uso de
prótesis biológica para pacientes mayores de 70 años o menores con contraindicación para
anticoagulantes; uso de autoinjerto de válvula pulmonar en pacientes menores de 40 años;
uso de homoinjerto de aorta superior y válvula aórtica de un donante de tejido cuando haya
endocarditis activa o no haya posibilidad de alguno de los procedimientos anteriores (Bonow
et al., 2006)

1.3. Tipos de prótesis valvulares cardíacas


En la actualidad se realizan 280.000 reemplazos valvulares anuales en el mundo (Pibarot et
al., 2009). Existen, para todos estos reemplazos, decenas de tipos de prótesis valvulares en el
mercado, lo que da una idea de que ninguna ha solucionado por completo el problema del
reemplazo valvular cardíaco. Podemos clasificarlas en 3 tipos fundamentales: las mecánicas,
las biológicas y las desarrolladas por ingeniería de tejido (Álvarez, 2004).

1.3.1. Prótesis mecánicas


Las prótesis valvulares mecánicas fueron las primeras en desarrollarse, y se han desarrollado
ya varios modelos. En general, podemos clasificarlas en prótesis de bola enjaulada y prótesis
de disco flotante, y estas últimas pueden subdividirse en prótesis monodisco y bidisco. Si bien
son las más duraderas por su alta resistencia al desgaste, presentan una serie de problemas
limitantes como la necesidad de anticoagulantes de por vida y diversas complicaciones a largo
plazo, además de la imposibilidad de crecer, la cual es imprescindible para la viabilidad de una
válvula de uso pediátrico (Steinhoff, 2000)
Las prótesis de bola enjaulada (conocidas como prótesis de Starr-Edwards) fueron las
primeras válvulas protésicas implantadas en humanos que resolvieron adecuadamente los
problemas valvulares. Consisten en una bola de material bioinerte y de muy lenta
degradación, con una jaula que la encierra, abierta hacia un extremo por un anillo y hacia el
otro por un conjunto de fibras gruesas (en general cuatro). Si bien al día de hoy ya están

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obsoletas, desde su creación hasta las años noventa fueron usadas largamente y se
sucedieron una serie de modificaciones. La primera prótesis Starr-Edwards, implantada en un
humano en 1960, comprendía una jaula de fibras de Lucite (PMMA) cerradas en cono, a la
que se le insertaba una bola de goma de silicona (polimetilsiloxano vulcanizado) moldeada por
compresión, para luego cerrarla por soldadura por solvente de un anillo de Lucite, con acetona
como solvente (Matthews, 1998)
Uno de los cambios fundamentales sobre esta primera prótesis surgió con el objetivo de
mejorar la resistencia a la corrosión, que delimitaba enormemente la durabilidad. Para esto, se
reemplazó el PMMA por acero inoxidable de bajo carbono. Posteriormente se usaron también
diferentes tipos de estelita (CoCrMo), entre los cuales podemos nombrar la estelita 21. Se
mejoró la forma del anillo para aumentar la fijación al flanco, y para preservar el tejido lindante
se agregó una esponja de goma de silicona porosa al cuerpo del anillo de costura
(proveyendo una mayor flexibilidad) y se reemplazó la forma cónica de la caja por una de
ángulos más suaves, semiesférica. La reducción del sonido de golpeteo se logró al cambiar la
cobertura siliconada de una goma de nylon por un cuerpo completamente de silicona. Sin
embargo, al día de hoy no ha podido evitarse el golpeteo completamente. La evolución de las
válvulas Starr-Edwards puede apreciarse en la figura 1. Otros cambios en base al mismo
principio han sido sugeridos por diferentes fabricantes, con resultados muy similares
(Matthews, 1998) (Lund et al., 1999)

Figura 1: Desarrollo ingenieril de las prótesis valvulares Starr-Edwards (Annette M. Matthews,


op. cit.)
Las prótesis de disco flotante son actualmente las más utilizadas, y han reemplazado casi por
completo a las de bola enjaulada. Esto se debe a que han superado dos aspectos
problemáticos de las anteriores: perfiles de velocidad demasiado grandes y una turbulencia
excesiva inducida por la oclusión. Esta tecnología se basa en el uso de un disco libremente
flotante que gira un ángulo predefinido por la disposición de topes. En general se trata de
hacer calzar al disco en la abertura circular sin superposición, de modo de diminuir lo más
posible el daño mecánico a los eritrocitos. Por esto se produce un pequeño reflujo que
enjuaga a los discos reduciendo también la incidencia de tromboembolismo. La principal
ventaja proviene del perfil hidrodinámico del flujo a través de la válvula cuando está abierta,
con menos perturbación del flujo que en las de bola enjaulada (Álvarez, 2004)
La mayoría de los cambios que sufrió este tipo de prótesis desde su invención fueron de tipo
morfológico, disminuyendo el impacto y fricción y mejorando los perfiles de flujo. Uno de los
más importantes fue el uso de dos valvas semicirculares en lugar de un único disco circular
(prótesis bidisco de St. Jude Medical), que disminuyen al mínimo las perturbaciones de flujo
en posición abierta ya que permite la circulación por un canal central y dos periféricos, muy
similares entre ellos (ver figura 2), que distribuyen la turbulencia y proveen un flujo casi
laminar. Posteriormente se crearon discos curvos y de apertura paralela al flujo, ambos con el
objetivo de disminuir la turbulencia y con ello las complicaciones tromboembólicas
(Yoganathan, 2000)

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Figura 2: Perfiles de velocidades de las prótesis mecánicas. Puede verse como la prótesis de
disco supera a la de bola enjaulada en velocidad de flujo y en distribución de esa velocidad,
así como también en ausencia de reflujo central. Entre las 2 prótesis de disco, la de doble
disco (C) tiene un perfil más parejo, con mejor hemodinámica (modificado de: Yoganathan,
op. Cit.)
Sin embargo, también los materiales usados cambiaron. En un principio el disco fue
construido con Derlin (polioximetileno) estabilizado para evitar degradación. Este presentaba
características deseables como un bajo coeficiente de fricción, alta dureza y estabilidad
dimensional. Actualmente se prefiere el uso de anillos de grafito y tungsteno cubiertos por una
capa de carbono pirolítico, la cual evita la formación de coágulos en su superficie reduciendo
el peligro de trombosis. El anillo y los ejes están fabricados con aleaciones de titanio
reforzado, que les provee una gran durabilidad. El anillo de costura está compuesto de un
tejido de Teflon (PTFE) (Yoganathan, 2000) (Gosálbez Jordá et al., 2003)

1.3.2. Prótesis biológicas


Las prótesis valvulares biológicas son las que se fabrican, de modo total o parcial, con tejido
orgánico preservado. Son menos duraderas que las mecánicas debido a su potencial
inmunogénico y a la fijación de detergentes usados para la descelularización, que lleva a la
imposibilidad de ser repobladas por células autólogas. Además, el hecho de que no permitan
la reconstrucción de tejido valvular viable puede llevar a producir trombogénesis, inflamación y
endurecimiento por calcificación, reduciendo aún más su durabilidad. Sin embargo, el motivo
de su creación fue la búsqueda de una solución a los problemas típicos de las válvulas
mecánicas (trombosis, embolismo, tratamientos anticoagulantes y daño globular con posible
anemia). Ante esto, los beneficios fundamentales de las prótesis biológicas son sus mejoradas
propiedades hemodinámicas, obteniéndose además una muy reducida audibilidad. En general
las prótesis biológicas pueden ser autoinjertos, homoinjertos y xenoinjertos, y en cualquier
caso pueden presentar soporte biomaterial (stended) o ser prótesis sin soporte (stenless)
(Steinhoff, 2000) (Simon et al., 1998)
Los autoinjertos pueden ser construídos sobre un soporte (como las válvulas pericárdicas
autólogas con soporte), pero existen también bioprótesis sin soporte, que son las más
recientes y que aún están en desarrollo. La más llamativa ventaja de los autoinjertos es su

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capacidad de crecimiento y desarrollo tisular, lo que los convierte en los candidatos principales
para transplante infantil y una buena alternativa en otros casos (Anastasiadis, 2004)
Entre los autoinjertos llama la atención un procedimiento de reemplazo aórtico por una válvula
pulmonar sana. Al mismo tiempo debe reemplazarse también la válvula pulmonar extraída. Se
reducen convenientemente los problemas si como reemplazo se utiliza otra válvula pulmonar,
en este caso un aloinjerto (de un donante de la misma especie, genotípicamente diferente).
De este modo se suple adecuadamente la necesidad de una válvula cardíaca, que si bien no
trabaja con la eficiencia de la válvula original asegura la mínima tasa de re-reemplazo valvular
a largo plazo y la mínima tasa de tromboembolismo asociado, respecto al resto de las prótesis
biológicas. Por otro lado, además del autoinjerto pulmonar, sólo los aloinjertos aórticos poseen
la cualidad de no presentar gradiente hemodinámico en el cierre, evitando el reflujo y el
trabajo forzado. Como contracara, la técnica es difícil, lo que lleva a una tasa relativamente
mayor de fallas quirúrgicas y un elevado riesgo. Este tipo de cirugías es conocido como el
procedimiento de Ross (Hopkins, 2005) (Westaby, 1995)
Ante la poca diversidad de procedimientos posibles con autoinjertos, una variante son los
homoinjertos. Estos son transplantes de válvulas cadavéricas de un donante de la misma
especie, las cuales mantienen sus propiedades mediante criopreservación. El problema
principal de estas válvulas es su baja disponibilidad. Por otro lado, existen algunos problemas
de rechazo de tejido, si este no es previamente tratado (Téllez de Peralta, 2008) (Hopkins,
2005)
Los xenoinjertos presentan una mayor disponibilidad. Estos son prótesis obtenidas de tejido
animal de otra especie. Son montados en soportes con cubierta de tela, en general hechos de
estelita, titanio o algún biopolímero, con cobertura superficial de teflón o polipropileno. Es
deseable una cierta flexibilidad, de manera de absorber parte de la tensión dinámica
circulatoria y evitar el desgaste de las válvulas. En general se usan válvulas de aorta porcina o
de pericardio bovino, aunque también se están probando valvas y miocardio ovino. Para evitar
su deterioro prematuro y corta longevidad pueden realizarse pretratamientos de detoxificación
como los anticalcificantes, antimineralizantes o antidegenerativos. Además, se las
descelulariza para evitar reacciones inmunogénicas. Esto produce ciertos problemas, como
son la dificultad del tejido para recolonizar una matriz con detergentes u otros productos
químicos (como el glutaraldehído, que además es tóxico), lo que limita la durabilidad de estos
injertos (Lichtenberg et al., 2007) (Zhao et al., 2003)
En cuanto a los injertos sin soporte, no sólo no poseen una estructura de base sino que
tampoco usan anillos de costura. Son prótesis de tamaño mayor que las con soporte de su
mismo estilo, y presentan a su vez mejores características hemodinámicas a corto plazo
debido a que no obstruyen el conducto aórtico. Sin embargo, a largo plazo presentan efectos
similares a las que poseen soporte, y están siendo superadas por las prótesis con soporte
implantadas supraanularmente (que con dicha disposición evitan la disminución del canal
aórtico) (Dominik et al., 2010) (Bloomfield, 2002)

1.3.3. Prótesis desarrolladas por ingeniería de tejidos (TE)


La ingeniería de tejidos se basa en 3 pilares fundamentales: soportes celulares (scaffolds),
células y factores de crecimiento. Las prótesis creadas por TE se basan en la creación de
tejido viable con células autólogas, obtenidas del paciente, sembradas y proliferadas sobre
scaffolds tridimensionales. Incluso existen alternativas basadas en la reconstrucción de tejido
sin scaffolds, con agregado de factores de crecimiento para proveerles una dinámica in vivo.
Surgen como una alternativa a las prótesis biológicas, por lo que deberían solucionar los
problemas de disponibilidad, facilidad en la implementación y durabilidad, manteniendo
propiedades hemodinámicas adecuadas. En general, los tipos de scaffolds incluyen polímeros
biodegradables, scaffolds biológicos y polímeros bioactivos. Serán detallados más adelante
(Steinhoff, 2000)

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1.4. Problemas frecuentes de las prótesis valvulares


Las válvulas artificiales mecánicas son actualmente las más duraderas, ya que tienen un
periodo de vida de entre 8 y 20 años cuando no presentan complicaciones primarias y con la
salvedad de que debe seguirse un tratamiento con anticoagulantes de por vida. Las biológicas
no requieren de anticoagulantes, pero duran actualmente entre 12 y 15 años si no sufrieron
calcificación (en tal caso, fallan entre los 3 y 4 años de implantadas). En niños, estas se
calcifican rápidamente produciendo disfunción, y en general la falla de prótesis biológicas
disminuye con la edad. Debido a que se desea evitar la dependencia de por vida de
operaciones de reemplazo valvular en jóvenes, y que en general los reemplazos valvulares se
necesitan en pacientes mayores a 60 años con cirugías de reemplazo 15 años después
sumamente riesgosas, es recomendable evitar la substitución de válvulas cardíacas en la
mayoría de los casos, o al menos retardarla lo más posible. Tratamientos alternativos (como
cirugías de reparación) suelen prescribirse hasta que se hace imprescindible suplantar la
válvula dañada (Bhimji, 2010) (Kardon, 2010) (Runge y Ohman, 2006)
Los problemas de prótesis no suelen presentarse en un período temprano post-operatorio. Sin
embargo, son frecuentes las complicaciones tardías, y pueden ser seguidas de muerte en
casos extremos o por tratamiento demorado. Entre las causas de mal funcionamiento de
válvula artificial encontramos la falla primaria, endocarditis de prótesis (PVE), trombosis de
prótesis (PVT), tromboembolismo, hemorragia por anticoagulantes y anemia hemolítica
mecánica. Si la causa es una de las últimas 2 nombradas, el reemplazo de la prótesis no
solucionará el problema (Kardon, 2010)
En prótesis biológicas, otra causa quirúrgica puede ser la calcificación degenerativa, que
conlleva rigidez de las valvas o incluso ruptura. La ruptura puede ser causada incluso sin
previa calcificación, por falla del tejido conectivo. La estenosis o insuficiencia de válvulas
protésicas puede ocurrir por perforación de las cúspides, trombosis, fibrosis en válvulas de
cerdo, formación de un paño de granulación, calcificación o pérdida de movimiento de las
valvas mecánicas. La falla primaria, en cambio, puede ocurrir por ruptura de la línea de sutura
o ruptura o separación de los componentes de la válvula. Incluso pueden aparecer fragmentos
de la válvula regurgitados o embolizados (Butany, 2001)

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Capítulo 2: SCAFFOLDS UTILIZADOS EN VÁLVULAS POR TE


El soporte celular (scaffold) es uno de los pilares de la ingeniería de tejidos. Se trata de una
matriz con forma y propiedades mecánicas similares a las del tejido a reemplazar, que será
encargada de contener al conjunto de células funcionales y proveer a la estructura una
estabilidad provisional para el crecimiento e integración tisular. En general también requieren
propiedades adicionales según la función y el tejido a suplantar. De gran importancia son: 1. la
habilidad de transportar nutrientes, factores regulatorios y desechos hacia y desde las células,
2. la biodegradabilidad a una tasa controlable y similar a la de regeneración del tejido, 3. la
promoción de interacción entre el scaffold y las células, de adhesión celular y de deposición
de matriz extracelular, 4. la biocompatibilidad, 5. la no toxicidad y 6. la facilidad de
manufactura. Estas propiedades son mayormente encontradas en los biopolímeros (Barron y
Pandit, 2003) (Fuchs et al., 2001)
Las líneas de investigación son variadas. Por un lado pueden usarse scaffolds biológicos
(matrices descelularizadas de válvulas animales –xenoinjertos- o humanas –homoinjertos-),
pero además se estudian materiales no biodegradables (como el tejido granular cicatrizal
subcutáneo) e incluso biodegradables (biopolímeros y compuestos que imitan la matriz
extracelular). En el último caso, propiedades fundamentales del material son su porosidad
(determinante de la velocidad neta de reabsorción), la posibilidad de invasión y proliferación
de células del paciente y las condiciones adecuadas para la síntesis de matriz propia
(Flameng, 2005).

2.1. Tipos de scaffolds


La morfología de los scaffolds depende mucho de las propiedades que quieran obtenerse. Los
scaffolds pueden ser poliméricos, de composites de biocerámicas-polímeros y de matrices
decelularizadas. Los poliméricos pueden ser espumados (con poros interconectados o no
conectados), fibrosos o basados en microesferas. Según su degradabilidad, pueden ser no
biodegradables o biodegradables, con diferentes tasas de degradación (Dhandayuthapani et
al., 2011)

2.1.1. Scaffolds no biodegradables


Los primeros scaffolds para TE de válvulas cardíacas fueron diseñados como estructuras no
degradables con la intención de mantener las propiedades mecánicas del scaffold. Los
scaffolds sintéticos de este tipo son actualmente poco usados y fueron en su mayoría
reemplazados por scaffolds biodegradables. Esto se debe principalmente a la fatiga del
material con subscuente producción de microfracturas, a insudación de proteínas plasmáticas
y a la mineralización. En cambio, los scaffolds biológicos no biodegradables son ampliamente
utilizados, incluso en aplicaciones clínicas (Vesely, 2005).
Con el objetivo de lograr reemplazos de valvas o incluso implantes valvulares íntegros se ha
propuesto el uso de capas continuas de hidrogeles no biodegradables de ácido hialurónico
(HA), previamente sometido a algún método de crosslinking (como la aplicación de divinil
sulfona, DVS). El crosslinking estabiliza al scaffold polimérico haciendolo perder sus
propiedades de degradabilidad. Sobre las capas pueden imprimirse (por microfabricación UV)
patrones microtexturados para mejorar la adhesión celular. El agregado de DVS mejora las
propiedades mecánicas del gel, sin alterar la biocompatibilidad, propiedades de adhesión
celular y señalización del HA, ya que el crosslinking no utiliza los sitios activos del HA. Estas
capas de ácdio hialurónico demostraron fomentar la adhesión, proliferación y generación de
matriz de elastina por parte de células musculares aórticas en ratas, lo cual demuestra un
gran potencial en este campo (Ramamurthi y Vesely, 2005)
Las mayores expectativas a futuro en cuanto a la TE de válvulas cardíacas están puestas en
la creación de scaffolds basados en xeno y homoinjertos valvulares. Esto se debe a las

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grandes ventajas que presentan estos injertos: morfología funcionalmente adecuada por su
similitud con la válvula reemplazada, hemodinamia mecánica y fisiológica igual a la requerida
(lo que reduce el pre acondicionamiento del scaffold, acortando el tiempo de espera para la
implantación), y la disponibilidad de moléculas señalizadoras naturales para la adhesión y
proliferación del tejido valvular autólogo (Mol, 2009).
Varios estudios han logrado una adecuada repoblación de homoinjertos y xenoinjertos en
animales. Tal es el caso de la repoblación de válvulas alogénicas ovinas y xenogénicas
porcinas en ovejas. Si bien las válvulas alogénicas se calcificaron luego de 12 semanas, las
válvulas xenogénicas sobrevivieron las 24 semanas desde la implantación sin calcificación
aparente (al microscopio óptico), pero con pequeñas microcalcificaciones halladas por
microscopía electrónica en las zonas de baja repoblación celular. Un análisis cuantitativo
celular determinó una repoblación valvular de cúmulos de células endoteliales luego de 12
semanas en las válvulas alogénicas, con intersticios vagamente poblados con algunos
fibroblastos y miocitos. En cambio, las válvulas xenogénicas mostraron una cubierta endotelial
uniforme a las 24 semanas, con intersticios poblados de fibroblastos y miocitos similar a la
población ovina nativa, con síntesis activa de ECM (indicada por cantidades de colágeno,
GAGs y elastina similares a los naturales) (Takagi et al., 2006)
La elección de injertos xenogénicos u homogénicos depende de una serie de ventajas y
desventajas. En general se usan xenoinjertos debido a que los donantes de válvulas
homogénicas son pocos, ya que se requieren válvulas funcionales. Existen problemas éticos
en la obtención de estas válvulas, lo que reduce la oferta, y no se ha probado aún repoblar
válvulas humanas y realizar post-tratamientos a válvulas explantadas, los cuales son
actualmente imprescindibles. En cuanto a los xenoinjertos, una desventaja menor es la
posibilidad de zoonosis por transmisión de virus (Walles et al, 2003).
Los homoinjertos, por otro lado, poseen mejores propiedades que los xenoinjertos: menor
trombogenicidad, riesgo de infección e inmunogenicidad. Sin embargo, los homoinjertos
criopreservados aumentan el riesgo de rechazo inmunológico crónico y deterioración
estructural (Domenech, 2008).
Nuevas técnicas de descelularización, como SynerGraft, proveen la perspectiva de
recelularización autóloga con mejora de la durabilidad y reducida inmunogenicidad. Estudios
de homoinjertos de válvula pulmonar descelularizada por el método SynerGraft mostraron
infiltración de la capa neoíntima sólo con granulocitos neutrófilos y macrófagos CD68-
positivos, pero sin células valvulares específicas a 5 semanas de la implantación. En ese
tiempo, la válvula implantada falló sin revelar signos de deterioro ni enfermedad, pero si
inflamación (Sayk et al., 2005). Incluso en un homoinjerto de válvula aórtica SynerGraft
explantada a 2 años de la implantación se encontró proliferación superficial de células
endoteliales y miofibroblastos, aunque no una colonización valvular completa. Actualmente no
existen homoinjertos viables a largo plazo, con excepción de injertos autólogos de válvula
pulmonar, pero se espera que se logren avances (Miller et al., 2006).
En el proceso de descelularización es muy importante remover todo el componente celular sin
dañar la válvula ni alterar las propiedades de la matriz. Las características intrínsecas del
scaffold son decisivas para su mayor durabilidad, y estas dependen del método de
descelularización empleado (Tudorache et al., 2007).
Una opción poco estudiada de xenoinjerto para válvulas cardíacas es el uso de pericardio
bovino descelularizado (APB) como scaffold con buenas propiedades mecánicas y posibilidad
de colonización autóloga. Su ECM nativa incluye colágeno insoluble, elastina y GAGs. Estos
últimos sirven de reservorio de factor de crecimiento fibroblástico (bFGF) y promueven la
angiogénesis y regeneración tisular (Lai et al., 2006). En el proceso de descelularización,
estos injertos pierden ECM restringiendo la adhesión celular y complicando la siembra celular
y la proliferación de matriz neogenerada. Esto se debe a que al usarse métodos agresivos de
descelularización se pierden GAGs, colágeno y fibronectina. La adhesión celular al colágeno y
la fibronectina de la ECM es mediada por las integrinas, proteínas de la membrana celular.

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Éstas tienen como ligando a las secuencias aminoacídicas RGD (arginina – lisina –
asparagina), presentes en el colágeno y la fibrina. Para mejorar la adhesión celular se
propuso conjugar covalentemente los APB con péptidos RGD, con resultados óptimos (Dong
et al., 2009). Finalmente, es conveniente mencionar que, a menos que los xenoantígenos
sean enmascarados por fijación química o removidos completamente por solubilización y
difusión, los xenoinjertos conllevan una reacción inmunológica (Iwai 2007).

2.1.2. Scaffolds biodegradables


La degradabilidad del scaffold permite la reabsorción y neogeneración de tejido autólogo,
permitiendo una más adecuada adaptación del injerto al particular ambiente interno de cada
paciente. El control de la velocidad de reabsorción de los scaffolds puede lograrse mediante el
control de su porosidad. La mayor porosidad de un scaffold asegura una más rápida
reabsorción, al igual que el mayor tamaño de poro. Scaffolds con poros pequeños y baja
porosidad incluso pueden lograr tasas de degradación menores que estructuras no porosas,
debido al atrapamiento de productos de degradación por los poros aledaños en scaffolds
porosos, y al efecto autocatalizador producido en las estructuras no porosas (Odelius et al.,
2011). Los scaffolds porosos a su vez pueden ser de poros aislados o de poros
interconectados. La propiedad de interconexión depende exclusivamente del método de
fabricación de los poros en el scaffold, y provee como ventaja un mejor crecimiento, migración
y nutrición celular, mejorando la colonización del tejido in vivo (Murphy et al., 2010)
Para mejorar las propiedades mecánicas de los scaffolds biodegradables se proponen
diversas alternativas. Una de ellas es el uso de fibras poliméricas como refuerzo de los
scaffolds. Tal es el caso de las válvulas de quitosano con fibras de quitosano, propuestas por
Albanna et al.. Para su fabricación se usaron heparina sódica USP (un mucopolisacárido
anticoagulante), quitosano de alto y mediano peso molecular (HMW y MMW) obtenido de
caparazones de cangrejo, y 1-etil-3-3-dimetilaminopropil-carbodiimida (EDC). Las fibras de
quitosano fueron producidas por extrusión de quitosano HMW, y el scaffold poroso por colado
de quitosano MMW. Las fibras se distribuyen manualmente en el scaffold antes de congelarlo,
y se agrega la heparina sódica activada por EDC para generar un entrecruzamiento por
heparina de las fibras. Este entrecruzamiento reduce la solubilidad del injerto, y provee al
mismo una matriz para generar uniones proteicas, mejorando la adhesión y proliferación
celular (Albanna et al., 2011).
Otro método para obtener mejores propiedades mecánicas es el uso de polímeros más
resistentes, como el colágeno tipo I. Con este pueden obtenerse poros de entre 115 um y 188
um, adecuados para la proliferación de células CDC, y con módulo elástico y propiedades
mecánicas mejoradas. La combinación con elastina y GAGs puede permitir una mayor
semejanza entre las propiedades del injerto y las válvulas cardíacas reales (Chen, 2012).
Scaffolds porosos de poli-4-hidroxibutarato (P4HB) de 80% de porosidad y poros de entre 200
y 400 um de diámetro también han sido propuestos y probados in vitro, obteniéndose una
buena proliferación de células endoteliales (Sodian et al., 2010).
Las ventajas de los scaffolds sintéticos respecto al xenoinjerto son su reducido potencial
inmunogénico y el conocimiento preciso de las propiedades mecánicas y químicas del
material, permitiendo una mejor predicción del comportamiento in vivo pre-implantación
(Vesely, 2005).

2.2. Técnicas de fabricación


2.2.1. Técnicas de conformado y porificación
Los métodos de fabricación del scaffold poroso se distinguen en métodos de porificación del
material, de conformado del scaffold y de optimización de sus propiedades. Los métodos de
optimización son los mismos que los utilizados para scaffolds biológicos. Muchos métodos de

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conformado del scaffold (como la impresión 3D o el electrospinning) permiten la conformación


de microporos, por lo que estos no necesitan un paso adicional de porificación.
Lixiviado (leaching): proceso de porificación que se vale de un porógeno (como el NaCl,
tamizado para obtener un tamaño de poro determinado). El mismo se deposita sobre un
molde y se inyecta a presión la solución polimérica, de modo que cubra todos los espacios
entre los cristales salinos. Luego se procede a evaporar el solvente por aplicación de vacío,
de modo de obtener una estructura polimérica alrededor de los cristales de las sales. Por
último se eliminan los cristales salinos por disolución (leach out) por lavado continuo con
agua. Como resultado se obtiene una estructura moldeada y porosa. Uno de los problemas de
esta técnica es la dificultad para eliminar completamente el porógeno. Ante esto, se han
propuesto técnicas de lixiviado capa por capa, fáciles de lavar (Gong et al., 2011)
Para resolver el problema de la interconexión de los poros y el control del tamaño de poro se
propuso usar microesferas como porógeno para el lixiviado. En un estudio se usaron
microesferas de gelatina y microesferas de parafina, obteniendo poros esféricos bien definidos
(ver figura). Estos scaffolds mostraron mejores propiedades mecánicas y resistencia al flujo
que los scaffolds con poros no esféricos no homogéneos (Draghi et al., 2005). Además, para
mejorar la dispersión de las sales y la cobertura del polímero de todo el volumen entre las
partículas porificadoras puede usarse un proceso de leaching centrifugado, que evita las
burbujas de aire en la estructura final mejorando las propiedades mecánicas y evitando la
concentración de tensiones (Xingeng Miao et al., 2009).

Figura 3: Imágenes SEM de microporos obtenidos por leaching de: A) microesferas de


gelatina en PLA; B) microesferas de parafina en PLA; C) NaCl en PLA (todas partículas de
200-400 um de diámetro)
Liofilización: la liofilización (o freeze-drying) es uno de los procesos de porificación de
materiales más usados en la actualidad. Se basa en el secado por congelamiento del material,
en el cual se procede a congelar un material disuelto y posteriormente reducir la presión hasta
lograr la sublimación (cambio de estado de líquido a gas) del solvente presente en la muestra.
En el caso de la liofilización de polímeros, esto producirá poros homogéneos con tamaños
dependientes de la temperatura, el vacío y el tiempo aplicados durante el proceso. Un ejemplo
de esto es el uso de scaffolds de colágeno con glicosaminoglicanos (condroitin-6-sulfato,
C6S). Se demostró que a partir de los 100 um de tamaño de poro, la disminución de la
proliferación de tejido óseo es muy sensible al aumento del tamaño de los poros, lo que
muestra que el tamaño de poros debe ser controlado estrictamente. Para esto puede utilizarse
el siguiente proceso: degasificar la muestra para evitar burbujas, enfriar la muestra a tasa
constante hasta una temperatura final bajo cero (-10 a -60°C), templar a 10°C por un
determinado tiempo (que modificará el tamaño del poro) y sublimar el agua por aplicación de
vacío (Murphy et al., 2010)
Separación de fases: técnica de porificación basada en la separación termodinámica de
soluciones homogéneas de polímeros en una solución de alta concentración polimérica y otra
de baja concentración a través de la liofilización. Tiene la ventaja de no usar porificadores, los
cuales suelen ser tóxicos y no permitir la adhesión y crecimiento celular, pero utiliza solventes
orgánicos que pueden dificultar también la celularización. Puede realizarse por exposición a
un solvente inmiscible o por enfriamiento por debajo de la curva binodal de solubilidad (ver

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figura). Estos métodos son llamados emulsificación y secado por congelamiento y


separación de fases inducida por temperatura (TIPS), respectivamente (Martínez-Pérez et
al., 2011).

Figura 4: Representaicón esquemática de la curva binaria de fase de una solución polimérica,


y sus curvas binodal y spinodal. La región supra-binodal es una región estable, que permite
una solución homogénea. La región sub-binodal es una región metaestable, que genera poros
por nucleación y crecimiento. La región sub-espinodal es una región inestable, con generación
de poros por mecanismo espinodal (separación homogénea en todo el material, sin núcleos
de porificacion) (Martínez-Pérez et al., 2011)
La emulsificación consiste en formar una emulsión entre una solución polimérica (por ejemplo,
PLA con diclorometano, naftaleno u otro solvente orgánico de bajo punto de fusión) y un
solvente inmiscible (como agua) por mezcla a alta velocidad (1.000 a 30.000 rpm). Se procede
a moldear la mezcla para permitir su conformación, y luego se enfría rápidamente por
inmersión en nitrógeno líquido, solidificando la estructura líquida (solventes). Se procede a
realizar la liofilización por vacío constante (entre 0,1 y 6 mbar) y a baja temperatura (por
debajo del punto triple del solvente) durante varios días. De este modo los solventes (solución
polimérica pobre) se subliman y lentamente son separados (Niu et al., 2013).
El método de TIPS ha sido bien investigado por su producción de estructuras porosas bien
interconectadas. Se basa en el uso de cambios de la energía térmica para inducir la
separación de la solución polimérica homogénea en varias fases, con mayor o menor
concentración de polímero. Se trata de pre-enfriar la solución a una temperatura inferior a la
curva binodal de solubilidad, adónde se presenta un mecanismo de separación de fases
líquido-líquido o sólido-líquido. Posteriormente se extraen por liofilización las fases separadas
(Martínez-Pérez et al., 2011). Por este método se han fabricado scaffolds de varios
composites de quitosano/nanotubos de carbono multipared (MWCNT), demostrándose que
pueden mejorarse las propiedades mecánicas del scaffold con la adición de pequeñas
cantidades de MWCNT (Olivas-Armendáriz et al., 2009). También se evaluaron composites de
quitosano/fibras de PLGA, y se demostraron propiedades mecánicas mejoradas respecto a las
malas propiedades del quitosano (Martel-Estrada et al., 2010).
Un nuevo método con potencial utilidad es el uso de freeze-drying con un proceso simultáneo
de entrecruzamiento de fibras poliméricas (crosslinking). El crosslinking de polisacáridos
puede llevarse a cabo durante la liofilización gracias a la mezcla de agentes entrecruzadores
(como el STMP, succinimidiloxicarbonil-metil-2-pirimidilditiol-tolueno, de aminas a fulfhidrilos).

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De este modo se obtuvieron hidrogeles tan estables como los scaffolds no porosos (Autissier
et al., 2010).
En cualquiera de los procedimientos anteriores se puede controlar la morfología y tamaño de
los poros modificando la composición (ver figura), la solución, la temperatura y el vacío al que
se someten. Mayor cantidad de solvente logrará estructuras más débiles pero más porosas.
Temperaturas inmediatamente inferiores que la de fusión del solvente lograrán una separación
por nucleación y crecimiento, formando poros esféricos y poco conectados, mientras que
temperaturas más bajas lograrán poros filamentosos o cilíndricos muy bien interconectados.
Vacíos más bajos (0,1 mbar) lograrán más rápida sublimación, obteniendo poros más
pequeños e interconectados. Cualquiera de los métodos puede ser sometido a templado para
lograr ampliación de los dominios porosos. Pueden lograrse porosidades mayores al 90%, con
tamaño de poros pequeños (de hasta 1-10 um de diámetro) o grandes (de 100 um, poco
homogéneos y difíciles de obtener) (Patel, Bonde y Srinivasan, 2010)

Figura 5: Modificación del tamaño de poro con la composición del material (por separación de
fases). Medio: colágeno (100%) con poros de 100 um de diámetro. Izquierda:
colágeno/elastina con poros de 140-180 um (volúmen de colágeno-elastina: arriba 50%-
%50%; abajo 20%-80%). Derecha: colágeno/C4S con poros de 80-50 um (volúmen de
colágeno-C4S: arriba 90%-%10%; abajo 50%-50%) (modificado de: Chen et al., 2012)
Espumado gaseoso: técnica de porificación que evade completamente el uso de solventes
orgánicos citotóxicos. Utiliza la nucleación y crecimiento de burbujas de gas dispersadas en
una solución polimérica viscosa, las cuales pueden ser creadas por agentes químicos
espumantes. Fluidos supercríticos (por ejemplo, CO2 a presión, poco inflamable, no tóxico y
punto crítico bajo) pueden ser eficientes en la formación de polímeros saturados de gas por su
buena transferencia de masa, tensión superficial nula y densidad ajustable por presión y
temperatura. La porificación se da en 2 etapas: 1. Creación de una fase polimérica saturada
de gas, y 2. Nucleación, crecimiento de poros y coalescencia (despresurización). El CO2 a
alta presión aumenta su solubilidad en el material, que al despresurizarse disminuye
(supersaturación de CO2) formándose núcleos de moléculas del gas. Estos crecen hasta que
el polímero vitrifica (Ji et al., 2012)
Se pueden modificar los parámetros de fabricación para lograr los scaffolds más adecuados
en cuanto a propiedades mecánicas y tamaño de poros para una correcta nucleación celular y
proliferación, pero los controles no son precisos y los poros tienen una gran dispersión de
tamaños. Entre los parámetros modificables están la temperatura del proceso, grado de
saturación, presión hidrostática, energía interfacial y propiedades viscoelástica de la mezcla
gas/polímero. Las desventajas de este método son la mala interconexión de los poros y la

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imposibilidad de usar materiales termolábiles, que son afectados por el calentamiento durante
el moldeado a compresión (Stella et al., 2010).

Moldeado: Método de conformación de scaffolds basado en el llenado de un molde por una


resina líquida (ya sea en condiciones normales o a alta temperatura o alta presión), que
posteriormente se endurecerá. La resina puede ser el polímero final derretido o una solución
monomérica que se hará polimerizar. Se utiliza como el paso común de modelado simultáneo
o posterior a determinados métodos de porificación, como el lixiviado y el espumado gaseoso.
Existen diversos tipos más modernos de moldeado, que se describen a continuación.
El solvent-casting (moldeado por solución) es el más común de los procesos de moldeado.
Se basa en la disolución de un polímero en un solvente (cloroformo, cloruro de metileno) que
pueda ser posteriormente extraído (por secado por vacío, evaporación, insolubilización del
polímero y lavado, etc) sin dañar la morfología y estructura del material (Xingeng Miao et al.,
2009).
El gel casting (moldeado por gel) es una técnica usada primeramente para crear estructuras
cerámicas o metálicas, ya sean porosas o densas. Se trata de formar un gel por
polimerización in situ (sobre un molde) de monómeros orgánicos. La mezcla inicial (slurry)
está compuesta del monómero, el solvente, los polvos cerámicos o de la sustancia a moldear
y aditivos (como crosslinkers, plastificadores, etc). El gel une a las partículas del material
deseado, y posteriormente se elimina el solvente por calor y el gel durante la sinterización de
las partículas por calor o químicamente (Wu et al., 2011).
El freeze casting (moldeado por congelamiento) es un proceso físico que utiliza el principio
de solidificación direccional de un vehículo líquido (por ejemplo, agua, campeno o campeno-
naftaleno) para moldear diversos tipos de materiales, como polímeros, cerámicas e incluso
metales (Fife et al., 2009). Se prepara una mezcla (slurry) polimérica con el vehículo líquido y
aditivos, se la degasifica y se llena un molde (típicamente de PTFE sellado en el piso por un
plato de cobre) que será enfriado direccionalmente por un cold-finger de cobre. Puede usarse
en enfriado bidireccional, sellando el molde con un techo de cobre y un segundo cold-finger.
Una vez finalizada la solidificación, se retira el material del molde y se realiza una liofilización
para eliminar el vehículo líquido solidificado (Wegst, Schecter, Donius y Hunger, 2010).
La velocidad de congelamiento de los frentes fríos determinará la concentración del polímero
en las diferentes zonas del scaffold. Un rápido congelamiento atrapará las partículas, mientras
que si se congela lentamente las empujará por arrastre viscoso. Otro parámetro que
determina las propiedades mecánicas del material es el vehículo líquido elegido y sus
propiedades de congelamiento. Una de las ventajas de este proceso es que usa sustancias
benignas, como el agua, evitando químicos porificadores y sustancias citotóxicas. Además
puede controlar la porosidad, tamaño y geometría del poro con bastante precisión, y no utiliza
etapas calientes que pueden dañar los polímeros (Hunger, Donius y Wegst, 2013)
Entrecruzamiento de fibras: proceso de conformación de scaffolds intrínsecamente porosos,
basado en la deposición de fibras en un molde y su posterior unión por uno de tres procesos:
1. Agregado de polímeros de menor punto de fusión disueltos que rellenen los huecos de la
red de fibras, de modo de evaporar el solvente y derretir ambos polímeros formando una
“soldadura” entre los 2 polímeros del composite (Este método fue utilizado para unir fibras de
PGA soldados con PLLA); 2. Atomizando un polímero disuelto que cubra las fibras no solubles
del scaffold (como la atomización de PLLA o PLGA en cloroformo para cubrir PGA) y
evaporando el solvente dejando las fibras pegadas por el polímero; 3. Utilizando agentes
químicos que mejoren la adhesión interfacial de fibras y matriz, con formación de puentes de
enlaces químicos (Mikos y Temenoff, 2000).
Un tipo de entrecruzamiento sencillo sin agregado de material de soldadura se da por
sinterización. En este proceso, usado por ejemplo para fibras de almidón-PCL (SPCL, o
starch-PCL), se cortan las fibras largas y se las coloca dentro de un molde, el cual es

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calentado para producir soldadura dura o sinterización. Al sacar del horno, se comprimen y se
enfrían las fibras y se esterilizan (Rodrigues et al., 2012).
Con esta técnica se logran tejidos con propiedades de adhesión y crecimiento celular
mejoradas respecto de otros scaffolds porosos, además de mejorar las propiedades
mecánicas por la unión entre las fibras y la matriz (ver figura). Una desventaja mayor es el uso
de solventes orgánicos, los cuales dificultan o impiden el crecimiento celular si no son
completamente removidos, para lo cual se requieren largos tiempos de lavado y secado al
vacío. Además existe calentamiento a altas temperaturas, lo cual es perjudicial para los
polímeros y biomoléculas (factores de crecimiento, etc) intervinientes, y es difícil controlar las
propiedades de los poros (Ku et al., 2011).

Figura 6: Fabricación de scaffolds fibrosos mediante entrecruzamiento de fibras con


aplicación de PGG (penta-galloyl glucose) en moldes de válvulas porcinas. (Tedder et al.,
2011)
Solid freeform fabrication (SFF): conjunto de procesos de conformación de scaffolds capa
por capa, desde un modelo previamente diseñado en computadora (CAD). Permiten el diseño
exacto de toda la estructura del scaffold (incluyendo sus porosidades). Utiliza equipamiento
esencialmente costoso y requiere de detallados procesos de diseño y corrección debido a Ia
contracción anisótropa durante Ia fabricación, y usa procesos térmicos que impiden el
agregado de biomoléculas como proteínas morfogénicas y factores de crecimiento a los
scaffolds, ya que estas se degradan con el calor. A cambio se obtienen arquitecturas precisas
y a medida para cada problema, sin el uso de solventes orgánicos (Kang et al., 2011). Permite
el uso de polímeros, cerámicas y metales, e incluye diversas estrategias, nombradas a
continuación:
- Microfabricación: conjunto de procesos basados en el diseño ayudado por
computadora (CAD), que incluyen el micromoldeado y la microablación láser. Permiten
la conformación de superficies porosas, pero para lograr injertos 3D requieren de
equipamiento adicional y procesos como el sinterizado láser. Como ambos métodos
proveen similares características mecánicas, pueden combinarse para generar
patrones e injertos de formas más complejas (Guillemette, 2010).
Para el micromoldeado, una oblea de material maquinable (como el composite glass-
mica) es maquinada por una sierra de precisión con punta micrométrica de diamante.
El molde es cubierto por una capa sacrificial de sacarosa y se hornea. Posteriormente
puede aplicársele el polímero derretido y esparcido con espátula de forma uniforme.
Se cura en alto vacío y alta temperatura durante horas, y se disuelve la capa sacrificial
con agua destilada para poder desprender fácilmente el modelo. Un ejemplo es la
microfabricación de patrones romboidales como cubierta de los scaffolds, que los

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provee propiedades mecánicas anisotrópicas similares a las que se ven en las válvulas
humanas naturales (Masoumi et al., 2013)
Por otro lado, la microfabricación láser permite lograr resultados similares con ayuda
del CAD, máscaras resistentes al láser (en general hechas de alúmina) y un láser que
maquina directamente el scaffold polimérico (Masoumi et al., 2012). Puede usarse
para lograr estructuras 3D si se combina con procesos de sinterización. Para eso se
requieren polvos de polímeros que serán sometidos a lásers (de CO2, en general) con
movimientos micrométricos controlados por computadora según un proyecto de trabajo
diseñado con software de CAD. Estos se encargarán de derretir los polvos poliméricos
(sinterización) y formar geometrías complejas capa por capa, sin usar sustancias
tóxicas ni estructuras de soporte (Lohfeld et al., 2010)
- Estereolitografía (Fotolitografía): proceso aditivo de fabricación de scaffolds capa
por capa que se guía por diseños CAD (que pueden incluso ser tomados de scans de
resonancia magnética o tomografía computada). Se basa en la solidificación de una
resina líquida por fotopolimerización usando un láser controlado por computadora. Una
vez solidificada la primera capa, se baja una plataforma permitiendo llenar una
segunda capa con resina líquida, y se vuelve a someter al tratamiento láser a una
nueva capa. Este proceso se repite hasta lograr el sólido 3D deseado. En general se
requieren procesos de post-curado para completar la conversión de grupos reactivos
(en general por luz UV estroboscópica) (Melchels, Feijen y Grijpma, 2010).
Electrospinning: el electrospinning es una técnica muy rápida de producción electrostática de
largas fibras tridimensionales con diámetros desde algunos nanómetros hasta micrómetros y
longitudes de hasta 1 km. Una de las propiedades principales del uso de estas fibras en
estructuras es la gran relación de área de contacto por unidad de masa, además de la alta
porosidad, bajo peso específico y bajo costo de material (Chronakis, 2010).

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Figura 7: Diagrama esquemático de los 2 setups para electrospinning. A) Setup horizontal. B)


Setup vertical (Bhardwaj y Kundu, 2010).
Existen dos setups estándar: el electrospinning horziontal y el vertical (ver figura). Requiere de
una fuente de alto voltaje (decenas de kV), un spinneret (la punta de una pipeta o jeringa) y un
plato colector puesto a tierra. Se introducen polímeros líquidos o soluciones poliméricas en el
tubo capilar, los cuales se mantienen suspendidos de la punta abierta de la jeringa por su
tensión superficial. Una vez aplicado el campo eléctrico, las fuerzas electrostáticas llegan a
vencer a las viscosas, lográndose la aceleración de un chorro (jet) de polímero hacia el plato
(ver figura). Una vez fuera del spinneret, el chorro deja de ser estable. El gran área de
contacto que tiene el chorro hace evaporar rápidamente al solvente, dejando sólo una larga
fibra polimérica (Baji et al., 2010)

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Figura 8: Ilustración esquemática del proceso de formación del chorro (jet). A) El campo
eléctrico induce cargas de superficie en la solución polimérica. B) Se elonga la gota
suspendida. C) Se deforma la gota hasta formar un cono de Taylor debido a la repulsión de
cargas del mismos signo en superficies aledañas. Se crea un chorro fino (Baji et al., 2010)
Puede usarse una gran diversidad de polímeros con esta técnica. Proteínas frecuentemente
utilizadas son el colágeno, la gelatina, caseína, acetato de celulosa, proteína de seda, quitina
y fibrinógeno. Sin embargo, se ha demostrado en los últimos años desnaturalización de estos
polímeros naturales, en especial de colágeno en gelatina, lo cual es un gran problema a
considerar (Zeugolis et al., 2008). Polímeros sintéticos usados son los poliésteres hidrofóbicos
biodegradables como PGA, PLA y PCL. También se usa en poliuretano (PU) y copolímeros
PLGA y PLLA-PCL para scaffolds en ingeniería de tejidos. Otros biopolímeros, como el
quitosano y el ácido hialurónico presentan también un gran uso por electrospinning (Bhardwaj
y Kundu, 2010).

2.2.2. Técnicas de mejora de las propiedades


Crosslinking: Es un proceso de endurecimiento de ciertos polímeros, como el colágeno. Se
logra por el entrecruzamiento por factores físicos o químicos de las fibras de polímeros
fibrosos. El caso más estudiado es el entrecruzamiento químico. Este puede lograrse con
hidroclorato de N-3-dimetilaminopropil-N-etilcarbodiimida (EDC).
En scaffolds de colágeno con glucosaminoglicanos C6S puede lograrse mediante un
tratamiento de dehidrotermalización (DHT). Este método es uno de los más nuevos, y consiste
en el calentamiento en vacío de la muestra (templado) por tiempos mayores a 1 día y a
temperaturas mayores a la temperatura de cristalización (para el caso del colágeno, entre
105°C y 180°C). Este procedimiento remueve agua del colágeno, produciendo dos efectos
bien diferenciados: por un lado, entrecruzamiento de fibras en determinados puntos de
contacto por reacciones de condensación por esterificación o formación de amidas; por el
otro, desnaturalización de los polímeros. El entrecruzamiento sólo es afectado por la
temperatura de templado, y produce variaciones en el módulo de compresión, mientras que la
desnaturalización es afectada por la temperatura y el tiempo de exposición, y produce
variaciones en el módulo tensil de la muestra (Haugh et al., 2009)
En general, este proceso se utiliza con polímeros con malas propiedades mecánicas o con
elevada tasa de absorción. Tal es el caso de los scaffolds de colágeno por electrospinning,
cuya estabilidad es muy baja. En estos injertos, los métodos de crosslinking químico producen
efectos indeseados de citotoxicidad y requieren procedimientos adicionales de enjuague muy
largos para la remoción total del químico utlizado. En estos casos es preferible el
entrecruzamiento físico por DHT (Drexler y Powell, 2010)
Photografting: adición covalente de grupos funcionales o monómeros a una matriz polimérica
por mecanismos inducidos por luz u otras ondas electromagnéticas. Se usa para mejorar las
propiedades de un injerto. Los hidrogeles, por ejemplo, son estructuras 3D poliméricas
entrecruzadas con propiedades hidrofílicas (bajo ángulo de contacto con el agua) y bajo
coeficiente de fricción, lo que los hace buenos para reemplazar tejidos blandos. Sin embargo,
sus propiedades mecánicas y biológicas (reabsorción) son malas, y pueden mejorar por
photografting. Es el caso del PVA, al que puede adicionársele monómeros de mayor hidrofilia
como la N-vinil pirrolidina (NVP), el polietilen glicol (PEG), el ácido acrílico (MMA) o el ácido
poli-láctico-co-glicólico por formación de enlaces hidrógeno. Estos puentes hidrógenos serán
forzados a formar enláces covalentes usando radiación gamma de alta energía (Jabbari y
Karbasi, 2003)

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2.3. Métodos de esterilización


Los métodos de esterilización de scaffolds varían dependiendo de las características del
material que compone el scaffold. No existe un método ideal, ni siquiera aún para un material
en particular. En los estudios de comparación de métodos de esterilización el resultado
depende de numerosos aspectos, con lo que la decisión sobre cómo esterilizar es un
problema complejo.
La esterilización mediante EtO (Ethylene oxide) asegura la completa eliminación de
contaminación biológica en el material, tiene gran penetrabilidad y compatibilidad, y puede
usarse en polímeros degradables y scaffolds porosos. Un protocolo utilizado en esterilización
de scaffolds de PGA mediante EtO consiste en secar por vacío durante 24 horas el material
para posteriormente esterilizarlo (Weber et al., 2011). Sin embargo, este método está siendo
dejado de lado por las características tóxicas del EtO (Freytes et al., 2006).
La esterilización a través de distintos tipos de radiación también es ampliamente utilizada, y se
ha comprobado que la aplicación de la dosis necesaria de radiación Gamma de alta energía
para lograr esterilidad en el material produce daños menores en la estructura del mismo (Di
Foggia et al., 2010). El uso de haces de electrones incidentes en el material está ampliamente
difundido no sólo en scaffolds, sino también en gran variedad de elementos médicos, pero
flaquea en su baja penetrabilidad (Dhandayuthapani, 2011). La radiación aplicada puede no
sólo esterilizar el material, sino también mejorar las propiedades del mismo, mediante
cambios en su microestructura (Plikk, 2006).
Un método ampliamente utilizado trabaja mediante la aplicación de calor, ya sea mediante
vapor o calor seco. Estos agentes esterilizantes aventajan a la aplicación de químicos y/o
radiación, sobre todo en el uso de tejidos naturales como scaffolds, ya que no dañan
significativamente la estructura del mismo y son menos costosos, además de no aportar
residuos tóxicos (Shamis et al., 2009).
Un enfoque novedoso en la esterilización de scaffolds se basa en la aplicación de microondas.
La estructura y la biocompatibilidad del material no son afectadas por este agente de
esterilización, por lo que la durabilidad y la funcionalidad de la válvula no se ven
comprometidas, y se logra la inactivación de las bacterias presentes en el tejido natural usado
como scaffold (Shamis et al., 2009).
Los mejores resultados en cuanto a esterilización y conservación de las propiedades del
scaffold se obtuvieron mediante aplicación de plasma de argón. Este es óptimo para una
esterilización remota por radiofrecuencia (radio-frequency glow discharge, RFGD) sobre
polímeros de PTFE sin afectar la forma e incluso mejorando sus propiedades anti-
trombogénicas (ver figura). Es un proceso de bajo costo en relación al beneficio, poco
contaminante y de baja temperatura. La gran diferencia entre la esterilización remota y la
directa es que en lugar de someterse al material a una atmósfera de plasma de argón (lo cual
puede resultar un proceso muy dañino), se separan las partículas activas y se las aplica sobre
el material con independencia espacial de la fuente de descargas. De este modo se asegura
un daño mínimo (casi imperceptible) de las superficies, y una mejora en las propiedades
finales (Hongxia y Jierong, 2008).

Figura 9: Análisis con microscopio electrónico (x3000) de láminas de PTFE luego de ser
sometidas a goteo de plasma sanguíneo de alta concentración plaquetaria: a) No esterilizado,
b) c) y d) Esterilizado con plasma de argón a 100 W (óptimo) durante 2 minutos a 20 cm 3/s de

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argón, variando el posicionamiento de la muestra a b) 0, c) 20, d) 40 cm del generador de


plasma. Puede verse una mejoría en la propiedad anti-adhesiva del PTFE al ser esterilizado,
con una situación óptima a 20 cm, una distancia adecuada teniendo en cuenta que mientras
más se aleja la muestra, más disminuye el efecto germicida (modificado de: Liu Hongxia,
Chen Jierong: op. cit)

2.4. Materiales para scaffolds


La elección adecuada del material del scaffold depende de una serie de factores que den
tenerse en cuenta: mecanismo de degradación, tasa de degradación, biocompatibilidad,
propiedades mecánicas, facilidad de fabricación, técnicas de conformado posibles para dicho
material y simplicidad de manejo para intervenciones quirúrgicas. En cuanto a la tasa de
degradación, existen 2 tipos fundamentales de materiales que corresponden a las 2 grandes
estrategias de la ingeniería de tejidos: los materiales no biodegradables pretenden crear un
scaffold completamente funcional pre-implantación, que permanecerá en el cuerpo hasta su
reemplazo o la muerte del paciente; los materiales biodegradables aprovechan la capacidad
de reparación y dinamismo de los tejidos biológicos a través de scaffolds que interactuarán
fuertemente con el organismo, de modo que éste los modelará y eventualmente los
reabsorberá, generando en su lugar tejido atólogo funcional, más adecuado a las funciones
reales del organismo que el injerto original (Amoabediny et al., 2011).
2.4.1. Materiales no biodegradables
Si bien la estrategia de scaffolds no biodegradables para válvulas cardíacas se ha dejado de
lado en los últimos años, todavía se utilizan materiales cosiderados no biodegradables en
combinación con polímeros biodegradables, permitiendo tasas de degradación relativamente
bajas pero controlables según la necesidad. Las cerámicas bioactivas (hidroxiapatita -HAP-,
fosfato tricálcico -TCP-, y algunos composites de vidrios de silicato y fosfatos -biovidrios- y
cerámicas vítreas) reaccionan con fluídos fisiológicos y a través de la actividad celular forman
fuertes uniones con los tejidos duros, y a veces también con los blandos. Es una interesante
estrategia para obtener buenas propiedades mecánicas con adecuada tasa de degradación y
biocompatibilidad (Dhandayuthapani et al., 2011).

2.4.2. Materiales biodegradables


a) Polímeros naturales:
Los polímeros naturales pueden ser considerados los primeros polímeros degradables usados
clínicamente. Por ser naturales, estos materiales tienen propiedades bioactivas e
interaccionan mejor con las células y el ambiente biológico, permitiéndoles mejorar la función
celular. Pueden ser clasificados en proteínas (seda, colágeno, gelatina, fribrinógeno, elastina,
keratina, actina y miosina), polisacáridos (celulosa, amilosa, dextrano, quitina y GAGs) o
polinucleótidos (ADN y ARN) (Dhandayuthapani et al., 2011).
Colágeno: el colágeno es la proteína estructural más abundante en animales. Comprende 1/3
del total de proteína humana y es el componente prevalente en la ECM. Se conocen al menos
26 tipos de colágeno de animales vertebrados, compuestos por 46 diferentes cadenas
polipeptídicas (Yang, Kaufman 2009).
Cada molécula de colágeno (fibra) se compone de una triple cadena polipeptídica
(tropocolágeno), cada una de las cadenas siendo una hélice alfa (2 hélices alfa 1 y una hélice
alfa 2). La triple hélice es una estructura del tipo poliprolina II (PPII), densamente empacada y
con las puntas no trenzadas, permitiendo la formación de entrecruzamientos entre fibrillas de
colágeno por unión de las puntas y reduciendo su solubilidad. El colágeno insoluble debe ser
precalentado (T>45°C) para la liberación de los entrecruzamientos y su extracción. De este
modo se produce una estructura de red 3D de fibras de colágeno resistentes (ver figura)
(Gómez-Guillén et al., 2011).

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Figura 10: Microfotografía electrónica (SEM) de la red de colágeno tipo I de un scaffold


vascular (Stegemann et al., 2007)
La secuencia de aminoácidos (AA) de las cadenas son tripletes con el 3er AA siendo siempre
glicina (Gly). Los otros 2 AA son en general 2-S-Prolina (Pro, 28%) y (2S,4R)-4-hidroxiprolina
(Hyp, 38%). En su forma desnaturalizada (gelatina), las 3 fibras que componen el
tropocolágeno se separan desde las puntas, formando una estructura terciaria globular y
perdiendo la forma de PPII. El colágeno así encontrado se usa para la fabricación de gelatinas
saborizadas en la industria alimenticia, y para la industria cosmética (Yang, Kaufman, 2009).
Compone membranas, tejidos de soporte y cubiertas. Las categorías del colágeno incluyen: 1.
Colágeno fibrilar; 2. Colágeno formador de redes; 3. FACIT (fibril-associated collagens with
interrupted triple helices); 4. MACIT (membrane-asociated collagens with interrupted triple
hélices); 5. MULTIPLEXIN (multiple triple-helix domains and interruptions) (Gara, 2010).
Pocas proteínas relacionadas al colágeno (CRPs) han sido usadas como biomateriales. Se
demostró que las CRP que muestran peptoides en su cadena tienen una notable habilidad
para unirse a células epiteliales y fibroblastos. Además, los CRP son útiles para inducir
agregación plaquetaria para ayudar al proceso de regeneración de tejido. Por último, las
monofibras de CRP y CRP conjugadas con polietilenglicol se unen naturalmente a fibras y
films de colágeno (Shoulders y Raines, 2009).
La extracción de colágeno produce un pool de cadenas alfa, componentes beta (2 cadenas
alfa unidas covalentemente) y componentes gamma (3 cadenas alfa), además de otros
agregados moleculares complejos. Las fuentes de colágeno son en general animales: piel de
cerdo, cuero bovino, residuos proteicos de la industria del cuero, piel de atún, tendones de
diversos mamíferos. El colágeno de mamíferos tiene mejores propiedades físicas que el de
peces, en general por su alto contenido de iminoácidos (Gómez-Estaca et al., 2009).
Una posible fuente alternativa de colágeno es el uso de desechos de la industria del cuero. En
esta, grandes cantidades de material rico en lípidos y proteínas (en general por procesos de
separación del cuero de la carne y de recorte del cuero), siendo el colágeno tipo I la proteína
más abundante. Esta le da al cuero y la piel las propiedades de elasticidad y resistencia a la
tracción. Para la extracción del colágeno se usan procesos de lavado con ácidos y extracción
o compresión a alta temperatura. Las encargadas de la separación proteica pueden ser
enzimas proteolíticas (por ejemplo, papaína y neutrasa) o ácidos (como el ácido fosfórico)
según la fuente utilizada (Sundar et al., 2011)

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Es una práctica común el uso de polímeros naturales como el colágeno como proveedores de
soporte y propiedades mecánicas específicas, combinados con polímeros sintéticos para
control de las tasas de absorción y conformado de sitios de adhesión celular (a través de
poros o mallas tejidas). Por ejemplo, fueron desarrollados scaffolds de colágeno como soporte
con PGA, PCL y PLLA mallados, con buena formación de tejido gracias a la biodegradación
de los polímeros sintéticos, y buenas propiedades biomecánicas provistas por el colágeno
(Torikai et al., 2008). Los scaffolds de colágeno con elastina mejoran el tamaño de poros y
proveen mayor flexibilidad, pero con peores propiedades de adhesión y proliferación celular.
En cambio, el agregado de condroitin-4-sulfato (C4S) disminuye los poros pero aumenta la
invasión y proliferación celular (Chen et al., 2012).
Elastina y ELP: la elastina es una proteína de la ECM encontrada predominantemente en
tejido conectivo de arterias, piel, pulmones y ligamentos, tejidos a los cuales les provee una
gran elasticidad. La tropoelastina, el precursor soluble de la elastina, está compuesta de
dominios entrecruzados alternativos hidrofóbicos e hidrofílicos. Los residuos de lisina (Lys) en
toda la extensión de la cadena de tropoelastina permiten su entrecruzamiento a través de
enzimas, creando fibrillas de elastina insoluble. Los dominios hidrofóbicos de tropoelastina
son solubles en ciertas condiciones de temperatura, pH, luz y disparadores redox, por lo que
entran en la clasificación de polímeros inteligentes (que responden ante estímulos) (MacEwan
y Chilkoti, 2009).
La estabilidad de la elastina, su resistencia a la tracción, su resiliencia y su elasticidad están
relacionadas directamente con la densidad y características de sus entrecruzamientos, los
cuales proveen la funcionalidad y estructura de la ECM, en especial en arterias. El
entrecruzamiento se produce por desaminación oxidativa espontánea de los residuos de Lys
de la tropoelastina mediada por lisil-oxidasa. Esta enzima entrecruza residuos de alisina y de
lisina para formar desmosina (DES) e isodesmosina (IDE), enlaces que resisten la elastólisis,
solubilización y proveen las propiedades biomecánicas de la proteína. La degradación de la
elastina puede producir y complicar placas de ateroma y aneurismas, así como también
envejecer válvulas cardíacas (Umeda, Aikawa y Libby, 2011)
Se demostró que la elastina es un polímero importante en la ECM de las válvulas cardíacas.
Es parte fundamental de la lámina ventricular (LV) de la estructura trilaminar de las válvulas.
Por otro lado, la evidencia demuestra que la degradación de la red de elastina tiene un rol
fundamental en la estenosis aórtica por calcificación, una de las principales causas de falla
valvular en la vejez y en los injertos valvulares biológicos y sintéticos, y la principal causa de
reemplazo valvular en el mundo. Las válvulas patológicas explantadas mostraron una severa
desorganización y fragmentación de la red de elastina, con fibrosis intersticial, depósitos de
calcio y acumulación de lípidos en la ECM (Perrota et al., 2011). Además se demostró que la
elastina reduce la proliferación de células musculares lisas y que sirve como sitio de
nucleación de la calcificación. Para evitar esto pueden usarse GAGs y factor de crecimiento
fibroblástico básico (bFGF) (Filová et al., 2009).
Se desarrolló un injerto trilaminar de válvula aórtica, imitando a las válvulas naturales. Las
válvulas naturales tienen una composición proteica de 40 a 50% de elastina y 25 a 30% de
colágeno. Para la ECM no proteica se utilizó policaprolactona (PCL), con elastina y colágeno
tipo I. Se depositaron por electrospinning, secuencialmente para generar una capa interna
(íntima), una intermedia (media) y una externa (adventicia), cada una con una mezcla
polimérica específica. Los resultados demuestran que dicho injerto imita adecuadamente las
propiedades anisotrópicas de las válvulas cardíacas (McClure et al., 2010).
La elastina no se usa como único componente del scaffold, sino que se busca reforzarla con
fibras colagénicas o usarla como aditivo para scaffolds de otros polímeros. Tal es el caso del
scaffold bilaminar de colágeno-elastina propuesto por Qi Chen et al.. Se observó que este
modelo proporcionó un módulo elástico y un módulo de flexión anisotrópicos similares a los
naturales, cuyo comportamiento ante tensiones es similar al mostrado en las válvulas
humanas (Chen et al., 2013).

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La elastina se obtiene principalmente del ligamento nucal de bovinos y otros mamíferos, por lo
que es poco abundante y de difícil producción masiva.
Los ELP (elastin-like polipeptides) son polímeros cuyas secuencias aminoacídicas
(repeticiones de VPAVG) se encuentran naturalmente en la elastina, en sus dominios
hidrofóbicos. Los ELP responden a la temperatura alterando su funcionalidad y solubilidad, y
se caracterizan por su transición de fase inversa (varias moléculas se asocian
hidrofóbicamente al aumentar la temperatura). Los SELP (silk-elastin-like polipeptides) son
polímeros derivados de los ELP, con secuencias de AA de seda (GAGAGS). No sólo
responden a la temperatura, sino también al pH y la concentración iónica. Las características
biomecánicas de los ELP y los SELP y sus interacciones con los tejidos son similares a las de
la elastina, pero pueden ser mejoradas modificando las secuencias de AA y la longitud de la
cadena. La producción de ELP y SELP puede realizarse a medida por ingeniería genética de
bacterias o células eucariotas heterólogas, controlando con precisión sus AA y peso molecular
y permitiendo una producción masiva (la Escherichia coli es una gran candidata en ese
sentido) (Collins et al., 2013)
Los ELP son biocompatibles, biodegradables, no inmunogénicos y sus propiedades pueden
hacerse a medida, imitando o no a las de la elastina. Pueden ser procesadas como geles,
films, espumas y fibras. Pueden además contener secuencias RGD (arg-lys-asp), REDV (arg-
glu-asp-val) o EILDV (glu-ile-leu-asp-val), secuencias reconocidas por las integrinas celulares
como propias de su ECM y que promueven la adhesión celular (Danhier et al., 2012). Los ELP
ya han sido usados como materiales para scaffolds de injertos vasculares (Nettles et al., 2010)
Quitina y quitosano: la quitina (poli-β-1-4-N-acetil-D-glucosamina) (ver figura) es un
biopolímero natural (polisacárido lineal) encontrado en el exoesqueleto de moluscos y
crustáceos. Es el polímero más producido en el mundo después de la celulosa. Es
biocompatible, biodegradable y puede ligarse a superficies cargadas negativamente, como las
membranas mucosas, por lo que puede ser usado como transportador de principios activos a
través de las superficies epiteliales. El quitosano es el derivado desacetilado de la quitina, por
condiciones alcalinas (NaOH) o hidrólisis por la enzima quitina-desacetilasa (Jayakumar et al.,
2010).

Figura 11: Molécula de N-acetil-D-glucosamida polimerizada (quitosano) por enláces alfa


glucosídicos (esteres)
Otra variante del quitosano es el quitosano modificado (MCN), el cual es un polímero
catiónico altamente cargado, lo cual permite una gran adsorción en matrices de polímeros de
carga negativa, como las de quitosano o las fibras de carboximetil celulosa (CMC).
Combinaciones de estos polímeros permiten formar scaffolds de mayor resistencia, superando
la desventaja del quitosano de sus malas propiedades mecánicas (Fatehi et al., 2010).
Se han realizado scaffolds de hidrogeles de quitina/poli-3-hidroxibutarato-co-3-hidroxivalerato
para reemplazo de piel por heridas y quemaduras (Sankar et al., 2012). Por sus pobres
propiedades mecánicas inherentes deben ser usados combinados con otros polímeros
cuando se requieren suplir funciones de soporte. Tal es el caso de las valvas de quitosano-

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gelatina-poliuretano desarrolladas por Wong et al. (Wong et al., 2010). Sin embargo, se ha
intentado también reforzar el quitosano con fibras de quitosano, las cuales fueron exitosas en
proveer propiedades mecánicas mejoradas al scaffold valvular (Albanna et al., 2012).
Se usa también al quitosano como refuerzo de válvulas de colágeno (Li et al., 2006) y de
PLLA (Li et al., 2009), demostrando una gran mejoría de las propiedades mecánicas en
ambos casos. También se demostró una mejora adherencia, proliferación y diferenciación
celular, reduciendo la tendencia a la mineralización de los respectivos scaffolds. Los recientes
estudios de Wang et al. demostraron que una matriz de nanofibras de PLLA reforzada con
fibras de chitosano permite un mayor control y predicción de las propiedades mecánicas
finales del injerto (Wang et al., 2009).
Celulosa y celulosa bacteriana (BC): la celulosa es un biopolímero (homopolisacárido de β-
glucosa) producido por las plantas para sus paredes celulares. Es el polímero más abundante
en la tierra, y se forma por enlace β-1,4-O-glucosídico. Sus propiedades mecánicas la hacen
uno de los polímeros más resistentes, y si bien es biodegradable, su degradación se produce
por hidrólisis, la cual es muy poco probable por su estructura compacta. La celulosa
bacteriana es una nanofibra de celulosa producida por bacterias (gluconacetobacter,
acanthamoeba, achromobacter, zoogloea), que sólo se diferencia de la celulosa vegetal en la
longitud de sus fibras. La red de nanofibras es muy similar a las redes poliméricas que
conforman la ECM, por lo que es potencialmente muy útil en el campo de la ingeniería de
tejidos. La BC es más fácil de sintetizar y separar para uso médico, ya que no posee lignina,
hemicelulosa ni otras moléculas que deben ser separadas para uso médico del material.
Ambos tienen gran resistencia y son fácilmente conformables (Petersen y Gatenholm, 2011)
Varios materiales compuestos (composites) de celulosa se desarrollaron como posibles
scaffolds para válvulas cardíacas. Un ejemplo de esto es el hidrogel de PVA-BC (alcohol
polivinilico y celulosa bacteriana) que imita el comportamiento mecánico no lineal y
anisotrópico de las válvulas porcinas. Para esto se usaron nanofibras de celulosa como
refuerzo fibroso, para evitar el problema de la falla por ruptura y calcificación valvular debida a
los esfuerzos dinámicos del torrente sanguíneo (Mohammadi, 2010).
Una alternativa a la celulosa es la carboximetil celulosa (CMC), polímero aniónico muy usado
en la industria del papel como refuerzo mecánico. Esta puede agregarse a matrices de
diversos materiales para formar composites más resistentes (Fatehi et al., 2010).

b) Polímeros sintéticos:
Los polímeros sintéticos son muy útiles en el campo biomédico debido a que sus propiedades
(porosidad, tasa de reabsorción, propiedades biomecánicas, módulo elástico) pueden ser
controladas y diseñadas para aplicaciones específicas. En general son más baratos de
obtener que los polímeros biológicos, ya que pueden ser producidos en grandes cantidades y
pueden almacenarse por largo tiempo sin degradarse. Muchos de estos polímeros disponibles
comercialmente tienen propiedades mecánicas y fisicoquímicas similares a las de los tejidos
biológicos. Los más usados en TE son los copolímeros de PLA (ya sea PLLA y PDLLA), PGA
y PLGA. El PHA pertenece a la clase de poliésteres microbianos, y se ha comenzado a usar
extensamente (Dhandayuthapani et al., 2011)
PLA: el ácido poliláctico es un biopolímero termoplástico, amorfo o semicristalino, producido
por polimerización estérica de monómeros de ácido láctico. El ácido láctico es un producto
final del metabolismo de la glucosa. El PLA es biodegradable y su tasa de degradación (más
lenta que la del PGA por ser una versión metilada del PGA, y por lo tanto menos hidrofílica) y
propiedades mecánicas pueden variarse controlando su peso molecular. La producción de
ácido láctico requiere de uno de 2 procesos: 1. La apertura del anillo de lactida (dímero cíclico
de ácido láctico deshidratado), o 2. Condensación deshidratante azeotrópica del ácido láctico
por solventes. Nuevos procesos productivos de PLA incluyen la ingeniería genética bacteriana

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(por ejemplo, en Escherichia Coli) para la producción masiva y de bajo costo de PLA (Jung et
al., 2010)

Figura 12: Síntesis de PLA: 1) Síntesis de ácido láctico como derivado de la hidrólisis de la
glucosa (ciclo de Krebs) y posterior fermentación anaeróbica. 2) Polimerización del ácido
láctico por esterificación en PLA.
Entre las ventajas del PLA se encuentra su fácil diseño y fabricación. Existen diversas
técnicas de manufacturas que pueden utilizarse para conformar PLA, como el tejido, colado
por solvente y leaching salino, espumado gaseoso, método de secado por congelación,
separación de fases, electrospinning, estereolitografía y el spinning húmedo de microfibras.
Además el PLA permite la liberación escalonada y continua de factores de crecimiento para
diseñar estrategias de fabricación de scaffolds funcionales. El PLLA (ácido poli-L-láctico,
conocido como Dacron) tiene buena fuerza tensil, y puede encontrarse como fibras no
degradables, polímero amorfo inyectable o estructuras biodegradables. El PLDLA tiene mayor
facilidad para modular las propiedades, pero sólo se usa como implante bioabsorbible
(Dhandayuthapani et al., 2011)
Se implantó en humanos con corazón monoventricular un scaffold de vena cavopulmonar de
una esponja biodegradable de copolímero de PLLA con poli-epsilon-caprolactona (P(LA/CL))
esterilizado con óxido de etileno (ETO), previo sembrado con células autólogas
mononucleares de médula espinal (MN BMC) obtenidas de la cresta ilíaca y la cabeza del

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fémur heparinizados del paciente. No se notó aneurisma, dilatación o ruptura del implante
luego de un promedio de 6 años de implantado, pero sí un debilitamiento significativo. Se
logró endotelización más rápida que en los scaffolds sin siembra autóloga, y se demostró que
las células endoteliales pertenecían al grupo de MN BMC diferenciadas (Hibino et al., 2010)
PGA: Polímero biodegradable y termoplástico, formado por uniones poliéster. Puede ser
fabricado por reacción de condensación de ácido glicólico o por apertura de anillos. Posee
una alta tasa de degradación (puede ser totalmente reabsorbido en semanas), por lo que se
usa para regeneración de tejidos biológicos (suturas, parches, injertos vasculares), y sus
buenas propiedades mecánicas le permiten usarse en fijación de tejidos. Puede producirse
mediante electrospinning, y por derretimiento y soplado para la formación de cubiertas y
relleno de moldes. Es un polímero barato y comercialmente se encuentra una gran
disponibilidad, en especial en forma de hojas de fibras no-malladas, pero los procesos de
fabricación no permiten geometrías complicadas (Dhandayuthapani et al., 2011).
Se propuso la creación de scaffolds para válvulas tricúspides fabricados con PGA no mallado
cubierto con P4HB, incorporados a stents radialmente autoexpandibles de nitinol (aleación de
níquel-titanio con memoria de forma). Se los cultivó con células MN BMC (células
mononucleares derivadas de la médula ósea) de chimpancés, y se los implantó con
procedimientos mínimamente invasivos. Hasta 4 semanas post-implantación, la funcionalidad
valvular se mantuvo adecuada, con remodelación celular sustancial y crecimiento interno de
tejido, incluso con endotelización. De todos modos se detectaron cultivos de muchos tipos de
leucocitos (granulocitos, monocitos y principalmente linfocitos), demostrando cierta toxicidad e
inflamación (Weber et al., 2011). También se propuso un scaffold vascular elástico de PGA
mallado y células musculares lisas, con resultados óptimos (Wang et al., 2010)
PLGA: el ácido poli-L-láctico-co-glicólico (ver figura) es un biopolímero biocompatible y
biodegradable, de muy fácil procesado y maquinabilidad, con gran fuerza mecánica. Puede
ser utilizado en la liberación controlada de drogas, como material de suturas o como material
para scaffolds resistentes. Es hidrofílico, de estructura cristalina y con morfología controlable,
propiedades que pueden modificarse cambiando la relación de los monómeros en la
preparación del copolímero. Permite su conformado por colado y leaching salino, leaching de
partículas congeladas, espumado gaseoso, todos métodos que permiten un estricto control
del tamaño y proporción de poros. Además pueden fabricarse microesferas por evaporación
de solvente o secado por congelación. Permite la creación de scaffolds inyectables como
cerámicas, muy biomiméticos, además del electrospinning, spinning húmedo y procesos de
liberación progresiva de factores de crecimiento (Zhan et al., 2013).

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Figura 13: Polimerización de los monómeros de ácido láctico y ácido glicólico en PLA, PGA y
PLGA (Baldwin y Saltzman, 1998)
PHA (Polihidroxialcanoato): nuevo polímero (poliéster) almacenable, obtenido de cultivo
bacteriano. Es sintetizado naturalmente por varios tipos de bacteria, y es un polímero
renovable con potencialidad de reemplazar algunos plásticos derivados del petróleo. Tiene la
ventaja de ser completamente biodegradable, al igual que el PLA. Una fuente de producción
de este polímero son los aceites vegetales, los cuales permitirían fabricarlo a gran escala ya
que gracias a la compleja mezcla de triglicéridos obtienen una mayor cantidad de PHA que
otros substratos, como la glucosa. Para evitar el uso de aceites comestibles para la
generación de PHA, se propone el uso de productos intermedios de la producción de aceite
de palma, un aceite que es producido en grandes cantidades (Sudesh et al., 2010).
Sodian et al. Propusieron en 1999 un scaffold de válvula tricúspide de PGA no tejido y PHA, el
cual es encargado de proveerle al scaffold una flexibilidad que el PGA no podía darle. Ambos
son poliésteres biodegradables y flexibles, pero el PHA es un termoplástico de baja
temperatura de fusión y muy buena flexibilidad. El PHA puede ablandarse y el PGA
comprimirse para lograr una lámina como pared vascular con cierto grosor y dureza, dejando
internamente al PGA y en la pared externa al PHA, con una disposición simil sándwich para
las valvas (PGA-PHA-PGA). Se sembraron dichos scaffolds con células vasculares ovinas
adultas y se optimizaron sus propiedades en un biorreactor. Luego de realizarse diferentes
pruebas se demostró una buena adhesión celular, con propiedades elásticas muy superiores a
las anteriores, permitiendo a las valvas abrirse y cerrarse con facilidad (Sodian et al., 1999)
PCL: la policaprolactona es un polímero sintético cuya principal característica es su muy baja
tasa de degradación (con u período de semidegradación medido en años). Por esto debe
usarse en TE combinada con otros polímeros para regular su degradación. La PCL es en ese
sentido de mu fácil miscibilidad, además de poseer muy buenas propiedades mecánicas y de
soporte. Además, permite varias técnicas de conformado, entre ellas el electrospinning, el
tejido y la estereolitografía. El electrospinning permite la formación de tricapas características
de las válvulas cardíacas. Se demostró que scaffolds así fabricados de PCL permitieron la
proliferación de fibroblastos en 3 meses en pruebas subcutáneas (Talacua et al., 2012).
Es interesante su potencialidad para estrategias in situ por su excelente estabilidad in vivo al
combinarse con colágeno por electrospinning. Estudios demostraron que luego de 1 mes de
implantado, las propiedades mecánicas del injerto vascular permanecieron viables, muy
similares a las propiedades vasculares normales (Tillman et al., 2009). También posee una

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gran facilidad para conformar las propiedades mecánicas del PCL según la necesidad a través
del agregado de materiales supramoleculares de relleno (Wise et al., 2006).
Injertos vasculares tubulares de PCL fabricados por electrospinning demostraron incluso
mejores propiedades de curación en ratas respecto a injertos de PTFE, el polímero
actualmente de elección para injertos vasculares por la necesidad de una baja
trombogenicidad. Sin embargo, los injertos de PCL pueden producir metaplasia condroide,
con lo cual se remarca la necesidad de adecuadas moléculas señalizadoras para guiar la
diferenciación del tejido hacia variedades de tejido conjuntivo no condrales (Pektok et al.,
2008).
Como desventaja de este material, estudios mostraron que la PCL (al igual que el PLA) no
tiene la capacidad de imitar las propiedades mecánicas de las válvulas cardíacas (no
linealidad, anisotropía, flexibilidad) y su deformabilidad ante esfuerzos en la dirección radial, a
diferencia de polímeros como la gelatina (colágeno desnaturalizado) y el poliuretano (Stradins
et al., 2012).
PHA: los poli-β-hidroxialcanoatos son una serie de poliésteres sintetizados por algunos
géneros bacterianos como material de reserva de energía ante la carencia de ciertos
nutrientes en el medio (como O2, P, N2, S o Mg) o el exceso de carbono. Son los polímeros
con mayores perspectivas como reemplazantes de los plásticos de origen petroquímico ya
que son renovables (provienen de sustancias agrícolas) y degradables en CO2 y H2O en
condiciones aerobias o en metano en condiciones anaerobias. Las bacterias que generan
mayores concentraciones (aptas para escala industrial) son la ralstonia eutropha (ex
alcaligenes eutrophus), la alcaligenes latus, pseudomonas oleovorans y la escherichia coli
recombinante, entre otras (Barbosa et al., 2005)
Los PHA más utilizados son el P3HB y P4HB (poli-N-hidroxibutirato), producidos en grandes
cantidades por la bacteria ralstonia eutropha con insumos sencillos como glucosa, fructosa y
residuos de la industria oleica, o por la vía fermentativa del bacillus megaterium. Son
homopolímeros altamente cristalinos, lo que los hace frágiles a temperatura ambiente, pero
permite un muy fácil diseño y conformación con propiedades mecánicas comparables a la de
los plásticos derivados del petróleo. Pueden usarse técnicas de conformado como tejido,
electrospinning y estereolitografía (Bello et al., 2008).
Mallas no tejidas de PGA con cubierta de P4HB fueron usados extensamente en la creación
de scaffolds vasculares y de válvulas cardíacas, con resultados prometedores. Fueron los
primeros implantes de triple capa implantados exitosamente en ovejas, gracias a la flexibilidad
del P4HB que permite el plegamiento de las valvas y su resistencia al flujo por alargamiento
de las fibras. El PGA es completamente absorbido en 4 semanas in vivo mientras que el P4HB
en 8 semanas, constituyendo en conjunto un material de rápida reabsorción. Esto y la pérdida
de las propiedades mecánicas por deformaciones permanentes (causando regurgitación) los
hace aún no aptos para su uso (Klouda et al., 2008)
Estudios comparativos demostraron que es más plausible el uso de scaffolds de PCL que los
tradicionales de PGA/P4HB, ya que sus propiedades mecánicas son más estables con el
tiempo y no comprometen la composición del tejido (Brugmans, Driessen-Mol et al., 2012).
Por otro lado, válvulas de PGA/P4HB fueron sembradas con células madre derivadas de tejido
adiposos (ADSC), resultando en un scaffold más duradero con propiedades mecánicas
estables gracias a la población y diferenciación celular endotelial, con creación de ECG con
GAGs y colágeno (Frese et al., 2012).
PGS: el poliglicerol-sebacato es un biopolímero (poliéster) biodegradable sintetizado por
policondensación de una mezcla de glicerol y ácido sebácico en relación 1:1 a 120°C en
ambiente de nitrógeno. El proceso de síntesis permite su fabricación a escala industrial. Sus
propiedades mecánicas pueden ser modeladas controlando el tiempo y temperatura de
curado, los reactantes y la concentración de acrilatos. Su naturaleza flexible lo hace útil para
la síntesis de tejidos blandos, entre ellos la creación de scaffolds valvulares, en especial para

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la imitación de la funcionalidad de las valvas, la cual es en general difícil de lograr por su


plegamiento continuo (Rai et al., 2012)
Scaffolds de espumas de PGS cubiertas con proteínas adhesivas tienen la habilidad de
fomentar la proliferación y síntesis de ECM por parte de células progenitoras endoteliales
derivadas de la sangre. Además, estos scaffolds exhiben propiedades mecánicas modificables
y similares a las de las válvulas naturales, excepto por su baja dureza (Masoumi et al., 2012).
Por otro lado, scaffolds para reemplazo de tejido cardíaco de PGS/colágeno (fibras del núcleo
de PGS con cáscara de colágeno) fueron fabricados por electrospinning. Se usaron células
madre mesenquimales (MSC) para la siembra y se probaron las propiedades elastoméricas
del scaffold. Se obtuvieron muy buenos resultados en cuanto a la proliferación celular y la
adhesión del parche al tejido cardíaco, aunque no se probó aun la recuperación de la función
cardíaca perdida (Ravichandran et al., 2013).

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Capítulo 3: CÉLULAS EMPLEADAS EN TE


3.1. Histología de las válvulas cardíacas
Las válvulas cardíacas normales muestran típicamente una estructura trilaminar (ver figura):
una lámina ventricular (LV, en válvula aórtica) o atrial (LA, en válvula AV), una lámina
esponjosa (LS) y una fibrosa (LF). La lámina fibrosa se extiende hacia el miocardio de los
músculos papilares por una capa de tejido conjuntivo de soporte, las chordae tendineae. Las 3
láminas difieren tanto en su composición celular como en la matriz extracelular (ECM) que la
compone, y tienen funciones específicas. La LV se encarga de contrarrestar las tensiones
generadas por el flujo (tensión de corte), la LS contrarresta la compresión por apertura y cierre
de las válvulas (flexión), y la LF y sus chordae tendineae soportan la presión de la válvula
cerrada (tensiones axiales) (Sacks, Merryman y Schmidt, 2009).

Figura 14: Estructura trilaminar de válvulas cardíacas maduras. A) Válvula aórtica o pulmonar
(1 de sus 3 valvas), con sus capas fibrosa (F), esponjosa (S) y ventricular (V). B) Válvula
auriculoventricular (AV) con sus capas atrial (A), esponjosa (S) y fibrosa (F). En ambos casos,
las valvas están sostenidas por chordae tendineae (CT) a los músculos papilares. Las flechas
indican la dirección del flujo sanguíneo (Combs y Yutzey, 2009)
Como ejemplo, la válvula mitral normal presenta deformaciones heterogéneas y con gran
anisotropía: la región central muestra deformaciones homogéneas, mientras que en los
bordes se ven deformaciones poco consistentes. La superficie valvular se deforma de modo
heterogéneo por existir regiones con diversa composición de ECM, además de una gran
concentración de tensiones alrededor de las inserciones de las chordae tendineae
(Krishnamurthy et al., 2009).

3.1.1. Células endoteliales


Las células endoteliales valvulares (VECs) recubren las superficies valvulares en contacto con
la sangre con una fina monocapa celular. Son muy similares a las células endoteliales
vasculares en sentido estructural y funcional. Ambas expresan el factor de von Willebrand
(glicoproteína que interviene en el momento inicial de la hemostasia ante una hemorragia),
producen óxido nítrico, tienen actividad de prostaciclinas y presentan uniones celulares
similares (Butcher et al., 2008).
Sin embargo, existen diferencias fenotípicas probablemente surgidas del hecho de que sus
fuentes son embriológicamente diferentes que las células endoteliales arteriales. Un ejemplo
de esto es la alineación de las VECs perpendiculares al flujo, mientras que las células
endoteliales aórticas se alinean paralelas a este (Hjortnaes y Aikawa, 2011).
La existencia de las VECs modifica incluso la expresión fenotípica de las VICs (células
intersticiales), reduciendo la expresión de α-SMA (fenotipo quiescente, o qVICs) y

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reduciéndolos en número, pero aumentando la síntesis proteica. Además reducen la pérdida


por flujo sanguíneo de los GAGs en la ECM (Butcher y Nerem, 2006).
Las VECs participan en el alivio de las tensiones de corte al tejido subyacente, ya que
responden distinto a diferentes tensiones: las de la capa ventricular, que son pulsátiles,
rápidas y unidireccionales, y las de la fibrosa, que son menores y casi oscilatorias. Si no lo
hicieran, las membranas comenzarían a expresar más receptores inflamatorios y proteína
morfogénica ósea (BMP), al tiempo que disminuirían los inhibidores de fibrosis y calcificación
(osteoprotegerina, péptido natriuretico C y cordina), como demostraron Sucosky (Sucosky et
al., 2009) y Yip (Yip et al., 2009). Esto llevaría a una lenta pero progresiva calcificación
valvular.
Otra función importante de las VECs es el mantenimiento de una membrana no trombogénica
para el paso del flujo sanguíneo, lo cual ha significado un problema enorme para las válvulas
por TE hasta la actualidad. Por último, también regulan respuestas inmunes y de inflamación
(Hjortnaes y Aikawa, 2011).

3.1.2. Células intersticiales


Las células valvulares intersticiales (VICs) son las principales células de síntesis y
mantenimiento de la ECM valvular. Incluyen 5 fenotipos identificables (ver figura): células
progenitoras embrionales, VICs quiescentes (qVIC), VICs activadas (aVIC), VICs progenitoras
(pVIC), y VICs osteoblásticas (obVIC). Son células con cierta plasticidad, que les permite
convertirse de un tipo a otro ante determinados estímulos (Liu, Joang y Gotlieb, 2007).
Las células progenitoras embrionales (endoteliales/mesenquimales) células provenientes
de la delaminación de la membrana endotelial, que invaden la primordia, la capa formadora de
las válvulas primitivas embrionales. En ellas se produce una transformación endotelial-
mesenquimal (EMT), inducido por estímulos mecánicos y factores de crecimiento, que inicia el
proceso de formación valvular en el embrión. Tras la transformación se convierten en VICs
quiescentes, las cuales presentan funciones y propiedades de los fibroblastos en los tejidos
conjuntivos blandos (Schoen et al., 2008).
Los fibroblastos (o VICs quiescentes) son células fusiformes que se encuentran en reposo
en las válvulas adultas y mantienen la fisiología valvular normal. Se encuentran en mayor
abundancia en las capas fibrosa y esponjosa. Expresan una cantidad muy baja de α-actina
muscular lisa (α-SMA) y de metaloproteínas de la matriz (MMP), hecho que se condice con su
baja actividad de reabsorción y síntesis de ECM (Schoen et al., 2008).
Poseen 2 tipos de uniones: una baja expresión de uniones gap (conexina-26 y 45, proteínas
transmembrana) que transportan sustancias entre células adyacentes; y una mayor cantidad
de uniones adhesivas (ubicadas sobre los largos procesos citoplamáticos extendidos por las
qVICs como extremidades, formando redes de células valvulares, como muestra la figura),
con N-cadherina y desmogleína, que sirven para evitar la pérdida de contacto de las uniones
gap. Es probable que estas uniones sirvan para el sensado de las condiciones ambientales
(stress, señales microbiológicas) por parte de las VICs y de su comunicación a través de la
red interdigitada de VICs por medio de las uniones gap, aunque esto aun no fue probado (Latif
et al., 2006).

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Figura 15: Redes de qVICs cultivadas in vitro. Puede verse cómo por diversos estímulos en la
obtención (mecánicos, químicos) y en el cultivo (biológicos) pierden su adecuada expresión de
células elongadas. En A forman redes interdigitadas, en B pierden su morfología por falta de
estímulos (contactos célula-célula, célula-matriz, etc) hasta llegar al estado C, en el que se
comportan como tejido altamente proliferativo, mayormente aVICs (Liu, Joag y Gotlieb, 2007)
Los miofibroblastos (o VICs activados) son las células encargadas de la producción de
ECM. Se originan de la mecanotransducción de qVICs ante fuerzas mecánicas alteradas en la
válvula adulta (a través de la red de filamentos de actina y miosina, conectado a las
integrinas) (ver figura), o de VECs durante la valvulogénesis (proceso denominado transición
endotelial-mesenquimal, EMT). Se distribuyen en toda la válvula, pero se encuentran
principalmente en la capa ventricular, junto con algunas células musculares lisas provenientes
del miotelio arterial (Iop et al., 2009).

Figura 16: Fibroblasto y sus marcadores de diferenciación celular. Diversas integrinas son
expresadas en las adhesiones gap supermaduras, conectadas a la red de filamentos de actina
(ASMA, alpha-smooth muscle actin) del citoesqueleto. Tensiones mecánicas de la red de
colágeno de la ECM son transducidas a través de las integrinas y promueven la

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diferenciación de qVICs a aVICs, al igual que factores de crecimiento de la familia TGF-β a


través de los receptores de TGF-β (van der Borne et al., 2009)
En válvulas normales adultas sólo representan entre el 2% y el 5% de las VICs, y una vez
removidas de su hábitat natural y cultivadas in vitro suelen activarse hasta un 80% (Schoen et
al., 2008). Regulan el crecimiento y remodelación valvular, así como las respuestas
patobiológicas. Esto es realizado a través de la secreción y reabsorción de proteínas de la
ECM a una tasa mucho mayor que otras células del cuerpo, lo que indica que están
continuamente reparando daños micrométricos inducidos por las fuerzas mecánicas. De este
modo se garantiza la larga durabilidad de las válvulas naturales (Hjortnaes y Aikawa, 2011).
La remodelación de la ECM resulta de la expresión de enzimas degradantes de ECM y de
inhibidores tisulares, secretados por las qVICs. Las enzimas más usuales son las
metaloproteinasas de la matriz (MMPs) y las catepsinas. Se demostró recientemente que la
actividad de las MMP y las catepsinas es regulada en válvulas cardíacas por los ciclos de
presión y las tensiones de corte (Platt et al., 2006). De igual modo, la síntesis de ECM por
activación e hipertrofia de las VICs se ve aumentada ante tensiones aumentadas y factores de
crecimiento, como el TGF-β (Liu y Gotlieb, 2008).
Algunas MMPs (proteínas que degradan colágeno, elastina, gelatina, glicoproteínas y
proteoglicanos), son expresadas por las VICs: la MMP1, una colagenasa-I; la MMP2, una
gelatinasa-A; la MMP9, una gelatinasa-B; la MMP13, una colagenasa-III. Los inhibidores
tisulares incluyen a los inhibidores tisulares de metaloproteinasas (TIMP), que controlan a las
MMP asegurando la degradación del tejido a igual tasa que su resintesis en condiciones
fisiológicas, pero desbalanceadas en condiciones patológicas (Verma y Hansch, 2007).
Las catepsinas (proteasas de cisteína lisosomales) son otras enzimas degradantes de gran
importancia. En general, al ser enzimas lisosomales, las catepsinas cumplen el rol de
degradar sustancias de deshecho celulares, microorganismos fagocitados o proteínas
endocitadas (lo cual sucede en macrófagos). Sin embargo, ciertas catepsinas expresadas en
macrófagos (cat V, K, L, S y B) y en las VICs (cat K, con función de elastinasa y colagenasa, y
cat S, con función de elastinasa, colagenasa, fibronectinasa y lamininasa) participan en
procesos de inflamación o autoinmunes. Esto llevo a descubrir que dichas catepsinas pueden
ser secretadas para funcionar en la ECM, cumpliendo un rol importantísimo en la reparación
valvular. Su control es ejercido extracelularmente por cistatinas y kininógenos, además de por
pH (Cheng et al., 2012).
Las VICs progenitoras son células vagamente definidas, que consistentes en una población
heterogénea de células progenitoras. Incluyen células progenitoras derivadas de la médula
ósea, células circulantes y células progenitoras residentes valvulares. Participan en la
reparación valvular por diferenciación ante estímulos en aVICs. También pueden diferenciarse
en obVICs ante estímulos calcificantes, como los factores condrogénicos y osteogénicos (Liu,
Joang y Gotlieb, 2007).
Las VICs osteoblásticas regulan la condrogénesis y la osteogénesis, y participan
activamente en el proceso de calcificación valvular. Secretan fosfatasa alcalina, osteocalcina,
osteopontina y sialoproteína ósea. Se cree que son derivadas de las qVICs y las pVICs ante
algunos agentes condro y osteogénicos. Comparten características con las células
endoteliales degeneradas de las placas de ateroma, ya que son generados por procesos
similares a la arterosclerosis por inflamación, infiltración lipídica y degeneración fenotípica
(Liu, Joang y Gotlieb, 2007).

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Figura 17: Los 5 fenotipos de VICs existentes y sus funciones (Liu, Joang y Gotlieb, 2007)

3.1.3. Matriz extracelular


La composición de la ECM de las diferentes láminas valvulares está en relación con las
funciones que cumple el tejido. En el lado ventricular de la LV, encargado de soportar el flujo
sanguíneo cíclico, se encuentran predominantemente fibras de elastina dispuestas
radialmente que proveen de una gran elasticidad. El componente más abundante de la válvula
aórtica humana es el colágeno, proteína muy resistente de soporte, en densos paquetes de
fibras en la LF (colágeno tipo I y III, que se extiende e incluye las chordae tendineae) para
soporte de tensiones axiales por presión durante el cierre de la válvula. También existen fibras
de colágeno en la LV, pero sólo se encuentran algunas muy dispersas en la LS. Los GAGs y
proteoglicanos se encuentran predominantemente en la LS (lo cual le da el nombre a dicha
capa, que asemeja a una esponja formada por la red de GAGs, permitiendo la flexión y su
retorno) (Gatonga et al., 2009).
De entre los polisacáridos valvulares el condroitin sulfato (C6S) se hace evidente por tinción
en todas las capas de la válvula, pero es más evidente en la LS, la LV y la zona arterial de la
LF. La laminina se expresa en toda la válvula, con mayor concentración en la LF cerca de la
membrana basal, y como algunos puntos dispersos en la LS. La fibronectina se distribuye en
toda la válvula también, pero se expresa mayormente en las dos láminas basales de la LF y la
LV (Grauss, 2010).

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Figura 18: Sección longitudinal de una valva de válvula mitral por tinción Tricolor de Mason
(x100). Pueden verse las láminas ventricular (V), fibrosa (F) y atrial (A), y la flecha apuntando
a una delgada capa de miocardio, en general en válvulas masculinas. Esta técnica tiñe de
azul las fibras de colágeno, de rojo las fibras musculares y los núcleos celulares de violeta
(Gatonga et al., 2009).
Existen diferencias marcadas en la composición de la ECM de las distintas válvulas. La
válvula aórtica (AV), por ejemplo, soporta presiones diastólicas de aproximadamente 90
mmHg, mientras que la pulmonar (PV) sólo debe soportar presiones del orden de los 15
mmHg. Esto lleva a que la ECM secretada sea distinta, debido a que la secreción es regulada
por estímulos mecánicos y factores de crecimiento. Por otro lado, la disposición de la ECM por
adaptaciones estructurales será distinta para soportar las cargas distintas (Liu y Gotlieb,
2008).
Esto se ve en el hecho que hay un menor contenido de colágeno en la PV, responsable de
una mejor respuesta hemodinámica (menor rigidez) (Joyce et al., 2009). En reposo, las fibras
de colágeno I de la AV están desalineadas, mientras que en la PV son relativamente regulares
o alineadas. Esto permite a la AV soportar mayores tensiones, aumentando la deformación
posible por alineamiento de fibras (aún más marcado que las de la PV) (Carruthers et al.,
2011). Esto demuestra una mayor habilidad de respuesta ante tensiones de la AV. Además, a
la presión de pico respectiva de cada válvula se demostraron iguales deformaciones de la
fibrosa, indicando una adaptación óptima de cada válvula a su entorno (Carruthers et al.,
2012). Cabe destacar que se logró un mayor alineamiento total de la fibras de la PV a igual
presión (90mmHg) aplicada, pero proporcionalmente el alineamiento es mayor en la AV (Joyce
et al., 2009).

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Figura 19: Muestra histológica de válvulas aórtica (AV, o semilunar) y pulmonar (PV) por
tinción Pentacrómica de Movat. Este método tiñe las fibras de colágeno de amarillo,
proteoglicanos y GAGs de azul, fibras elásticas de negro. Pueden verse las fibras de colágeno
I no alineadas en la fibrosa de la AV (amarillo), así como la prevalencia de GAGs en la
spongiosa (azul) y las fibras de elastina (negro) alineadas en la ventricular (Carruthers et al.,
2011)
La elastina es una proteína de gran importancia en las válvulas cardíacas debido a que les
provee su flexibilidad (imprescindible para la constante apertura y cierre cíclicos de las valvas)
y su elasticidad para reducir las tensiones que soporta y evitar su endurecimiento. Es
sintetizada por células elastogénicas (como fibras musculares lisas y fibroblastos) en forma de
monómeros de tropoelastina soluble, no glicosilada y muy hidrofóbica, con alta repetición de
motivos VPGG, VPGVG, APGVG, etc, los cuales le permiten grandes deformaciones
(Fernandez-Colino et al., 2011). Después de modificaciones postraslacionales se produce el
crosslinking y la organización polimérica en redes de elastina (ver figura), encargadas de
soportar las tensiones a bajas deformaciones (a altas deformaciones, entra en juego el
colágeno) (Patel et al., 2006)

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Figura 20: entramado de fibras de colágeno, red de elastina y fibroblastos productores de


ECM
La síntesis de fibras elásticas requiere de 5 componentes proteicos fundamentales. Por un
lado la tropoelastina monomérica, componente fundamental que requiere de un posterior
proceso de crosslinking para alargarse y lograr el comportamiento elástico de las fibras; por
otro lado, las fibrillas de fibrilina-1 son la armazón estructural que brinda un núcleo de
formación alrededor del cual poder construir la morfología fibrilar (Kasamatsu et al., 2011).
La tropoelastina es una proteína de la ECM de la mayoría de los vertebrados, de entre 60 y 72
kDa, siendo el componente fundamental de las fibras elásticas. La tropoelastina secretada se
adhiere a la superficie celular, donde forma agregados esféricos para lograr crosslinking e
incorporación en fibras elásticas en crecimiento. Se caracteriza por sus dominios hidrofóbicos
e hidrofílicos alternantes, y su alta flexibilidada. Su extreme C-terminal es el encargado de la
union a nuevas cadenas de elastina y de su anclaje a las célulcas. Es de particular interés en
tejidos con grandes deformaciones, cmo el vascular. Se ha propuesto su uso como biomaterial
dada su biocompatibilidad y la posibilidad de reemplazar tejidos elásticos (Wise y Weiss,
2009).
El entrecruzamiento (crosslinking) de los monómeros de tropoelastina es catalizado por la lisil-
oxidasa (LOX), enzima amino-oxidasa dependiente de cobre que produce la polimerización de
la elastina. Para esto, la LOX debe unirse con la tropoelastina, lo cual no ocurre naturalmente.
El pro-LOX (el propéptido de la LOX), por su parte, sólo logra depositarse en la tropoelastina
coacervada (es decir, formando micelas) por medio de la fibulina-4 (FBLN4, una glicoproteína)
(ver figura 21). En la vecindad del sustrato (es decir, de la sustancia sobre la que actua la
enzima), el pro-LOX es activado (formación de LOX), evitando el crosslinking desorganizado
de tropoelastina (Horiguchi et al., 2009).

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Figura 21: Formación de las fibras elásticas. A la izquierda, (1) coacervación de tropoelastina
(hidrofóbica) al ser secretada a la ECM, y (2) ensamblaje de FBLN4 con proLOX. (3) Posterior
deposición de proLOX ensamblado en la proelastina, escisión del proLOX (LOX maduro) con
(4) crosslinking de tropoelastina por LOX maduro. A la derecha, ausencia de FBLN4 no
permite la adecuada deposición de FBLN4 en la proelastina. El LOX maduro une la
tropoelastina aleatoriamente y en menor proporción que la lograda con FBLN4, determinando
la formación de elastina desorganizada (modificado de: Horiguchi et al., 2009)
El 5to componente proteico es la MFAP4 (microfibrillar associated protein) o MAGP36
(microfibril-associated glycoprotein), proteínas que permiten un crosslinking ordenado del
tropocolágeno (ver figura). El ensamblaje a través de la MFAP4 de las microfibrillas de
fibrilina-1 permite la formación de largas fibras de elastina orientadas, evitando la formación
de pequeñas fibras esparcidas por toda la ECM sin orden aparente. Sin este paso
fundamental no podrían formarse fibras elásticas sino una matriz amorfa, con propiedades
elásticas pobres (Kasamatsu et al., 2011).

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Figura 22: Importancia de la MFAP4 en el desarrollo fibrilar de las fibras elásticas; a) síntesis
de fibras elásticas en presencia de MFAP4; b) crosslinking de tropoelastina en ausencia de
MFAP4 (nótese la desorganización producida por fibras no alineadas) (Kasamatsu et al.,
2011)
La interacción de las fibras con receptores celulares se produce a través del extremo C-
terminal de la tropoelastina. La elastina es un regulador autócrino de sus células secretoras,
evitando patologías fibrocelulares. Las señales de la elastina no son mediadas por integrina,
sino por proteínas de unión celulares con la elastonectina y el receptor de proteína G
(proteínas de unión a nucleótidos de guanosina, que hidrolizan GTP en GDP y fosforilan
sustratos), induciendo organización fibrosa de los filamentos de actina por tensión, inhibiendo
la proliferación de fibras musculares y regulando su migración, y favoreciendo la adhesión de
células endoteliales (Patel et al., 2006). Las enfermedades que afectan la elastina (genéticas,
injuria o vejez) puede derivar en estenosis, hiperproliferación de células musculares lisas,
incremento del grosor valvular o vascular y fibrosis (Urban et al., 2001). La desorganización de
las fibras de elastina puede incluso producir aneurismas (Horiguchi et al., 2009).

3.2. Embriología de las válvulas cardíacas


Durante el desarrollo embronario el corazón es el primer órgano en funcionar. Es formado por
un tubo miocárdico primitivo compuesto por una capa celular miocárdica rodeada de una
membrana celular endotelial interna. El primer indicio de las válvulas cardíacas se da por la
formación de cojines endocardiales en el tracto de salida y en la región auriculoventricular
(AV) del canal, durante la semana 5ta a 8va. Esta formación de cojines endocardiales
comienza cuando moléculas de señalización del miocardio inducen una transición endotelial-
mesenquimal (EMT) de las células endoteliales adyacentes. Se generan así células
progenitoras mesenquimales, que contribuyen a formar las estructuras sépticas valvulares y
las VICs adultas (Abdulla, Blew y Holterman, 2004).

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Figura 23: Diferentes niveles del control de EMT por el factor VEGF (valvular endotelial GF)
en los cojines endoteliales. I. Una baja expresión de VEGF permite la EMT endocardial. II.
Altos niveles de VEGF suprimen la formación de cojines fuera de la zona de formación. III. Los
niveles de VEGF inducen la expresión de señales que inician la formación septal valvular
(modificado de Wagner y Siddiqui, 2007)
Las células mesenquimales son altamente proliferativas, y están embebidas en una ECM
pobremente organizada. Esto no impide que los cojines funcionen bien como válvulas
unidireccionales para el flujo sanguíneo. Se crea además una capa superficial valvular, la
primordia, que dará lugar a las valvas por afinamiento y elongación seguida de una
separación (para las válvulas tricúspides) o una fusión (para las bicúspides). Además, se
produce una remodelación de la ECM, que se separa en 3 capas: la atrial (para la válvula AV)
o ventricular (para la aórtica), rica en elastina; la fibrosa, rica en colágeno fibrilar; la esponjosa,
rica en proteoglicanos. La proliferación celular se detiene al conformarse la estructura
trilaminar, y casi no hay futura proliferación de VICs en las válvulas adultas. Esto sugiere que
los factores de crecimiento son imprescindibles en TE (Gittenberger-de Groot et al., 2013).
Las células valvulares provienen de diversas fuentes. Las células endoteliales que rodean las
valvas forman una capa continua con el endocardio. En el tracto de salida, las células
precursoras del endocardio y el miocardio provienen del campo cardíaco secundario. Las
células mesenquimales de las válvulas son derivadas de células endoteliales (como fue
demostrado por los ratones transgénicos del linaje Tie2-Cre y Rosa26R) por EMT. Las VIC
adultas provienen en su mayoría o incluso completamente de estas mismas células
endoteliales, aunque hay evidencia de que algunas podrían provenir de células derivadas del
epicardio en etapas embrionarias (Combs y Yutzey, 2009).
El desencadenamiento del desarrollo valvular está regulado por moléculas seañalizadoras y
factores de crecimiento. La proteína morfogénica del hueso 2 (BMP2) enviada desde el
miocardio al endocardio es requerida para la inducción inicial de la EMT. La señalización Wnt
(promotor de la capa fibrosa rica en colágeno) y el TGF-β también son importantes durante la
EMT y la proliferación de células mesenquimales en los cojines endocardiales. La
señalización notch (que puede promover el crecimiento, muerte, activación o diferenciación de

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células en contacto con la célula productora) regula la represión del gen endotelial, lo cual la
hace necesaria también para la EMT (ver figura). Las células mesenquimales de los cojines
endocardiales expresan los factores de transcripción Twist1 y Msx, características de las
células mesenquimales, que promueven la expresión de genes de producción de ECM
primitiva. El FGF4 activa la proteína escleraxis y los tenocitos, células que mejoran las
propiedades mecánicas. La estratificación trilaminar es probablemente regulada por los
esfuerzo cíclicos del flujo sanguíneo (Hinton y Yutzey, 2010).

Figura 24: Modelo de interacciones regulatorias para: A) la formación de los cojinetes


endocardiales. B) el desencadenamiento y mantenimiento de la EMT. En A) El miocardio
expresa BMP2 induce la formación de ácido hialurónico, e induce la transcripción Tbx2 en el
miocardio, inhibeindo genes del propio miocardio. El endocardio expresa VEGF promueve la
formación endotelial de los cojinetes. En B) El miocardio expresa BMP2, promoviendo la
EMT de los cojinetes. El endocardio sintetiza TGFβ y señales Notch1 (que suprimen
expresión de cadherinas valvulares endoteliales), promoviendo la EMT. Además expresa
señales Wnt/β-catenina, que aumentan la respuesta EMT. Una vez establecidos los cojinetes,
la expresión endocardial de VEGF mantiene prolifereación endiotelial, inhibiendo la EMT
(Combs y Yutzey, 2009)
Evidencia actual sostiene un rol importante de la periostina, TGFβ y BMP en enfermedades
valvulares heredadas o adquiridas. La subfamilia beta de la TGF humana tiene 3 miembros:
TGFβ1, TGFβ2 y TGFβ3. La periostina es una pequeña proteína de la ECM secretada por
fibroblastos durante el desarrollo y la enfermedad valvular, asociada con zonas de fibrosis,
que interactúa con la fibronectina, tenascina-C, colágeno I y V y proteoglicanos de heparin-
sulfato. Sirve de ligando a algunas integrinas, la quimiotaxis y la EMT. La deficiencia de
periostina está asociada con estenosis valvular en niños. La deficiencia de BMP y TGFβ o sus
mediadores están relacionadas con patologías valvulares, entre ellas engrosamiento valvular,
enfermedad cardíaca reumática crónica y calcificación valvular (Conway et al., 2010).

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3.3. Obtención y cultivo de células


La obtención de células es la extracción de un tipo específico de células autólogas por
diversos medios según el tejido del cual deben extraerse, cuidando de no modificarlas en el
proceso ya que pueden perder sus propiedades. Esto sucede por ejemplo con las células
valvulares intersticiales (VICs), que al ser sacadas de su entorno natural suelen transformarse
en gran medida (hasta un 70% del total de células) en VICs activadas, ya sea por pérdida de
contacto con otras células y con la ECM (señalización proliferativa por integrinas, complejos
de unión gap y de adhesión) o por estímulos mecánicos y químicos en el proceso de
extracción (Liu, Joag y Gotlieb, 2007).
a) Células vasculares autólogas: Las células vasculares pueden ser obtenidas por ejemplo
de la carótida del individuo. En experimentación con tejidos de corderos, la obtención de estas
células pudo realizarse por cosecha de pequeños segmentos rectangulares de carótida. Estos
son guardados en sangre heparinizada a baja temperatura, para luego separar las células
usando colagenasa A (Mol, 2009).
El medio es lavado y se obtienen las células endoteliales por centrifugado, resuspendiendolas
en medio de cultivo con agregado de heparina, factor de crecimiento endotelial y penicilina. Se
las cultiva en medios cubiertos por colágeno, con agregado de factores de crecimiento y
recambio del medio de cultivo cada 2 días. Se mantiene el cultivo en incubadoras a 37°C por
algunas semanas hasta obtener la cantidad de células endoteliales requeridas (Steinhoff,
2000).
Para la obtención de miofibroblastos, pequeños segmentos de carótida u otro tejido de pared
vascular son picados y ubicados en placas de Petri con DMEM (Dulbecco's Modified Eagle
Medium, medio de cultivo general para células de mamífero). En cuestión de semanas, los
miofibroblastos crecen formando una capa superficial del cultivo. Luego de la expansión
celular, las células están listas para ser sembradas en los scaffolds (Steinhoff, 2000). Se han
repoblado in vitro válvulas de oveja descelularizadas, y posteriormente se implantaron como
válvulas pulmonares. Los resultados son prometedores pero se produjo engrosamiento de las
valvas (Simionescu et al., 2012).
b) Células autólogas de médula ósea (BMC): De forma similar al caso anterior, se han
repoblado válvulas de perro descelularizadas con células autólogas derivadas de la médula
ósea, y se implantaron en reemplazo de válvulas aórticas. Se demostró una repoblación y
endotelización parcial de la válvula en un plazo de 3 semanas. En este caso y en el anterior,
las células sembradas pre implantación se mantuvieron hasta el momento de la explantación,
lo cual demuestra la contribución de estas a la reconstrucción tisular (Kim, S. et al., 2006)
La obtención de células de la médula se realiza por aspiración de la médula ósea,
generalmente del húmero del donante. Las células BMC se aislan usando ficol (por ejemplo,
con la mezcla Ficoll-Paque, un separador de células sanguíneas que genera diversas capas),
ovteniendose 2 fracciones útiles, la de células simil endoteliales y la de células BMC (Kadner
et al., 2002).
La capa de células simil-endoteliales (simil-EC) se fracciona y se cultiva posteriormente en
placas de Petri. El cultivo incluye la expansión en EGM-2 (endotelial growth medium 2,
compuesto mayormente por medio basal de cultivo de grandes vasos sanguíneos con el
agregado de factores de crecimiento IGF y VEGF) y el posterior crecimiento por agregado de
hidrocortisona, factor de crecimiento fibroblástico (FGF-B), VEGF, IGF, ácido ascórbico
(vitamina C), heparina y EGF (Kim, S. et al., 2006).
La fracción de células BMC obtenidas de la solución con ficol se utiliza para la obtención de
miofibroblastos (MF) o simil-MF. Se cultiva en medio de cultivo M199 (medio para diversos
tipos celulares, e incluso aplicable para diversas especies animales), con serum bovino fetal.
Las células simil-MF y simil-EC pueden ser entonces cultivadas serialmente en scaffolds
acelulares o scaffolds sintéticos. Esto se probó en válvulas pulmonares de perro,

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demostrandose cierta repoblación celular y mantenimiento de las células sembradas luego de


1 y 3 semanas (Kim, S. et al., 2006).
Otro método para aislar células MSC del cultivo de céluas BMC se debe a su propiedade de
adhesión selectiva a superficies plásticas. Estas MSC tienen un gran potencial de expansión y
diferenciación, además de su modificación genética por vectores virales. Además secretan
citoquias y quemoquinas, las cuales tienen un papel fundamental en la reparación y
repoblación tisular (Gnecchi y Melo, 2009).
c) Células madre prenatales: son obtenidas del cordón umbilical o líquido amniótico del
individuo. Esta estrategia permitiría identificar genéticamente la probabilidad de futuros
problemas valvulares de un individuo, y en base a esto determinar la criopreservación de
células del cordón para su posterior utilización (Schmidt et al., 2006).
Las células sanguíneas CD133+ derivadas del cordón umbilical pueden ser criopreservadas
para su utilización futura en TE. Luego de la expansión y diferenciación de estas células en
miofibroblastos (por uso de insulina, factor de crecimiento epidérmico y factor de crecimiento
fibroblástico), estos pueden usarse para siembra de scaffolds biodegradables, los cuales
pueden ser cubiertos por una capa de células del cordón diferenciadas en endoteliales.
Scaffolds de este tipo fueron optimizados en biorreactores duplicadores de pulso (los cuales
se discutirán más adelante). Estas válvulas demostraron una excelente formación de capas
endoteliales con tejido conectivo entre el interior y el exterior del scaffold. Las células
invadieron los poros del scaffold y produjeron ECM rica en colágeno, elastina y GAGs,
semejante a la ECM de las valvas de válvulas pulmonares humanas (Sodian et al., 2010).
d) Células madre adultas: Las células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea
(BM-MSC) tienen ciertas ventajas respecto a otros tipos de células madre o progenitoras en
cuanto a sus perspectivas de uso clínico ya que requieren protocolos más simples para su
aislación, reserva y expansión in vitro. Además poseen un fenotipo muy similar al de las
células valvulares, capacidad inmunoregulatoria beneficiosa y la posibilidad de diferenciarse
en células endoteliales, fibroblastos, miofibroblastos y células musculares lisas. Por último
puede destacarse que se demostró que al sembrar BM-MSC en las capas ventricular y fibrosa
de la una válvula cardíaca, estas repoblaron mejor la capa ventricular, produciendo una mejor
dispersión en la estructura tridimensional y una mayor supervivencia en esta capa (Iop et al.,
2009)
Los factores de crecimiento de la familia TGF- β tienen una relevancia especial en el proceso
de diferenciación de las MSCs adultas (ver figura), dado que este tipo de factores media la
diferenciación mesenquimal directa, y además por estar involucrados en el mantenimiento de
la pluripotencialidad de las células madre, junto con la posterior selección y control del
proceso de diferenciación, determinando la dirección y extensión del mismo (Derynck y
Akhurst, 2007).
Las MSCs son células atractivas desde el punto de vista de la medicina regenerativa, dada su
excelente proliferación y capacidad de diferenciación; además, están presentes en gran
variedad de tejidos. Los factores TGF- β se consideran factores mitóticos para las MSCs, con
el rol de mantener la constante renovación, la potencialidad y el estado de indiferenciación,
mientras que los BMPs tienen la capacidad de inducir la diferenciación celular. MSCs
humanas derivadas de la médula ósea pueden dividirse en cultivo en más de un billón de
células, sin perder la pluripotencialidad propia de las células madre. Sin embargo el uso actual
de este tipo de células está limitado por el desconocimiento en cuanto a los mecanismos que
regulan la proliferación y diferenciación de las mismas. (Santibanez y Kocic, 2012)

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Figura 25: Rol de la superfamilia TGFβ en la diferenciación de MSCs (Derynck y Akhurst,


2007)
e) Células madre adiposas (ADSC): Normalmente este tipo de células se aíslan de la
fracción vascular estromal de tejido adiposo homogeneizado que se obtiene como producto de
la lipoaspiración. Su identificación es compleja debido a las similitudes con otros tipos de MSC
y a la fata de marcadores específicos definitivos. Sin embargo existe creciente evidencia que
muestra que ambos tipos celulares podrían ser VSC. En la neovascularización estas células
se diferencian en músculo liso y células endoteliales, por lo cual son reclutadas ante lesiones,
donde participan en la reparación/regeneración tisular (Lin et al., 2010)
El potencial de las ADSCs de diferenciarse en varios tipos de tejidos de origen mesenquimal,
además de las propiedades de estimulación de angiogénesis y la disminución de la
inflamación las convierte en una alternativa interesante para la generación de válvulas
cardíacas por TE. El mayor problema presente es la dificultad en el cultivo para lograr
volúmenes de tejido clínicamente útiles. Además no se ha confirmado fehacientemente la
completa diferenciación a otros tipos tisulares fuera de los adipocitos, si bien se han visto
resultados cercanos. Por último, la obtención de estas células mediante lipoaspiración no
asegura que las células cultivadas sean solamente del tipo de las ADSCs, por lo que los
resultados vistos normalmente no pueden atribuirse solamente a este tipo celular (Locke et al.,
2011)
Las ADSC son fáciles de obtener en repetidos procedimientos y de aislar posteriormente.
Además ya se produjeron válvulas cardíacas sembradas con ADSC humanas obtenidas de la
remoción de tejido graso de cirugías plásticas (liposucción) sobre scaffolds bipoliméricos de
PGA/P4HB. La formación de tejido fue estimulada con el uso de biorreactores de tensiones
dinámicas. Además, se procedió a resembrar los scaffolds posterior a los tratamientos de
optimización de propiedades con células endoteliales derivadas de ADSCs. La diferenciación
se coniguió por cultivo de ADSCs en preencia del factor de crecimiento VEGF. La distribución
celular fue homogénea, con formación incluso de una cubierta endotelial. Además, la matriz
obtenida fue mecánicamente estable y su contenido de GAGs y colágeno era adecuado
(Frese et al., 2012)

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f) Fibroblastos: Se han logrado válvulas cardíacas basadas en fibrina mediante el uso de


fibroblastos humanos provenientes de la piel, exhibiendo anisotropía estructural y mecánica
similar a la de las válvulas normales. En pruebas de implantación en ovejas, este tipo de
válvulas logró presentar funcionalidad normal a corto plazo (4-8 semanas), pero se observó
una incipiente contracción tisular a ser resuelta para la aplicación a largo plazo. Los
fibroblastos humanos mantuvieron el fenotipo contráctil y su viabilidad 8 semanas post
implantación en ovinos, demostrando a su vez proliferación post implantación. Los estudios
histológicos en las válvulas explantadas mostraron también que la mayoría de las células
presentes eran de origen humano, indicando que los fibroblastos fueron los responsables del
crecimiento tisular en la válvula, junto con una aparente deposición de colágeno y
posiblemente otros componentes de ECM (Syedain, 2011).
g) Cardiomiocitos: La expresión de los genes específicos del tejido cardíaco y mesodérmico
por células madre embrionarias (ESCs) de ratón puede ser desencadenada por los factores
TGF- β, BMP2, BMP4 y por la cardiomiogénesis. La generación de cardiomiocitos a partir de
ESCs es un objetivo de interés dada su posible aplicación en enfermedades cardíacas y/o
regeneración del corazón. En ESCs humanas se logró diferenciación a cardiomiocitos
mediante un tratamiento con activina seguida de BMP4. Si bien actualmente es un tratamiento
caro, sería ideal poder lograr válvulas cardíacas con células morfológica y funcionalmente
idénticas a las VICs y VECs (Santibanez y Kocic, 2012).
La diferenciación en células mesodérmicas y cardíacas puede ser inducida por factor BMP2,
lograndose una cardiogenicidad completa con aumento de los cardiomiocitos entre otros
cuerpos embrioides. La cardiogénesis dependiente de BMP también se observó con el uso de
TGF-β o BMP2 en el medio de cultivo de ESCs. Se requiere sin embargo de una coordinación
muy precisa espacial y temporal de la señalización, como demuestran estudios con
señalización Noggin post inducción mesodérmica, que es imprescindible para la inducción de
cardiomiocitos. Además la señalización Snt canónica toma un papel fundamental (Lian et al.,
2012)
h) Células autólogas vasculares circulantes en sangre: este tipo de células se originan a
partir de las células madre adultas de la médula ósea, y tienen las propiedades de las células
progenitoras endoteliales (EPCs) (Griese et al., 2003). Son movilizadas por citoquinas y
reclutadas a los lugares de neovascularización, donde se diferencian en células endoteliales
maduras. Son de por sí una fuente natural de células madre en el proceso de embriogénesis
de las válvulas cardíacas, por lo que tienen gran potencial en la ingeniería de tejidos de
válvulas cardíacas (Ankeny et al., 2012).

3.4. Siembra celular


El paradigma completo de la ingeniería de tejidos puede describirse en cuatro pasos
generales: aislación y cultivo de células del paciente, posterior siembra en un scaffold
adecuado, cultivo in vitro para la formación del tejido y finalmente implantación en el paciente.
Por otro lado, un enfoque más reciente se basa en aprovechar la capacidad de regeneración
tisular del organismo, implantando scaffolds previamente tratados con factores de crecimiento
que favorecen la repoblación del implante in situ.
3.4.1. Siembra in vitro:
Es el enfoque más frecuentemente utilizado en la generación de válvulas cardíacas por TE, y
consiste en la colocación de células sobre un scaffold preformado, para su posterior cultivo
fuera del organismo, antes de la implantación. Las células utilizadas son autólogas, pero no se
ha logrado aún perfeccionar este método puesto que se ha visto retracción del tejido formado
y posterior insuficiencia valvular en ovejas implantadas con válvulas sembradas de esta
forma. Por esto la viabilidad a largo plazo de las válvulas implantadas sembradas in vitro no
es óptima. Además, el proceso de siembra y posterior cultivo representa un desafío

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importante, dada su complejidad. A través de este método se induce la formación de tejido


autólogo en fase de pre implantación (Gottlieb et al., 2010).
Las alternativas más prometedoras en las estrategias de scaffolds sintéticos in vitro implican
el uso de polímeros de degradación rápida, los cuales no son adecuados para las estrategias
in situ, por ejemplo (Mol et al., 2009).
Frente al uso de scaffolds naturales, esta técnica se ve favorecida por la estructura y el
material, pero existe el problema de los métodos de descelularización, que pueden alterar la
estructura del material o dejar restos celulares que induzcan la reacción inmunológica en el
receptor, además del riesgo de zoonosis en el caso de matrices xenogénicas. Sin embargo, la
siembra celular ex vivo acarrea problemas por ser altamente invasiva al scaffold y conlleva el
riesgo de predisponer a infección, además de ser complicada de por sí. (Iwai et al., 2007).

3.4.2. Siembra in situ (o in vivo):


Fundamentalmente, la ingeniería de tejidos in situ necesita un scaffold no trombogénico, no
inmunogénico y funcional, capaz de guiar la remodelación tisular in vivo. En esta situación, las
células interactúan de forma dinámica y bidireccional con la ECM vía factores de crecimiento y
moléculas de adhesión (Pratt et al., 2003).
Un enfoque sobre los materiales para scaffolds utilizados en siembra in situ destaca como
características necesarias las siguientes: transformación in situ de líquido a sólido, para
permitir una cirugía mínimamente invasiva; susceptibilidad al ataque enzimático que permite a
las células abrir canales de circulación en la matriz; presencia de ligandos con posibilidad de
unión a células y por último incorporar sitios de afinidad para factores de crecimiento (Pratt et
al., 2003).
Uno de los desafíos principales de las estrategias in situ es el logro de un balance sostenido
en el tiempo entre la reabsorción del scaffold y la síntesis de matriz neogenerada por las
células huésped, logrando la revitalización de la válvula por la repoblación in situ (Iwai 2007).
Esto es necesario no sólo para eliminar el material de scaffold original, sino también para
permitir la migración celular al ser susceptible a las enzimas que permiten a las células dirigir
la formación de matriz y controlarla. Aun sin respuesta inmunológica, la falta de balance entre
resorción y generación tisular puede llevar a atrofia, ruptura o hipertrofia de la válvula (Iwai et
al., 2007).
Como la celularización y las subsecuente producción y reemplazo de matriz extracelular es un
proceso lento y gradual, los scaffolds implantados deben poseer una durabilidad significativa,
sin pérdida de la funcionalidad, a través del control de la tasa de degradación. Además, debe
considerarse que en el desarrollo de válvulas in vivo se reclutan células que median la
respuesta inflamatoria del organismo (Mendelson, 2006). Esta tasa de degradación varía para
cada paciente, ya que los organismos de cada persona se comportan de manera diferente,
entre otras cosas por la disminución con la edad de la concentración de células progenitoras
endoteliales en el torrente sanguíneo (Schmidt, 2005).
Las estrategias in situ no permiten el uso de polímeros de rápida reabsorción, ya que implican
una pérdida rápida de las propiedades mecánicas con disminución de la funcionalidad de la
válvula, arriesgando la vida del paciente. Una alternativa a estos polímeros es el uso de
injertos de triple capa, en el cual un interior polimérico de rápida degradación (compuesto de
PGA tejido –knitted- con fibras de colágeno) es reforzado por una capa exterior de lenta
degradación de PLLA tejido –woven- (ácido poli-L-láctico). Ambas capas son unidas por una
lámina intermedia de policaprolactona. Se espera que la estructura porosa interna del PGA y
el colágeno microesponjoso promuevan la repoblación celular del scaffold in situ. La capa de
PLLA refuerza mecánicamente la estructura. Los tests de degradación de estos polímeros
sintéticos, fundamentalmente a través de reacciones hidrolíticas, demostraron que la
resistencia mecánica del PGA deja de ser adecuada pasado un período de 3 semanas,

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mientras que la capa de PLLA mantiene su resistencia pasados 6 meses, por degradarse más
lentamente. (Torikai, 2008)
Este tejido trilaminar mostró una alta durabilidad in vivo en injertos vasculares de hasta 12
meses en animales. Las pruebas se llevaron a cabo en cerdos de Crown (animales de 12 a 20
Kg). Los animales se separaron en 5 grupos al azar, que se sacrificaron pasados distintos
períodos desde la implantación. Se comprobó que el grosor de las paredes de tejido
neoformado no aumenta de una manera directamente proporcional al tiempo de implantación
(Torikai, 2008).
Se comprobó también que para el caso de creación de válvulas in situ la combinación
PGA/PLLA posee mayor afinidad con las células que el ePTFE usado también en este tipo de
técnicas. Todos los implantes desarrollaron endotelización completa, hecho nunca observado
en los implantes de ePTFE, más allá del tiempo de implantación. Los estudios mostraron la
integridad de la endotelización de la pared luminal de las válvulas, y que el endotelio
neoformado poseía membrana basal. Esto fundamenta la ausencia de trombos formados
sobre la superficie luminal del implante en el tiempo de implantación al que fueron sometidos.
Además, en las capas subendoteliales se observó una gran población de SMCs, gracias a las
cuales el tejido neogenerado demostraró una respuesta fisiológica normal (Reacción
vasomotora) a 2 meses de la implantación (Torikai, 2008).
En estudios sobre perros, la respuesta a este mismo tipo de implante también fue
satisfactoria, mostrando que luego de la completa regeneración del tejido neoformado, el
contenido de colágeno en la ECM era equivalente al presente en el tejido vascular nativo. Sin
embargo, las fibras elásticas fueron menos abundantes, y la capa elástica fue más angosta
que la de la aorta normal, pero con el paso del tiempo se comprobó que las fibras elásticas
siguieron desarrollándose (Yokota, 2008).
Se ha demostrado la existencia de un progenitor común para las células endoteliales y las
hematopoyéticas, y que este progenitor se diferencia en células endoteliales en el cultivo in
vitro frente a la presencia de factor de crecimiento fibroblástico, factor de crecimiento 1 y
factor de crecimiento vascular endotelial. Para la demostración de este hecho in vivo, se
implantaron válvulas pre sembradas con células derivadas de médula ósea de humanos en
perros. Se obtuvo que las células endoteliales desarrolladas en la superficie luminal del
implante sólo correspondieron al ADN del donante, concluyendo que las células progenitoras
CD34+ presentes en la médula ósea pueden circular en la circulación periférica y colonizar
superficies endoteliales de prótesis vasculares. (Shi et al., 1998) Además en estudios sobre
vasculogénesis se mostró que las EPCs son importantes en la neovascularización, proceso
que no depende solamente de la angiogénesis a partir de vasos preexistentes. (Asahara,
1999)

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Figura 26: Comparación de estrategias in situ versus in vitro.


Aunque todavía se entiende de forma pobre, se ha demostrado que existen mecanismos que
guían la generación de células musculares lisas de la capa íntima a partir de células
precursoras de la médula ósea, si bien los resultados de análisis de precursores celulares
muestran que no todas las células muscuares lisas formadas provienen de los precursores
presentes en médula ósea. Dado que los precursores de SMCs circulan por la superficie
luminal de la aorta en el caso estudiado, no pudo determinarse dónde exactamente se da la
adhesión de dichas células en la superficie, ni tampoco el ingreso de células progenitoras a
través de la neovascularización de la capa adventicia (Asahara, 1999).
Sin embargo se piensa que debido a las altas tensiones de corte presentes en la luz aórtica es
difícil que las células se adhieran en dicha superficie. Esto se relaciona con la repoblación de
válvulas pulmonares de xenoinjertos en ovejas, cuyo patrón de repoblación de células
huésped mononucleares depende altamente del desarrollo de neovascularización en capas
más profundas como la adventicia (desarrollo de los vasa vasorum) (Deb, 2005).
Se documentó un caso de homoinjerto valvular en humano que fue colonizado por células
provenientes de la circulación, y que se diferenciaron en células endoteliales y de músculo
liso, propagándose por el implante en forma centrífuga desde el lúmen arterial. Además, la
fibrosis y la calcificación fueron mínimas (Miller, 2006).
Una alternativa que está siendo explorada utiliza la cualidad de las células del organismo para
infiltrarse en cualquier cuerpo extraño implantado. Se evalúa la capacidad regenerativa de las
células que infiltran un cuerpo de non-vowen PGA implantado en forma subcutánea en
ratones, y se explantan luego de 1, 2, 3 y 4 semanas. Se observó un crecimiento de tejido en
el interior del scaffold implantado, progresivo en función del tiempo de implantación. A la 4ta
semana los implantes estaban completamente encapsulados en tejido conectivo con alta
vascularización. Se mostró que la regeneración tisular se produjo de mejor manera al colocar
sustancias antiinflamatorias en el scaffold, que ayudan a minimizar la respuesta inmunológica
(Lee, 2008).
Además, los experimentos de diferenciación cellular demostraron que las células que
infiltraron los scaffolds implantados fueron capaces de transformarse en células osteogénicas,
endoteliales, adipogénicas y miogénicas, demostrando que muchas de las células reclutadas

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al scaffold son multipotentes y que, dado un entorno óptimo, pueden diferenciarse en tipos
celulares específicos, necesarios para la regeneración tisular funcional (Lee, 2008).
El proceso de revitalización de las válvulas repobladas in situ depende completamente de la
respuesta del organismo ante una lesión, la cual guía la reparación tisular, y surge de manera
espontánea. La repoblación involucra la presencia en la circulación de células progenitoras
vasculares, las cuales se depositan en la superficie luminal del implante, y células del estroma
que migran desde la capa periadventicia del tejido de granulación o a través del sitio de
anastomosis. Consecuentemente, el reclutamiento de fibroblastos y su actividad sintética
promueve la remodelación de la ECM; la proliferación de EPCs guía la neogeneracion
endotelial sobre el implante (Iwai, 2007).

Figura 27: Esquema que muestra los enfoques in vitro e in vivo de la ingeniería de tejidos.

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Capítulo 4: FACTORES PARA LA CONSTRUCCIÓN DE VÁLVULAS POR TE


4.1. Factores de crecimiento
Los factores de crecimiento son proteínas o polipéptidos de señalización secretados para
promover respuestas celulares específicas, como la migración, proliferación y diferenciación
celular. Son producidos por secreción celular ante señales, y actúan por unión a receptores
transmembrana de las células blanco. Estos receptores producen respuestas por segundos
mensajeros (mediadores celulares) que transducirán la señal y activarán el aparato genético
desencadenando una respuesta biológica (ver figura). Por su corta vida media y lenta difusión
señalizan sólo a corto rango espacial y temporal a través de la ECM (respuesta no endócrina).
Su actuación sobre determinado grupo de células depende del número y tipo de receptores de
membrana de las mismas y de la transducción intracelular de la señal (Discher et al., 2009).

Figura 28: Vía regulatoria desencadenada por factores de crecimiento. 1. Secreción por la
célula productora. 2. Interacción con la ECM. 3. Interacción con proteínas receptoras de la
membrana (en este caso, integrinas). 4. Mecanismo de regulación interna (mediadores
celulares citoplasmáticos, expresión genética nuclear) (Lee, Silva y Mooney, 2010)
Los factores de crecimiento de posible uso en ingeniería de válvulas cardíacas son (Lee, Silva
y Mooney, 2010):
Angiopoyetinas (Ang)
- Ang-1: ayuda en la maduración y estabilidad de los vasos sanguíneos, el corazón y el
tejido muscular.
- Ang-2: desestabiliza, produce regresión y disocia las células del tejido endotelial
aledaño.

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Factores de crecimiento fibroblástico (FGFs): familia de 22 factores que se unen a 18


ligandos celulares (receptores de FGF (FGFR) con quinasas de tirosina transmembrana) de
gran potencial regenerativo y de reparación de tejidos por proliferación de fibroblastos y
mitogénesis en general, incluyendo piel, vasos, músculos, tejido adiposo, tendones y
ligamentos, cartílago, hueso, diente y nervio. El principal camino de señales que activa es de
RAS/MAP. Se degradan fácilmente in vivo, por lo que se recomienda su uso encapsulado.
Actúa simultáneamente con heparina o heparán-sulfato para activar los FGFR (Lee, Silva y
Mooney, 2010).
La señalización intracelular se produce por fosforilación de tirosina (tyr-P), que sirven como
disparadores de varias reacciones en cadena. Las tyr-P puede servir como sitio de
reclutamiento de SH2 (Src homology-2) o PTB (unión de fosfotirosina), que anclan proteínas o
señalizan enzimas. Los caminos de fosforilación pueden ser 3: 1. RAS/MAP (mitogen
activated protein), regula expresión genética, mitosis, diferenciación y apoptosis; 2. PI3
kinasa/AKT (fosfoinositida 3 kinasa), determina supervivencia y polaridad celular; 3. PLC-
gamma (fosfolipasa C gamma), aun no se saben las consecuencias de este último camino,
pero se sugiere que induce la adhesión celular (Yun et al., 2010).
Los FGF participantes del crecimiento, desarrollo y reparación valvular son, hasta adonde se
sabe, el FGF1 y el FGF2:
- aFGF (FGF ácido) o FGF1: factor proliferativo celular (en especial endotelial, epitelial
y fibroblástico), que tiene un rol importante en la migración celular (quimiotaxis).
Participa activamente en la angiogénesis (con más potencia que VEGF y PDGF) por
promoción de proliferación endotelial y de organización física tubular. También revierte
la transición endotelial-mesenquimal producida por la TGFβ1 (Ramos, 2010).
- bFGF (FGF básico) o FGF2: produce migración, proliferación y supervivencia de
células endoteliales, así como migración y proliferación de fibroblastos y células
miogénicas, procesos esenciales para proliferación de vasos sanguíneos nuevos,
hueso, nervios, músculo y piel. Participa activamente en la angiogénesis (Kottakis et
al., 2011).
Factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF-AB o PDGF-BB): regula el
desarrollo, proliferación, migración y crecimiento embrionario de células endoteliales. Por esto
permite la neogeneración y el crecimiento de tejido inmaduro de vasos sanguíneos, músculo,
hueso, cartílagos y piel (Lee, Silva y Mooney, 2010).
Factor de crecimiento transformador (TGF): gran familia de factores de crecimiento
proliferativos y transformadores, entre las cuales se incluyen TGFα y TGFβ. Los factores
TGFβ, muy activos en la valvulogénesis, el desarrollo y reparación valvular y las valvulopatías.
Incluye TGFβ1 (y otros TGFβX), BMP, activinas, inhibinas, proteínas nodales, miostatinas y la
hormona anti Mülleriana (Kingsley, 1994).
La secreción natural del TGFβ se da a través de un complejo trimolecular, el gran complejo
latente (LLC). Está compuesto por un dímero de TGFβ madura, un propéptido de TGFβ
(péptido asociado con la latencia, LAP) y una proteína de unión de TGFβ latente (LTBP). Las
LTBPs se unen covalentemente a las TGFβ, regulando la secreción de citoquinas, su
deposición en la ECM y su activación. La deposición de TGFβ en la ECM es modulada por la
interacción de las LTBPs y la fubrilina-1, una proteína microfibrilar. Esto indica que para una
correcta interacción de las TGFβ con la ECM es necesaria la interacción con LTBP (Todorovic
et al., 2011).
- TGF-β1: factor que es secretado y se fija a macromoléculas de la ECM, como la
fibronectina y las fibrilinas. Actúa sobre el hueso y los cartílagos, proliferando y
diferenciando las células formadoras de hueso y evitando la proliferación de tejido
endotelial. Actúa sobre las células endoteliales, promoviendo su transformación en
tejido mesenquimal (EMT, endotelial-mesenchymal transition), promoviendo la
formación y desarrollo valvular, así como también su remodelación (Conway et al.,

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2011). Además, la TGFβ (al igual que las tensiones mecánicas) induce la activación de
las VICs adultas con incremento de su actividad sintética de ECM (Schoen, 2008)
(Hulin et al., 2012). Los efectos regulatorios de la TGFβ1 circulatoria evitan la
inflamación, la calcificación y la degeneración valvular (Attaran et al., 2010).
- Proteína morfogénica del hueso (BMP): factores secretados por fibroblastos que se
fijan a macromoléculas de la ECM, como la fibronectina y las fibrilinas. La BMP2 es
expresada en el miocardio auriculoventricular (AV) durante la maduración de los
cojines endoteliales, promoviendo la EMT y maduración de la válvula AV. En la
valvulogénesis aórtica participan las BMP4, 5, 6 y 7. Los niveles de BMP2 en la válvula
humana adulta no son detectables en válvulas sanas, pero sí en válvulas enfermas. La
BMP4, en cambio, si es expresada en células valvulares adultas sanas para su
maduración y mantenimiento (Conway et al., 2011).
Factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF): Este factor es el más citado en los
trabajos de investigación y actúa sobre los vasos sanguíneos, fomentando el crecimiento
endotelial. Inhibe la invasión celular de los tejidos, pero aumenta la migración celular, hecho
que se condice con su actuación tardía en la formación de los cojines endoteliales que
conformarán las válvulas cardíacas primitivas. De este modo, al no actuar e un principio
permite la invasión celular del tejido, y su actuación posterior fomenta la motilidad celular de
los miofibroblastos para la remodelación de la ECM según las tensiones aplicadas (Chiu et al.,
2010)
La composición de la ECM es crucial para la mediación de la respuesta de factores de
crecimiento, ya que esta puede regular la presentación de los factores mediante la unión de
los factores a la ECM. En algunos factores de crecimiento existen dominios de unión con la
heparina, que hacen fundamental la composición adecuada de la matriz en la señalización.
Esta unión con heparina representa reacciones más lentas que los factores sin dominios de
unión con heparina, los cuales presentan una más rápida difusión. Además, la ECM regula el
anclaje y motilidad de las células, adaptando el tejido a su estructura. Por ejemplo las
integrinas, proteínas de membrana con dominios de unión con ECM, regulan activamente la
angiogénesis y señalización de tejido endotelial (Place, Evans y Stevens, 2009).
La concentración local de factores puede regular respuestas célula-célula, como las uniones
mediadas por cadherinas que son aumentadas para suprimir la proliferación celular sólo
cuando un determinado factor disminuye su concentración por debajo de un umbral. Además,
la angiogénesis mediada por VEGF es controlada por señalización notch, que suprime los
picos de concentración de VEGF. La inhibición local de los notch por DAPT (un inhibidor de
señalización notch) promueve la angiogénesis por crecimiento endotelial gracias a una mayor
captación de VEGF (Chen et al., 2011).
Si se desea lograr angiogénesis o endotelización (ver figura), la 1era etapa requiere de
factores Ang-2 (retrotrae la estructura de vasos preexistentes), FGF (ayuda en la migración,
proliferación y supervivencia de nuevas células endoteliales) y VEGF (fomenta el crecimiento
endotelial) para formar neovascularización inmadura. En una 2da etapa se utiliza Ang-1 y
PDGF-BB (factor de crecimiento BB derivado de plaquetas) ayudan a madurar y estabilizar los
vasos sanguíneos, permitiéndoles un crecimiento adecuado. Esto se puede realizar con
estrategias secuenciales de liberación de factores, mejores que la liberación de factores
únicos. La secuencia puede estar gobernada tanto por tasas de degradación variables como
por diferente unión de los factores con los polímeros degradables (Place, Evans y Stevens;
2009).

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Figura 29: Factores de crecimiento involucrados en la angiogénesis o endotelización de


scaffolds. Los nuevos vasos se forman por endotelización, gracias a la organización celular en
tubos. Estos serán posteriormente estabilizados por células musculares lisas (SMC) y
pericitos. La endotelización se produce por liberación de VEGF. El reclutamiento de SMCs se
consigue por la liberación de PDGF-BB. Este paso puede ser evitado si sólo se requiere
endotelización de una superficie (Place, Evans y Stevens; 2009)
Oligopéptidos imitadores proteicos: son péptidos que imitan las propiedades de adhesión
de los factores de crecimiento, obteniendo respuestas similares a las de estos.
Las integrinas, receptores de adhesión celular a la ECM, son glicoproteínas de membrana
heterodiméricas (existen 24 proteínas formadas por diferentes combinaciones de monómeros
α y β) dependientes de cationes. La mayoría de las integrinas reconoce ciertas proteínas de la
ECM mediante ciertas secuencias aminoacídicas como RDG (arg-lys-asp), EILDV (glu-ile-leu-
asp-val) y REDV (arg-glu-asp-val) (Barczyk et al., 2010).
La unión con integrinas de inmunoglobulinas superficiales celulares (ICAM-I y VCAM-I) o
proteínas de ECM (fibronectina y vitronectina) promueve una transducción intracelular de
señales. Además, las integrinas forman complejos con factores de crecimiento (TGF-β, PDGF,
VEGF) y sus receptores, ayudándolos en sus respuestas (Danhier, Le Breton y Préat, 2012).
Por último, las respuestas de las integrinas a estímulos regulan múltiples reacciones
intracelulares en cadena, como las GTPasas Erk, FAK (focal adhesion kinases), Src y Rho,
caminos que se entrecruzan con los producidos por diversos factores de crecimiento (Echarri
et al., 2006). En particular, algunas integrinas regulan enzimas proteolíticas de la ECM
(MMPs) (Ramsey et al., 2007) y angiogénesis por interacción con factores de crecimiento
(FGF, VEGF) (Desgrosellier et al., 2010).
La secuencia RGD es el sitio de adhesión celular (a través de la integrina αv-β3 y otras) de
fibronectina, fibrinogeno, vitronectina, plasminogeno, trombospondina, protrombina, MMP-2,
laminina, osteopontina, entre otras proteínas de la ECM. Utilizando moléculas que repitan esta
secuencia pueden imitarse todos los efectos anteriormente discutidos. Se han probado
scaffolds macroporosos presentadores de RGD (arg-lys-asp). También pueden usarse
péptidos RGD (promotores de adhesión celular) unidos covalentemente a los scaffolds,

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estrategia que aumenta dramáticamente la tasa de supervivencia de células


progenitoras endoteliales y el retorno sanguíneo. Diversas estrategias de modificación de la
molécula (incluso moléculas no peptídicas imitadoras) (ver figura) se utilizan para mejorar la
vida media, especificidad y respuesta de los péptidos RGD (Danhier, Le Breton y Préat, 2012).

Figura 30: Algunas estrategias RGD. A) Secuencia RGD original. B) RGD antagonista cíclico.
C) Péptido cíclico c(RGDfK). D) ACDCRGDCFCG. E) y F) 2 moléculas peptidomiméticas
(Danhier, Le Breton y Préat, 2012)
Otro péptido recientemente descubierto es el YCWS-QYLCY, que puede inmovilizarse a
hidrogeles y aumentar la supervivencia celular.

4.2. Moléculas señalizadoras


Para beneficiarse de la capacidad regenerativa natural del cuerpo, el scaffold implantado de
válvula cardíaca requiere desencadenar los mecanismos apropiados para el reclutamiento,
organización y diferenciación celular. Esto se obtiene mediante las adecuadas moléculas
señalizadoras. Los scaffolds sintéticos tradicionales tienen la desventaja de no poseer dichas
moléculas desencadenantes de reacciones en cadena, por lo que no proveen sustento para
las interacciones naturales presentes en la ECM. Para lograr una mejor adaptación valvular a
través de “scaffolds inteligentes”, ya sea para procesos in vitro o in situ, se requiere entonces
del agregado de las mismas (Mol et al., 2009).

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4.2.1. Mecanismos de señalización


Los mecanismos de señalización intracelular pueden ser variados y se influyen unos a otros.
Los más importantes para la adherencia, activación, proliferación y motilidad celular y para la
síntesis de tejido son: por GPCR (G-Protein-Coupled Receptors), Wnt pathway (o receptores
Frizzle/β-catenina), señalización Notch (receptores Notch), señalización Hedgehog (o
receptores Patched/Smoothened), señalización TGF-β (o señalización SMAD, con receptores
TGFR), señalización Hippo (o por unión Adherente y Zonula Occludens), y por receptores
FGFR (fibroblast growth factor receptor) (Berridge, 2012).
GPCR: Las proteínas-G (o proteínas de unión a GTP) son un grupo heterogéneo de proteínas
heterotriméricas ligadas al nucleótido guanina (ya sea en forma de GDP o GTP) en la
superficie interior de la membrana plasmática. Estas funcionan como un interruptor binario:
unidas a GDP están desactivadas (“off”); unidas a GTP pasan al estado activado (“on”). Esto
último sucede por intercambio mediado por GPCR ante ante diversos estímulos, incluidas
hormonas y neurotransmisores, proteinasas, aminas, nucleósidos, lípidos, factores de
crecimiento y estímulos luminosos en células fotosensibles. Algunos ejemplos son el receptor
de somatostatina 3 (Sstr3), el receptor de hormona concentradora de melanina 1 (Mchr1) y el
receptor de serotonina 6 (5-HT6) (Berridge, 2012).
En presencia de estímulos las proteínas-G activan kinasas, como Tyr (tirosina-kinasa), Src
(una familia de tirosinas-quinasas), FAK (focal adhession kinase) o AC (adenil-ciclasa) que
desencadenan una cascada de reacciones a través de proteínas (ver figura). Las más
importantes de estas son la RAS (para seguir el mecanismo de la proteína MAPK), la PKA
(para el mecanismo de la cAMP), entre otras. La via cAMP regula reacciones del metabolismo
celular. La vía MAPK (mitogen-activated protein kinases) fomenta la transcripción proteica e
inhibe la tumorogénesis. Una desregulación de este mecanismo puede dejar activada en “on”
u “off” la transcripción de una proteína o la mitogénesis, produciendo determinados canceres
(Stenmark, 2009).

Figura 31: Mecanismo de SWITCH binario de las GPCR. La proteína-G está inactiva cuando
es unida a GDP (modo “off”). GPCR intercambia el GDP de la proteína-G por GTP ante
estímulos, lo cual la activa (modo “on”). Activa puede activar distintas kinasas, cada una de las
cuales implica un mecanismo diferente (Berridge, 2012)

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Wnt pathway: regula la pluripotencialidad de las células madre y otras células poco
diferenciadas, a la vez que tiene un importante rol en el desarrollo celular y de los órganos.
Representa uno de los mecanismos por el cual actúan diversos factores de crecimiento, como
FGF, TGF-β y BMP. El ligando Wnt es una glicoproteína secretada parácrina (por otra célula
cercana) o autócrinamente (por la misma célula), que se une a receptores frizzled (Cai et al.,
2013).
En la ausencia de Wnt (estado “off”), las β-cateninas (E-cadherinas integrales de adaptación
célula-célula y co-reguladoras transcripcionales) son fosforiladas y degradadas, reduciendo la
capacidad de respuesta de la célula. Ante la presencia de Wnt (estado “on”) se producen 3
respuestas (ver figura): 1. Respuesta canónica: las β-cateninas son liberadas (acumulación
citoplasmática) y traslocadas al núcleo, fomentando la diferenciación, proliferación o migración
celular y disminuyendo la adhesión; 2. Respuesta no canónica: regula el citoesqueleto por
polimerización de actina y profilina durante la migración, mitosis o diferenciación celular; 3.
Respuesta no canónica reguladora de calcio: regula la liberación de calcio del retículo
endoplasmático (RE) (Berridge, 2012).

Figura 32: Respuestas celulares a la presentación del ligando Wnt. Izquierda: Respuesta
canónica, con acumulación de β-catenina citoplasmática y translocación hacia el núcleo para
control de los genes Wnt. Medio: Respuesta no canónica (RNC) por polaridad celular, con
activación de proteínas unidas a GTP (Rho y Rac) que, a través de quinasas, remodelan el
esqueleto de actina y producen contracción de actina/miosina. Derecha: RNC de regulación
de calcio, liberando o reteniendo Ca2+ del REL (Berridge, 2012)
La regulación Wnt es muy importante en las etapas de formación de las válvulas cardíacas,
durante la transformación EMT. En el mesénquima de cojines endocardiales de válvulas de
ratón y gallina se encontró expresión de múltiples genes del mecanismo Wnt (Wnt2, LEF1,
Fzd2) consistentes con la EMT (Alfieri et al., 2010). Además se estudió la pérdida de β-
cateninas en células valvulares embrionales de ratón y se descubrió que no ocurre EMT en
ausencia de Wnt (Liebner et al., 2004). La presencia en células valvulares mesenquimales de
Wnt2 es consistente con la proliferación celular durante la etapa de EMT. Wnt2 es además

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requerido para la diferenciación celular del linaje cardíaco en células madre embrionarias
(Wang et al., 2007).
Además se pudo relacionar la calcificación patológica de válvulas cardíacas adultas con el
aumento de la expresión de mecanismos canónicos de señalización Wnt, lo cual puede estar
relacionado con la función que cumple Wnt en el desarrollo del linaje osteoblástico, además
de su función de regulador de calcio. Sin embargo, para la osteogénesis por Wnt se requiere
además un medio osteogénico, por lo que probablemente existan otros factores que afecten
conjuntamente a la calcificación de las válvulas (Caira et al., 2006).
Señalización Notch: Regula la diferenciación celular y la homeostasis en células adultas. La
regulación es yuxtácrina y unidireccional entre 2 células en contacto. Una unión de proteínas
de membrana de una célula emisora y una célula receptora produce la escisión del dominio
extracelular de la receptora, desencadenando una cascada por liberación intracelular del
dominio citoplasmático de la proteína, el cual transduce en el núcleo el mensaje (ver figura)
(Andersson, Sandberg y Lendahl, 2011).

Figura 33: Modelo de señalización Notch (Canónica y No canónica). Pueden verse: a) unión
ligando(célula emisora)-Notch(célula receptora); b) endocitosis de ligando-dominio Notch
extracelular (NECD); c) endocitosis de NICD; d) traslocación de NICD al núcleo; e) NICD
remueve moléculas represoras y permite expresión del gen (modificado de: Ables et al., 2011)
La señalización Notch es un camino crucial en la diferenciación celular durante el desarrollo
del corazón, y particularmente en el desarrollo valvular y la transformación endotelial-
mesenquimal (EMT). La EMT se produce sin infiltración de la primordia en células endoteliales
y endocardiales via Notch (transmitido yuxtacelularmente). Notch activa Snail1,2, una proteína
que produce la expresión de genes mesenquimales (α-actina, fibronectina, N-cadherina,
vimetina) y la inhibición de genes endoteliales (como los marcadores E-cadherina y α/β-
catenina). El agregado de factor BMP2 induce la migración y total invasión del tejido valvular
con EMT (ver figura), sugiriendo que la señalización Notch desencadena la EMT y una
posterior señalización BMP2 completa el proceso (Luna-Zurita et al., 2010).

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Una diferencia en la señalización del endocardio en el canal auriculo-ventricular (AVC) (con


expresión de Notch1) respecto al endocardio de las regiones atrial y ventricular (sin expresión
de Notch1) determina que la EMT sólo se produzca en los cojines endoteliales, y no en las
cavidades cardíacas (De la Pompa y Epstein, 2012). El descenso progresivo de la
señalización Notch durante la adultez participa en procesos patológicos valvulares como la
formación de mesénquima valvular, fibrosis y calcificación (Luna-Zurita et al., 2010).

Figura 34: Diagrama de la expresión de señalizadores Notch en el desarrollo valvular. A)


Corazón en semana 5ta-8va. B) Cojines endocardiales del tracto de salida (OFT) y del canal
auriculoventricular (AVC) en la primordia valvular, sitios de expresión de la EMT. Señales
(flechas) del endocardio (Notch1Snail1/2) y miocardio (BMP2TGFβ2) convergen para
disparar la EMT. Células de la cresta neural (NC) y mesénquima endocardial (celeste) via
BMP2 invaden la válvula en OFT (aórtica), mientras que sólo el endocardio invade la válvula
en AVC (mitral). C) Expresiones Notch durante el remodelamiento de la OFT (modificado de:
de la Pompa y Epstein, 2012)
Señalización Hedgehog (Hh): al igual que la señalización Wnt regula desarrollo y
proliferación celular de forma parácrina o incluso a cierta distancia. Es activado por la unión de
ligandos a receptores Patched (Ptch), los cuales son represores de la actividad de proteínas
Smoothened (Smo). Las proteínas Smo son una familia de proteínas de membrana GPCR (G-
protein coupled receptor). Los ligandos pueden ser de 3 tipos: Sonic hedgehog (Shh), Indian
hedgehog (Ihh) y Desert hedgehog (Dhh). El complejo ligando/receptor es internalizado,
posibilitando la acción de las proteínas Smo como procesadores de los factores de
transcripción Gli (ver figura) (Humke et al., 2010).

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Figura 35: Señalización Hh. A) Producción de ligandos (Shh, Ihh o Dhh) con agregado de
colesterol para polimerización (formación de complejos de señales) y palmitato (para
señalización de alto nivel), y empacado en partículas asociadas a lípidos. B. Unión de Hh a
Ptch permite a Smo liberar proteínas Gli, que activan genes blanco. C. Célula sin unión a Hh,
cuya Ptch inhibe la acción de Smo. Las proteínas Gli se fosforilan y se convierten en
represoras de genes blanco (Wilson y Chuang, 2010)
En mamíferos los cilios primarios son los reguladores del mecanismo Hh a través de un
proceso dinámico de transporte interflagelar (IFT). Las células de mamíferos expresan
proteínas Ptch, Smo y Gli (1, 2 y 3) sólo en las puntas de los cilios primarios. El proceso Hh,
entonces, implica el transporte dinámico de los receptores de membrana Ptch y las GPCR
Smo (ver figura). Sin las señales Hh en la ECM, las Ptch reprimen no sólo la acción de las
Smo, sino también su transporte anterógrado (hacia la punta) por el cilio. Al unirse el ligando a
Ptch, esta proteína deja el cilio por el mecanismo retrógrado (hacia la base del cilio) de
transporte IFT, mediado por la proteína citoplasmática dineína. La Smo entonces es
transportada hacia la punta del cilio por IFT anterógrado, mediado por kinesina a través del
axonema ciliar. Allí cumple su rol de liberar Gli, la cual es transportada hacia la célula a través
del cilio. La respuesta a los estímulos Hh de las células ciliadas incluye el aumento de las
prolongaciones citoplasmáticas y la motilidad celular (Kardon y Vale, 2009).

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Figura 36: Mecanismo Hh en mamíferos (ratón) a través del cilio primario. C) Ptch1 activa por
ausencia de factores Hh en el medio, inhibe la acción de Smo. D) Al unirse a Hh, Ptch1 se
inactiva y es arrastrada fuera del cilio (dineína). Esto permite a Smo ser traslocada hacia el
cilio (kinesinas en el axonema ciliar) para activar la señalización (Wilson y Chuang, 2010)
Las proteínas Gli humanas 3: Gli1, Gli2 y Gli3. Gli 2 y Gli3 son factores de transcripción
bifuncionales regulados por procesamiento proteolítico, de modo que en su longitud completa
actúan con un extremo C-terminal activador transcripcional y truncados actúan con un
extremo N-terminal represor genético. Ambos son esenciales para la embriogénesis, como lo
demuestran estudios en ratones. Gli1, en cambio, sólo actúa en su longitud completa con su
extremo activador C-terminal, y no puede ser regulado. Por otro lado, es prescindible en el
desarrollo embrional y sólo actúa como lazo de realimentación positiva, potenciando los
efectos de la señalización (Hui y Angers, 2011).
Los blancos genéticos son variados, e incluyen reguladores de la diferenciación y renovación
de células madre, y de la proliferación, determinación y muerte celular (Canettieri et al., 2010)
Señalización TGF-β: la superfamilia TGFβ incluye a las TGFβs y las BMPs (bone
morphogenic proteins). Las TGFβs 1, 2 y 3 controlan un amplio espectro de procesos
celulares, desde EMT, crecimiento celular, apoptosis, diferenciación, síntesis de ECM y
remodelación de tejidos, todo de un modo altamente dependiente del contexto (Sporn et al.,
2006). Genes muy implicados en la actividad de los miembros de la familia TGFβ son el de la
periostina, (Postn), el factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) y el inhibidor de
activadores de plaquetas (PAI1), cruciales en el desarrollo del hueso, tejidos blandos y en la
remodelación tisular (Snider et al., 2009).
La señalización se basa en la oligomerización (mediada por presentación de ligandos) de
kinasas de serina/treonina unidas a receptores, que fosforilan las moléculas de señalización
citoplasmática SMAD (SMAD2 y SMAD3 para los caminos TGF-β/activina; SMAD1, 5 y 8 para
el camino de BMP). Los SMADs carboxilados se unen al co-mediador SMAD4
(heterodimerización), que les permite la translocación al núcleo y la regulación genética (ver
figura) (Wu, Hill et al., 2009).

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Figura 37: Diagrama de la señalización de la superfamilia TGF-β (TGFβ1 y BMP) (Berridge,


2012)
Los mecanismos de señalización TGFβ pueden ser regulados por la expresión de SMADs
inhibitorios (iSMADs) mediados por SMURFs (SMAD ubiquitin regulatory factors). Los iSMADs
más frecuentes son SMAD6, que inhibe BMPs, y SMAD7 que inhibe ambos, BMP y TGFβ.
Estos degradan receptores de la familia TGF (Tang et al., 2010). Por otro lado, los caminos de
activina y BMP son atenuados en varios niveles por la señalización MAPK (mitogen-activated
protein kinase). Este diálogo entre 2 caminos de señalización permite generar regulación
externa y evitar lazos de realimentación positiva (Goto et al., 2007).
Una de las mayores funciones de los factores TGFβ es la inhibición de la proliferación celular.
Por su parte, SMAD2 y SMAD4 son supresores de tumores. Además, la señalización TGF-β
puede activar caminos independientes de SMADs (no canónicos), incluso puede interactuar
con otros caminos de señalización a través de moléculas como Erk, SAPK/JNK, y p38 MAPK.
La Rho GTPasa (RhoA) activa ciertas proteínas, como mDia y ROCK, promoviendo la
reorganización del citoesqueleto para la motilidad y dispersión celular, elcrecimiento y la
citokinesis. Cdc42/Rac regula la adhesión celular a través de kinasas efectoras como PAK,
PKC y c-Abl gracias a la activación por TGF-β (Berridge, 2012) (Santibanez y Kocic, 2012).
Durante el desarrollo valvular se expresan varios genes TGF (en especial TGFβ2 durante la
EMT, y TGFβ3 durante el desarrollo). Durante la formación valvular existe una importante
interacción entre los caminos de señalización TGFβ y BMP, durante la cual los receptores de
TGFβ2 se unen también con BMP2, factor desencadenante de la EMT (Townsend et al.,
2011). Se ha reportado también la expresión de Tgfb2 durante el desarrollo cardíaco en el
miocardio peri-valvular, el mesénquima valvular y la pared del arco arterial faríngeo.
Disruptores genéticos sobre el gen Tgfb2 produjeron malformaciones valvulares en ratones,
con defectos en el septum valvular, defectos miocardiales y válvulas desproporcionadas.
Estos genes son candidatos ideales para la respuesta homeostática natural a las tensiones, y
para los procesos de reparación en la válvula adulta (Azhar et al., 2011).
La vía de señalización de las TGFβ está vinculada con procesos patológicos a largo plazo o
crónicos en las válvulas cardíacas. Aumentos de TGFβ1 y pSMAD2 están asociados con
calcificación valvular y aneurismas aórticos (Gomez et al., 2009). Asímismo, aumentos de la
expresión de SMAD3 fueron encontrados en pacientes con aneurisma aórtico y patologías
osteoartríticas, con patología valvular y miocardial (van de Laar et al., 2011).
Dada su importancia enla regulación de procesos de osificación, no sorprende que una
alteración polimórfica de un único nucleótido del receptor TGFβR3 (receptor de TGFβ2)

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implique una matriz ósea con densidad mineral significativamente alterada (Xiong et al.,
2009). Respecto a los procesos de osificación, se encontró que BMP2 también puede actuar
como ligando de TGFβR3 (Townsend et al.2011). Esta interacción entre la vía de señalización
TGFβ2 y BMP2 tiene un rol importante en procesos de calcificación valvular aórtica (Hakuno
et al., 2009) (Miyazono, Kamiya y Morikawa, 2010).
Señalización Hippo: controla el crecimiento y proliferación celular, siendo crítico en la
inhibición de la modificación del tamaño del órgano y del desarrollo de procesos carcigénicos.
La señalización es principalmente mecánica (filamentos de actina) o mediada por uniones
intercelulares adherentes y zonula occludens (yuxtacelular), además de por daños del ADN.
La densidad celular del tejido aumenta la formación de uniones, estimulando este mecanismo.
El camino final depende de la actividad de 2 coactivadores transcripcionales, el YAP y el TAZ,
que inducen antiapoptosis y proliferación celular, entre otros procesos compartidos con
distintos mecanismos de señalización (FGF, TGF). La fosforilación de YAP y TAZ promueve su
degradación o la activación de genes pro-apoptóticos (Cell Signalling Technology, 2010).
La estimulación parácrina a través de la zonula adherens determina la fosforilación de YAP y
su inmobilización. La zonula occludens actúa por varios caminos: 1. El complejo proteico
Crumbs une a los coactivadores YAP y TAZ a complejos SMAD (transductores de la
señalización TGF-β), inhibiendo su actividad nuclear; 2. Ante alta densidad celular suprime la
actividad nuclear por vía de la quinasa MST1/2, que fosforila a la kinasa LATS1/2 (activación)
para que esta fosforile a YAP y TAZ (ver figura); 3. Ante baja densidad celular, en cambio, la
zonula occludens fomenta la traslocación de YAP y TAZ al núcleo para permitir su expresión
genética (Halder y Johnson, 2011).
La proteína CD44, expresada en la vecindad de las zonula occludens, es un receptor
transmembrana de ácido hialurónico (componente fundamental de la ECM de tejidos blandos,
como las válvulas cardíacas) que puede responder incluso a osteopontina y colágeno
(también encontrados normalmente en el tejido valvular). El camino de CD44 es similar al ya
expresado. MST 1 y 2 (MST1/2) son 2 quinasas que fosforilan kinasas LATs (Large Tumor
Supresor) 1 y 2, proteínas encargadas de inhibir la actividad tumoral (Berridge, 2012).

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Figura 38: Un camino de la señalización Hippo. La proteína CD44 (ligada a zónula


occludens), ante alta densidad celular, recibe estimulación mecánica que fomenta la
activación de MST1/2  quinasa LATS1/2, fosforilando YAP y TAZ e inmobilizandolas por el
factor 14-3-3 (Berridge, 2012)
Otros mecanismos de regulación Hippo son la motilidad celular y las deformaciones de la
ECM, que estimulan mecánicamente al citoesqueleto de actina activando también la vía de la
MST-1/2. Por último, el daño del ADN activa la kinasa LATS-1/2, inhibiendo también la
proliferación celular (Badouel y McNeil, 2011).

4.2.2. Sustratos y acciones que desencadenan


Los sustratos son materiales o sustancias sobre los que actúan las enzimas o que actúan
sobre las proteínas receptoras de la membrana plasmática (Houghton Mifflin Company, 2009).
Diferentes sustratos activan los mecanismos de señalización ya mencionados. Cada camino
puede ser activado por distintos sustratos, y algunos sustratos activan más de un camino.
GAGs: el uso de GAGs, como el heparán sulfato (HS) y el ácido hialurónico (HA), en los
scaffolds funciona como promotor de la síntesis de ECM por diversas células sembradas. Se
cultivaron células endoteliales umbilicales venosas humanas (HUVECs) en scaffolds de fibrina
con gelatina y fibronectina, comparando los resultados en scaffolds sin GAGS respecto a los
que contenían distintas proporciones de HS, HA y HS+HA. Se demostró por métodos
inmunohistoquímicos la proliferación celular aumentada en scaffolds con GAGS (mayor aún
en presencia de HS+HA). Los sitios de adhesión como los dominios αC y RGD de integrinas y
proteínas de membranas se unen a sitios activos de la molécula de fibrinógeno pero también
a GAGs, siendo estas uniones las responsables de la adhesión celular mejorada al scaffold.
Por otro lado, también se demostró que la síntesis de colágeno IV y elastina se ve mejorada
en las matrices con HA, HS o HA+HS (ver figura). Estas ECM mostraron incluso la
organización de las redes de colágeno típicas del colágeno 4 en tejidos vasculares (Divya y
Krishnan, 2009).

Figura 39: Microfotografías de elastina depositada en células endoteliales por inmunotinción.


Arriba, matríces sin GAGs. Abajo, matríces con HS+HA. Izquierda, cultivo por 10 días.
Derecha, cultivo por 20 días. Puede verse elastina aumentada en los scaffolds con GAGs y
con el aumento de tiempo (modificado de: Divya y Krishnan, 2009)

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La inmovilización de HA en scaffolds es más favorable a la organización de la elastina en


fibrillas insolubles y la creación de redes para formar hojas tejidas de elastina (Joddar, Ibrahim
y Ramamurthy, 2007).
Fibrina: La fibrina parece accionar los mecanismos de producción de ECM por células madre
o fibroblastos. Redes de elastina con un alto grado de direccionalidad se han encontrado en
scaffolds con fibrina sembrados con células madre luego de 2 semanas de cultivo con
respecto a los scaffolds sin fibrina (Williams et al. 2006).
La siembra celular en scaffolds reforzados con fibrillas de fibrina parece mejorar la adhesión y
proliferación celular, respetando la estructura de la fibrina. Alfonso et al. determinaron que
scaffolds de PLC con fibrina permiten una proliferación celular aumentada. Las células
parecieron usar el marco de fibrina para migrar entre las fibras de PLC del scaffold. Este
comportamiento no se ve en los scaffolds sin fibrina (ver figura) (Alfonso et al., 2013).

Figura 40: Celularización en scaffolds: A) PLC sembrado sin fibrina. B) PLC con fibrina
smebrado. En B) puede verse la organización densa de células en las regiones con fibrina
(Alfonso et al., 2013)
La fibrina usada en TE muestra gran capacidad para el crecimiento celular homogéneo,
producción de colágeno, alta eficiencia de sembrado y buena distribución celular. Además, los
tejidos expuestos a scaffolds de fibrina demuestran muy buena remodelación in vivo (Syedain
et al., 2008). Por otro lado, las tensiones dinámicas aplicadas a los scaffolds como
pretratamiento para mejorar sus propiedades mecánicas producen depleción de GAGs del
scaffold. La fibrina parece sin embargo aumentar la retención de GAGs en el scaffold ante
tensiones dinámicas. Esto es bueno ya que los GAGs en la capa esponjosa disminuye las
tensiones por flexión producidas dinámicamente en las valvas (ver figura) (Alfonso et al.,
2013).

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Figura 41: Retención de GAGs por la estructura de fibrinas. Arriba: Sin fibrinas, puede verse
la casi total depleción de GAGs (azules) del scaffold luego de una semana de tensiones
dinámicas. Abajo: La estructura de fibrina (rojo) retiene lo GAGs (azules) luego de una
semana de aplicación de las tensiones dinámicas (Alfonso et al., 2013)
Vitaminas: Sustancias orgánicas, de origen vegetal o animal, que se encuentran en los
alimentos en pequeñas cantidades y son imprescindibles para el desarrollo y crecimiento de
los animales, puesto que estos son incapaces de sintetizarlas y deben obtenerlas a través de
la alimentación. Las vitaminas se dividen en dos grandes grupos: las liposolubles, como las
vitaminas A, D, E y K y las hidrosolubles, como la C y los compuestos del complejo B. Son
encargadas de actuar como cofactores de diversas reacciones enzimáticas, muy importantes
durante la generación y remodelado de redes poliméricas de la ECM (Diccionario
Enciclopédico Vox 1, 2009).
El uso de ácido retinóico (RA, metabolito de la vitamina A) y ácido ascórbico (AA, metabolito
de la vitamina C) demostró ser de gran ayuda en la proliferación de redes proteicas de la ECM
y en la adecuación de las propiedades mecánicas. Se trataron injertos vasculares (de
colágeno I fibrilar) sembrados con células musculares lisas (SMC) de aorta humana con 0,3
mM de AA y 0,1 mM de RA. Se demostraron propiedades biomecánicas mejoradas con el
tiempo de cultivo (aumento de resistencia, disminución de dureza). También mejoró la
creación de ECM, hecho demostrado en el aumento de ARNm de colágeno y elastina el las
SMC en 15 y 30 días de cultivo (Ogle y Mooradian, 2002).
La adición de vitamina D mejora las propiedades mecánicas de los scaffolds, pero induce la
diferenciación de células madre mesenquimales (MSC) humanas en condroblastos u
osteoblastos, modificando su secreción y perjudicando a la ECM (Formosa et al., 2010).
Sucede algo similar en células del estroma medular (Ravindran, 2012)
Productos de degradación de scaffold: los scaffolds biodegradables liberan monómeros
durante su degradación. Estos se acumulan cerca de los injertos y son reabsorbidos por los
tejidos, induciendo diversas reacciones. Fragmentos de ácido hialurónico (HA) en forma
oligomérica agregados a scaffolds podrían inducir la estimulación de citokinas y quemokinas.
La expresión y secreción de este tipo de moléculas es inducida de un modo dependiente del

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tiempo al liberarse anticuerpos TLR2 y TLR4, los cuales son estimulados por oligómeros de
HA (Shimada et al., 2008).
Más aun, la diferencia de tamaño de poros y morfología del scaffold también influye en la
expresión genética de las células, en especial debido a las alteraciones en el contacto célula-
material y célula-célula. Del mismo modo esto ocurre con los productos de degradación, que
modifican los contactos de adhesión con la ECM (Hee et al., 2005)
Citoquinas y quemoquinas: las citoquinas son una superfamilia muy amplia de proteínas, las
cuales son liberadas por determinadas células y producen el desplazamiento o marcan el
camino para el desplazamiento de otras células, por medio de los caminos de señalización
que mueven el citoesqueleto de actinas (GPCR, integrinas y kinasas de tyrosina receptoras
-RTKs-). Las quemoquinas son un tipo de citoquinas encargadas del movimiento de leucocitos
y las respuestas inflamatorias (SABiosciences, 2012).
Las citoquinas pueden ser fomentadas por el agregado de GAGs a los scaffolds. Esto sucede
por la unión natural de los GAGs a algunas proteínas quemoatrayentes. RANTES y las
proteínas inflamatorias de macrófagos (MIP-1α y MIP-1β) aumentan las propiedades
adhesivas de las células a las que atraen. De este modo se pueden generar scaffolds con
propiedades de atracción celular (Schall y Bacon, 1994).
El ácido hialurónico de alto (HMW-HA) y bajo (LMW-HA) peso molecular existen naturalmente
en la ECM de varios tejidos, y promueven la agregación de citoquinas. La interacción con
determinadas células con LMW-HA estimula la unión con receptores de membrana
relacionados con el citoesqueleto de actina y la AFAP (proteína asociada con los filamentos de
actina). Así se estimula la motilidad celular, al tiempo que se desencadenan procesos
regulados por ciertos genes blanco (mediante factores de transcripción). De este modo se
señaliza la producción de citoquinas y quemoquinas pro inflamatorias, las cuales pueden
usarse para fomentar la rápida angiogénesis y endotelización, así como también los procesos
de remodelación vascular y valvular (Bourguignon et al., 2011).
Más importante aún es el uso de quemoquinas para atraer células madre a través de la
inflamación. Las células madre mesenquimales (MSC) y las hematopoyéticas (HSC) pueden
producir efectos beneficiosos alterando las respuestas inflamatorias para evitar la fibrosis y
mejorar la curación. La incorporación de quemoquinas, en este caso SDF-1α (stromal derived
factor), por inyección a un scaffold de PLGA fue implementada y evaluada en ratones. En 2
semanas la respuesta de las células madre autólogas fue mejorada 3 veces en cuanto a la
población celular (ver figura) y la interfase célula-matriz. Además, se redujo la respuesta
inflamatoria celular y el aumento de la angiogénesis, reduciendo el tejido fibrótico (Thevenot et
al. 2010)

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Figura 42: Aumento de la población de MSC por agregado de citokina SDF-1α a scaffolds de
PLGA. En rojo se marcan las células CD45-, mientras que en verde las SSEA-4, 2 tipos de
MSC. En azul se tiñeron los núcleos celulares. A. Scaffold de PLGA sin citokinas. B. Scaffold
con citokinas. Se nota a simple vista la celularidad aumentada en B (modificado de: Thevenot
et al., 2010)
Anticuerpos CD34 y aptameros de alta afinidad: Los anticuerpos son moléculas de
membrana o secretadas que se adhieren selectivamente a antígenos, proteínas reconocibles
por el sistema inmune que señalizan e identifican diversas células (Janeway et al., 2001). Los
aptameros son ácidos nucleicos (ADN y ARN) monocatenarios que permiten señalizar
respuestas genéticas específicas y plegarse en estructuras 3D uniéndose con gran afinidad a
moléculas determinadas (proteínas en general, enzimas, receptores de membrana,
anticuerpos, etc). A través de estrategias de ingeniería superficial (como cubiertas peptídicas
de scaffolds) ayudan en el reclutamiento activo y la diferenciación celular valvular, en conjunto
con el uso de factores de crecimiento específicos (Jayasena, 1999).
La inmovilización de células por anticuerpos fue probada por Rotmans et al., que usó
anticuerpos anti-CD34 para la atracción de células progenitoras endoteliales circulantes
(EPCs). Estudios in vivo demostraron que scaffolds con cubiertas de anticuerpos produjeron
una endotelización más rápida, aunque produjeron hiperplasia de la membrana íntima en
injertos arteriovenosos de PTFE expandido en cerdos (Rotmans et al., 2005). Otra molécula
que puede atraer células con gran especificidad es la P-selectina. Injertos vasculares fueron
implantados en la arteria femoral de ratas como shunts cubiertos con dicha proteína y se
obtuvo una captura satisfactoria de células mononucleares CD34+ (Wojciechowsky et al.,
2008).
Aptameros fueron inmovilizados en cubiertas de polietilenglicol (PEG) star (scaffolds de PTFE
y PDMS cubiertos con PEG). Star PEG es un PEG con forma de estrella de 6 brazos, que de
este modo logra adherirse con facilidad y formar cubiertas sobre superficies irregulares. Luego
de la polimerización, star PEG tiene grupos funcionales libres que pueden usarse para unir
moléculas de adhesión celular (Schleicher et al., 2009). Las ventajas de los aptameros como
moléculas de adhesión son su pequeño tamaño, su gran afinidad y especificidad, su no
toxicidad y su no inmunogenicidad. Un estudio demostró la posibilidad de unir aptámeros de
células CD31-positivas porcinas, obteniéndose una gran captación y retención celular
(Hoffmann et al., 2008).
Fibulina: Las fibulinas son una familia de 7 glicoproteínas secretadas hacia la ECM
(Horiguchi, 2009). Contienen dominios de unión a calcio similares a los del factor de

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crecimiento epidérmico (cbEGF-like domains). La fibulina 5 específicamente contiene 6 de


estos dominios, uno de los cuales presenta el péptido RGD, a través del cual promueve la
adhesión celular, organogenicidad, fibrogenicidad, remodelación vascular y metástasis
tumoral. Esto se debe a que une las redes de elastina a las integrinas de superficie celular en
las paredes de los vasos sanguíneos. La fibulina-5 unida a células endoteliales podría mediar
en el proceso de prliferación celular y adhesión celular a la ECM o a la matriz artificial de un
scaffold (Preis, 2006).
Las fibulinas, complementadas con fibrilina 1 son moléculas de la ECM subendotelial y
pueden ser usadas como cubiertas altamente efectivas a la hora de lograr mejorías en el
atrapamiento de células endoteliales. Funcionan a través de mecanismos mediados por
integrinas, lo que les provee estabilidad ante tensiones de corte altas. La adhesión celular por
integrinas reportó jugar un papel regulatorio importante en la apoptosis celular, proceso
imprescindible durante el remodelado de estructuras biológicas (Mol et al., 2009).
Nogo-B es un regulador de funciones neurales que está implicado en la adhesión y migración
celular. Las fibulinas, en especial la fibulina-5, pueden unirse a Nogo-B. Se probaron células
HeLa para demostrar que la migración e invasión celular por sobreexpresión de Nogo-B se
debió a la elevada secreción de fibulina-5 (Zhou et al., 2010b).
También se demostró la posibilidad de mejorar la adhesión celular a superficies artificiales con
fibulina-5. Se usaron células endoteliales humanas de vena safena, y se demostró que la
expresión de fibulina-5 mejoró la adhesión de las células inmediatamente (a 30 minutos de la
siembra celular). Esto prueba que la fibulina-5 es una buena alternativa para mejorar la
adhesión celular de injertos endovasculares (Preis et al., 2006)
Las fibras elásticas consisten en microfibrillas proteicas (fibrilina, proteínas de unión a TGF-β,
integrinas) y elastina polimerizada, ensambladas por fibulina-5 (un ligando de la ECM para las
integrinas). Esta última es esencial para determinar la organización de las fibras elásticas, así
como para la síntesis de elastina. Como ligando se une por su dominio N-terminal a integrinas
de membrana αv-β3, αv-β5 y α9-β1. De este modo, y gracias a su unión C-terminal con la
elastina, organiza y estabiliza la red de fibras elásticas (Nakamura et al., 2002)
IFBM (biomateriales interfaciales, o cubierta peptídica de scaffolds): la cubierta peptídica
de los scaffolds es el agregado de finas capas peptídicas sobre los scaffolds para proveerles
una actividad biológica deseada. Debe tener al menos un dominio de adhesión al material y
una funcionalidad bioactiva. Existen IFBMs citofóbicos, péptidos de adhesión de células
endoteliales (como los RGD), péptido de unión con polipirrol conjugado con secuencia de
unión a integrinas (GRGDS), entre muchos otros (Gu y Masters, 2010).
De Mel et al. proponen varios métodos para la retención de células en los scaffolds (ver
figura), entre ellos el uso de péptidos RGD y otras secuencias peptídicas. La cubierta
peptídica RGD demostró mejora de la endotelización, adhesión celular y retención dentro del
injerto en estudios in vitro (de Mel et al., 2008). El electrospinning de mallas de nanofibras
(electrospun nanofiber meshes) con péptidos RGD inmovilizados en su superficie demostró
cumplir con estas características (Kim y Park, 2006).

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Figura 43: Imitaciones sintéticas de las propiedades de adhesión de moléculas de la ECM a


las integrinas. De mayor a menor afinidad: 1. Sitios peptídicos encriptados (liberación de
oligopéptidos RDG). 2. Entrecruzadores peptídicos de unión a células. 3. Secuencias
reconocibles por integrinas (modificado de: Place, Evans y Stevens; 2009)
Una serie de péptidos pueden ser fabricados por técnicas de síntesis peptídicas de fase
sólida. De este modo puede diseñarse cada AA de la cadena de modo de unirse no
covalentemente a un material de superficie bioinerte como el poliestireno (PS) modificando su
función biológica (adhesión biológicamente apropiada, dispersión y supervivencia celular).
Incluso pueden crearse patrones espaciales de células adheridas. Se probaron estas
funciones con PS-biotina, PS-RGD y PS-RGE. La biotina (FFSFFFPASAWGSSGSSGK) se
usa como polímero de unión al PS, a la que luego se le agregan las secuencias RGD y RGE.
RGE es una secuencia de control, similar a RGD pero sin la funcionalidad de adhesión a la
integrina. Luego se sembraron los injertos con células endoteliales umbilicales (HUVECs),
demostrándose que PS-RGD retiene y permite colonización de 9 veces más células que PS y
PS-RGE (ver figura) (Meyers et al., 2009).

Figura 44: Adhesión celular de HUVECs a injertos. Arriba: PS-RGD. Abajo: PS sin tratamiento
de superficie. Washed/stained muestra la adhesión luego de lavado de los cultivos e
inmunotinción (Meyers et al., 2009)
Los cultivos celulares en colágeno promueven la apoptosis celular aumentada con el paso del
tiempo. Esto está ligado a la falta de uniones de integrinas de unión RGD (αv-β3 y α5-β1) a
ligandos presentadores de RGD, demostrado por la mayor supervivencia de células con
menor expresión de dichas proteínas (Stupack et al., 2001). Esto se debe a que sin las
suficientes uniones RGD se sintetizan ciertos factores como los de necrosis tumoral (TNFs)

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por diferentes vías de señalización (GPCR, Scr, TLR, FGF). Los IFBM unidos a RGD inhiben
por vía de las integrinas a los TNFs, promoviendo la supervivencia celular (Meyers et al.,
2009).

4.3. Estimulación mecánica


La exposición del tejido en formación in vitro a flujos y tensiones aplicadas a través de un
biorreactor ha mostrado mejorar la generación tisular. Se comprobó que ante la aplicación de
grandes tensiones cíclicas el tejido formado logró mayores niveles de organización y
propiedades mecánicas excelentes. El flujo a través de la válvula que está siendo creada
genera un efecto de estabilización en el crecimiento tisular, impidiendo la proliferación a
grandes tasas, pero logra mejorar el resultado en el endotelio formado, ya que inhibe la
proliferación por sobre este de miofibroblastos que empeoran la propiedad antitrombótica de
la pared luminal de la válvula. La estimulación mecánica se basa en el control de diversos
parámetros, destacados sucesivamente (Mol, 2003).
a) Estiramiento: El uso de estiramientos cíclicos (Tensiones del 5% a una frecuencia de 0.5
Hz, con un ciclo de trabajo del 12.5%) por 2 y 5 semanas en scaffolds colágenos sembrados
con células de músculo liso aisladas de aorta de rata demostró que los implantes
desarrollados bajo estas condiciones fueron más fuertes y gruesos que los creados en
condiciones estáticas. Las propiedades mecánicas no variaron significativamente respecto de
las propiedades de las muestras control luego de 2 semanas de aplicación de las condiciones
antes nombradas, mientras que en las muestras de 5 semanas se comprobaron incrementos
significativos en resistencia mecánica y grosor del tejido. Como se utilizaron scaffolds
colágenos, el aumento del mismo no pudo registrarse, pero se observó una significativa
deposición de elastina. Se resalta que los resultados obtenidos fueron independientes de la
edad previa al tratamiento en biorreactor del scaffold sembrado utilizado (Isenberg 2003).

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Figura 45: Sistema desarrollado por Isenberg et al para la aplicación de estiramientos cíclicos.

Figura 46: Esquema del sistema desarrollado por Isenberg et al para la aplicación de
estiramientos cíclicos.

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Diversas estrategias de estiramiento de las válvulas han sido implementadas. Las más
importantes son citadas a continuación.
- Deformación estática y dinámica: La aplicación de deformaciones favorece la producción
de elastina en el tejido neoformado. Los datos relevados experimentalmente ofrecen evidencia
sobre que la aplicación de deformaciones cíclicas resulta en actividades de remodelación
tisular mediada por células, apuntando a reestructurar los componentes de la ECM. Se
estudió particularmente la expresión de los genes que codifican colágeno tipo I y elastina,
obteniéndose resultados prometedores; sin embargo, la aplicación de las deformaciones
durante períodos prolongados genera consecuencias adversas sobre la integridad estructural
del tejido (Seliktar 2003).
- Deformación dinámica continua de larga duración: En este caso, los implantes son
sometidos a 2 magnitudes de tensión diferentes, mostrando diferencias respecto a los
controles sin aplicación de tensiones en sus propiedades bioquímicas, mecánicas y en
organización de la microestructura. Los resultados sugieren que la producción de colágeno
con un número mayor de entrecruzamientos está relacionada a la aplicación de
deformaciones prolongadas en el tiempo. Sin embargo, el uso de grandes tensiones tiene un
efecto negativo en las propiedades mecánicas del tejido. Las tensiones dinámicas inducen
una alineación de las células y el colágeno diferente en relación a la profundidad del tejido
(Boerboom 2008).
- Deformación dinámica intermitente: Se cultivaron fibroblastos humanos de vena safena en
medio de cultivo DMEM con Glutamax y gentamicina, para su posterior siembra en scaffolds
de PGA+P4HB. Se sembraron con la ayuda de gel de fibrina como transportador celular, a
una densidad de 2 millones de células por cm2. Luego de 1 semana de cultivo en condiciones
de deformación continua, los implantes se separaron en 2 grupos, uno para control y otro para
la aplicación de deformaciones intermitentes uniaxiales del 4%, a frecuencia de 1Hz, con
aplicación durante 3 horas alternada con descanso de 3 horas. Se retiraron para su posterior
estudio implantes de ambos grupos luego de 2, 3 y 4 semanas de cultivo bajo las condiciones
antes mencionadas. Las muestras fueron analizadas en la organización y morfología tisular,
producción de colágeno, densidad de entrecruzamientos y propiedades mecánicas. Aunque
las deformaciones cíclicas presentes en tejidos nativos alcanzan de 8% a 12%, previamente
se demostró que su aplicación no mejora los tejidos neoformados sino que reduce sus
propiedades (Boerboom, 2008).
En la aplicación de deformaciones intermitentes se produjo un aumento de formación de ECM
comparado con la aplicación de deformaciones continuas, lo cual se traduce en una mejor
producción de colágeno, en las muestras de 2 y 3 semanas de cultivo. Sin embargo esta
producción se estabilizó en las muestras sometidas a tensión intermitente, mientras que creció
de forma sostenida en las muestras sometidas a tensión continua. El nivel de
entrecruzamientos logrado es similar al de los tejidos nativos, y no se estabilizó sino que
continuó aumentando, pero las propiedades mecánicas, lo mismo que el colágeno, se
estabilizaron luego de cierto período, sin mejorar en el tiempo y alcanzando niveles menores a
los del tejido nativo. Se proponen métodos bioquímicos para promover la síntesis de
colágeno, y se recalca la importancia de estudiar la relación entre la expresión génica y el
condicionamiento mecánico (Rubbens et al., 2009).

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Figura 47: Se observan los tejidos formados con deformaciones continuas (A-C) y con
deformaciones intermitentes (D-F), después de 2 (A y D), 3 (B y E) y 4 semanas (C y F) de
cultivo. El colágeno se observa en azul, las células en rojo, núcleos en negro, los restos del
scaffold en celeste. Se aprecia la mejora del tejido formado con deformaciones intermitentes.
b) Flujo: Se trabajó con 11 válvulas pulmonares ovinas descelularizadas, sembradas con
células ovinas con una densidad de 1.2x10(7) células por válvula. El cultivo se inició con un
flujo de 0.1 l/min en 8 biorreactores. En 4 de ellos el flujo inicial fue lento, y se incrementó en 1
l/min 2 veces por día, hasta alcanzar un flujo máximo de 0.5 l/min y con una frecuencia de
pulsos de 20 pulsos/min. En los otros 4 biorreactores el flujo se aumentó a una tasa de 0.7
l/min/día, alcanzando 2l/min con una frecuencia de pulsos de 50 por minuto. La presión media
del sistema se mantuvo a 25 +/- 5 mmHg. Se encontró que el endotelio, que inicialmente
estaba formado como una monocapa discontinua, logró una continuidad en todo el implante
(paredes y cúspides), inducida por la circulación pulsátil moderada. El flujo alto llevó a una
pérdida parcial de las células en la superficie luminal, generando grandes defectos en esta y
una completa pérdida de las células sobre las cúspides. La actividad metabólica del tejido
neoformado fue significativamente mayor luego del cultivo expuesto a flujo moderado,
mientras que las cúspides no lograron mantener ningún proceso metabólico en los cultivos

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expuestos a grandes flujos. Se concluye que los flujos moderados pulsátiles con incrementos
pequeños estimulan la proliferación celular, mientras que los flujos mayores provocan daños
en el tejido en formación. Esto podría explicar las fallas de válvulas ingenieradas luego de la
implantación in vivo, al estar de repente sujetas a los flujos fisiológicos (Lichtenberg, 2006).
c) Alineamiento comisural de fibras: Este método busca resolver el problema común de la
falta de propiedades mecánicas en los implantes valvulares creados mediante TE, alineando
las fibrillas colágenas en la válvula de forma similar a como están alineadas en las válvulas
nativas, de tal forma que este alineamiento logre propiedades mecánicas similares a las
nativas. Esto es posible mediante una compactación que llevan a cabo las mismas células del
tejido, la cual se efectúa de forma anisotrópica y limitada mecánicamente, lo cual genera una
tensión anisotrópica sobre la red colágena, induciendo la alineación de las fibras. Trabajos
previos mostraron una forma de predicción de la dirección del alineamiento de fibras en
respuesta a tensiones anisotrópicas. Con esto, se mejoran las propiedades mecánicas de
forma anisotrópica, que es lo más adecuado considerando la fisiología de las válvulas
cardíacas (Neidert, 2006).
d) Tensión isométrica continua: los miofibroblastos tienen una actividad importante en la
reconstrucción tisular en las heridas que desarrollan fibrosis. La fuerza desarrollada por estas
células está condicionada por citoquinas, por componentes de la ECM y por las tensiones
mecánicas aplicadas al tejido. La comprensión de este fenómeno ayudaría a lograr mejoras
en las propiedades mecánicas de los tejidos desarrollados mediante TE. (Hinz 2003). Los
tejidos formados con fibroblastos y ECM alineados presentaron mejor resistencia mecánica
respecto de los tejidos con alineación aleatoria, evaluada mediante la tensión de ruptura y el
módulo de elasticidad. El tejido vascular formado sobre la matriz prealineada mejoró la
capacidad contráctil de las células musculares lisas comparada con aquellas que crecieron en
matrices sin alineación previa. Estos resultados muestran que la fuerza generada por las
células durante la organización tisular es importante sobre la alineación del mismo, y por esto
influye sobre la funcionalidad posterior del mismo (propiedades mecánicas y vasocontráctiles)
(Grenier, 2005).

4.4. Estimulación químico-biológica


Hipoxia: Para la experimentación con este parámetro se sembraron scaffolds de PGA+P4HB
con miofibroblastos humanos de vena safena, y se cultivaron bajo normoxia o hipoxia (7% O 2),
incubados con y sin insulina. La producción de glicosaminoglicanos bajo hipoxia y bajo
insulina se aproximó a la de las válvulas nativas. Si bien ambos (hipoxia e insulina) mejoraron
la producción de ECM y las propiedades mecánicas, no se observó un efecto sinergístico en
la aplicación de ambos. La cantidad de colágeno y el nivel de entrecruzamientos no
alcanzaron los niveles de las válvulas nativas, mientras que los implantes en cultivo hipóxico
durante 4 semanas alcanzaron la resistencia y el grosor de los tejidos nativos. Anteriormente
no se habían logrado implantes de esta naturaleza con scaffolds de polímeros de rápida
degradación, con lo cual el O2 merece ser tenido en cuenta para la mejora de las válvulas
construidas por TE (Balguid et al., 2008).
Plasma de baja temperatura: Scaffolds de composites de colágeno con chitosano expuestas
a glutaraldehído para obtener fibras entrecruzadas demuestran tener una alta citotoxicidad y
aumento de hidrofobicidad. Para revertir estos efectos sin perjudicar las propiedades
biológicas del scaffold puede usarse plasma de oxígeno de baja temperatura. Estudios
demostraron que esta técnica aumenta la hidrofilicidad y la proliferación celular (Wang, Zhang,
Wang, 2007).
Procesamiento por perfusión de ozono: Algunos procesos de modificación de las
propiedades de scaffolds, como el entrecruzamiento de fibras, producen reducción de la
hidrofilicidad, no permitiendo la penetración del medio de cultivo y empeorando su eficacia. Se
ha reportado que el uso de atmósferas ricas en ozono previas al tratamiento mecánico y
cultivo aumenta la humectabilidad superficial y profunda de scaffolds de colágeno. Por

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espectroscoía fotoelectrónica por rayos X se demostró que esto se debe a la incroporación de


grupos funcionales oxigenados a las fibrillas de colágeno, aumentándose así la capacidad de
almacenar agua sin comprometer la estabilidad biológica (Liu, Shen, Han, 2008).
Una alternative similar a esta, también propuesta por Liu et al., es el uso de una técnica de
procesamiento por rayos UV y ozono. Esta técnica mejoró la humectabilidad del scaffold en
las superficies exterior e interior del scaffold. De este modo, el scaffold absorbe más agua sin
comprometer las propiedades biológicas ni la estabilidad del scaffold. Pruebas in vitro con
células madre mesenquimales (MSC) demostraron que este proceso aumentaba aún más la
colonización de los scaffolds, con migraciones celulares hasta muy dentro de la micro
estructura porosa del colágeno y alta tasa de supervivencia celular (Liu et al., 2010).

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Capítulo 5: VÁLVULAS CONSTRUÍDAS POR TE

5.1. Fabricación de scaffolds biológicos decelularizados


Existen 3 pasos fundamentales en la fabricación de scaffolds biológicos decelularizados: 1.
Selección y extracción de la válvula funcional xeno u alogénica; 2. Descelularización de la
válvula para obtención del scaffold; 3. Siembra celular y/u optimización de propiedades.
a. Extracción:
La extracción consiste en la elección de la especie donante, el individuo y la válvula funcional
a implantar. Ya se discutieron las ventajas y desventajas del uso de autoinjertos, homoinjertos
y xenoinjertos.
Existen dos caminos posibles a partir de la decisión del uso de scaffolds biológicos: la
utilización de scaffolds correspondientes a la ECM de válvulas humanas (cadavéricas) o el
uso de válvulas descelularizadas de especies animales (generalmente cerdo). El interrogante
es si las válvulas xenogénicas pueden ser modificadas eficientemente para lograr su posterior
repoblación con células autólogas y ser normofuncionales una vez implantadas. El primer
camino, si bien tiene ventajas claras en cuanto a que el donante y el receptor son de la misma
especie, implica una baja disponibilidad de implantes (sujeta a encontrar donantes
adecuados) y un proceso de desinfección más complejo (Hopkins, 2005).
En cuanto a los injertos xenogénicos, hay evidencia que muestra la existencia de proteínas en
ECM con capacidad antigénica, algo que se sospechaba desde la implantación de válvulas
xenogénicas descelularizadas y repobladas con células autólogas, que dieron posteriormente
como resultado la reacción inmunogénica del receptor. Se comprobó que dependiendo del uso de
válvulas porcinas o humanas la migración de monocitos a la zona del implante se veía afectada;
en las válvulas humanas esta migración fue significativamente menor (P<0.05) (Rieder, 2005). Más
aún, implantes alogénicos sin descelularizar generan una menor respuesta inflamatoria que las
válvulas de cerdo descelularizadas (Krueger et al., 2005).
b. Descelularización:
Este paso reviste gran importancia para el uso de homoinjertos y xenoinjertos, debido a que
esta técnica debe asegurar una completa ausencia celular para evitar la inmunogenicidad, no
debe dejar residuos tóxicos y debe evitar en lo posible dañar al tejido o alterar sus
propiedades. Los distintos métodos de descelularización empleados son:
- Fijación celular por glutaraldehído: no es en sí un método de descelularización, pero
cumple la misma función al evitar las respuestas inmunogénicas producidas por la
presencia de células extrañas. Este procedimiento bloquea además el crecimiento
celular interno, destruyendo la viabilidad de las VICs o los fibroblastos pericárdicos,
que determina el subsiguiente deterioro estructural de la válvula. Esto se produce
porque la durabilidad valvular y las propiedades mecánicas dependen de la calidad de
la ECM, que es constantemente remodelada por las células soporte de las válvulas en
un proceso de dinámica generación y reabsorción de ECM. Los fragmentos de VICs
sin vida sirven de núcleos de calcificación, y las discontinuidades del endotelio (VECs)
producidas por la manipulación de la válvula aumentan la permeabilidad de la misma a
los fluídos biológicos. Todo esto determina la no aptitud de los injertos fijados con
glutaraldehído para ingeniería de tejidos in vitro o in situ (Schoen, 2008).
- Tripsina / EDTA (ácido etilendiaminotetraacético): método enzimático agresivo de
descelularización de válvulas cardíacas. Se basa en la inmersión de los injertos en una
solución de tripsina (0,5% en peso) y EDTA (0,05% en peso) con ADNasas y ARNasas,
revolviendo continuamente por 24 hs. La tripsina rompe los enlaces peptídicos en el
extremo carboxílico del enlace Arginina-Lisina, destruyendo las uniones célula-matriz y
proteínas de membrana. Una inmersión prolongada puede significar la destrucción de
la ultraestructura de la ECM por pérdida del colágeno, laminina, fibronectina, elastina y

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GAGs. El EDTA (así como el EGTA) provee unión de iones metálicos, separando las
células de la ECM (Crapo et al., 2011)
La descelularización de válvulas de cerdo por este método produce pérdida de la
estructura de 3 capas valvular, con mantenimiento de algunos cuerpos celulares
contraídas, con núcleos picnóticos (cromatina hipercondensada) y pérdida de contacto
con la matriz extracelular. La sustracción total de las células no es posible ni siquiera
con sucesivos lavados, y si la exposición a tripsina se extiende por demasiado tiempo
se pierde completamente la estructura de la válvula (Grauss et al., 2010)
- Método Triton: método enzimático que consiste en sumergir los injertos en PBS
(buffer salino de fosfato) sin iones Ca2+ ni Mg2+, en solución con ter-octilfenil-
polioxietileno (Triton X-100) y EDTA al 0,02% en peso, con ADNasas y ARNasas,
revolviendo continuamente. Desestabiliza las uniones ADN-proteínas, las uniones
lípido-lípido y lípido-proteína, destruyendo las paredes celulares y su unión con ECM,
pero con ligeros efectos negativos sobre la ultraestructura de la ECM. Como resultado
se obtiene una completa pérdida de la celularidad, con mantenimiento integral de la
estructura trilaminar valvular y funcionalidad de la valvula (Grauss et al., 2010).
- Detergentes no enzimáticos: detergentes que, por sus propiedades anfibólicas, son
usados para remover el estrato celular y, en muy baja medida, parte de la ECM
valvular. Comprenden compuestos como el deoxicolato de sodio (SDC) o el
dodecilsulfato de sodio (SDS). Ambos son compuestos tensoactivos iónicos no
enzimáticos poco agresivos, que proveen remoción celular mucho más eficiente que
los métodos más antiguos (tripsina/EDTA) manteniendo la integridad de la ECM con
mayor efectividad que el método Triton. Sin embargo, se notó una pérdida de las
propiedades biomecánicas valvulares por cambios microestructurales, aun con
preservación a grandes rasgos de la estructura fibrosa (Rieder et al., 2003).
Usando SDS se logró repoblación por células autólogas en perros, con alta resistencia
a la calcificación. Luego de 1 mes se logró la reendotelización espontánea, y al 2do
mes las células ya habían infiltrado algunas capas debajo de la intima, con buena
recelularización de la valva y la adventicia. Al 6to mes se logró una ECM superficial
similar a la natural, con fibras de actina alineadas con las fibras musculares lisas (Iwai
et al., 2007).
Los resultados a mediano plazo usando SDS demuestran integridad estructural
estable, baja tasa de calcificación y hemodinámica adecuada. Sin embargo, luego de 3
años la repoblación autóloga valvular es limitada, lo cual da una idea de la causa de la
relativamente corta vida media de dichas válvulas. Si se lograra solucionar este
problema, los aloinjertos aórticos descelularizados parecen una alternativa
prometedora (Da Costa et al., 2010).
El uso de SDC logró mejores propiedades mecánicas que el SDS. La integridad de la
ECM fue más efectiva, con una remoción celular total. Sin embargo, tanto SDC como
SDS y los demás métodos desarrollados hasta la actualidad afectan la respuesta
inmunológica humana e incrementan la trombogenicidad del injerto (Zhou et al., 2010).
- SynerGraft: método alternativo de descelularización que usa la autolisis celular y la
digestión por nucleasas para minimizar la antigenicidad. Consiste en la lísis celular por
solución hipotónica, digestión de material genético por nucleasas (ADNasa I y ARNasa
A) y lavado por solución buffer salina (BSS, isotónica). Con este método se logró
mantener la estructura de colágeno y elastina íntegramente, incluso luego de la
criopreservación, con remoción celular total (Gerson et al., 2012).
Sin embargo, si bien el uso de aloinjertos descelularizados por SynerGraft en humanos
adultos logró resultados iniciales prometedores, los xenoinjertos con válvulas porcinas
generaron respuestas inmunogénicas severas y falla temprana del injerto en niños
(Simon et al., 2003). Se demostró además que los xenoinjertos aún revisten un alto

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grado de inmunogenicidad respecto a los homoinjertos. En general la respuesta es


producida por granulocitos, ya que la descelularización reduce las respuestas de
monocitos y linfocitos. La presencia de granulocitos indica reacciones de inflamación
temprana. Se pudo determinar que algunos factores inhibitorios naturalmente
presentes en la ECM se pierden durante el proceso de descelularización, lo que
produce la activación de granulocitos humanos por tejido valvular porcino, pero deben
elucidarse concretamente los mecanismos de la inmunogenicidad remanente en
xenoinjertos descelularizados para poder evaluar si la obtención de válvulas
clínicamente viables es posible o no, y de qué manera evitar la inmunogenicidad por el
uso de nuevas técnicas de descelularización o agregado de factores inhibitorios
(Bastian et al., 2008).
En general, la aplicación de detergentes (SDS, Triton X-100, desoxicolato) es uno de los
métodos más utilizados por la simplicidad de uso (Iwai 2007). Los detergentes son sustancias
hidrosolubles que tienen la capacidad de separar y solubilizar las estructuras de membranas
celulares, encapsulándolas en micelas, permitiendo un lavado fácil. Se clasifican en iónicos,
no iónicos y zwitteriónicos, respecto de sus características de hidroafinidad. Los detergentes
no iónicos como Triton X-100 son mejores en la separación de las uniones lípido-lípido y
proteína-lípido que en las uniones entre proteínas, por lo que se consideran no
desnaturalizantes. Por el contrario, los detergentes iónicos como el SDS son
desnaturalizantes, usados normalmente en laboratorios para separar los enlaces no
covalentes entre proteínas. Diferencias en tamaños moleculares, carga, concentración de
micelas y habilidad desnaturalizante determinan la penetración en el tejido, los patrones de
ruptura de membranas y la interacción proteína-detergente (Knigth, 2008) (Iwai, 2007)
Para mejorar la acción detergente se utilizan soluciones búfer hipotónicas o hipertónicas. Las
soluciones hipotónicas generan que las células se hinchen y exploten, en un proceso
conocido como lisis osmótica. En cambio, el uso de soluciones hipertónicas deshidrata las
células y facilita su separación de la ECM. Finalmente, luego del tratamiento con enzimas,
detergentes y búferes, se deben utilizar nucleasas para degradar los restos de ácidos
nucleicos presentes (Knigth, 2008).
La aplicación de tripsina (proteasa sérica) permite el desprendimiento de las células de la
ECM, liberando las adhesiones a través de la proteólisis de los ligandos; en menor medida
separa la unión entre proteínas de la ECM, dejando la matriz más abierta, permitiendo el
lavado de los restos celulares. El uso de enzimas debe ser controlado para no dañar
demasiado la matriz, lo cual resultaría en disminución de la resistencia mecánica y las
propiedades biomecánicas de la válvula (Knigth, 2008).
c. Optimización de propiedades:
El crosslinking de fibras de colágeno es el método más usado de optimización de
propiedades. Este mejora las propiedades mecánicas, reduce la hidrólisis de los scaffolds
biológicos y la inmunogenicidad de los scaffolds. Se basa en el uso de agentes físico-
químicos para la obtención de entrecruzamientos entre las fibras de colágeno superficiales de
los scaffolds. Igual que en los tejidos nativos, las propiedades mecánicas de las válvulas
ingenieradas depende de la arquitectura, cantidad y entrecruzamiento de las fibras de
colágeno (Rubbens et al., 2009).
Estudios demostraron que puede lograrse mayor densidad de entrecruzamientos en las
válvulas con la aplicación de deformaciones cíclicas continuas durante tiempos prolongados.
Para estudiar la densidad de entrecruzamientos se hidrolizan muestras de tejidos por adición
de ácido clorhídrico (por ejemplo, al 25% en volumen) a alta temperatura (110 °C). La
densidad de hidroxiprolina es determinada utilizando cromatografía líquida de alta
performance (HPLC). La relación directa entre la cantidad de Hyp y de colágeno permite una
fácil estimación de esta última (Boerboom et al., 2008).
Otra forma de aumentar el entrecruzamiento de fibras es el uso de ácido
nordihidroguayaretico (NDGA). De este modo se evita el uso de agentes (como el

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glutaraldehído) citotóxicos que afectan la estabilidad del scaffold a largo plazo. El NDGA es un
producto natural bioactivo que ha sido provado con éxito en scaffolds para TE reconstructiva
de tendones. Se demostró una resistencia mecánica mejorada respecto de los scaffolds sin
entrecruzamientos, y una menor citotoxicidad que los scaffolds tratados con GA en cerdos.
Debe tenerse especial cuidado en utilizar las proporciones adecuadas, debido que a altas
concentraciones el NDGA es relativamente citotóxico (Lü et al., 2010).
Una de las ventajas del entrecruzamiento del colágeno es que permite, hasta cierto punto, la
mejora de la resistencia a la calcificación de los scaffolds. Se entrecruzaron fibras de injertos
descelularizados de válvulas aórticas de cerdo por medio de procianidinas, y se observó la
morfología, la densidad de entrecruzamientos y la resstencia a la tensión. Posteriormente se
implantaron 3 tipos de muestras subcutáneas en ratas: injertos decelularizados sin
entrecruzamientos extra, con procianidina y con glutaraldehído (GA). Se observó una
resistencia a la tensión aumentada en las muestras con entrecruzamientos, mayor en las
tratadas con procianidina que las tratadas con GA. En las matrices con procianidina no se
detectó calcificación luego de 2 meses (Liu et al., 2009).

5.2. Fabricación de scaffolds sintéticos


Fueron propuestos injertos vasculares trilaminares, con una capa luminal de PGA tejido con
microesponja de colágeno como scaffold promotor del crecimiento tisular interno, una capa
intermedia de PCL y una capa externa de PLLA mallado como refuerzo. Estos componentes
son todos biocompatibles y biodegradables, con gran afinidad celular. Los resultados de la
explantación de válvulas a 12 meses de su implantación en porcinos fueron buenos. No se
produjo aneurismas ni formación de trombos, se produjo repoblación con formación de
neomedia y endotelización, con integración con células musculares lisas y síntesis colagénica
suficiente (Torikai et al., 2008).
En otro trabajo se fabricaron scaffolds bicapa con colágeno tipo I y elastina bovinos, obtenidos
del tendón de Aquiles y del ligamento del cuello respectivamente. Se realizaron mezclas con
diferentes concentraciones de ambos componentes (100%-0%,50%-50%, 20%-80%) en
suspensión en ácido etanoico 0.05 M, a razón de 1% peso/volumen. Se colocaron en moldes
de PTFE y posteriormente se enfriaron a -20°C. Para formar la estructura bicapa, primero se
moldeó la capa inferior y posteriormente, sobre esta, la capa superior. Se controló el volumen
usado en cada capa para lograr espesores iguales en ambas. Finalmente se colocaron en un
secador por 24 hs, sometidos a un vacío de 0.05 mbar, y removiendo los cristales de hielo por
sublimación. Los moldes usados también pueden ser de PDMS (Qi Chen, 2013).

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Figura 48: Microfotografías de la estructura bicapa generada con colágeno y elastina, para 2
proporciones diferentes. Se aprecia que ambas capas están bien interconectadas y poseen
microestructura similar (Qi Chen, 2013).
Los estudios demostraron que el agregado de elastina aumenta el tamaño de los poros (ver
figura), mientras que el C4S lo disminuye. Las mejores propiedades mecánicas se obtuvieron
usando las mayores proporciones de colágeno. El agregado de elastina disminuyó la
migración de células derivadas de cardioesferas (CDCs, células madre presentes en tejido
cardíaco), produciendo una colonización sólo superficial. En los casos de scaffolds de
colágeno y colágeno-C4S, la migración celular fue profunda a través de los poros
interconectados. Los scaffolds con C4S mostraron el mejor comportamiento en cuanto a
adhesión celular. Esto puede explicarse teniendo en cuenta que las células se unen
naturalmente al colágeno mediante las integrinas de la membrana plasmática, y que la unión
celular es facilitada por los GAGs. Específicamente, el C4S mejora la actividad metabólica
celular y provee adhesión de células y factores de crecimiento. Un próximo estudio debería
intentas conseguir scaffolds trilaminares que se asemejen a las válvulas reales, con una capa
colagénica, una de colágeno-elastina y una tercera de colágeno-C4S (Qi Chen et al., 2012).
Se demostró que estas estructuras bicapa lograron una buena interfase, y que las diferencias
en la composición de ambas introdujo un comportamiento anisotrópico, asemejándose a la
naturaleza del tejido valvular nativo, y un cierto nivel de controlabilidad en cuanto a la
distribución celular en el scaffold. Se lograron implantes mecánica y biológicamente
calificados para su uso como válvulas cardíacas ingenieradas. Se prevé, respecto de estos
resultados, avanzar en la creación de scaffolds tricapa, asemejándose aún más a la estructura
natural del tejido valvular (Qi Chen et al., 2013).
Injerto trilaminar:
Las estrategias in situ no permiten el uso de polímeros de rápida reabsorción, ya que implican
una rápida degradación de las propiedades mecánicas con pérdida de la funcionalidad de la
válvula, arriesgando la vida del paciente. Pueden usarse entónces scaffolds tricapa, con
diferentes grados de absorción por capa. Una propuesta utilizó un lado luminal de PGA +
colágeno microesponjoso, una capa central de policaprolactona y el exterior de ácido poli-L-
láctico tejido. Todos estos materiales son biocompatibles y biodegradables. Se espera que la
estructura porosa del PGA y la esponja colágena tengan un rol crucial en promover la
recelularización in situ del implante. La capa tejida externa tiene como fin reforzar el implante,
y la capa intermedia de policaprolactona une ambas capas (Torikai, 2008).
Se mostró que este tipo de válvula no generó trombosis ni aneurisma en ningún momento aún
sin suministro de drogas anticoagulantes. Los análisis histológicos y bioquímicos mostraron
excelente regeneración tisular in situ, con una monocapa endotelial, células musculares lisas,

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colágeno y elastina. Se comprobó una alta durabilidad, 12 meses sin signos de problemas en
animales. Uno de los problemas fue la persistencia de fibras de PLLA, necesarias en su
momento para resistencia mecánica, pero que deberían haber desaparecido, luego de la
generación de matriz extracelular propia del tejido neogenerado (Yokota, 2008).

5.3. Creación de válvulas sin scaffold sólido


Esta técnica surge en respuesta a la pobre retención celular en inyecciones directas al tejido
cardíaco de células para favorecer la reparación tisular (Nesselmann, 2008) y frente a los
problemas surgidos del uso de materiales para scaffolds que pueden provocar reacciones
diversas, ya sean de origen natural o sintético. La idea consiste en el cultivo de monocapas
celulares sobre superficies inteligentes que reaccionan ante cambio de temperatura,
pudiéndose desprender la capa celular de la superficie polimérica al bajar la temperatura
(Rieder, 2005) (Hopkins, 2005).
Si se usa poli(N-isopropilacrilamida), a 37°C la superficie es ligeramente hidrofóbica y permite
la adhesión celular y su proliferación, pero a temperaturas menores a 32°C se vuelve
hidrofílica, permitiendo el desprendimiento espontáneo de la capa de células cultivadas. Las
células adyacentes generan proteínas de unión célula-célula y ECM, lo cual otorga estabilidad
mecánica a la capa celular. Otros métodos de cultivo, sin la superficie inteligente, utilizan
enzimas para separar la capa celular de la superficie de cultivo evitando la adhesión (ver
figura). Al lavar la concentración enzimática disminuye posibilitando la adhesión (Masuda,
2008).

Figura 49: Cultivos celulares para TE sin scaffolds. A. Comportamiento de la superficie de


poli(N-isopropilacrilamida) frente a la variación de temperatura, y B. Comparación de uso de
superficies celulares versus superficies tradicionales y el método de separación mediante
enzimas (Masuda, 2008).

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Dada la generación de ECM en la superficie basal de la capa celular, esta ultima puede
adherirse al tejido hospedador directamente, prescindiendo del uso de adhesivos o suturas.
Respecto al uso de scaffolds biodegradables o de scaffolds solubles, el método scaffoldless
también es ventajoso. Los scaffolds biodegradables ocasionan reacciones inflamatorias y
formación de tejido fibroso en su proceso de degradación, además de que por su naturaleza
altamente porosa, las células sembradas no tienen posibilidad de formar conexiones entre sí,
al quedar distanciadas físicamente. El uso de scaffolds en forma de geles (mezcla de
colágeno y células) ha demostrado mejorar el tejido cardíaco, pero igualmente las células no
logran conexiones físicas entre ellas. La técnica scaffoldless permite la formación de
volúmenes de tejido con células interconectadas y ECM basal, minimizando la respuesta
inflamatoria al no utilizar ninguna sustancia para soporte físico más que la misma ECM
generada por las células (ver figura) (Masuda, 2008).

Figura 50: comparación de métodos de TE con scaffolds biodegradables o solubles versus TE


sin scaffold. A. Técnica con scaffold y siembra celular. B. Técnica con scaffold soluble con
mezcla celular. C. Técnica sin scaffold por siembra celular (Masuda, 2008)

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5.4. Fabricación de válvulas in situ


El primer implante vascular por ingeniería de tejidos clinicamente utilizado fue un scaffold
biodegradable sembrado in vivo con células mononucleares de médula espinal (BMC). Estos
scaffolds tubulares de poliésteres permiten una amplia remodelación en sus receptores
animales, convirtiendose aparentemente en vasos sanguíneos vivos (Hibino et al., 2005). Este
hecho sentó las bases para el enfoque in situ de los scaffolds ya existentes valvulares, que
consiste en la implantación de scaffolds sin células que gradualmente se reabsorben y
convierten en tejidos vivos por captura de células progenitoras endógenas, en general
provenientes del torrente sanguíneo (ver figura). De este modo, la técnica incluye scaffolds
descelularizados tanto como scaffolds sintéticos. Se obtiene disponibilidad a demanda
eliminando el tiempo de espera entre la falla y la cirugía de reemplazo y reduciendo costos,
además de reducir la necesidad de acondicionamiento pre-implantación (Bouten, Driessen-
Mol, Baaijens, 2012).

Figura 51: TE in situ de implantes vasculares (proceso muy similar al buscado en los
implantes valvulares). En A puede verse la invasión del implante por monocitos, atraídos por la
citoquina MCP1. En B continúa la infiltración celular, esta vez por parte de SMCs y ECs
atraídas por diversas citoquinas secretadas por los monocitos. Estos también secretan factor
VEGF, que estimula el crecimiento endotelial vascular. En C puede verse el tejido vivo
neoformado, con reabsorción total del scaffold (modificado de: Roh et al., 2010)
Es scaffold implantable requerido debe ser no trombogénico, no inmunogénico, bioabsorbible,
funcionalmente viable y capáz de población o repoblación por células huésped autólogas. El
reclutamiento celular debe ser controlado para que el tejido se desarrolle sin pérdida de
propiedades mecánicas y mejorando paulatinamente la funcionalidad. De este modo se
requieren scaffolds que recluten selectivamente células circulantes progenitoras, fomenten su
diferenciación y función adecuada y controlen la formación de tejido. Para esto se requieren
materiales “inteligentes” con señales y factores biológicos y buenas propiedades
biomecánicas (van Loon et al., 2013).
Una propuesta para permitir la señalización natural de los procesos de reabsorción y
desarrollo in situ es el control de la respuesta inflamatoria temprana que sobreviene al colocar
el implante, la cual puede guiar la futura formación de tejido. Esto se desprende de lo sugerido
al implantar scaffolds vasculares sembrados con BMCs humanas no inmunogénicas en
ratones, lo cual produjo la desaparición de estas células en cuestión de días. En su lugar, el
scaffold fue invadido por monocitos de ratón y posteriormente con células musculares lisas
(SMC) y células endoteliales (EC). Esto se debió en parte a la respuesta natural inflamatoria,
pero principalmente a la secrecíon de factores quemotácticos por parte de los BMC humanos
sembrados, atrayentes de monocitos, lo que sugiere que se pueden transformar scaffolds en
tejido vivo funcional a través del uso y modificación de los procesos inflamatorios de
remodelado tisular (Roh et al., 2010).
La injuria incurrida durante la implantación desencadena la respuesta inflamatoria
independientemente del material utilizado, ya que se produce por daño celular y disrupción
tisular. Esta respuesta puede aprovecharse si es adecuadamente modulada en su amplitud y

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oportunidad modificando el biomaterial, agregando factores, modificando los sitios de sutura y


el procedimiento de implantación. Si se conocen exactamente los mecanismos de esta
respuesta y se utilizan las variables correctas puede lograrse homeostasis y evitar el
desarrollo temprano de fibrosis, una de los principales problemas actuales de las válvulas (van
Loon et al., 2013).
Las cargas hemodinámicas sobre las valvas son complejas y difíciles de reproducir in vitro.
Estas incluyen patrones de deformación rápidamente cambiantes, apertura y cierre valvular,
tensiones de corte que distan hasta un orden de magnitud entre las soportadas por la válvula
cerrada respecto a las que soporta la válvula abierta. Todas estas variables influyen
significativamente en la diferenciación celular y en la morfología del tejido neogenerado
durante el desarrollo valvular. De este modo las estrategias in situ son de aplicación mucho
más sencilla que las clásicas estrategias in vitro (Balachandran et al., 2010).
Dentro de esta estrategia, una nueva técnica prometedora es el crecimiento celular de
válvulas in vivo dentro de la cavidad peritoneal. Esto tiene la desventaja de no permitir a la
válvula ayudarse de las tensiones dinámicas sanguíneas para la estratificación y
conformación de la ECM. Sin embargo permite el desarrollo celular natural, poco costoso y
autólogo, sin peligros para el paciente. Una vez formado el tejido valvular, el implante es
rescatado de la cavidad e injertado en el sitio requerido. Estudios de este tipo se han llevado a
cabo en ovejas por implatación de injertos ovinos descelularizados, logrando una buena
recelularización (De Visscher et al., 2007 y 2008). Sin embargo, no se ha determinado aun si
el tipo de células obtenidas por este proceso es el adecuado, y si posteriormente puede
lograrse una funcionalidad correcta (Vranken et al., 2008)

5.5. Uso de biorreactores


Muchas técnicas han sido propuestas para favorecer el desarrollo celular in vitro, ya sea para
estudios o para preacondicionamiento del injerto valvular. Todas estas pueden aplicarse en
biorreactores, como fue anteriormente explicado. A continuación se muestran algunas de las
más utilizadas.
a) Imitación de condiciones fisiológicas: Normalmente las válvulas ingenieradas no poseen
las condiciones mecánicas necesarias, por lo cual se aplican condiciones de stress físico para
desarrollarlas. Mediante biorreactores de flujo pulsátil variable y con niveles de presión
ajustables, el cultivo in vitro se puede realizar en condiciones de presión fisiológica y con un
flujo de medio nutritivo. El cultivo in vitro puede permitir incluso la completa degradación del
scaffold y su resíntesis por proliferación celular y de ECM. Esta es la estrategia más utilizada,
aunque en los últimos años se está demostrando que no es la mejor (Hoerstrup et al., 2000).
Otro enfoque busca lograr condiciones similares a las fisiológicas simulando un ventrículo
izquierdo y la poscarga, representada por una compliancia que produce el efecto de la
respuesta elástica de los grandes vasos, y una resistencia en serie representando las
arteriolas y capilares. La válvula se sitúa entre el ventrículo y la compliancia (ver figura). Se
pueden controlar las variables de resistencia, compliancia, volumen eyectado y frecuencia, y
las condiciones hidrodinámicas se pueden variar en un amplio rango fisiológico (Dumont
2002). Synedain et al. usaron un control por retroalimentación a través de la variable de
distención del injerto medida por captura digital de imágenes. De este modo se asegura una
distención máxima determinada, asegurando un acondicionamiento similar para todos los
implantes (Syedain et al., 2011).

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Figura 52: Biorreactor de flujo-estiramiento pulsados. a. injertos de 2 mm en mandriles de


vidrio durante el cultivo estático de 2 semanas; b. injertos de 2 mm montados en el bioreactor
(hasta 6 a las vez en este biorreactor); c. Diseño esquemático del bioreactor, con jeringa
montada en una bomba cíclica para impulsar el flujo pulsado, con el medio de cultivo fluyendo
transmural a través del tejido y el lúmen, y reinyectada por la válvula superior (Syedain et al.,
2011)
Otros dispositivos diseñados con estos fines se colocan dentro de una incubadora
convencional, y utilizan controles de lazo cerrado para proveer un grado de control elevado.
La presión media, el caudal, la frecuencia y la forma del pulso pueden controlarse simulando
condiciones hemodinámicas fisiológicas y no fisiológicas (Hildebrand 2004).

b) DPD (Diastolic Pulse Duplicator): En este tipo de biorreactores se intenta imitar la


dinámica de la diástole, logrando tensiones sobre el tejido. Este equipo aplica una diferencia
de presión dinámica sobre la válvula cerrada. Además, la válvula está sometida a tensiones
continuas. Los resultados logrados mediante software de cálculo numérico muestran un tejido
formado superior y propiedades mecánicas no lineales respecto de aquellas de tejidos
ingenierados logrados sin cargas aplicadas (Mol, 2005).
En las pruebas de laboratorio frente a cultivos no condicionados, se obtuvo que ante este
condicionamiento se incrementaron la formación tisular y las propiedades mecánicas. La
organización del tejido mostró un grado de anisotropía mayor cuando las condiciones
aplicadas eran de naturaleza dinámica. Sin embargo, esto no fue funcionalmente suficiente en
condiciones fisiológicas, si bien las válvulas mostraron una apertura apropiada. Se atribuye
este resultado a que el grado de anisotropía del tejido no alcanzó los niveles del tejido nativo
(Mol, 2006).
El sensado y control en tiempo real de las tensiones locales en el tejido es un objetivo
importante, dado que gracias a este tipo de análisis se podrían definir protocolos de
acondicionamiento. Se han presentado métodos para determinar estas tensiones a través de

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la deformación volumétrica de la válvula, obteniendose valores realistas. Por otro lado, para
evitar ensayos destructivos se propusieron análisis numéricos inversos, de carácter
experimental, que permiten cuantificar dichas propiedades de forma no invasiva y no
destructiva. Los resultados obtenidos de los ensayos reales sobre 6 válvulas se contrastaron
con los calculados, validándose el método propuesto. Además, este algoritmo diseñado
permite el trabajo en tiempo real, y puede ser utilizado para monitorear y controlar la evolución
de las propiedades mecánicas durante el cultivo del implante (Kortsmit ert al., 2009)
c) Sólo estiramiento: En lugar de aplciarse flujos a través de las válvulas, el
acondicionamiento se produce mediante estiramiento. Como ventaja principal se encuentra la
facilidad para su control. La diferencia entre el comportamiento ante estímulos de estiramiento
dinámicos y estáticos del implante sólo es visible en una mayor producción de GAGs en el
caso dinámico. Para ambos casos se logró tejido más homogéneo con abundancia de
colágeno respecto de los controles. Como desventaja se logró menor número de células que
en los controles, lo que da a entender que no fomenta la proliferación celular sino sólo la
síntesis de ECM (Mol, 2006).

5.6. Proyecciones a futuro en la creación de válvulas


Varios de los desarrollos presentados en el trabajo tienen amplias perspectivas que hacen
pensar que en un futuro no tan lejano puedan obtenerse las primeras válvulas por TE
implantables. Sin embargo, antes quedan problemas por solucionar. A continuación se
nombran las ideas más promisorias y posibles soluciones a algunos de los problemas más
importantes.
a) Traducción de resultados en animales a injertos para humanos
Los injertos valvulares en animales pueden dar una idea de cómo se comportará el implante
para uso clínico ante las tensiones dinámicas de la circulación sanguínea y de su tasa de
supervivencia. Así se complementan los estudios in vitro de propiedades estructurales y
funcionales a largo plazo. Sin embargo, debido a las diferencias celulares y de señalización
entre los distintos animales, los resultados no concuerdan exactamente al implantar
materiales y morfologías idénticas en distintas especies. Este problema no sólo complica la
extrapolación de resultados en animales a resultados en hombres, sino también en el sentido
inverso ya que resultados prometedores usando células humanas no siempre se repiten para
células de otras especies (Hjortnaes et al., 2009).
El cultivo de células humanas en scaffolds de PGA/P4HB para válvulas cardíacas, usando
fibrina como transportador celular y posteriormente acondicionadas en el biorreactor
duplicador de pulso diastólico logró válvulas normales y funcionales, mientras que la siembra
de células ovinas, de menor tamaño que las humanas, en estos mismos scaffolds y luego del
mismo tratamiento generó válvulas no funcionales, con valvas gruesas y retraídas,
imposibilitando así su prueba en animales. Luego de la optimización del protocolo
adaptándolo a células ovinas se logró obtener válvulas normofuncionales con células de esta
especie. Los cambios en el protocolo fueron disminuir el tiempo de cultivo y cambiar la
composición del medio, disminuyendo la cantidad de serum presente (Mol, 2009).
b) Biorreactores con feedback automático
El uso de biorreactores es todavía imprescindible en las técnicas de fabricación in vitro. Esto
se debe a las propiedades subóptimas de los materiales de scaffolds. En el desarrollo valvular
embrionario existen muchas variables que son controladas con gran precisión temporal y
espacial, entre ellas la expresión de factores de crecimiento y moléculas señalizadoras, las
tensiones y deformaciones dinámicas, la producción de ECM. Los biorreactores que
pretendan lograr válvulas similares a las naturales al momento de la implantación requieren
entonces este tipo de controles con feedback que permiten su automatización (Chiu et al.,
2010).

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Una primera aproximación es la entrega de cargas de presión pulsátil controladas con


precisión que induzcan deformaciones como estímulos para la repoblación celular y la
integración con el scaffold natural o sintético. Esto fue logrado por el monitoreo de la
complianza del injerto, con la cual se reajustaban continuamente los parámetros de presión
del flujo. Se lograron estimar complianzas muy similares a las reales, y se sometieron a
tratamiento válvulas porcinas decelularizadas demostrándose comportamiento adecuado,
aunque no se han hecho aún estudios de repoblación valvular (Vismara et al., 2009). En el
mismo sentido, el control del estiramiento fue propuesto en válvulas de gel de fibrina
sembradas con fibroblastos dérmicos neonatales y factores de crecimiento. Se logró un
correcto desarrollo de ECM con resistencia a la tensión y anisotropía similar a las válvulas
pulmonares ovinas (Syedain y Tranquillo, 2009).
También se ha logrado controlar la endotelización de los injertos por medio del uso de
parámetros óptimos de flujo (controlados por bioreactores pulsátiles asistidos por
computadora) y cultivo por células progenitoras endoteliales (EPC), las cuales por medio de
señalización debida a tensiones lograron diferenciacrse en tejido endotelial mejorando las
propiedades antitrombogénicas del implante. Como puede verse, se ha propuesto el control
de una variable a la vez cuando parece ser imprescindible el control simultáneo de multiples
variables. Además aun no se han logrado biorreactores que entreguen factores de crecimiento
y señalización de forma controlada y siguiendo los protocolos naturales de desarrollo valvular
embrionario (Lee et al., 2009).
c) Enfoque in vitro rápido
Las estrategias más sencillas de fabricación guían la lógica al uso de variedades de xeno y
homoinjertos descelularizados y pretratados como scaffolds. El enfoque in vitro rápido
propone complejizar la fabricación usando scaffolds sintéticos, pero logrando a cambio tejidos
de más rápida degradación, evitando el riesgo de inmunogenicidad y obteniendo válvulas con
tejido completamente autólogo (Hoerstrup et al, 2000). Los avances necesarios para que esta
estrategia tenga futuro son: la incorporación de una red elástica al scaffold, por motivos
biomecánicos y de señalización; el acondicionamiento mecánico a medida usando
biorreactores con monitoreo y control automático de condiciones aplicadas; el uso de factores
de crecimiento y moléculas señalizadoras con control dinámico para una diferenciación,
organización y crecimiento celular a medida. Puede verse que aun se está lejos de lograr una
válvula adecuada por este medio. Por esto y debido a su alta complejidad de fabricación este
enfoque parece estar perdiendo terreno actualmente (Bouten et al., 2012).
d) Modulación de propiedades in situ
Es la estrategia más rápida, barata y de fabricación a demanda, por lo que a futuro parece
tener más probabilidades de convertirse en la alternativa respecto a las válvulas macánicas.
Como principales ventajas pueden nombrarse su rápida manufactura (debido a que no se
necesita preacondicionar las válvulas), la posibilidad de fabricarlas a medida y a demanda, y
el acondicionamiento en las condiciones reales de uso (Bouten et al., 2012). La mayoría de
los estudios se basan en homo y xenoinjertos descelularizados, y se están solucionando los
problemas típicos de estas estrategias (Dijkman et al., 2012).
Los scaffolds sintéticos, en cambio, a través de su uso directo o con implantación de células
autólogas obtenidas el día de la intervención, proveen una alternativa prometedora debido a
que permitirían un injerto de rápida fabricación y propiedades de reabsorción modulables. Al
igual que las estrategias in vitro, los scaffolds sintéticos in situ requieren de un preciso control
de moléculas señalizadoras y factores de crecimiento para guiar la celularización. Se sugirió
que es posible modular ciertas propiedades, como la elasticidad, mediante el control dinámico
de substratos. Para esto pueden usarse hidrogeles degradables por substrato, los cuales ante
la presencia de un factor activo inyectado en la sangre pueden reducir su módulo elástico,
inhibiendo por ejemplo la proliferación y diferenciación de nuevos miofibroblastos (aVICs) en
las válvulas (Kloxin et al., 2010).

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e) Plegamiento valvular en cirugías minimamente invasivas


La tendencia actual en cirugías cardíacas de mínima invasión se considera importante para
reducir la moratalidad y el tiempo de recuperación de los pacientes. Las primeras cirugías
mínimamente invasivas de válvula aórtica se están comenzando a realizar a pacientes de
riesgo, con resultados alentadores. Para lograr esto en las válvulas ingenieradas se requiere
plegar los injertos, en general mediante el uso de stents. La concentración de tensiones
generada por los stents puede dañar las válvulas. Lo mismo sucede con el plegamiento del
scaffold, que debe reducir el diámetro en 2,5 veces para cirugías transvasculares, por
catéteres o transapicales. Por esto deben usarse polímeros resistentes al plegamiento y evitar
que se formen sitios débiles o fibróticos propensos a la calcificación (Rodés-Cebau,
DeLarochelliére y Dumont, 2012).
f) Intervención one-step
Es un método con características de las estrategias in vitro, pero permitiendo el cultivo cellular
durante la intervención quirúrgica (intervención de un solo paso para implantación y siembra)
y posterior optimización in situ. La idea es generar scaffolds de polímeros sintéticos
biodegradables integrados en stents expandibles (por ejemplo, de nitinol) para permitir una
cirugía sencilla transvascular. Durante la intervención, células mononucleares autólogas de
médula espinal son obtenidas, sembradas en el scaffold y el conjunto es implantado
transapicalmente. Se han logrado buenos resultados a corto plazo (4 semanas) (Weber et al.,
2011) (Weber et al., 2012).
g) Modelización computacional
Las pruebas en animales demostraron comportamientos de los materiales y las válvulas
ingenieradas muy distintos respecto a otros animales y respecto a los resultados en humanos.
Se estima que esto se debe a la diferencia de tamaños celulares, a las propiedades
biomecánicas distintas y a las velocidades de reabsorción y crecimiento diferentes entre las
distintas especies. Por esto, el pasaje de las pruebas in vivo en animales hacia el uso clínico
requiere de una correcta traducción de los resultados, los materiales y las técnicas, la cual no
se ha logrado aún. Esto implica que es probable que se requieran evaluar los injertos por
nuevos métodos, que tengan en cuenta los mecanismos de proliferación celular en humanos,
ya sea por colonización desde el torrente sanguíneo, neovascularización o diferenciación
intravalvular. Además debe poderse simular la respuesta al cuerpo extraño y la señalización.
Para lograr esto se sugiere la simulación de un modelo general del implante, para luego
extenderlo a un sembrado celular particular, como hicieron Sacks y colaboradores basados en
un modelo básico de Engelmayr (Sacks, Schoen y Mayer, 2009) (Engelmayr et al., 2006).
Una de las claves de la simulación a escala molecular es la comprensión del mecanismo por
el cual las células sensan fuerzas mecánicas y deformaciones y cómo se traduce en
respuestas biológicas. Para esto pueden usarse simulaciones de dinámica molecular, con la
cual se pueden estudiar deformaciones en proteínas y ácidos nucleicos para entender los
cambios en estructuras celulares (Bao y Suresh, 2003). El comportamiento tisular también
puede ser modelado. Acoplando los estudios a nivel molecular, celular y valvular estáticos y
dinámicos no fue todavía, pero puede aportar datos fundamentales para modificar el
contenido celular, materiales y morfología de los scaffolds (Bouten et al., 2011).

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G. CONCLUSIONES

Mediante este trabajo pudimos observar la enorme cantidad de información disponible sobre
el tema elegido, que sin embargo se encuentra muy dispersa. La realización de una
investigación bibliográfica termina siendo imprescindible para introducirnos en el tema y
obtener un enfoque general del estado del arte dentro del campo de la ingeniería tisular
aplicada a válvulas cardíacas. En este sentido, sólo después de haber revisado una gran
cantidad de bibliografía logramos compenetrarnos con la terminología y los conceptos usados
más ampliamente, para luego poder relacionarlos y volcarlos en un informe general.
Además, pudimos relacionar conceptos básicos de la asignatura con distintas aplicaciones
reales. En la lectura de papers y trabajos sobre el tema encontramos valiosa la visión general
que nos había aportado el estudio de las diferentes propiedades de los materiales y sus
utilidades.
Pensamos que, por un lado, los conceptos adquiridos pueden ser útiles como punto de partida
para una futura investigación en profundidad. Por otro lado, el método de investigación
aplicado resultará útil en nuestro futuro profesional, cuando necesitemos informarnos sobre
cualquier tema científico sobre el cual debamos trabajar. Asimismo, la metodología grupal
aporta un enfoque importante ya que los trabajos científicos en general requieren de la
participación de varios profesionales.

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I. GLOSARIO
1.1. Glosario alfabetizado en Inglés
amphibolic: anfibólico: proceso que involucra reacciones catabólicas y anabólicas.

aneurysm: aneurisma: ensanchamiento o abombamiento anormal de una porción de una


arteria debido a una debilidad en la pared del vaso sanguíneo.

angiogenesis: angiogénesis: angiogénesis es el proceso fisiológico que consiste en la


formación de vasos sanguíneos nuevos a partir de los vasos preexistentes.

anisotropy: anisotropía: es la propiedad general de la materia según la cual diferentes


propiedades varían según la dirección en que son examinadas.

antigenicity: antigenicidad: particularidad del antígeno que hace que éste sea reconocido por
un determinado anticuerpo.

apoptosis: apoptosis: muerte celular programada.

aptamers: aptámeros: Los aptámeros son oligonucleótidos de cadena sencilla con tamaños
entre 70 y 100 nucleótidos capaces de reconocer de forma específica y con alta afinidad a
varios tipos de moléculas diana mediante un plegamiento tridimensional de su cadena.

aterosclerosis: ateroesclerosis: es un síndrome caracterizado por el depósito e infiltración de


sustancias lipídicas en las paredes de las arterias de mediano y grueso calibre.

atherosclerotic plaques: placas de ateroma: Las placas de ateroma o ateromas son lesiones
focales que se inician en la capa íntima de una arteria.

atomization: atomización: pulverización de líquidos.

autocrine: autócrino: se aplica a un tipo de secreción química que afecta a la misma célula
que secretó la sustancia, como una hormona, por ejemplo.

autolisis: autolisis: proceso biológico por el cual una célula se autodestruye, ya sea porque no
es más necesaria o porque está dañada y debe prevenirse un daño mayor.

azeotropic: azeotrópico: mezcla líquida de dos o más compuestos químicos que hierven a
temperatura constante y que se comportan como si estuviesen formadas por un solo
componente.

bioactive: bioactivo: Relativo o perteneciente a una sustancia que tiene un efecto en el tejido
vivo o causa una reacción en él.

biocompatibility: biocompatibilidad: capacidad de un material para no interferir ni degradar el


medio biológico en el cual son utilizados.

biodegradability: biodegradabilidad: propiedad de un producto o sustancia que le permite


descomponerse en los elementos químicos que lo conforman, debido a la acción de agentes
biológicos, como plantas, animales, microorganismos y hongos, bajo condiciones ambientales
naturales.

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biomechanics: biomecánica: área de conocimiento interdisciplinaria que estudia los modelos,


fenómenos y leyes que sean relevantes en el movimiento y al equilibrio (incluyendo el
estático) de los seres vivos.

biomimetic: biomimética: ciencia que estudia a la naturaleza como fuente de inspiración,


nuevas tecnologías innovadoras para resolver aquellos problemas humanos que la naturaleza
ha resuelto, mediante los modelos de sistemas (mecánica), procesos (química) y elementos
que imitan o se inspiran en ella.

calcification: calcificación: La calcificación es una acumulación de calcio en tejidos del


organismo.

chemotaxis: quimiotaxis: fenómeno en el cual las bacterias y otras células de organismos uni
o multicelulares dirigen sus movimientos de acuerdo con la concentración de ciertas
sustancias químicas en su medio ambiente.

chondrogenic: condrogénico: generador de cartílago.

chondroid metaplasia: metaplasia condroide: transformación citológica de las células de un


tejido diferenciado en células de otro tipo de tejido que puede tener un parentesco próximo o
remoto, en este caso, tejido cartilaginoso.

chronic: crónico: se aplica a enfermedades de larga duración y por lo general de progresión


lenta.

coalescence: coalescencia: posibilidad de dos o más materiales de unirse en un único cuerpo.

coacervation: coacervación: proceso de formación de micelas

composites: resinas compuestas: son materiales sintéticos que están mezclados


heterogéneamente y que forman un compuesto.

congenital: congénito: cualquier rasgo o identidad presente en el nacimiento adquirido durante


la vida intrauterina.

cryopreservation: criopreservación: proceso en el cual células o tejidos son congelados a muy


bajas temperaturas, generalmente entre -80 ºC y -196 ºC (el punto de ebullición del nitrógeno
líquido) para disminuir las funciones vitales de una célula o un organismo y poderlo mantener
en condiciones de vida suspendida por mucho tiempo.

decellularization: descelularización: extracción de todas las células del órgano de un paciente


manteniendo la matriz extracelular del órgano.

elastolysis: elastólisis: degeneración del tejido elástico.

embolism: embolismo: obstrucción rápida y brusca de una arteria por un émbolo.

endocarditis: endocarditis: enfermedad que se produce como resultado de la inflamación del


endocardio, es decir, un proceso inflamatorio localizado en el revestimiento interno de las
cámaras y válvulas—bien sea nativas o protésicas—cardíacas.

endocrine: endócrino: propiedad de las glándulas también llamadas ‘de secreción interna’, que
vierten sus secreciones directamente a la sangre, o relacionado con ellas.

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endothelialization: endotelización: generación de tejido endotelial sobre la superficie de


prótesis o stents.

etiology: etiología: se refiere a las causas de las patologías.

fusiform: fusiforme: en forma de huso (antiguo instrumento utilizado para hilar); con forma
alargada, elipsoide, y con las extremidades más estrechas que el centro.

genotypic: genotípico: relacionado a la información genética que posee un organismo en


particular.

glycosylated: glicosilado: se aplica a sustancias que poseen un glúcido adherido a su


molécula.

hemodynamic: hemodinámica: estudio de la dinámica de la sangre en el interior de las


estructuras por las que circula.

hemostasis: hemostasia: conjunto de mecanismos aptos para detener los procesos


hemorrágicos.

hydrophilic: hidrofílico: que posee afinidad por el agua.

hydrophobic: hidrofóbico: que es repelido por el agua.

hypertrophy: hipertrofia: aumento del tamaño de un órgano cuando se debe al aumento


correlativo en el tamaño de las células que lo forman.

hypotonic: hipotónico: solución con baja concentración de soluto.

immiscible: inmiscible: sustancias que en ninguna proporción pueden formar una fase
homogénea.

ischemia: isquemia: sufrimiento celular causado por la disminución transitoria o permanente


del riego sanguíneo y consecuente disminución del aporte de oxígeno (hipoxia), de nutrientes
y la eliminación de productos del metabolismo de un tejido biológico.

juxtacrine: yuxtácrino: Relativo a una relación hormonal en la cual la célula excretora es


adyacente a una célula efectora.

leaching: lixiviación: también conocida como extracción sólido-líquido, es un proceso en el que


un disolvente líquido pasa a través de un sólido pulverizado para que se produzca la
disolución de uno o más de los componentes solubles del sólido.

machinable: maquinable: se aplica a los materiales que soportan los procesos de maquinado,
tales como fresado, torneado, limado, etc.

metaplasia: metaplasia: transformación citológica de un epitelio maduro en otro que puede


tener un parentesco próximo o remoto.

mitogenesis: mitogénesis: inducción de mitosis celular.

nanofibers: nanofibras: fibra polimérica con diámetro inferior a 500 nanómetros.

neovascularization: neovascularización: Desarrollo de nuevos vasos sanguíneos.

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Nucleation: nucleación: comienzo de un cambio de estado en una región pequeña pero


estable.

osteogenic: osteogénico: Compuesto de u originado a partir de cualquier tejido que participa


en el desarrollo, crecimiento o reparación de un hueso.

pathology: patología: rama de la medicina encargada del estudio de las enfermedades.

phenotypic: fenotípico: relacionado a la expresión de la información genética que posee un


organismo.

proteolytic: proteolítico: Dícese de una sustancia que disuelve las materias albuminoides o
proteicas.

quiescent: quiescente: Que está quieto pudiendo tener movimiento propio.

regurgitation: regurgitación: filtración de sangre a través de una válvula que no cierra


completamente.

SCF (supercritical fluids): fluidos supercríticos: cualquier sustancia que se encuentre en


condiciones de presión y temperatura superiores a su punto crítico que se comporta como “un
híbrido entre un líquido y un gas”, es decir, puede difundir como un gas (efusión), y disolver
sustancias como un líquido (disolvente).

sintering: sinterizado: tratamiento térmico de un polvo o compactado metálico o cerámico a


una temperatura inferior a la de fusión de la mezcla, para incrementar la fuerza y la resistencia
de la pieza creando enlaces fuertes entre las partículas.

surfactant: tensoactivo: sustancias que influyen por medio de la tensión superficial en la


superficie de contacto entre dos fases (p.ej., dos líquidos insolubles uno en otro).

tachycardia: taquicardia: incremento de la frecuencia cardiaca.

thermoplastic: termoplástico: material plástico que a temperaturas relativamente altas se


vuelve deformable o flexible, se derrite cuando se calienta y se endurece en un estado de
transición vítrea cuando se enfría lo suficiente.

thromboembolism: tromboembolismo: situación clínica que ocurre cuando se genera un


coágulo en el interior del sistema vascular y permanece in situ (trombosis) o es desplazado
hacia delante en el torrente circulatorio (embolia).

thrombosis: trombosis: coágulo en el interior de un vaso sanguíneo y uno de los causantes de


un infarto agudo de miocardio. También se denomina así al propio proceso patológico, en el
cual, un agregado de plaquetas o fibrina ocluye un vaso sanguíneo.

tumorigenesis: tumorogénico: que genera tumores.

valve prolapse: prolapso valvular: valvulopatía (cardiopatía valvular) caracterizada por el


desplazamiento de una valva anormalmente engrosada de una válvula cardíaca.

valvuloplasty: valvuloplastia: procedimiento terapéutico mediante el cual una válvula


estenótica recupera su apertura, mediante el inflado de un globo en la luz de la válvula,
insertado mediante un catéter.

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zoonoses: zoonosis: enfermedad que puede transmitirse de animales a seres humanos.

1.2. Glosario alfabetizado en castellano


Aneurisma: aneurysm.
Anfibólico: amphibolic.
Angiogénesis: angiogenesis.
Anisotropía: anisotropy.
Antigenicidad: antigenicity.
Apoptosis: apoptosis.
Aptámeros: aptamers.
Arterosclerosis: aterosclerosis.
Atomización: atomization.
Autócrino: autocrine.
Autólisis: autolisis.
Azeotrópica: azeotropic.
Bioactivo: bioactive.
Biocompatibilidad: biocompatibility.
Biodegradabilidad: biodegradability.
Biomecánica: biomechanics.
Biomimético: biomimetic.
Calcificación: calcification.
Coalescencia: coalescence.
Resinas compuestas: composites.
Condrogénico: chondrogenic.
Congénito: congenital.
Criopreservación: cryopreservation.
Crónico: chronic.
Descelularizacion: decellularization.
Elastólisis: elastolysis.
Embolia: embolism.
Endocarditis: endocarditis.
Endócrina: endocrine.
Endotelización: endothelialization.
Etiologia: etiology.
Fenotípico: phenotypic.
Fluidos supercríticos: SCF (supercritical fluids).
Fusiformes: fusiform.

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Genotípico: genotypic.
Glicosilada: glycosylated.
Hemodinámica: hemodynamic.
Hemostasia: hemostasis.
Hidrofilico: hydrophilic.
Hidrofobico: hydrophobic.
Hipertrofia: hypertrophy.
Hipotónica: hypotonic.
Inmiscible: immiscible.
Isquemia: ischemia.
Lixiviación: leaching .
Maquinable: machinable.
Metaplasia: metaplasia.
Metaplasia condroide: chondroid metaplasia.
Mitogénesis: mitogenesis.
Nanofibras: nanofibers.
Neovascularización: neovascularization.
Nucleación: Nucleation.
Osteogénicos: osteogenic.
Patologia: pathology.
Placas de ateroma: atherosclerotic plaques.
Prolapso valvular: valve prolapse.
Proteolíticas: proteolytic.
Quiescentes: quiescent.
Quimiotaxis: chemotaxis.
Regurgitación: regurgitation.
Sinterización: sintering.
Taquicardia: tachycardia.
Tensoactivo: surfactant.
Termoplástico: thermoplastic.
Tromboembolismo: thromboembolism.
Trombosis: thrombosis.
Tumorogénesis: tumorigenesis.
Valvuloplastia: valvuloplasty.
Yuxtácrina: juxtacrine.
Zoonosis: zoonoses.

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J. CLAVES DE BÚSQUEDA

1) tissue engineering of human heart valves

2) tissue engineering valves

3) heart valve pathologies

4) válvulas cardiacas protésicas

5) collagen heart valve scaffold

6) PLGA heart valve scaffold

7) TE heart valves future

8) hipoxia + engineered heart valves

9) strains + tissue properties + TE

10) decellularized scaffolds + heart valves

11) pulsatile bioreactor

12) decellularized valve + TE

13) strains + tissue engineering + heart valves

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K. ANEXOS
K.1. Títulos y resúmenes
Alfieri, Christina; 2010, Wnt signaling in heart valve development and osteogenic gene
induction. Developmental Biology, 2010, vol. 338, pp. 127-135.
Abstract:
Wnt signaling mediated by β-catenin has been implicated in early endocardial cushion
development, but its roles in later stages of heart valve maturation and homeostasis have not
been identified. Multiple Wnt ligands and pathway genes are differentially expressed during
heart valve development. At E12.5, Wnt2 is expressed in cushion mesenchyme, whereas Wnt4
and Wnt9b are predominant in overlying endothelial cells. At E17.5, both Wnt3a and Wnt7b are
expressed in the remodeling atrioventricular (AV) and semilunar valves. In addition, the
TOPGAL Wnt reporter transgene is active throughout the developing AV and semilunar valves
at E16.5, with more localized expression in the stratified valve leaflets after birth. In chicken
embryo aortic valves, genes characteristic of osteogenic cell lineages including periostin,
osteonectin, and Id2 are expressed specifically in the collagen-rich fibrosa layer at E14.
Treatment of E14 aortic valve interstitial cells (VICs) in culture with osteogenic media results in
increased expression of multiple genes associated with bone formation. Treatment of VIC with
Wnt3a leads to nuclear localization of β-catenin and induction of periostin and matrix gla
protein but does not induce genes associated with later stages of osteogenesis. Together,
these studies provide evidence for Wnt signaling as a regulator of endocardial cushion
maturation as well as valve leaflet stratification, homeostasis, and pathogenesis.

Ankeny, R.F.; Ankeny, C.J.; Nerem, R.M.; Jo, H., 2012, Maturing EPCs into endothelial cells:
may the force be with the EPCs: focus on "Fluid shear stress induces differentiation of
circulating phenotype endothelial progenitor cells". Am J Physiol Cell Physiol, 2012, vol 303,
no. 6, pp. C589-C591.
Abstract:
Endothelial progenitor cells (EPCs) are a unique cell type found circulating in the peripheral
blood with the capacity to become mature endothelial cells. EPCs can be released from many
sources including the bone marrow, adipose tissue, the vessel wall, as well as potentially the
spleen, liver, and intestine (4). Currently, there are two main methods of isolating EPCs: 1)
separation during in vitro cell culture by morphological properties/differences, such as time of
outgrowth, or 2) cell sorting with specific markers (9). More specifically, cell sorting relies on
key markers, such as CD133, CD34, vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor 2
(VEGF-R2), or a combination of these markers to isolate and purify an EPC population (12).
There still remains debate with respect to the optimal isolation and culturing procedures;
however, there is a consensus regarding the therapeutic potential of EPCs as a cell source for
regenerative medicine, including for both replacement and endogenous repair.

Asahara, Takayuki et al., 1999, Bone Marrow Origin of Endothelial Progenitor Cells
Responsible for Postnatal Vasculogenesis in Physiological and Pathological
Neovascularization, Circulation Research, 1999, no. 85, pp 221-228

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Abstract:
Circulating endothelial progenitor cells (EPCs) have been isolated in peripheral blood of adult
species. To determine the origin and role of EPCs contributing to postnatal vasculogenesis,
transgenic mice constitutively expressing b-galactosidase under the transcriptional regulation
of an endothelial cell–specific promoter (Flk-1/LZ or
Tie-2/LZ) were used as transplant donors. Localization of EPCs, indicated by flk-1 or tie-2/lacZ
fusion transcripts, were identified in corpus luteal and endometrial neovasculature after
inductive ovulation. Mouse syngeneic colon cancer cells (MCA38) were implanted
subcutaneously into Flk-1/LZ/BMT (bone marrow transplantation) and Tie-2/LZ/BMT mice;
tumor samples harvested at 1 week disclosed abundant flk-1/lacZ and tie-2/lacZ fusion
transcripts, and sections stained with X-gal demonstrated that the neovasculature of the
developing tumor frequently comprised Flk-1– or Tie-2–expressing EPCs. Cutaneous wounds
examined at 4 days and 7 days after skin removal by punch biopsy disclosed EPCs
incorporated into foci of neovascularization at high frequency. One week after the onset of
hindlimb ischemia, lacZ-positive EPCs were identified incorporated into capillaries among
skeletal myocytes. After permanent ligation of the left anterior descending coronary artery,
histological samples from sites of myocardial infarction demonstrated incorporation of EPCs
into foci of neovascularization at the border of the infarct. These findings indicate that postnatal
neovascularization does not rely exclusively on sprouting from preexisting blood vessels
(angiogenesis); instead, EPCs circulate from bone marrow to incorporate into and thus
contribute to postnatal physiological and pathological neovascularization, which is consistent
with postnatal vasculogenesis.

Attaran, Saina et al., 2010, Identification of low circulatory transforming growth factor beta-1
in patients with degenerative heart valve disease. Interactive Cardiovascular and Thoracic
Surgery, 2010, vol. 11, pp.791-793.
Abstract:
Transforming growth factor β-1 (TGF-β1) is an immunosuppressive cytokine. It exerts
cardioprotection during acute myocardial ischaemia, promoting healing of the injured
myocytes. Lower plasma concentrations of TGF-β1 have been identified in patients with
coronary artery disease (CAD) compared to those with normal coronary arteries. We
measured plasma TGF-β1 concentrations in patients with CAD compared to those with
degenerative heart valves (DHVs) and normal coronary arteries. The mean concentration of
TGF-β1 in patients with valvular heart disease was significantly lower (18.67 μg/l) than the
mean in the coronary artery bypass graft (CABG) group (26.46 μg/l). There was no correlation
between the patient characteristics and preoperative concentration of TGF-β1. It is possible
that the lower plasma concentration of TGF-β1 in patients with valvular heart disease and the
lack of its regulatory effect results in the increased inflammation and calcification seen in
DHVs.

Azhar, M. et al., 2011, Transforming growth factor Beta2 is required for valve remodeling
during heart development. Dev. Dyn., 2010, vol. 10.
Abstract:
Although the function of transforming growth factor beta2 (TGFβ2) in epithelial mesenchymal
transition (EMT) is well studied, its role in valve remodeling remains to be fully explored. Here,

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we used histological, morphometric, immunohistochemical and molecular approaches and


showed that significant dysregulation of major extracellular matrix (ECM) components
contributed to valve remodeling defects in Tgfb2−/− embryos. The data indicated that cushion
mesenchymal cell differentiation was impaired in Tgfb2−/− embryos. Hyaluronan and cartilage
link protein-1 (CRTL1) were increased in hyperplastic valves of Tgfb2−/− embryos, indicating
increased expansion and diversification of cushion mesenchyme into the cartilage cell lineage
during heart development. Finally, Western blot and immunohistochemistry analyses indicate
that the activation of SMAD2/3 was decreased in Tgfb2−/− embryos during valve remodeling.
Collectively, the data indicate that TGFβ2 promotes valve remodeling and differentiation by
inducing matrix organization and suppressing cushion mesenchyme differentiation into
cartilage cell lineage during heart development.

Bastian, F. et al., 2008, IgG deposition and activation of the classical complement pathway
involved in the activation of human granulocytes by decellularized porcine heart valve tissue.
Biomaterials, 2008, vol. 29, pp. 1824-1832.
Abstract:
Decellularization treatment of heart valves has been thought to eliminate tissue
immunogenicity. Early failure of tissue-engineered xenogeneic heart valves was seen in
children and has been a major drawback in this promising field of research. This study was
designed to characterize the effects of acellular porcine heart valve tissue on immune
activation in vitro. Incubation of decellularized porcine tissue with human plasma led to
adsorption of IgG, activation of the classical complement pathway and adhesion of activated
polymorphonuclear leukocytes (PMN). This inflammatory response was strongly inhibited by
proteins extracted from native porcine tissue which might indicate that inhibitors of PMN
activation present in the extracellular matrix (ECM) are lost during the decellularization
process.

Boerboom, R.; Rubbens, M.; Driessen, N.; Bouten, C.; Baaijens, F., 2008, Effect of strain
magnitude of the tissue properties of engineered cardiovascular constructs. Ann. Biomed.
Eng., 2008, vol. 36, pp. 244-253.
Abstract:
Mechanical loading is a powerful regulator of tissue properties in engineered cardiovascular
tissues. To ultimately regulate the biochemical processes, it is essential to quantify the effect of
mechanical loading on the properties of engineered cardiovascular constructs. In this study the
Flexercell FX-4000T (Flexcell Int. Corp., USA) straining system was modified to simultaneously
apply various strain magnitudes to individual samples during one experiment. In addition,
porous polyglycolic acid (PGA) scaffolds, coated with poly-4-hydroxybutyrate (P4HB), were
partially embedded in a silicone layer to allow long-term uniaxial cyclic mechanical straining of
cardiovascular engineered constructs. The constructs were subjected to two different strain
magnitudes and showed differences in biochemical properties, mechanical properties and
organization of the microstructure compared to the unstrained constructs. The results suggest
that when the tissues are exposed to prolonged mechanical stimulation, the production of
collagen with a higher fraction of crosslinks is induced. However, straining with a large strain
magnitude resulted in a negative effect on the mechanical properties of the tissue. In addition,
dynamic straining induced a different alignment of cells and collagen in the superficial layers
compared to the deeper layers of the construct. The presented model system can be used to
systematically optimize culture protocols for engineered cardiovascular tissues.

Bourguignon, Lilly et al., 2011, Interaction of Low Molecular Weight Hyaluronan with CD44
and Toll-Like Receptors Promotes the Actin Filament-Associated Protein 110-Actin Binding
and MyD88-NFjB Signaling Leading to Proinflammatory Cytokine/Chemokine Production and
Breast Tumor Invasion. Cytoeskeleton, 2011, vol. 68, pp. 671-693.
Abstract:
Both high and low molecular weight hyaluronan (HMW-HA vs. LMW-HA) exist in various
tissues and cells. In this study, we investigated LMW-HA-mediated CD44 interaction with Toll-

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like receptors (TLRs), the actin filament-associated protein (AFAP-110), and a myeloid
differentiation factor (MyD88) in breast tumor cells (MDA-MB-231 cells). Our data indicate that
LMW-HA (but not HMW-HA) preferentially stimulates a physical association between CD44
and TLRs followed by a concomitant recruitment of AFAP-110 and MyD88 into receptor-
containing complexes in breast tumor cells. LMW-HA-activated AFAP-110 then binds to
filamentous actin (F-actin) resulting in MyD88/nuclear factor-κB (NF-κB) nuclear translocation,
NF-κB-specific transcription, and target gene [interleukine 1β and interleukine-8 (IL-1β and IL-
8)] expression. These signaling events lead to proinflammatory cytokine/chemokine production
in the breast tumor cells. AFAP-110-F-actin (activated by LMW-HA) also promotes tumor cell
invasion. Downregulation of AFAP-110 or MyD88 by transfecting breast tumor cells with AFAP-
110 siRNA or MyD88 siRNA, respectively not only blocks the ability of LMW-HA to stimulate
AFAP-110-actin function, but also impairs MyD88-NF-κB nuclear translocation and NF-κB
transcriptional activation. Consequently, both IL-1β/IL-8 production and tumor cell invasion are
impaired. Taken together, these findings suggest that LMW-HA plays an important role in
CD44-TLR-associated AFAP-110-actin interaction and MyD88-NF-κB signaling required for
tumor cell behaviors, which may contribute to the progression of breast cancer.

Bouten, C. et al., 2011, Substrates for cardiovascular tissue engineering. Advanced Drug
Delivery Reviews, 2011, vol. 63, pp. 221-241.
Abstract:
Cardiovascular tissue engineering aims to find solutions for the suboptimal regeneration of
heart valves, arteries and myocardium by creating ‘living’ tissue replacements outside (in vitro)
or inside (in situ) the human body. A combination of cells, biomaterials and environmental cues
of tissue development is employed to obtain tissues with targeted structure and functional
properties that can survive and develop within the harsh hemodynamic environment of the
cardiovascular system. This paper reviews the up-to-date status of cardiovascular tissue
engineering with special emphasis on the development and use of biomaterial substrates. Key
requirements and properties of these substrates, as well as methods and readout parameters
to test their efficacy in the human body, are described in detail and discussed in the light of
current trends toward designing biologically inspired microenviroments for in situ tissue
engineering purposes.

Carruthers, Christopher et al., 2011, Gene expression and collagen fiber micromechanical
interactions of semilunar heart valve interstitial cell. Cellular and Molecular Bioingeneering,
2012, vol. 5, no. 3, pp. 254-265.
Abstract:
The semilunar (aortic and pulmonary) heart valves function under dramatically different
hemodynamic environments, and have been shown to exhibit differences in mechanical
properties, extracellular matrix (ECM) structure, and valve interstitial cell (VIC) biosynthetic
activity. However, the relationship between VIC function and the unique micromechanical
environment in each semilunar heart valve remains unclear. In the present study, we
quantitatively compared porcine semilunar mRNA expression of primary ECM constituents,
and layer- and valve-specific VIC–collagen mechanical interactions under increasing

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transvalvular pressure (TVP). Results indicated that the aortic valve (AV) had a higher fibrillar
collagen mRNA expression level compared to the pulmonary valve (PV). We further noted that
VICs exhibited larger deformations with increasing TVP in the collagen rich fibrosa layer, with
substantially smaller changes in the spongiosa and ventricularis layers. While the VIC–
collagen micromechanical coupling varied considerably between the semilunar valves, we
observed that the VIC deformations in the fibrosa layer were similar at each valve’s respective
peak TVP. This result suggests that each semilunar heart valve’s collagen fiber microstructure
is organized to induce a consistent VIC deformation under its respective diastolic TVP.
Collectively, our results are consistent with higher collagen biosynthetic demands for the AV
compared to the PV, and that the valvular collagen microenvironment may play a significant
role in regulating VIC function.

Chen, Qi et al., 2012, Collagen-based scaffolds for potential application of heart valve tissue
engineering. J. Tissue Sci. Eng., vol. S11:003, pp. 1-6.
Abstract:
Collagen and elastin are two major components of the extracellular matrix of heart valves. This
work examines bi-layer scaffolds made of collagen and elastin for potential use in the tissue
engineering of heart valves, by investigating the effects of the layered structure on the
mechanical and biological properties. The scaffolds showed anisotropic bending moduli
depending on the loading directions (lower when with curvature than against curvature), which
mimicked the characteristic behaviour of the native heart valves. The interaction of
cardiosphere-drived cells with the scaffolds was characterized by scanning electron
microscopy and multiphoton microscopy, and an asymmetrical cell distribution was observed.
The bi-layer scaffolds have represented a forwarding step to the tri-layer scaffolds that more
closely resemble the native heart valves.

Conway, Simon; Doetschman, Thomas; Azhar, Mohamad; 2011, The inter-relationship of


periostin, TGFbeta, and BMP in heart valve development and valvular heart diseases. The
Scientific World Journal, 2011, vol. 11, pp. 1509-1524.
Abstract:
Recent studies have suggested an important role for periostin and transforming growth factor
beta (TGFβ) and bone morphogenetic protein (BMP) ligands in heart valve formation and
valvular heart diseases. The function of these molecules in cardiovascular development has
previously been individually reviewed, but their association has not been thoroughly examined.
Here, we summarize the current understanding of the association between periostin and TGFβ
and BMP ligands, and discuss the implications of this association in the context of the role of
these molecules in heart valve development and valvular homeostasis. Information about
hierarchal connections between periostin and TGFβ and BMP ligands in valvulogenesis will
increase our understanding of the pathogenesis, progression, and medical treatment of human
valve diseases.

Di Foggia, Michele et al., 2010, Effects of sterilisation by high-energy radiation on biomedical


poly-(e-caprolactone)/hydroxyapatite composites, J Mater Sci: Mater Med, 2010, no 21, pp
1789-1797
Abstract:
The effects of a high energy sterilization treatment on poly-ε-caprolactone/carbonated
hydroxyapatite composites have been investigated. Poly-ε-caprolactone is a biodegradable
polymer used as long-term bioresorbable scaffold for bone tissue engineering and carbonated
hydroxyapatite is a bioactive material able to promote bone growth. The composites were
gamma-irradiated in air or under nitrogen atmosphere with doses ranging from 10 to 50 kGy
(i.e. to a value higher than that recommended for sterilization). The effects of the irradiation
treatment were evaluated by vibrational spectroscopy (IR and Raman spectroscopies) coupled
to thermal analysis (Differential Scanning Calorimetry and Thermogravimetry) and Electron
Paramagnetic Resonance spectroscopy. Irradiation with the doses required for sterilization
induced acceptable structural changes and damaging effects: only a very slight fragmentation

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of the polymeric chains and some defects in the inorganic component were observed.
Moreover, the radiation sensitivity of the composites proved almost the same under the two
different atmospheres.

Dijkman, Petra; Driessen-Mol, Anita et al., 2012, Decellularized homologous tissue


engineered heart valves as off-the-shelf alternatives to xeno- and homografts. Biomaterials,
2012, vol. 33, pp. 4545-4554.
Abstract:
Decellularized xenogenic or allogenic heart valves have been used as starter matrix for tissue-
engineering of valve replacements with (pre-)clinical promising results. However, xenografts
are associated with the risk of immunogenic reactions or disease transmission and availability
of homografts is limited. Alternatively, biodegradable synthetic materials have been used to
successfully create tissue-engineered heart valves (TEHV). However, such TEHV are
associated with substantial technological and logistical complexity and have not yet entered
clinical use. Here, decellularized TEHV, based on biodegradable synthetic materials and
homologous cells, are introduced as an alternative starter matrix for guided tissue
regeneration. Decellularization of TEHV did not alter the collagen structure or tissue strength
and favored valve performance when compared to their cell-populated counterparts. Storage
of the decellularized TEHV up to 18 months did not alter valve tissue properties. Reseeding
the decellularized valves with mesenchymal stem cells was demonstrated feasible with
minimal damage to the reseeded valve when trans-apical valve delivery was simulated. In
conclusion, decellularization of in-vitro grown TEHV provides largely available off-the-shelf
homologous scaffolds suitable for reseeding with autologous cells and trans-apical valve
delivery.

Erdbrügger, Wilhelm et al., 2006, Decellularized Xenogenic Heart Valves Reveal


Remodeling and Growth Potential in Vivo, Tissue Engineering, 2006, Vol 12, no 8, pp 2059-
2068
Abstract:
We have developed an advanced tissue processing technique on porcine pulmonary heart
valves for pulmonary valve replacement and its initial clinical application during the autograft
operation according to Ross. The novel concept consists of a cell-free matrix achieved by
deoxycholic acid treatment that is repopulated by host cells in vivo. Molecular biology,
radioligand binding, and electron microscopy consistently showed that these valves are almost
free of cellular components. Animal experiments and clinical investigations revealed excellent
hemodynamic properties of the valves, no need for antithrombotic therapy, and repopulation by
host cells without any signs of calcification. In juvenile sheep the internal diameter of the
implanted valves significantly increased in growing animals by approximately 10 mm. The
repopulation of the decellularized heart valves was found not only in sheep but also in humans,
which indicates that the underlying mechanisms, presumably repair mechanisms, might be
common in mammals. If these findings can be confirmed by others, they will lead to new

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concepts in the field of cardiovascular tissue engineering that will eliminate the need for in vitro
construction of autologous heart valves.

Freed, Lisa E. et al., 2009, Advanced Material Strategies for Tissue Engineering Scaffolds,
Advanced Materials, 2009, no 21, pp 3410-3418
Abstract:
Tissue engineering seeks to restore the function of diseased or damaged tissues through the
use of cells and biomaterial scaffolds. It is now apparent that the next generation of functional
tissue replacements will require advanced material strategies to achieve many of the important
requirements for long-term success. Here, we provide representative examples of engineered
skeletal and myocardial tissue constructs in which scaffolds were explicitly designed to match
native tissue mechanical properties as well as to promote cell alignment. We discuss recent
progress in microfluidic devices that can potentially serve as tissue engineering scaffolds,
since mass transport via microvascular-like structures will be essential in the development of
tissue engineered constructs on the length scale of native tissues. Given the rapid evolution of
the field of tissue engineering, it is important to consider the use of advanced materials in light
of the emerging role of genetics, growth factors, bioreactors, and other technologies.

Frese, Laura et al., 2012, Adipose fat derived tissue-engineered heart valves. QScience
Proceedings, 2012, Session 8 – New approaches to tissue engineering.
Abstract:
A major challenge in tissue engineering of heart valves is the in vitro creation of mature tissue
structures compliant with the native valve function. Concerning the remodeling capacity of the
extracellular matrix (ECM), various cell types have been investigated, including prenatal cells,
umbilical cord and vascular derived cells. The pluripotency and availability of human
mesenchymal stem cells has made them highly attractive for tissue engineering purposes.
However, for clinical use, adult bone marrow derived mesenchymal stem cells (MSC) are
suboptimal due to the highly invasive donation procedure, and the decline in MSC number and
differentiation potential with increasing age of the patient. Adipose derived stem cells (ADSC)
represent an interesting alternative of mesodermal origin. The easy and repeatable access to
subcutaneous adipose tissue and the simple isolation procedures provide a clear advantage.
Here, we investigate the suitability of ADSC as a novel cell source for tissue engineered heart
valves (TEHV). Tissue Engineered (TE) heart valve leaflets (n=6) were produced, based on
PGA/P4HB scaffolds seeded with human ADSC isolated from fat tissue excisions from plastic
surgery. To stimulate tissue formation and induce matrix alignment, the TE leaflets were

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cultivated in dynamic strain bioreactors for 4 weeks. We subsequently reseeded the cultivated
valves with ADSC derived endothelial cells. Differentiation into endothelial-like cells was
induced by cultivation of ADSC in the presence of vascular endothelial growth factor. To
determine the ECM composition of the TE leaflets, biochemical analyses for
glycosaminoglycans (GAG), hydroxyproline (HYP) and DNA were performed. To further
evaluate the microstructural features, tissue samples of TE leaflets were analyzed by stainings
as well as by scanning electron microscopy. The mechanical properties of the ADSC derived
TE leaflets were analyzed using a biaxial tensile tester. TE leaflets based on ADSC showed a
homogenous vital cell distribution throughout the whole leaflet structure and the formation of a
confluent endothelial lining. Furthermore, a mechanically stable matrix with GAG and collagen
was demonstrated. These results indicate that ADSC represent an interesting alternative
autologous mesenchymal human cell source with clinical relevance due to their easy
accessibility and excellent proliferation and tissue formation capacities.

Gerson, Cindy et al., 2012, Structural integrity of collagen and elastin in SynerGraft
decellularized-cryopreserved human heart valves. Cryobiology, 2012, vol. 64, pp. 33-42.
Abstract:
SynerGraft® (SG) decellularized–cryopreserved cardiac valve allografts have been developed
to provide a valve replacement option that has reduced antigenicity, retained structural
integrity, and the ability to be stored long-term until needed for implantation. However, it is
critical to ensure that both the SG processing and cryopreservation of these allografts do not
detrimentally affect the extracellular matrix architecture within the tissue. This study evaluates
the effects of SG decellularization and subsequent cryopreservation on the extracellular matrix
integrity of allograft heart valves. Human aortic and pulmonary valves were trisected, with one-
third of each either left fresh (no further processing after dissection), decellularized, or
decellularized and cryopreserved. Two-photon laser scanning confocal microscopy was used
to visualize collagen and elastin in leaflets and conduits. The optimized percent laser
transmission (OPLT) required for full dynamic range imaging of each site was determined, and
changes in OPLT were used to infer changes in collagen and elastin signal intensity. Collagen
fiber crimp period and collagen and elastin fiber diameter were measured in leaflet tissue.
Statistically significant differences in OPLT and the dimensional characteristics of collagen and
elastin in study groups were determined through single factor ANOVA. The majority of donor-
aggregated average OPLT observations showed no statistically significant differences among
all groups, indicating no difference in collagen or elastin signal strength. Morphometric analysis
of collagen and elastin fibers revealed no significant alterations in treated leaflet tissues
relative to fresh tissues. Collagen and elastin structural integrity within allograft heart valves
are maintained through SynerGraft® decellularization and subsequent cryopreservation.

Gómez-Guillén, M.C. et al., 2011, Functional and bioactive properties of collagen and gelatin
from alternative sources: a review. Food Hydrocolloids, 2011, vol. 25, pp. 1813-1827.
Abstract:
The rising interest in the valorisation of industrial by-products is one of the main reasons why
exploring different species and optimizing the extracting conditions of collagen and gelatin has
attracted the attention of researchers in the last decade. The most abundant sources of gelatin
are pig skin, bovine hide and, pork and cattle bones, however, the industrial use of collagen or
gelatin obtained from non-mammalian species is growing in importance. The classical food,
photographic, cosmetic and pharmaceutical application of gelatin is based mainly on its gel-
forming properties. Recently, and especially in the food industry, an increasing number of new
applications have been found for gelatin in products such as emulsifiers, foaming agents,
colloid stabilizers, biodegradable film-forming materials and micro-encapsulating agents, in line
with the growing trend to replace synthetic agents with more natural ones. In the last decade, a
large number of studies have dealt with the enzymatic hydrolysis of collagen or gelatin for the
production of bioactive peptides. Besides exploring diverse types of bioactivities, of an
antimicrobial, antioxidant or antihypertensive nature, studies have also focused on the effect of
oral intake in both animal and human models, revealing the excellent absorption and

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metabolism of Hyp-containing peptides. The present work is a compilation of recent


information on collagen and gelatin extraction from new sources, as well as new processing
conditions and potential novel or improved applications, many of which are largely based on
induced cross-linking, blending with other biopolymers or enzymatic hydrolysis.

Isenberg, Brett et al., 1993, Long-Term Cyclic Distention Enhances the Mechanical
Properties of Collagen-Based Media-Equivalents, Annals of Biomedical Engineering, 2003, Vol
31, pp 937-949
Abstract:
In this study, we sought to identify the key parameters involved in long-term cyclic distension
(CD) as they pertain to the development of collagen-based media-equivalents (MEs). By using
only highly compacted, cross-linked constructs, we avoided the complicating issues of
irrecoverable creep and transient alignment, and isolated the effects of cyclic mechanical
loading on ME development. Our system allowed us to study this development over a wide
range of parameters including strain amplitude, pulse frequency, pulse shape, and culture
time. We found that in most cases involving cyclic distension, MEs were both stronger and
stiffer than constructs that were grown under static conditions. The mechanical properties were
not significantly different from static controls after two weeks of CD, however, five weeks of CD
was sufficient to note significant increases in both stiffness and strength. The strain, stretch
time, and relaxation time were all important variables in determining ME mechanical
properties. While we were unable to detect a significant net change in the amount of total
collagen, we observed significant deposition of insoluble elastin in our CDMEs, something that
has never been previously reported using adult smooth muscle cells. Finally, these changes in
ME development did not depend on the age of the MEs prior to the initiation of CD.

Kadner A, Hoerstrup SP, Zund G, et al., 2002, A new source for cardiovascular tissue
engineering: human bone marrow stromal cells. Eur J Cardiothorac Surg, 2002; vol. 21, pp.
1055-60.
Abstract:
Objective: Vascular-derived cells represent an established cell source for tissue engineering of
cardiovascular constructs. Previously, cell isolation was performed by harvesting of vascular
structures prior to scaffold seeding. Marrow stromal cells (MSC) demonstrate the ability to
differentiate into multiple mesenchymal cell lineages and would offer an alternative cell source
for tissue engineering involving a less invasive harvesting technique. We studied the feasibility
of using MSC as an alternative cell source for cardiovascular tissue engineering. Methods:
Human MSC were isolated from bone marrow and expanded in culture. Subsequently MSC
were seeded on bioabsorbable polymers and grown in vitro. Cultivated cells and seeded
polymers were studied for cell characterization and tissue formation including extracellular
matrix production. Applied methods comprised flow cytometry, histology,
immunohistochemistry, transmission (TEM) and scanning electron microscopy (SEM), and
biochemical assays. Results: Isolated MSC demonstrated fibroblast-like morphology.
Phenotype analysis revealed positive signals for alpha-smooth muscle actin and vimentin.
Histology and SEM of seeded polymers showed layered tissue formation. TEM demonstrated
formation of extracellular matrix with deposition of collagen fibrils. Matrix protein analysis
showed production of collagen I and III. In comparison to vascular-derived cell constructs

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quantitative analysis demonstrated comparable amounts of extracellular matrix proteins in the


tissue engineered constructs. Conclusions: Isolated MSC demonstrated myofibroblast-like
characteristics. Tissue formation on bioabsorbable scaffolds was feasible with extracellular
matrix production comparable to vascular-cell derived tissue engineered constructs. It appears
that MSC represent a promising cell source for cardiovascular tissue engineering.

Latif, N. et al, 2006, Characteization of molecules mediating cell-cell communication in human


cardiac valve interstitial cells. Cell Biochem. Biophys., 2006, vol. 45, pp. 255-264.
Abstract:
Cell-cell interactions and adhesion determine cellular architectural organization, proliferation,
signaling, differentiation, and death. We have identified the molecular components of different
cell-cell junctions in human valve interstitial cells (ICs) both in situ and in culture. ICs were
isolated, cultured, and phenotyped for cell surface and cytoplasmic markers by flow cytometry
and immunocytochemistry. Western blotting was used to identify and quantify the molecular
components of these cell-cell junctions in human valve ICs and compared with expression in
smooth muscle and fibroblast cell types. N-cadherin and desmoglein were weakly detected on
a low percentage of ICs, and the other classical cadherins were not detected. α- and β-catenin,
but not γ-catenin, were expressed at equivalent levels by all valve ICs. Valve ICs did not
express connexin-32 and-40; however, connexin-26 and-43 were equally expressed by a low
percentage of ICs, demonstrating cell surface and cytoplasmic expression, and connexin-45
was weakly expressed. The other cell types also expressed N-cadherin, α- and β-catenin,
desmoglein and connexin-43. The expression of these junctional molecules was predominantly
by valve ICs on the inflow side of the valves. Human valve ICs have the ability to communicate
with other valve ICs and mediate cell-cell adhesion via N-cadherin, connexin-26 and-43, and
desmoglein. The junctions between valve ICs could support an interconnecting and
coordinated cellular unit capable of controlling the functionality of the valve.

Lichtenberg, A. et al., 2007, Biological scaffolds for heart valve tissue engineering. Methods
in Molecular Medicine, 2007, Vol. 140, pp. 309-317.
Abstract:
Tissue engineering might bear promising solutions for overcoming the limitations of biological
and mechanical heart valve substitutes. The concept of heart valve tissue engineering bases
on decellularized biological matrices, as removal of cellular components might reduce
immunological reactions, which are thought to be responsible for accelerated valvular graft
deterioration and their subsequent repopulation with autologous cells, which leads to tissue
integrity and continuous remodeling. Here, we report a method for efficient removal of cells
from ovine heart valve tissue (including cusp, wall, and myocardial cuff) by detergents for the
generation of biological valvular scaffolds.

Masuda, Shinako et al., 2008, Cell sheet engineering for heart tissue repair, Advanced Drug
Delivery Reviews, 2008, no 60, pp 277-285
Abstract:
Recently, myocardial tissue engineering has emerged as one of the most promising therapies
for patients suffering from severe heart failure. Nevertheless, conventional methods in tissue
engineering involving the seeding of cells into biodegradable scaffolds have intrinsic
shortcomings, such as inflammatory reactions and fibrous tissue formation caused by scaffold
degradation. On the other hand, we have developed cell sheet engineering as scaffoldless
tissue engineering, and applied it for myocardial tissue engineering. Using temperature-
responsive culture surfaces, cells can be harvested as intact sheets and cell-dense thick

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tissues are constructed by layering these cell sheets. Myocardial cell sheets non-invasively
harvested from temperature-responsive culture surfaces are successfully layered, resulting in
electrically communicative 3-dimensional (3-D) cardiac constructs. Transplantation of cell
sheets onto damaged hearts improved heart function in several animal models. In this review,
we summarize the development of myocardial tissue engineering using cell sheets harvested
from temperature-responsive culture surfaces and discuss about future views.

Mol, Anita et al., 2009, Tissue engineering of heart valves: advances and current challenges.
Expert Rev. Med. Devices, 2009, vol. 6, no. 3, pp. 259-275.
Abstract:
It is estimated that the number of patients requiring heart valve replacement will triple over the
next five decades. None of the current replacement valves can fully restore native valve
function because they lack growth and remodeling capabilities. Heart valve tissue engineering
is a promising technology to overcome these limitations. Various approaches are being
employed, either aimed at development of the valve substitute in vitro or at the use of the
regenerative potential of the body (in situ) for the tissue culture phase. This review provides an
overview of the progress within both the in vitro and in situ tissue engineering approaches for
trileaflet heart valve tissue engineering. Current challenges with these approaches are
discussed, focusing in particular on the use of synthetic scaffold materials.

Rotmans, J.; Heyligers, J.; Verhagen, H.; 2005, In vivo cell seeding with anti-CD34
antibodies succesfully accelerates endothelialization but stimulates intimal hiperplasia in
porcine arteriovenous expanded polytetrafluorethylene grafts. Circulation, vol. 112, no. 1, pp.
12-18.
Abstract:
Background— The patency of AV expanded polytetrafluoroethylene (ePTFE) grafts for
hemodialysis is impaired by intimal hyperplasia (IH) at the venous outflow tract. The absence
of a functional endothelial monolayer on the prosthetic grafts is an important stimulus for IH. In
the present study, we evaluated the feasibility of capturing endothelial progenitor cells in vivo
using anti-CD34 antibodies on ePTFE grafts to inhibit IH in porcine AV ePTFE grafts.
Methods and Results— In 11 pigs, anti-CD34–coated ePTFE grafts were implanted between
the carotid artery and internal jugular vein. Bare ePTFE grafts were implanted at the
contralateral side. After 3 (n=2) or 28 (n=9) days, the pigs were terminated, and the AV grafts
were excised for histological analysis and SEM. At 3 and 28 days after implantation, 95% and
85% of the coated graft surface was covered by endothelial cells. In contrast, no cell coverage
was observed in the bare graft at 3 days, whereas at 28 days, bare grafts were partly covered
with endothelial cells (32%; P=0.04). Twenty-eight days after implantation, IH at the venous
anastomosis was strongly increased in anti-CD34–coated grafts (5.96±1.9 mm2) compared
with bare grafts (1.70±0.4 mm2; P=0.03). This increase in IH coincided with enhanced cellular
proliferation at the venous anastomosis.
Conclusions— Autoseeding with anti-CD34 antibodies results in rapid endothelialization within
72 hours. Despite persistent endothelial graft coverage, IH at the outflow tract is increased

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profoundly at 4 weeks after implantation. Further modifications are required to stimulate the
protective effects of trapped endothelial cells.

Syedain, Zeeshan; Tranquillo, Robert, 2009, Controlled cyclic stretch bioreactor for tissue-
engineered heart valves. Biomaterials, 2009, vol. 30, pp. 4078-4084.
Abstract:
A tissue-engineered heart valve (TEHV) represents the ultimate valve replacement, especially
for juvenile patients given its growth potential. To date, most TEHV bioreactors have been
developed based on pulsed flow of culture medium through the valve lumen to induce strain in
the leaflets. Using a strategy for controlled cyclic stretching of tubular constructs reported
previously, we developed a controlled cyclic stretch bioreactor for TEHVs that leads to
improved tensile and compositional properties. The TEHV is mounted inside a latex tube,
which is then cyclically pressurized with culture medium. The root and leaflets stretch
commensurately with the latex, the stretching being dictated by the stiffer latex and thus
controllable. Medium is also perfused through the lumen at a slow rate in a flow loop to provide
nutrient delivery. Fibrin-based TEHVs prepared with human dermal fibroblasts were subjected
to three weeks of cyclic stretching with incrementally increasing strain amplitude. The TEHV
possessed the tensile stiffness and stiffness anisotropy of leaflets from sheep pulmonary
valves and could withstand cyclic pulmonary pressures with similar distension as for a sheep
pulmonary artery.

Thevenot, Paul et al., 2010, The effect of incorporation of SDF-1alfa into PLGA scaffolds on
stem cell recruitment and the inflammatory response. Biomaterials, 2010, vol. 31, no. 14, pp.
3997-4008.
Abstract:
Despite significant advances in the understanding of tissue responses to biomaterials, most
implants are still plagued by inflammatory responses which can lead to fibrotic encapsulation.
This is of dire consequence in tissue engineering, where seeded cells and bioactive
components are separated from the native tissue, limiting the regenerative potential of the
design. Additionally, these interactions prevent desired tissue integration and angiogenesis,
preventing functionality of the design. Recent evidence supports that mesenchymal stem cells
(MSC) and hematopoietic stem cells (HSC) can have beneficial effects which alter the
inflammatory responses and improve healing. The purpose of this study was to examine
whether stem cells could be targeted to the site of biomaterial implantation and whether
increasing local stem cell responses could improve the tissue response to PLGA scaffold
implants. Through incorporation of SDF-1α through factor adsorption and mini-osmotic pump
delivery, the host-derived stem cell response can be improved resulting in 3X increase in stem
cell populations at the interface for up to 2 weeks. These interactions were found to
significantly alter the acute mast cell responses, reducing the number of mast cells and
degranulated mast cells near the scaffold implants. This led to subsequent downstream
reduction in the inflammatory cell responses, and through altered mast cell activation and stem
cell participation, increased angiogenesis and decreased fibrotic responses to the scaffold
implants. These results support that enhanced recruitment of autologous stem cells can
improve the tissue responses to biomaterial implants through modifying/bypassing

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inflammatory cell responses and jumpstarting stem cell participation in healing at the implant
interface.

Torikai, Kei et al., 2008, A self-renewing, tissue-engineered vascular graft for arterial
reconstruction. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 2008, vol. 136, no. 1, pp.
37-45.
Abstract:
Various tissue-engineered vascular grafts have been studied to overcome the clinical
disadvantages of conventional prostheses. Previous tissue-engineered vascular grafts have
generally required preoperative cellular manipulation or use of bioreactors to improve
performance, and their mechanical properties have been insufficient. We focused on the
concept of in situ cellularization and developed a tissue-engineered vascular graft for arterial
reconstruction that would facilitate renewal of autologous tissue without any pretreatment.
The graft comprised an interior of knitted polyglycolic acid compounded with collagen to supply
a scaffold for tissue growth and an exterior of woven poly-l-lactic acid for reinforcement. All
components were biocompatible and biodegradable, with excellent cellular affinity. The grafts,
measuring 10 mm in internal diameter and 30 mm in length, were implanted into porcine
aortas, and their utility was evaluated to 12 months after grafting.
All explants were patent throughout the observation period, with no sign of thrombus formation
or aneurysmal change. Presence in the neomedia of endothelialization with proper integrity
and parallel accumulation of functioning smooth muscle cells, which responded to vasoreactive
agents, was confirmed in an early phase after implantation. Sufficient collagen synthesis and
lack of elastin were quantitatively demonstrated. Dynamic assessment and long-term results of
the in vivo study indicated adequate durability of the implants.
Conclusion:
The graft showed morphologic evidence of good in situ cellularization, satisfactory durability to
withstand arterial pressure for 12 postoperative months, and the potential to acquire
physiologic vasomotor responsiveness. These results suggest that our tissue-engineered
vascular graft shows promise as an arterial conduit prosthesis.

Zhou, Shumin et al., 2010b, Nogo-B mediates HeLa cell adhession and motility through
binding of fibulin-5. Biochemical and Biophysical Research Communication, 2010, vol. 398, pp.
247-253.
Abstract:
Nogo-B is a known regulator of neural functions and plays an important role in cell adhesion
and migration. To our knowledge, the molecular mechanism behind its regulation of cell motility
is still unknown. Here, we identified Fibulin-5, a secreted extracellular matrix protein, as a
binding partner of Nogo-B. Using HeLa cells as a model, we found that Nogo-B and Fibulin-5
co-localize in the cytoplasm and plasma membrane. Furthermore, in HeLa cells that
overexpress Nogo-B, cell migration and invasion was promoted by the elevated secretion of
Fibulin-5. Thus, identification of the Nogo-B binding protein Fibulin-5 may contribute to uncover
the pathway in which Nogo-B regulates tumor cell movement.

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K.2. Publicaciones científicas

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