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Departamento de Biotecnología
T E S I S
P R E S E N T A
ÍNDICE DE TABLAS……………………………………………………...………...… i
ÍNDICE DE FIGURAS………………………………………………………………..... ii
RESUMEN…………………………………………………………...……………...….. 1
ABSTRACT…………………………………………………………………………..… 2
1. ANTECEDENTES…………………………………………….…………………..…. 3
1.4.1 Generalidades………………………..………………………….……..…….. 15
2. JUSTIFICACIÓN……………………………………………………………………. 21
3. OBJETIVOS…………………………………………………………………………. 22
4. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………………. 23
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………………………….. 34
5.7 Análisis químico de los cultivos in vitro y comparación con la planta silvestre… 53
6. CONCLUSIONES…………………………………………………………………… 57
7. RECOMENDACIONES……………………………………………………………... 58
8. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………….. 59
9. ANEXOS…………………………………………………………………………….. 71
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 12. Comparación de los principales compuestos detectados por HPLC en los
extractos metanólicos de la parte aérea y la raíz de la planta silvestre con
los cultivos in vitro de raíces, brotes y plántulas de C.
tenuiflora……………………………………………………….………….... 55
i
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 16. Cromatografía en capa fina. Fracciones del extracto de acetato de etilo de
la parte aérea de C. tenuiflora……………………………………………... 49
Figura 17. Cromatografía en capa fina. Aucubina, F-37A y F-40A del extracto de
acetato de etilo de la parte aérea, F-37R y F-40R del extracto metanólico
de raíz………………………………….………………………………….. 50
ii
Figura 18. Cromatogramas de HPLC. A Aucubina; B F-37A; C F-40A; D F-40R de
la planta silvestre de C. tenuiflora................................................................ 51
iii
LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS
δ Desplazamiento químico
BAP 6-bencilaminopurina
Ic Índice de crecimiento
KIN Cinetina
Rf Factor de retención
td Tiempo de duplicación
tR Tiempo de retención
Vc Velocidad de crecimiento
Xo Biomasa inicial
iv
RESUMEN
1
ABSTRACT
2
1. ANTECEDENTES
Castilleja tenuiflora Benth. es una planta mexicana que se conoce comúnmente como:
Bella Inés, Calzón de indio, Castilleja, Chacamekua (purépecha), Cola de borrego, Coneja,
Copete de grulla, Cubano, Enchiladitas, Envidia, Espinosa, Flor de hielo, Garañona,
Garayona, Hierba del cáncer, Hierba del golpe, Mirto, Platanitos, Plumero, Yerba de la
epístola, Sangrinaria (Mondragón y Vibrans, 2005).
Reino: Plantae
Subreino: Traqueobionta (plantas vasculares)
Superdivisión: Spermatophyta (plantas con semillas)
División: Magnoliophyta (plantas con flor)
Clase: Magnoliopsida (dicotiledóneas)
Subclase: Dilleniida
Orden: Scrophulariales
Familia: Scrophulariaceae
Género: Castilleja Mutis ex L.f.
Especie: Castilleja tenuiflora Benth.
Sinonimias: Castilleja angustifolia Martens. et Galeotti y Castilleja canescens
Benth.
(Mondragón y Vibrans, 2005)
Castilleja tenuiflora (Figura 1) es una especie de hábito terrestre que crece en bosques de
pino-encino, a altitudes de 740 - 3400 m.s.n.m. Es una planta herbácea que alcanza de 30
cm a 1 m de alto; el tallo es erecto, ramificado, con pelos largos y rígidos, de color blanco a
blanco-grisáceo. Las hojas son sésiles y auriculadas (con oreja) en la base, linear-
lanceoladas miden de 1 a 4.5 cm de largo, el ápice puede ser agudo u obtuso, con tricomas
suaves y largos o pelos largos y tiesos, algunas veces glanduloso-pubescentes. La
3
inflorescencia es racemosa, con numerosas flores, pedicelos de 3 a 5 mm de largo, brácteas
lanceoladas, de 1.2 a 4 cm de largo con ápice agudo, en ocasiones teñido de rojo. Las flores
presentan una corola de 3 a 4.5 cm de largo, de color anaranjado, ocasionalmente amarilla,
verdosa, con pelos simples y muy cortos, de 1.5 a 2 cm de largo; las anteras miden de 2 a 3
mm de largo; el estilo de 3 a 4 cm de largo y el estigma es bilobulado; cáliz de 2 a 3 cm de
largo, lóbulos dentados, con pelos largos y tiesos a muy largos y rígidos, con el ápice teñido
de rojo. El fruto es una cápsula ovoide, de 9 a 14 mm de largo que contiene semillas
elipsoides de aproximadamente 1.8 mm de largo, de color café (Rzedowski y Rzedowski,
2001).
4
de C. tenuiflora para el tratamiento del cáncer (Hirschhorn, 1982; Graham et al., 2000).
Aunque no esta reportado la parte que se usa para tratar el cáncer, vendedores de plantas
medicinales de los mercados de Sonora, Ozumba y Yautepec mencionan que la parte aérea
es la que se utiliza para tratar este mal.
Estudios fitoquímicos sobre especies del género Castilleja muestran que uno de los grupos
de metabolitos secundarios que acumulan principalmente son los iridoides. En la tabla 1, se
resumen los trabajos entorno a la identificación de los iridoides en especies del género
Castilleja. Sin embargo se reporta un alto grado de variabilidad tanto en el tipo como la
concentración de iridoides entre las plantas individuales y las partes de la planta. De las
hojas, el tallo y la flor de C. hispida se aisló la aucubina, el catalpol, el penstemonósido, el
metil éster de shanzhisida, la 8-epiloganina y el metil éster del gardósido (Stermitz et al.,
1986). El mellitósido fue aislado de las hojas, el tallo y la flor de C. indivisa (Stermitz y
Pomeroy, 1992). De la planta completa de C. integra se aisló el catalpol y el
macfadienósido; de las hojas se identificó la shanzhisida, el metil éster de shanzhisida, el
ácido 8-epilogánico y el gardósido, mientras que en las brácteas y flor, el ácido adoxosídico
y el adoxósido (Stermitz y Mead, 1993). En hojas y tallo de C. miniata se identificó la
aucubina, el bartsiósido, el catalpol, el 6-deoxicatalpol, la 8-epiloganina, el metil éster del
gardósido, el mussaenósido y el metil éster de shanzhisida (Stermitz et al., 1985). De las
hojas y el tallo de C. miniata aff. rhexifolia se aisló la aucubina, el catalpol, el
penstemonósido, el metil éster de shanzhisida, la 8-epiloganina y el metil éster del
gardósido mientras que en la flor se identificó la aucubina, el catalpol, el 6-deoxicatalpol, la
8-epiloganina, el mussaenósido y el metil éster de shanzhisida (Stermitz et al., 1985). De
las hojas, el tallo y la flor de C. occidentales se identificó la aucubina, el catalpol, el
penstemonósido, el metil éster de shanzhisida, la 8-epiloganina y el metil éster del
gardósido (Stermitz et al., 1986). De hojas, tallo y flor de C. purpurea var. purpurea se
aisló el metil éster de shanzhisida y el 6-O-acetilmellitósido. Sin embargo en C. var. citrina
sólo se identificó el 6-O-acetilmellitósido (Stermitz y Pomeroy, 1992). En las hojas, el tallo
y la flor de C. sulphurea se aisló la aucubina, el catalpol, el penstemonósido, el metil éster
5
de shanzhisida, la 8-epiloganina y el metil éster del gardósido (Stermitz et al., 1986). En
específico, sobre C. tenuiflora sólo existe un reporte en el que se identificaron en los
extractos butanólicos de la parte aérea los iridoides glicosilados: bartsiósido, aucubina,
metil éster del ácido geniposídico, metil éster del ácido mussaenosídico y metil éster de
shanzhisida (Figura 2) (Jiménez et al., 1995).
COOMe
HO
O O O
COOMe COOMe
HO
O O
HO Oβgluc HO Oβgluc
4 5
6
Tabla 1. Iridoides identificados en especies del género Castilleja.
7
1.3 Aspectos generales de los iridoides
4 3
6 5
7
8 9 1
6 7 8
Figura 3. Estructura química de los iridoides y seco-iridoides. 6 Iridano; 7 Secoiridoide; 8
Iridoidal.
En las plantas, los iridoides forman parte del mecanismo de defensa frente a diversas
condiciones ambientales como el ataque de herbívoros (Bowers y Stamp, 1993) u otros
patógenos (Marak et al., 2002a; 2002b). Los heterósidos al ser hidrolizados, tienen la
propiedad de desnaturalizar proteínas, mermando el contenido nutricional para el herbívoro.
Los iridoides tienen algún sabor que provoca que el animal rechace la planta en posteriores
ocasiones (Jensen et al., 2002). De forma complementaria, los iridoides como las
iridolactonas de Nepeta cataria (Lamiaceae) atraen a depredadores de los herbívoros (Bates
et al., 1958).
Por otro lado, algunos insectos utilizan los iridoides para protegerse. Determinadas especies
de mariposas y abejas en estado larvario capturan iridoides como la aucubina, sirviéndoles
8
de defensa contra sus depredadores. Incluso, se conoce que existe una relación directa entre
la concentración y el tipo de iridoides con la oviposición y desarrollo larvario de especies
de la familia Lepidopterae (Nieminen et al., 2003), Nymphalidae (Klockars et al., 1993;
Adler et al., 1995) y Chrysomelidae (Wiilinger y Dobler, 2001).
Hasta la década de los noventas del siglo XXI, se pensaba que el isopentenil pirofosfato
(IPP) se biosintetizaba exclusivamente en el citosol y se metabolizaba allí mismo, o se
transportaba a los plastidios. Sin embargo, se observó que los plastidios de trigo son
capaces de biosintetizar carotenos a partir de [14C]-acetato, lo que sugirió que en ellos
también se llevaba a cabo la biosíntesis del IPP (Heintze et al., 1994). El IPP es la
estructura base de todos los compuestos terpénicos, incluyendo los iridoides.
Las plantas poseen dos rutas independientes para la biosíntesis del IPP, en compartimientos
celulares diferentes: 1) La ruta del acetato/mevalonato en el citoplasma para la biosíntesis
de esteroles, sesquiterpenos y triterpenos; 2) La ruta de la 1-deoxi-D-xilulosa-5-fosfato
(DXOP) en los plastidios para la biosíntesis de isoprenoides plastídicos, carotenoides, fitol,
isoprenos, monoterpenos y diterpenos (Figura 4). La descripción de la ruta metabólica del
mevalonato está basada en las investigaciones realizadas sobre la biosíntesis de los
9
esteroles, principalmente en mamíferos y levaduras (Rohmer, 2003). La ruta de la DXOP se
inicia con la condensación entre el piruvato y el gliceraldehído-3-fosfato, productos del
metabolismo primario, para dar DXOP, en una reacción dependiente de tiamina y
catalizada por la 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa. En el siguiente paso, la 1-deoxi-D-
xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa reduce DXOP para formar 2-C-metil-D-eritriol-4-
fosfato (MEP), el cuál es fosforilado por la 2-C-metil-D-eritriol-4-fosfato citidiltransferasa
y de esta manera se obtiene 4-(citidina 5’-difosfato)-2-C-metil-D-eritriol, para después ser
fosforilado por la 4-(citidina 5’-difosfato)-2-C-metil-D-eritriol cinasa para formar 2-
fosfato-4-(citidina 5’-difosfato)-2-C-metil-D-eritriol. Subsecuentemente este compuesto es
transformado a 2-C-metil-D-eritriol-2,4-ciclodifosfato por una 2-C-metil-eritriol-2,4-
ciclodifosfato sintasa. El 2-C-metil-D-eritriol-2,4-ciclodifosfato es transformado a (E)-4-
hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato por la 4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato sintasa para
finalmente ser transformado a IPP por la 4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa. El
IPP es convertido a su isómero reactivo, el dimetilalil difosfato (DMAPP) por la IPP
isomerasa. La condensación de DMAPP con una molécula de IPP es llevada a cabo por la
dimetilalil-difosfato:isopentenil-difosfato dimetilaliltrans-transferasa y genera el geranil
difosfato (GPP), iniciándose de esta forma la biosíntesis de los monoterpenos
(Lichtenthaler et al., 1997, Lichtenthaler, 1999). Una vez sintetizado el GPP, éste es
transformado a geraniol por una fosfatasa, aunque se sabe poco de esta reacción química. El
geraniol resulta ser el punto de énlace de la ruta DXOP con la ruta de biosíntesis de los
iridoides (Figura 4).
10
Figura 4. Metabolismo primario, metabolismo secundario, compartamentalización y sitio
de biosíntesis de los iriodoides. IPP: isopentenil pirofosfato; DMAPP: dimetilalil difosfato;
GPP: geranil difosfato; HMG-CoA: 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA-sintasa.
11
Figura 5. Biosíntesis del antirrhinósido. 9 Geraniol; 10 10-Oxocitral; 11 8-epi-iridodial; 12-
13 8-epi-iridotrial; 14 Ácido 8-epi-deoxilogánico; 15 Ácido mussaenosídico; 16 Ácido
deoxigeniposídico; 17 6,10-dideoxiaucubina; 18 Linárido; 19 10-deoxicatalpol; 20
Antirrhinósido.
12
1.3.3 Actividad antitumoral y quimiopreventiva de los iridoides
13
velocidad de crecimiento de la línea celular de glioma C6 tanto in vitro como in vivo (Wang
et al., 1992; 1993). También induce la apoptosis activando señales proapoptóticas como p-
53 y c-myc e inhibiendo el Bcl-2 (Chang et al., 2002).
La genipina, aglicona del genipósido, mostró una mayor actividad quimiopreventiva como
inhibidor de la inducción de la formación de antígenos de EBV por TPA que el genipósido.
(Ueda y Iwashashi, 1991). Este compuesto tiene actividad antitumoral, ya que es
genotóxico y mutagénico (Ozaki et al., 2002).
Sobre la actividad biológica en especies del género Castilleja, solo se ha reportado que los
extractos de diferentes partes de C. linariaefolia presentaron actividad in vivo contra
carcinomas en ratas; en particular, el extracto de las flores. De esta parte de la planta se
aislaron los glicósidos: acteósidos e isoacteósidos, los cuales presentaron actividad
citotóxica (Pettit et al., 1990). Algunos iridoides de especies de la familia Scrophulariaceae
han mostrado actividad antitumoral e inmunoestimulante (Tabla 2).
14
Tabla 2 (Continuación). Ensayos realizados que prueban la actividad antitumoral,
quimiopreventiva e inmunoestimulante de los iridoides de especies de la familia
Scrophulariaceae.
Quimiopreventiva:
1.4.1 Generalidades
Las plantas son fuente de diversas sustancias de interés para el hombre, en las que se
incluyen compuestos llamados metabolitos secundarios que son utilizados en la industria
como colorantes, saborizantes, fragancias y fármacos, entre otros. De manera general, en
las plantas, la acumulación de estos compuestos ocurre sólo en ciertas épocas del año y en
15
algunos órganos, lo que puede limitar su abastecimiento. Por ello, el cultivo de células y
tejidos vegetales (CCTV) ha sido considerado como una alternativa biotecnológica para la
producción de metabolitos secundarios (Verpoorte et. al., 2002). Después del desarrollo
comercial para la producción de la chiconina con cultivos de células de Lithospermum
erytrorhizon, varios son los trabajos sobre el establecimiento de cultivos de células y
tejidos vegetales y la identificación de compuestos con potencial para su producción
industrial (Zhao et al., 2005).
16
basada en el objetivo del cultivo. Si lo que se quiere es obtener plántulas asépticas (libres
de virus), el explante ideal es el meristemo (dependiendo de la especie de 0.2 – 0.5 mm de
longitud) o la germinación de semillas en condiciones asépticas. Para inducir respuesta de
callogénesis y/o morfogénesis, las células meristemáticas de los tejidos obtenidas de
plántulas en condiciones asépticas, se hacen crecer de forma desdiferenciada (masa amorfa
denominada callo) o diferenciada (organogénesis o embriogénesis), mediante la aplicación
de reguladores de crecimiento vegetal (CIAT, 1991).
Los reguladores de crecimiento vegetal (RCV) son sustancias orgánicas que a bajas
concentraciones influyen en los procesos fisiológicos de las plantas (Tabla 3)
(Frankenberger y Arshadm, 1995).
Los RCV cuando son producidos por las plantas (endógena) se les denominan
fitohormonas, las cuales actúan como mensajeros químicos que regulan el crecimiento y
17
desarrollo de la planta. También regulan las respuestas a las señales ambientales (Morgan,
1990). El término regulador de crecimiento vegetal se refiere a un compuesto sintético o
natural que se aplica (exógena) para alterar el crecimiento y desarrollo de las plantas o
cultivos de células y tejidos vegetales. El término fitohormona y regulador de crecimiento
vegetal se utiliza alternativamente, particularmente cuando se refiere a auxinas, citocininas,
giberelinas y ácido abscísico (Frankenberger y Arshadm, 1995).
Las suspensiones celulares están constituidas por células meristemáticas, las cuales son
inducidas a crecer de forma desdiferenciada en un medio de cultivo líquido en agitación
constante, lo que permite su disgregación, su proliferación y su continúo crecimiento. Los
cultivos en suspensión permiten estudiar los mecanismos bioquímicos que regulan la
permeabilización y la biosíntesis del metabolito secundario de interés; esto con la finalidad
de redireccionar el metabolismo secundario, mediante agentes permeabilizantes y el
incremento de la producción del metabolito de interés, mediante la modificación genética y
los inductores bióticos y abióticos (Bourgaud et al., 2001). Para seleccionar una suspensión
celular se necesitan caracterizar las cinéticas de crecimiento y la producción de metabolitos
secundarios de las diferentes líneas celulares. Idealmente se prefieren líneas celulares con
productividades altas del metabolito secundario de interés y que además sea un producto
extracelular y que esté asociado a su crecimiento.
18
En muchas ocasiones, los cultivos en suspensión no producen los compuestos de interés,
debido principalmente a que los metabolitos secundarios son producidos por células
especializadas y/o en distintas etapas del desarrollo de la planta (Balandrin et al., 1985). En
estos casos, el cultivo de órganos es una alternativa (Subroto et al., 1996; Mahagamasekera
y Doran, 1998).
Para obtener un cultivo de raíces y brotes, se inicia con la optimización el medio de cultivo
que permita la organogénesis vía indirecta o indirecta, la proliferación de biomasa y la
producción de metabolitos secundarios. Las raíces y los brotes se transfieren a medios
líquidos en agitación constante para continuar su crecimiento. Para seleccionar líneas de
raíces ó brotes, se caracterizan sus cinéticas de crecimiento y producción de metabolitos
secundarios. Al igual que en los cultivos en suspensión idealmente se prefieren líneas de
raíces o brotes con productividades altas del metabolito de interés y que además sea un
producto un producto extracelular y esté asociado a su crecimiento (Bourgaud et al., 2001).
19
Tabla 4. Cultivos in vitro de especies de la familia Scrophulariaceae.
RCV
Especie Explante Medio Resultados Referencia
(µM)
Antirrhinum majus Entrenudos con tallo Poirier-Hamon et al. (1974) 2,4-D (2.2 – 9.0) Embriogénesis Poirier-Hamon et al., 1974
A. majus Brotes Murashige & Skoog (1962) BAP (4.4) Brotes Atkinson et al., 1989
A. majus Brotes Murashige & Skoog (1962) BAP (4.4) Callo Atkinson et al., 1989
Scrophularia yoshimure Entrenudos con tallo Murashige & Skoog (1962) BA (4.44) + ANA (1.07) Brotes Hsin-Sheng et al., 2001
S. yoshimure Tallo con nudos Murashige & Skoog (1962) BA (4.4 4) + ANA (1.07) Brotes Hsin-Sheng et al., 2001
S. yoshimure Brotes Murashige & Skoog (1962) BA (4.44) + ANA (1.07) Brotes Hsin-Sheng et al., 2001
S. yoshimure Hoja Murashige & Skoog (1962) BA (4.44) + ANA (1.07) Brotes Hsin-Sheng et al., 2001
20
2. JUSTIFICACIÓN
Castilleja tenuiflora es una planta mexicana usada tradicionalmente para tratar el cáncer
debido a las recomendaciones de la herbolaria, por lo que comúnmente se conoce como
“hierba del cáncer”. Es una especie demandada en el mercado y para su comercialización se
recolecta de manera no sostenible. En los extractos butanólicos de la parte aérea de esta
especie, se identificaron los iridoides glicosilados: bartsiósido, aucubina, metil éster del
ácido geniposídico, metil éster del ácido mussaenosídico y metil éster de shanzhisida.
Estudios demuestran que algunos de estos iridoides tienen actividad antitumoral,
quimiopreventiva e inmunoestimulante. En el interés de contar con sistemas
biotecnológicos para la eventual producción de los compuestos bio-activos, es necesario
establecer el cultivo in vitro de C. tenuiflora y analizar su composición de iridoides.
21
3. OBJETIVOS
22
4. MATERIALES Y MÉTODOS
23
4.2 Germinación de semillas
Las semillas se lavaron con detergente durante 5 min y se enjuagaron en 3 ocasiones con
agua desionizada estéril. Después de sumergieron en NaOCl 0.5% durante 5 min y
posteriormente en etanol 70% durante 1 min y se enjuagaron 3 veces con agua desionizada
estéril. Las semillas se sembraron en cajas Magenta con 30 mL de medio de cultivo
Murashige y Skoog (MS, Murashige y Skoog, 1962) (Sigma, M5519) complementado con
3% de sacarosa y 0.2% de fitagel. El pH del medio se ajustó a 5.8 antes de esterilizar. En
cada caja se sembraron 10 semillas; se sembraron 250 semillas en total. Las semillas se
incubaron bajo un fotoperiodo de 16 h luz (150-200 µmol/m2s) a 25±2 ºC.
Se esterilizaron 6 cajas Drigalski con papel filtro Whatman (No. 2 de 12.5 cm de diámetro
y cuadriculado 1 cm x 1 cm). Los frutos de C. tenuiflora secos (cápsulas) se colocaron en
bolsas de organza previamente esterilizadas y se sumergieron en etanol al 70% por
diferente tiempo de inmersión (0, 30 y 60 s) por duplicado. Posteriormente, las cápsulas se
enjuagaron en agua desionizada estéril durante 30 s. Las cápsulas desinfestadas se abrieron
con pinzas esterilizadas y se esparcieron las semillas (aproximadamente 100) en las cajas
Drigalski con papel filtro. Las semillas se incubaron bajo un fotoperiodo de 16 h luz (150-
200 µmol/m2s) a 25±2 ºC.
Se utilizaron 2 charolas germinadoras con 200 cavidades cada una. Las cavidades se
rellenaron con una mezcla de tepojal-turba estéril en una proporción 1:1. Las semillas se
24
separaron según su color (amarillo y café). En cada cavidad se colocaron 5 semillas. Una
charola germinadora correspondió a semillas amarillas y la otra a semillas cafés. Las
charolas se taparon con un domo de plástico transparente y se colocaron en una cámara de
cultivo bajo un fotoperiodo de 16 h luz (150-200 µmol/m2s) a 25±2 ºC. Diariamente se
rociaron las charolas con agua desionizada para mantener húmedo el sustrato, evitando
maltratar las plántulas.
Antes de inocular en un medio cultivo, las hojas sin separar de los internodos se lavaron
con detergente comercial “Roma” durante 5 min y en 3 ocasiones con agua desionizada.
Después se sumergieron en una mezcla de NaOCl 1% y Tween 80 al 0.01% durante 5 min
y se lavaron 3 veces con agua desionizada estéril. Las hojas de aproximadamente 0.8 cm de
largo fueron sumergidas en etanol 70% y benomilo 1 g/L durante 30 s, respectivamente.
25
Tabla 5. Combinación de auxinas y citocininas usadas para inducir callogénesis y
organogénesis.
a
Cada número representa un experimento que consiste en 5 frascos Gerber con 30 mL de
medio de cultivo y 5 explantes de hoja; n = 25 explantes.
Las raíces formadas a partir de los experimentos descritos en la sección 4.4, se transfirieron
a frascos de boca ancha de 6 cm de diámetro y con volumen nominal de 200 mL, cubiertos
con tapa de rosca de plástico, a los cuales se le adicionaron 30 mL de medio MS líquido sin
reguladores de crecimiento vegetal y 3% de sacarosa. El pH del medio se ajustó a 5.8 antes
de esterilizar. Las raíces se cultivaron en agitación orbital de 100 r.p.m., iluminación
continua (150-200 µmol/m2s) y a 25±2 ºC. Se subcultivaron cada 20 días, en medio de
26
cultivo fresco, transfiriendo aproximadamente ¼ de la biomasa total de cada frasco en
medio de cultivo fresco.
Las plántulas formadas a partir de los brotes, se resembraron cada 20 días en medio MS,
con 3% de sacarosa, 0.2% de fitagel y sin RCV. El pH del medio se ajustó a 5.8 antes de
esterilizar. Las plántulas estuvieron bajo fotoperiodo de 16 h luz (150-200 µmol/m2s) y a
25±2 ºC.
27
RCV. La edad del inóculo fue de 15 días. Las raíces se cultivaron bajo las condiciones
descritas previamente (ver sección 4.5). Se analizaron cinco frascos cada 3-4 días, durante
31 días.
28
Abs 490 nm = 0.0087 [Azúcares totales] + 0.0161 (2)
X - Xo
Ic = (3)
Xo
Donde:
Xo: Biomasa inicial
X: Biomasa en un tiempo determinado
y = b + m⋅x
X = Xo + Vc ⋅ t (4)
El tiempo de duplicación (td) es un valor cinético, que indica el tiempo en que el cultivo
tarda en duplicar la biomasa correspondiente al inóculo. Se entiende inóculo a la cantidad
de biomasa con la que se inicia el cultivo es decir 2Xo.
2Xo = Xo + Vc ⋅ td
2Xo – Xo = Vc ⋅ td
Xo
td = (5)
Vc
29
El rendimiento de biomasa con base a sustrato (Yx/s), se calculó de acuerdo a la ecuación
6.
X - Xo
Yx/s = (6)
So - S
Donde:
So: Concentración de fuente de carbono inicial
S: Concentración de fuente de carbono en un tiempo determinado
El material vegetal (parte aérea y raíz) de C. tenuiflora fué secado bajo condiciones de
oscuridad a temperatura ambiente. El material vegetal seco fue molido por separado y
almacenado en bolsas de papel a temperatura ambiente hasta su uso. Se realizó una
extracción exhaustiva de ambas partes de la planta. Se maceraron 1800 g de parte aérea en
n-hexano, acetato de etilo y metanol durante 24 h para cada disolvente. Mientras que para
obtener el extracto de la raíz, se partió de 669.1 g que se maceró únicamente en metanol
durante 24 h. En todos los casos, los extractos se concentraron con un evaporador rotatorio
(Büchi®, R-114) a presión reducida, a una temperatura de 50-60 °C y los residuos obtenidos
se almacenaron en frascos color ámbar a 8±2 ºC.
30
se concentraron con un evaporador rotatorio (Büchi®, R-114) a presión reducida, a una
temperatura de 50-60 °C y se almacenaron en frascos color ámbar a 8±2 ºC hasta su
análisis.
Las muestras de biomasa de raíces de la cinética, brotes (20 días) y plántulas (20 días) in
vitro fueron congeladas a -18±2 ºC y posteriormente se liofilizaron (Heto drywinner®,
modelo DW3). Se almacenaron en viales de plástico a -18±2 ºC, hasta su análisis por
HPLC. Los liofilizados (6 g) fueron macerados en metanol, en una relación 2:1 (p/v)
durante 24 horas. Los extractos se concentraron y almacenaron de acuerdo a lo descrito
previamente (ver sección 4.8.1). En el caso del cultivo in vitro de raíces, también se analizó
el sobrenadante filtrado previamente y congelado a -18±2 ºC.
Se utilizaron placas de sílica gel (cromatofolios Merck® de aluminio y sílica gel 60 F254
1.05554.0001), usando como disolvente mezclas de n-hexano:acetato de etilo (85:15) y
cloroformo:metanol (95:5; 90:10; 85:15). El revelado se realizó con el reactivo para
iridoides que consistió en una mezcla de ácido clorhídrico:ácido acético (80:20) (Wagner y
Bladt, 1996). Después de haber aplicado el revelador, las placas se colocaron en una
31
parrilla a 90 ºC durante 5 s. La coloración azul y café indicaba la presencia de iridoides. Se
usó como estándar de referencia a la aucubina (Sigma, MFCD00136026).
32
4.9 Elucidación estructural mediante Resonancia Magnética Nuclear (RMN)
33
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
34
Figura 8. Frecuencia de colecta de C. tenuiflora en los distintos meses del año en México
de 1990 a 2006 (Datos obtenidos a partir de la revisión del herbario MEXU-UNAM).
35
Con la información del herbario y el acercamiento con los informantes, se ubicó una
población de C. tenuiflora en el km 37 Carr. Xochimilco-Oaxtepec, Juchitepec, Edo. de
México. La especie colectada fue determinada como Castilleja tenuiflora Benth. por el M.
en C. Rolando Ramírez, curador del Herbario HUMO del Centro de Educación Ambiental e
Investigación Sierra de Huautla (CEAMISH) de la Universidad Autónoma del Estado de
Morelos (UAEM). En dicho herbario, se depositó un ejemplar (HUMO25208).
Las plántulas in vitro, son la alternativa más apropiada para obtener explantes que sirvan
para inducir cultivos in vitro, ya que los riesgos de contaminación son menores en
comparación al uso de material silvestre; además, el material joven responde más rápido
que el material adulto (CIAT, 1991). Por lo que se sembraron semillas de C. tenuiflora en
condiciones in vitro. Sin embargo, las semillas no germinaron (Tabla 7) debido quizás a un
efecto negativo de la manipulación y/o los agentes desinfestantes.
Para discriminar que las semillas no fueran capaces de germinar, se probó la germinación
en papel filtro (Figura 9A). El 82% de las semillas, cuyas cápsulas no fueron desinfestadas
germinaron en 30 días, mientras que las semillas, provenientes de cápsulas desinfestadas
con etanol presentaron menor germinación (42% y 59%). Estos resultados indican que las
semillas de C. tenuiflora son capaces de germinar pero presentan “sensibilidad” a la
desinfestación con etanol.
36
viables. Debido a la nula germinación in vitro y al lento desarrollo de las plántulas
obtenidas por la germinación de semillas en sustrato, se decidió utilizar plantas silvestres
como fuente de explantes.
% Germinación promedio
Prueba Número de semillas
(30 días)
In vitro 200 0
Papel filtro
Cápsulas 200 82
Sin tratamiento
Cápsulas 200 42
Sumergidas en etanol (30 s)
Cápsulas 200 59
Sumergidas en etanol (60 s)
Sustrato
Semillas amarillas 2000 67
37
Figura 9. A Semillas de C. tenuiflora germinadas en caja Drigalski; B Fruto de C.
tenuiflora (Cápsula); C Semillas amarillas y cafés; D Plántulas obtenidas a partir de
semillas germinadas en tepojal-turba.
En los cultivos in vitro se ha generalizado el uso de las auxinas para la formación de raíces
en tejidos no diferenciados, las citocininas para la formación de brotes adventicios y la
combinación de auxinas y citocininas en una misma concentración para la formación y
proliferación de callos (Rayen et al., 1999). Sin embargo, los tejidos de las distintas
especies vegetales presentan diferencias en su capacidad de respuesta por la edad, la etapa
fenológica, el tipo de explante, así como por la cantidad de hormonas endógenas y
proteínas receptoras. Por lo que es necesario realizar estudios que conlleven a conocer el
tipo y la dosis de RCV para la inducción callos, brotes y raíces para cada tipo de especie.
38
entrenudos como explantes, sin embargo la contaminación de este material fue del 100%,
por lo que se descartaron.
Los primeros cambios en los explantes de hoja se observaron a partir de las dos semanas de
sembrarlos en los diferentes medios de cultivo. Estos consistieron en la formación de
callos, raíces y brotes, lo que dependió del tipo de auxina o citocinina, así como de su
combinación (Tabla 8). En el medio 2 (2,4-D) hubo formación de callos (Figura 10A) con
un 20% de inducción, sin embargo estas estructuras al ser resembradas en medio fresco no
crecieron. En los medios 6 y 9 (ANA en combinación con KIN o BAP) se formaron callos
con un 4% de inducción, éstos aparentemente presentaron crecimiento al resembrarse, sin
embargo se oxidaron (Figura 10B). En el medio 3 (ANA) se desarrollaron callos
rizogénicos (Figuras 10C-D). En los medios 1, 4 y 7 se formaron brotes con un 4% de
inducción (Figura 10E). En los medios 5 y 8, los explantes se necrosaron (Figura 10D).
Cabe señalar que los bajos porcentajes de inducción, para la formación de callos, raíces y
brotes, a partir de las hojas de plantas adultas de C. tenuiflora silvestre (Tabla 8), se
debieron quiza a la edad del explante y al efecto negativo de los agentes desinfestantes en
estos (necrosamiento).
Auxina Citocinina
Experimento Tipo de respuesta % de inducción
(10 µM) (10 µM)
1 - - Brotes 4
2 2,4-D - Callos 20
3 ANA - Callos rizogénicos 4
4 - KIN Brotes 4
5 2,4-D KIN Necrosamiento -
6 ANA KIN Callos/Oxidación 4
7 - BAP Brotes 4
8 2,4-D BAP Necrosamiento -
9 ANA BAP Callos/Oxidación 4
39
Figura 10. Callogénesis y organogénesis a partir de hoja silvestre de C. tenuiflora. A Callo
formado con 10 µM de 2,4-D a las 2 semanas; B Callo oxidado con ANA y KIN; C-D
Callos rizogénicos formados con 10 µM de ANA a las 4 semanas; E Brote desarrollado con
10 µM de BAP; F Explante de hoja necrosado con 2,4-D en combinación con KIN o BAP.
40
En trabajos previos con especies de la familia Scrophulariaceae se ha observado el papel de
algunos RCV para inducir callos, raíces, brotes y plántulas. Para la micropropagación de
Scoparia montevidiensis se utilizó 0.25 mg/mL de BAP (Escandón et al., 2005). En otro
estudio con Mecardonia tenella utilizando como explantes los segmentos nodales, se
observó qué el incremento del valor de la relación de ANA/BAP indujo la formación de
callos rizogénicos, mientras que el decremento de dicha relación indujo la formación brotes
con raíces. Por otro lado, ANA y BAP en una misma proporción indujo la formación de
callos y el solo uso de BAP indujo la formación de brotes sin raíces (Escandón et al.,
2006). En Bacopa monniera se determinó el efecto de ANA sobre los brotes de esta especie
y se observó que estos reguladores inducen la formación de raíces en estas estructuras
(Singh et al., 2001). Estos resultados comparados con los obtenidos en este trabajo con C.
tenuiflora muestran que al parecer en las especies de la familia Scrophulariaceae la auxina
ANA induce la formación raíces mientras que la citocinina BAP induce la formación de
brotes.
41
En un cultivo de 4 semanas de edad se observó la formación de brotes (Figura 11D), los
cuales se aislaron, transfirieron a medio de cultivo fresco sin RCV y mantuvieron en
agitación. Se observó la elongación y multiplicación de estas estructuras (Figura 11E); a los
30 días alcanzaron una altura de 7 cm, sin embargo se observó una “ligera” hiperhidricidad
ya que mostraban una apariencia vidriosa. Los brotes se resembraron en medio de cultivo
fresco de manera periódica (20 días) durante 8 meses, conservando su capacidad de
multiplicación.
Estos resultados muestran que las hojas de plantas adultas de C. tenuiflora silvestre son
fuente de explantes para establecer cultivos in vitro de esta especie.
42
Figura 11. Cultivo in vitro de raíces, brotes y plántulas de C. tenuiflora. A Callo rizogénico;
B-C Raíces; D-E Brotes; F Plántulas.
43
5.5 Cinética de crecimiento, pH y consumo de azúcares del cultivo in vitro de raíces
44
400
200
100
0
0 10 20 30
Tiempo (Días)
30
Biomasa seca (g/L)
20
10
0
0 10 20 30
Tiempo (Días)
Figura 13. Caracterización del crecimiento de raíces in vitro de C. tenuiflora en base seca.
Cultivo de 6 meses (n = 5). Se reportan valores promedio, las barras representan la
desviación estándar.
45
Tabla 9. Parámetros cinéticos del crecimiento del cultivo in vitro de raíces de C. tenuiflora.
Xo Xmáx
Evaluación Vc td
(g/L) (g/L) Ic
(Inóculo de 15 días) (g/L día) (días)
0 días 28 días
Cultivo 6 meses
8.29±1 25.14±1 2.02 0.49 19
n=5
De acuerdo con los parámetros cinéticos, el crecimiento del cultivo in vitro de raíces de C.
tenuiflora coincidió con el crecimiento de raíces secundarias de Hyoscyamus niger (Yang et
al., 1997). Sin embargo en trabajos futuros, sería importante determinar la morfología de
las raíces y establecer un método de corte de raíces adecuado para reducir la variabilidad y
obtener cultivos de raíces homogéneos, ya que Yang et al. (1997) observó que la
heterogeneidad en la morfología de la raíces (raíces primarias, secundarias y terciarias)
influye en el crecimiento de los cultivos de raíces in vitro de Hyoscyamus niger. Por tal
motivo propuso un método de corte que permite obtener cultivos de raíces con relaciones
constantes entre raíces primarias, secundarias y terciarias (cultivos de raíces homogéneos).
El pH aumentó de 5.1 en el día 0 a 6.3 en el día 28 lo cual coincide con la fase lineal del
crecimiento (Figura 14). Por otro lado, entre el día 28-31, el pH disminuyó de 6.3 a 6.0 lo
que coincide con la formación de brotes a partir de las raíces.
46
7
6
pH
4
0 10 20 30
Tiempo (Días)
Figura 14. pH durante el crecimiento del cultivo in vitro de raíces de C. tenuiflora. Cultivo
de 6 meses (n = 5). Se reportan valores promedio, las barras representan la desviación
estándar.
50
40
Azúcares totales (g/L)
30
20
10
0
0 10 20 30
Tiempo (Días)
Figura 15. Concentración de azúcares totales residuales durante el crecimiento del cultivo
in vitro de raíces de C. tenuiflora. Cultivo de 6 meses (n = 5). Se reportan valores
promedio, las barras representan la desviación estándar.
47
5.6 Obtención de estándares de la planta silvestre
Los rendimientos de las extracciones con n-hexano, acetato de etilo y metanol a partir de
1800 g de la parte aérea de la planta silvestre y el rendimiento de la extracción metanólica a
partir de 669.1 g de la raíz silvestre de C. tenuiflora se muestran en la tabla 10.
Extracto Rendimiento
Parte de la planta Disolvente
(g) (%)
n-hexano 7.9 0.4
Parte aérea
Acetato de etilo 10 5
(1800 g)
Metanol 18.8 10
Raíz
Metanol 49 7
(669.1 g)
El análisis por cromatografía en capa fina de los 3 extractos de la parte aérea indicó la
presencia de iridoides (por la coloración café y azul al revelar). El extracto hexánico
contiene el perfil de iridoides menos polar y el metanólico el más polar. Dado que en el
extracto de acetato de etilo se observó la presencia de iridoides con una gama amplia de
polaridad, este fue seleccionado para el fraccionamiento. A partir de éste, se obtuvieron 127
fracciones, las cuales fueron analizadas por cromatografía en capa fina y agrupadas de
acuerdo a la similitud de sus perfiles; de esta manera se obtuvieron 42 fracciones, de las
cuales la fracción F-37 de la parte aérea (F-37A) y la fracción F-40 de la parte aérea (F-
40A) presentaron los perfiles mayoritarios de iridoides, siendo además de las más polares
(Figura 16).
48
F7 F8 F9 REF F10 F11 F12 F19 F20 F21 REF F22 F23 F24 F36 F37 F38 REF F39 F40
Figura 16. Cromatografía en capa fina. Fracciones del extracto de acetato de etilo de la
parte aérea de C. tenuiflora. A Fracciones F-7-F-12. Fase móvil: cloroformo-metanol
(85:15); B Fracciones F-19-F-24. Fase móvil: cloroformo-metanol (95:5); C Fracciones F-
36-F-40. Fase móvil: cloroformo-metanol (95:5). Fase estacionaria: SiO2. Revelador
iridoides: ácido clorhídrico-acido acético (80:20). REF: extracto de acetato de etilo sin
fraccionar.
En otro análisis por cromatografía en capa fina, usando como fase móvil cloroformo-
metanol (80:20), se observó que la fracción F-37A contiene un compuesto cuyo Rf fue de
0.6. En la fracción F-40A se detectaron dos compuestos con un Rf de 0.2 y 0.6
respectivamente, de los cuales el compuesto con el Rf 0.2 fue el mayoritario. La aucubina
(estándar) mostró un Rf de 0.2; lo cual indicó que este compuesto se encontraba en la
fracción F-40A (Figura 17). Estos resultados indican que uno de los iridoides que acumula
mayoritariamente C. tenuiflora en la parte aérea es la aucubina.
El análisis del extracto de acetato de etilo de la parte aérea mostró que los iridoides
mayoritarios son de alta polaridad, por lo que para la raíz silvestre, se preparó y analizó el
extracto metanólico de ésta. Se obtuvieron dos fracciones, las cuales fueron denominadas
F-37R y F-40R debido a que mostraron un perfil similar a las del extracto de acetato de
etilo de la parte aérea (Figura 17). En ambas fracciones se detectaron al menos dos
compuestos cuyo Rf coincide con el observado en la parte aérea. Estos resultados
demuestran que la raíz de C. tenuiflora acumula iridoides, coincidiendo los mayoritarios,
49
con los que se acumulan en la parte aérea, entre los que se encuentra la aucubina. Este es el
primer reporte sobre la composición química de la raíz de C. tenuiflora.
Figura 17. Cromatografía en capa fina. Aucubina, F-37A y F-40A del extracto de acetato de
etilo de la parte aérea, F-37R y F-40R del extracto metanólico de raíz. Fase estacionaria:
SiO2. Fase móvil: cloroformo-metanol (80:20). Revelador iridoides: ácido clorhídrico-acido
acético (80:20). EMR: extracto metanólico de raíz.
Las fracciones F-37A, F-40A y F-40R fueron analizadas por HPLC. La aucubina (1)
presentó un tR=2.1 min (Figura 18A) y λmax=195 nm y fue identificado tanto en la parte
áerea como en la raíz de C. tenuiflora (Figuras 18C y D). Este resultado junto con el
análisis por cromatografía en capa fina corrobora que la parte aérea y la raíz de C.
tenuiflora acumula mayoritariamente a la aucubina.
50
Figura 18. Cromatogramas de HPLC. A Aucubina; B F-37A; C F-40A; D F-40R de la planta silvestre de C. tenuiflora.
51
Por otro lado, en las fracciones se detectaron otros tres picos principales (Figuras 18B-D).
El denominado (2) presentó tR=2.8 min y λmax de 208 nm, (3) presentó tR=3.9 min y λmax de
196-197 nm, mientras que para el (4) tR=5.6-5.7 min y λmax fue 238 nm. Se decidió elucidar
la estructura química de al menos uno de estos tres compuestos.
Átomo δC δC
F-37 Bartsiósido
Aglicona
1 96.5 96.0
2 - -
3 139.7 140.1
4 107.3 110.1
5 34.9 33.6
6 39.1 39.50
7 128.3 130.1
8 142.9 142.6
9 48.7 48.8
10 60.4 60.8
Glucosa
1’ 99.0 99.8
2’ 73.3 74.2
Figura 19. Estructura del bartsiósido 3’ 77.2 77.5
4’ 69.4 71.0
5’ 77.2 77.1
6’ 61.0 62.10
52
El análisis de la fracción F-37A, por cromatografía en capa fina, HPLC y RMN, sugiere
que el compuesto (3) con un tR=3.9 min y una λmax=196-197 nm corresponde al bartsiósido
(Figura 18B-C). Esta suposición se basa en que en la fracción F-37A el compuesto cuyo Rf
es 0.6, es más abundante en comparación a F-40 (Figura 17). Por otro lado, el tamaño del
pico (3) presentó el mismo comportamiento (Figura 18B-C). La estructura del compuesto
(4) no fue elucidada debido a su baja concentración. El compuesto (2) presenta λmax=208
nm y espectro de absorción similar al de la aucubina. Esto sugiere que se trata de un
iridoide de estructura semejante al de la aucubina y sería interesante elucidar su estructura
química en trabajos futuros.
5.7 Análisis químico de los cultivos in vitro y comparación con la planta silvestre
La figura 20 muestra el análisis por HPLC de los extractos metanólicos del cultivo in vitro
de raíces, brotes y plántulas. Estos cromatogramas muestran que los cultivos in vitro
acumulan varios compuestos químicos, algunos de los cuales pueden corresponder a
iridoides, de acuerdo con su espectro de absorción. Los principales compuestos (más
abundantes) fueron seleccionados y se compararon con base en su tR y espectro de
absorción con los identificados en la planta silvestre (Tabla 12).
Al igual que la planta silvestre, las plántulas in vitro de C. tenuiflora acumulan aucubina (1)
y bartsiósido (3), lo que no ocurrió en los brotes. En el cultivo de raíces, se detectó
aucubina pero únicamente en el sobrenadante (0 y 7 días del cultivo), lo cuál es un
indicativo de que este compuesto esta siendo excretado. Por otro lado, el compuesto (5) fue
detectado en la planta silvestre y en los cultivos in vitro pero no se detectó en la raíz
silvestre. En el sobrenadante del cultivo de raíces se detectaron los compuestos (6) y (7)
cuyo espectro de absorción sugiere se trata de iridoides. De estos dos compuestos, el (6) fue
detectado en la parte aérea de la planta silvestre. Resultaría interesante elucidar su
estructura química en trabajos posteriores.
53
Figura 20. Cromatogramas de los extractos metanólicos de cultivos in vitro de C. tenuiflora. A Sobrenadante del cultivo de raíces de
14 días; B Sobrenadante del cultivo de raíces de 28 días; C Brotes de 20 días; D plántulas de 20 días.
54
Tabla 12. Comparación de los principales compuestos detectados por HPLC en los
extractos metanólicos de la parte aérea y la raíz de la planta silvestre con los cultivos in
vitro de raíces, brotes y plántulas de C. tenuiflora.
Los resultados del presente trabajo coinciden parcialmente con lo reportado para
Scrophularia nodosa. Tanto en la planta silvestre (hojas, tallo, flor y raíces) como en los
cultivos in vitro de brotes de esta especie vegetal se identificaron los iridoides: aucubina,
harpagósido y catalpol en nivles similares, mientras que en los cultivos in vitro de raíces y
callos no se detectaron (Sesterhenn et al. 2006)
55
órgano de acumulación. Esto explicaría al menos en parte, las diferencias entre los perfiles
cromatográficos de los cultivos in vitro con órganos aéreos (brotes y plántulas) y el de
raíces.
56
6. CONCLUSIONES
Se estableció una metodología para extraer y analizar por métodos cromatográficos, los
iridoides de C. tenuiflora.
57
7. RECOMENDACIONES
Elucidar la estructura de los compuestos extraídos de la planta silvestre (parte aérea y raíz)
y de los cultivos in vitro (raíces, brotes y plántulas) de C. tenuiflora.
Probar la actividad biológica de los iridoides de la planta silvestre y de los cultivos in vitro
de C. tenuiflora.
58
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70
9. ANEXOS
HO
O OH
O O
OH OH
OH
HO
120
115
110
77.94 62.60 46.07
105 141.49 130.27 105.72 99.90 97.22 82.74 74.81 71.44 61.32 47.89
100
95
90
85
80
75
70
65
60
55
50
45
40
35
30 147.95
25
20
15
10
0
150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40
71
Anexo 2. Espectro de RMN13C de F-37A.
72
Anexo 3. Espectro de RMN13C de F-37A (continuación).
73