You are on page 1of 85

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

Departamento de Biotecnología

Establecimiento del cultivo in vitro de


Castilleja tenuiflora Benth.

T E S I S

Que para obtener el grado de


Maestría en Ciencias en Desarrollo de Productos Bióticos

P R E S E N T A

Gabriel Rosas Romero

Directora: Dra. Gabriela Trejo Tapia

Yautepec, Morelos, México, Noviembre 2007


El presente trabajo fue realizado en el Departamento
de Biotecnología del Centro de Desarrollo de
Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional
bajo la dirección de la Dra. Gabriela Trejo Tapia y en
el Centro de Investigaciones Biomédicas del Sur del
Instituto Mexicano del Seguro Social con asesoría del
Dr. Alejandro Zamilpa Álvarez. Fue financiado por la
Secretaría de Investigación y Posgrado del Instituto
Politécnico Nacional (Proyectos 20060011 y
20070118).

Para la realización del mismo se contó con una beca


del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología
(Registro 199411) y del Programa Institucional de
Formación de Investigadores (PIFI) del Instituto
Politécnico Nacional.
ÍNDICE

ÍNDICE DE TABLAS……………………………………………………...………...… i

ÍNDICE DE FIGURAS………………………………………………………………..... ii

LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS………………………………...……..... iv

RESUMEN…………………………………………………………...……………...….. 1

ABSTRACT…………………………………………………………………………..… 2

1. ANTECEDENTES…………………………………………….…………………..…. 3

1.1 Aspectos generales de Castilleja tenuiflora Benth……………….…………….... 3

1.2 Iridoides en especies del género Castilleja………………………….………….... 5

1.3 Aspectos generales de los iridoides…………………………………………..….. 8

1.3.1 Ecología de los iridoides……………………………………………..……… 8

1.3.2 Biosíntesis de los iridoides…………………………….……………..……… 9

1.3.3 Actividad antitumoral y quimiopreventiva de los iridoides………………..... 13

1.4 Cultivo de células y tejidos vegetales……………………………………..……... 15

1.4.1 Generalidades………………………..………………………….……..…….. 15

1.4.2 Reguladores de crecimiento vegetal…………………………………………. 17

1.4.3 Cultivos de células desdiferenciados y diferenciados……………………….. 18

2. JUSTIFICACIÓN……………………………………………………………………. 21

3. OBJETIVOS…………………………………………………………………………. 22

3.1 Objetivo general………………………………………………………………….. 22

3.2 Objetivos específicos…………………………………………………………….. 22

4. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………………. 23

4.1 Obtención de material silvestre de C. tenuiflora…………………………………. 23


4.2 Germinación de semillas…………………………………………………………. 24

4.2.1 Prueba in vitro……………………………………………………………….. 24

4.2.2 Prueba en papel filtro………………………………………………………... 24

4.2.3 Prueba en sustrato…………………………………………………………… 24

4.3 Desinfestación de hojas de plantas silvestre……………………………………... 25

4.4 Inducción de cultivos in vitro…………………………………………………….. 25

4.5 Establecimiento y mantenimiento del cultivo in vitro de raíces………………… 26

4.6 Cultivo de brotes y plántulas……………………………………………………... 27

4.7 Cinética de crecimiento, pH y consumo de azúcares del cultivo in vitro de raíces 27

4.7.1 Condiciones experimentales………………………………………………… 27

4.7.2 Determinación gravimétrica del crecimiento………………………………... 28

4.7.3 Determinación del pH……………………………………………………….. 28

4.7.4 Determinación de azúcares totales…………………………………………... 28

4.7.5 Cálculo de los parámetros cinéticos…………………………………………. 29

4.8 Aislamiento de los iridoides……………………………………………………… 30

4.8.1 Preparación de extractos de parte aérea y raíz………………………………. 30

4.8.2 Fraccionamiento de los extractos……………………………………………. 30

4.8.3 Preparación de los extractos de los cultivos in vitro………………………… 31

4.8.4 Cromatografía en capa fina………..…………….…….…………………….. 31

4.8.5 Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)………………………... 32

4.9 Elucidación estructural mediante Resonancia Magnética Nuclear (RMN)……… 33

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………………………….. 34

5.1 Obtención de material silvestre de C. tenuiflora…………………………………. 34

5.2 Germinación de semillas…………………………………………………………. 36


5.3 Inducción de callogénesis y organogénesis……………………………………… 38

5.4 Establecimiento del cultivo in vitro de raíces, brotes y plántulas………………... 41

5.5 Cinética de crecimiento, pH y consumo de azúcares del cultivo in vitro de raíces 44

5.6 Obtención de estándares de la planta silvestre…………………………………… 48

5.6.1 Rendimiento de las extracciones…………………………………………….. 48

5.6.2 Análisis por cromatografía en capa fina……………………………………... 48

5.6.3 Análisis por HPLC…………………………………………………………... 50

5.6.4 Elucidación estructural mediante Resonancia Magnética Nuclear (RMN13C) 52

5.7 Análisis químico de los cultivos in vitro y comparación con la planta silvestre… 53

6. CONCLUSIONES…………………………………………………………………… 57

7. RECOMENDACIONES……………………………………………………………... 58

8. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………….. 59

9. ANEXOS…………………………………………………………………………….. 71
ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Iridoides identificados en especies del género Castilleja………..…….......... 7

Tabla 2. Ensayos realizados que prueban la actividad antitumoral, quimiopreventiva


e inmunoestimulante de los iridoides de especies de la familia
Scrophulariaceae…………………………………………………………..… 14

Tabla 3. Función de los reguladores de crecimiento vegetal en los cultivos de células


y tejidos vegetales……………………………………………...………….… 17

Tabla 4. Cultivos in vitro de especies de la familia Scrophulariaceae….………......... 20

Tabla 5. Combinación de auxinas y citocininas para inducir callogénesis y


organogénesis………...................................................................................... 26

Tabla 6. Mezcla de disolventes por gradiente de polaridad ascendente…..……...…... 31

Tabla 7. Germinación de semillas de C. tenuiflora en diferentes condiciones……...... 37

Tabla 8. Tipo de respuesta y porcentaje de inducción de las hojas de plantas


silvestres de C. tenuiflora a los reguladores de crecimiento vegetal………... 39

Tabla 9. Parámetros cinéticos del crecimiento del cultivo in vitro de raíces de C.


tenuiflora……………………………………………………………….…… 46

Tabla 10. Rendimientos de las extracciones de C. tenuiflora……………………..….... 48

Tabla 11. Desplazamientos químicos (δ) de RMN13C del bartsiósido y F-37A…......... 52

Tabla 12. Comparación de los principales compuestos detectados por HPLC en los
extractos metanólicos de la parte aérea y la raíz de la planta silvestre con
los cultivos in vitro de raíces, brotes y plántulas de C.
tenuiflora……………………………………………………….………….... 55

i
ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Castilleja tenuiflora Benth…………………………………….………..… 4

Figura 2. Estructura química de los iridoides glicosilados identificados en la parte


aérea de C. tenuiflora……………………………………………………... 6

Figura 3. Estructura química de los iridoides y seco-iridoides…………………….... 8

Figura 4. Metabolismo primario, metabolismo secundario, compartamentalización


y sitio de biosíntesis de los iriodoides……………………………..……… 11

Figura 5. Biosíntesis del antirrhinósido…………………….……………………….. 12

Figura 6. Espectro de absorción de la aucubina…………………….…………..…… 32

Figura 7. Distribución de C. tenuiflora en México………………………………….. 34

Figura 8. Frecuencia de colecta de C. tenuiflora en los distintos meses del año en


México de 1990 a 2006…………………………………….…..…………. 35

Figura 9. A Semillas de C. tenuiflora germinadas en caja Drigalski; B Fruto de C.


tenuiflora (Cápsula); C Semillas amarillas y cafés; D Plántulas obtenidas
a partir de semillas germinadas en tepojal-turba………………………….. 38

Figura 10. Callogénesis y organogénesis a partir de hoja silvestre de C. tenuiflora…. 40

Figura 11. Cultivo in vitro de raíces, brotes y plántulas de C. tenuiflora…………….. 43

Figura 12. Caracterización del crecimiento de raíces in vitro de C. tenuiflora en base


húmeda…………………………………………………………………….. 45

Figura 13. Caracterización del crecimiento de raíces in vitro de C. tenuiflora en base


seca………………………………………………………………………... 45

Figura 14. pH durante el crecimiento del cultivo in vitro de raíces de C. tenuiflora…. 47

Figura 15. Concentración de azúcares totales residuales durante el crecimiento del


cultivo in vitro de raíces de C. tenuiflora…………………………………. 47

Figura 16. Cromatografía en capa fina. Fracciones del extracto de acetato de etilo de
la parte aérea de C. tenuiflora……………………………………………... 49

Figura 17. Cromatografía en capa fina. Aucubina, F-37A y F-40A del extracto de
acetato de etilo de la parte aérea, F-37R y F-40R del extracto metanólico
de raíz………………………………….………………………………….. 50

ii
Figura 18. Cromatogramas de HPLC. A Aucubina; B F-37A; C F-40A; D F-40R de
la planta silvestre de C. tenuiflora................................................................ 51

Figura 19. Estructura del bartsiósido…………………………………………………. 52

Figura 20. Cromatogramas de los extractos metanólicos de cultivos in vitro de C.


tenuiflora………………………………………………………………….. 54

iii
LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS

δ Desplazamiento químico

2,4 D Ácido 2,4-diclorofenoxiacético

ANA Ácido α-naftalenacético

BAP 6-bencilaminopurina

CCTV Cultivo de células y tejidos vegetales

Ic Índice de crecimiento

KIN Cinetina

RCV Reguladores de crecimiento vegetal

Rf Factor de retención

S Concentración de fuente de carbono en un tiempo determinado

So Concentración de fuente de carbono inicial

td Tiempo de duplicación

tR Tiempo de retención

Vc Velocidad de crecimiento

X Biomasa en un tiempo determinado

Xmáx Biomasa máxima

Xo Biomasa inicial

Yx/s Rendimiento de biomasa con base a sustrato

iv
RESUMEN

Castilleja tenuiflora Benth. (Scrophulariaceae) es una planta mexicana silvestre, conocida


como “hierba del cáncer” y usada tradicionalmente para tratar el cáncer y otros
padecimientos relacionados. En la parte aérea se identificaron iridoides glicosilados a los
cuales se les atribuye actividad anticancerígena e inmunoestimulante. En el interés de
contar con sistemas biotecnológicos para producir compuestos bio-activos, el objetivo del
presente trabajo fue establecer el cultivo in vitro de C. tenuiflora y comparar el perfil de
iridoides con la planta silvestre. Para inducir callogénesis y organogénesis, se inocularon
explantes de hoja de C. tenuiflora silvestre, en medio MS con sacarosa y diferentes
reguladores de crecimiento vegetal (RCV) con una concentración 10 µM: auxinas (ácido
2,4-diclorofenoxiacético, 2,4 D y ácido α-naftalenacético, ANA) y citocininas (cinetina,
KIN y 6-bencilaminopurina, BAP). KIN y BAP indujeron la formación de brotes, mientras
que en combinación con ANA indujeron la formación de callos; sin embargo, estas
estructuras se oxidaron y no crecieron. Por el contrario, ANA indujo la formación de callos
rizogénicos, estas estructuras crecieron en medio de cultivo fresco. El cultivo de raíces se
estableció cuando las raíces de los callos rizogénicos se transfirieron a medio MS líquido
sin RCV. El crecimiento de las raíces in vitro de C. tenuiflora fue caracterizado. En el día
28 se alcanzó la concentración de biomasa máxima (Xmáx), la cual fue de 25.14±1 g/L. El
índice de crecimiento (Ic) en el intervalo de 0-28 días del cultivo de raíces fue de 2.02, lo
cual significa que el inóculo se triplicó, las raíces crecieron con una Vc de 0.49 g/L día
correspondiente a un td de 19 días. Por otro lado a las 4 semanas se observó la formación
de brotes, estas estructuras se aislaron y cultivaron en medio líquido sin RCV. De estos
brotes, se cortaron segmentos, incluyendo hoja y entrenudo, y se sembraron en medio MS
semisólido sin RCV, los segmentos se elongaron dando lugar a la formación de plántulas.
Los análisis químicos de las plantas silvestres de C. tenuiflora, mediante cromatografía en
capa fina, HPLC y RMN13C mostraron que se acumulan los iridoides aucubina y bartsióido
en la parte aérea y en la raíz. En los cultivos in vitro de raíces, brotes y plántulas se
detectaron varios compuestos químicos, entre ellos iridoides. En específico, la aucubina es
acumulada en plántulas y el cultivo de raíces. Mientras que el bartsiósido se acumuló
únicamente en las plántulas.

1
ABSTRACT

Castilleja tenuiflora Benth. (Scrophulariaceae) is a mexican plant growing in the wild,


known as "hierba del cáncer" and traditionally used to treat cancer and other related
diseases. In the aerial part were identified glycoside iridoids to which anticancer and
immunostimulant activity is attributed. In the interest of having biotechnological systems to
produce bio-active compounds, the aim of the present work was to establish the in vitro
culture of C. tenuiflora and to compare the iridoides profile with the wild plant. To induce
callugenesis and organogenesis, leaf explants of wild C. tenuiflora were inoculated in MS
medium supplemented with sucrose and different plant growth regulators (PGR) with a
concentration 10 µM: auxins (2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D and α-
naphthaleneacetic acid, ANA) and cytokinins (kinetin, KIN and 6-benzilaminopurine,
BAP). KIN and BAP induced the formation of shoots, while in combination with ANA
induced calluses formation; however, these structures were oxidized and they did not grow.
By contrast, ANA induced the formation of rhizogenic calluses, these structures grew in
fresh culture medium. In vitro root culture was established when the rhizogenic calluse´s
roots were transferred to liquid MS culture medium whithout PGR. The growth of in vitro
root of C. tenuiflora was characterized. At day 28 the highest biomass concentration was
reached, it was 25.14 ±1 g/L. The growth rate index between 0-28 days was 2.02, which
indicated the inoculum was triplicated; the roots grew with a rate of 0.49 g/L day
corresponding a duplication time of 19 days. After 4 weeks in the roots culture was
observed the formation of shoots, these structures were isolated and cultured in liquid
medium without PGR. From these shoots, segments including leaves and internodes, were
excised and transferred to semisolid MS culture medium without PGR. The segments were
enlarged and converted in plantlets. Chemical analysis (TLC, HPLC and NMR13C) showed
that wild plants of C. tenuiflora accumulates the iridoids aucubin and bartsioside in the
aerial part and in the root. In vitro cultures of roots, shoots and plantlets accumulated
several chemical compounds including iridoids. Specifically, aucubin was found in the
plantlets and in root cultures. Bartsioside was only accumulated in the plantlets.

2
1. ANTECEDENTES

1.1 Aspectos generales de Castilleja tenuiflora Benth.

Castilleja tenuiflora Benth. es una planta mexicana que se conoce comúnmente como:
Bella Inés, Calzón de indio, Castilleja, Chacamekua (purépecha), Cola de borrego, Coneja,
Copete de grulla, Cubano, Enchiladitas, Envidia, Espinosa, Flor de hielo, Garañona,
Garayona, Hierba del cáncer, Hierba del golpe, Mirto, Platanitos, Plumero, Yerba de la
epístola, Sangrinaria (Mondragón y Vibrans, 2005).

La clasificación taxonómica de C. tenuiflora es la siguiente:

Reino: Plantae
Subreino: Traqueobionta (plantas vasculares)
Superdivisión: Spermatophyta (plantas con semillas)
División: Magnoliophyta (plantas con flor)
Clase: Magnoliopsida (dicotiledóneas)
Subclase: Dilleniida
Orden: Scrophulariales
Familia: Scrophulariaceae
Género: Castilleja Mutis ex L.f.
Especie: Castilleja tenuiflora Benth.
Sinonimias: Castilleja angustifolia Martens. et Galeotti y Castilleja canescens
Benth.
(Mondragón y Vibrans, 2005)

Castilleja tenuiflora (Figura 1) es una especie de hábito terrestre que crece en bosques de
pino-encino, a altitudes de 740 - 3400 m.s.n.m. Es una planta herbácea que alcanza de 30
cm a 1 m de alto; el tallo es erecto, ramificado, con pelos largos y rígidos, de color blanco a
blanco-grisáceo. Las hojas son sésiles y auriculadas (con oreja) en la base, linear-
lanceoladas miden de 1 a 4.5 cm de largo, el ápice puede ser agudo u obtuso, con tricomas
suaves y largos o pelos largos y tiesos, algunas veces glanduloso-pubescentes. La

3
inflorescencia es racemosa, con numerosas flores, pedicelos de 3 a 5 mm de largo, brácteas
lanceoladas, de 1.2 a 4 cm de largo con ápice agudo, en ocasiones teñido de rojo. Las flores
presentan una corola de 3 a 4.5 cm de largo, de color anaranjado, ocasionalmente amarilla,
verdosa, con pelos simples y muy cortos, de 1.5 a 2 cm de largo; las anteras miden de 2 a 3
mm de largo; el estilo de 3 a 4 cm de largo y el estigma es bilobulado; cáliz de 2 a 3 cm de
largo, lóbulos dentados, con pelos largos y tiesos a muy largos y rígidos, con el ápice teñido
de rojo. El fruto es una cápsula ovoide, de 9 a 14 mm de largo que contiene semillas
elipsoides de aproximadamente 1.8 mm de largo, de color café (Rzedowski y Rzedowski,
2001).

Figura 1. Castilleja tenuiflora Benth.

De acuerdo a las recomendaciones de la herbolaria mexicana, todas las partes de la planta


son utilizadas para tratar enfermedades de diversa índole. Por ejemplo, el cocimiento de la
parte aérea se emplea para lavar heridas y evitar la caída del pelo. La parte aérea en
infusión es útil para curar el sarampión, la inflamación, afecciones del hígado o del riñón y
combinada con las flores como agua de uso para la tos. La infusión de las hojas se toma en
ayunas para aliviar la disentería, nervios, torzón y vómito. Las flores en infusión se usan
contra vómito, nervios, disentería, retraso o adelanto menstrual y dolor menstrual. No se
tiene definida la parte que se usa para aliviar cólicos hepáticos, enfermedades del estómago,
tosferina y piquete de víbora (Zamora y Torres, 2002). En otros reportes se menciona el uso

4
de C. tenuiflora para el tratamiento del cáncer (Hirschhorn, 1982; Graham et al., 2000).
Aunque no esta reportado la parte que se usa para tratar el cáncer, vendedores de plantas
medicinales de los mercados de Sonora, Ozumba y Yautepec mencionan que la parte aérea
es la que se utiliza para tratar este mal.

1.2 Iridoides en especies del género Castilleja

Estudios fitoquímicos sobre especies del género Castilleja muestran que uno de los grupos
de metabolitos secundarios que acumulan principalmente son los iridoides. En la tabla 1, se
resumen los trabajos entorno a la identificación de los iridoides en especies del género
Castilleja. Sin embargo se reporta un alto grado de variabilidad tanto en el tipo como la
concentración de iridoides entre las plantas individuales y las partes de la planta. De las
hojas, el tallo y la flor de C. hispida se aisló la aucubina, el catalpol, el penstemonósido, el
metil éster de shanzhisida, la 8-epiloganina y el metil éster del gardósido (Stermitz et al.,
1986). El mellitósido fue aislado de las hojas, el tallo y la flor de C. indivisa (Stermitz y
Pomeroy, 1992). De la planta completa de C. integra se aisló el catalpol y el
macfadienósido; de las hojas se identificó la shanzhisida, el metil éster de shanzhisida, el
ácido 8-epilogánico y el gardósido, mientras que en las brácteas y flor, el ácido adoxosídico
y el adoxósido (Stermitz y Mead, 1993). En hojas y tallo de C. miniata se identificó la
aucubina, el bartsiósido, el catalpol, el 6-deoxicatalpol, la 8-epiloganina, el metil éster del
gardósido, el mussaenósido y el metil éster de shanzhisida (Stermitz et al., 1985). De las
hojas y el tallo de C. miniata aff. rhexifolia se aisló la aucubina, el catalpol, el
penstemonósido, el metil éster de shanzhisida, la 8-epiloganina y el metil éster del
gardósido mientras que en la flor se identificó la aucubina, el catalpol, el 6-deoxicatalpol, la
8-epiloganina, el mussaenósido y el metil éster de shanzhisida (Stermitz et al., 1985). De
las hojas, el tallo y la flor de C. occidentales se identificó la aucubina, el catalpol, el
penstemonósido, el metil éster de shanzhisida, la 8-epiloganina y el metil éster del
gardósido (Stermitz et al., 1986). De hojas, tallo y flor de C. purpurea var. purpurea se
aisló el metil éster de shanzhisida y el 6-O-acetilmellitósido. Sin embargo en C. var. citrina
sólo se identificó el 6-O-acetilmellitósido (Stermitz y Pomeroy, 1992). En las hojas, el tallo
y la flor de C. sulphurea se aisló la aucubina, el catalpol, el penstemonósido, el metil éster

5
de shanzhisida, la 8-epiloganina y el metil éster del gardósido (Stermitz et al., 1986). En
específico, sobre C. tenuiflora sólo existe un reporte en el que se identificaron en los
extractos butanólicos de la parte aérea los iridoides glicosilados: bartsiósido, aucubina,
metil éster del ácido geniposídico, metil éster del ácido mussaenosídico y metil éster de
shanzhisida (Figura 2) (Jiménez et al., 1995).

COOMe
HO

O O O

βgluc βgluc Oβgluc


HO HO HO
1 2 3

COOMe COOMe
HO

O O

HO Oβgluc HO Oβgluc
4 5

Figura 2. Estructura química de los iridoides glicosilados identificados en la parte aérea de


C. tenuiflora. 1 Bartsiósido; 2 Aucubina; 3 Metil éster del ácido geniposídico; 4 Metil éster
del ácido mussaenosídico; 5 Metil éster de shanzhisida (Jiménez et al., 1995).

6
Tabla 1. Iridoides identificados en especies del género Castilleja.

Especie Parte de la planta Iridoides Referencias


Aucubina, catalpol, penstemonósido,
Hojas, tallo y flor metil éster de shanzhisida, Stermitz et al., 1986
C. hispida
8-epiloganina,
metil éster del gardósido
C. indivisa Hojas, tallo y flor Mellitósido Stermitz y Pomeroy, 1992
Planta completa Catalpol, macfadienósido

Hojas Shanzhisida, metil éster de shanzhisida, Stermitz y Mead, 1993


C. integra
ácido 8-epilogánico, gardósido

Brácteas y flor Ácido adoxosídico, adoxósido


Aucubina, bartsiósido, catalpol,
6-deoxicatalpol, 8-epiloganina,
C. miniata Hojas y tallo Stermitz et al., 1985
metil éster del gardósido, mussaenósido,
metil éster de shanzhisida
Aucubina, catalpol, penstemonósido,
Hojas y tallo metil éster de shanzhisida,
8-epiloganina, metil éster del gardósido
C. miniata
Stermitz et al., 1985
aff. rhexifolia
Aucubina, catalpol,
Flor 6-deoxicatalpol, 8-epiloganina, mussaenósido,
metil éster de shanzhisida
Aucubina, catalpol, penstemonósido,
C. occidentales Hojas, tallo y flor metil éster de shanzhisida, Stermitz et al., 1986
8-epiloganina, metil éster del gardósido
C. purpurea Shanzhisida metil éster,
Hojas, tallo y flor Stermitz y Pomeroy, 1992
var. purpurea 6-O-acetilmellitósido
C. purpurea
Hojas, tallo y flor 6-O-acetilmellitósido Stermitz y Pomeroy, 1992
var. citrina
Aucubina, catalpol, penstemonósido,
C. sulphurea Hojas, tallo y flor shanzhisida metil éster, Stermitz et al., 1986
8-epiloganina, metil éster del gardósido

7
1.3 Aspectos generales de los iridoides

Los iridoides (Figura 3) constituyen un grupo de monoterpenos con esqueleto


ciclopenta[c]piránico, basados en la estructura del iridano (cis-2-oxabiciclo-[4,3,0]-
nonano). También están incluidos los secoiridoides, caracterizados por la ruptura del enlace
entre C7 y C8 del anillo ciclopentánico (Bianco, 1994). El término “iridoide” se debe al
iridoidal, primer compuesto de este tipo que se identificó y aisló de las hormigas del género
Iridomyrmex, que lo sintetizan como defensa frente a otros insectos (Trim y Hill, 1952).

4 3
6 5

7
8 9 1

6 7 8
Figura 3. Estructura química de los iridoides y seco-iridoides. 6 Iridano; 7 Secoiridoide; 8
Iridoidal.

1.3.1 Ecología de los iridoides

En las plantas, los iridoides forman parte del mecanismo de defensa frente a diversas
condiciones ambientales como el ataque de herbívoros (Bowers y Stamp, 1993) u otros
patógenos (Marak et al., 2002a; 2002b). Los heterósidos al ser hidrolizados, tienen la
propiedad de desnaturalizar proteínas, mermando el contenido nutricional para el herbívoro.
Los iridoides tienen algún sabor que provoca que el animal rechace la planta en posteriores
ocasiones (Jensen et al., 2002). De forma complementaria, los iridoides como las
iridolactonas de Nepeta cataria (Lamiaceae) atraen a depredadores de los herbívoros (Bates
et al., 1958).

Por otro lado, algunos insectos utilizan los iridoides para protegerse. Determinadas especies
de mariposas y abejas en estado larvario capturan iridoides como la aucubina, sirviéndoles

8
de defensa contra sus depredadores. Incluso, se conoce que existe una relación directa entre
la concentración y el tipo de iridoides con la oviposición y desarrollo larvario de especies
de la familia Lepidopterae (Nieminen et al., 2003), Nymphalidae (Klockars et al., 1993;
Adler et al., 1995) y Chrysomelidae (Wiilinger y Dobler, 2001).

Los iridoides tienen propiedades alelopáticas. La aucubina, el harpagósido, o el laterósido


inhiben la germinación de semillas de Hordeum vulgare e incluso, disminuyen la longitud
de las raíces de semillas pregerminadas (Pardo et al., 1998).

Al parecer, algunos factores ambientales afectan la síntesis de iridoides. Por ejemplo


estudios in vitro realizados con Plantago lanceolata, temperaturas comprendidas entre 18-
20 °C aumentaron los niveles de iridoides y disminuyeron en situaciones de sombra o
elevadas concentraciones de nitrógeno (Kordana et al., 1998; Tamura, 2001; Tamura y
Nishibe, 2002), mientras que la radiación UV parece no influir en la producción de
iridoides (McCloud y Berenbaum, 1999).

1.3.2 Biosíntesis de los iridoides

Hasta la década de los noventas del siglo XXI, se pensaba que el isopentenil pirofosfato
(IPP) se biosintetizaba exclusivamente en el citosol y se metabolizaba allí mismo, o se
transportaba a los plastidios. Sin embargo, se observó que los plastidios de trigo son
capaces de biosintetizar carotenos a partir de [14C]-acetato, lo que sugirió que en ellos
también se llevaba a cabo la biosíntesis del IPP (Heintze et al., 1994). El IPP es la
estructura base de todos los compuestos terpénicos, incluyendo los iridoides.

Las plantas poseen dos rutas independientes para la biosíntesis del IPP, en compartimientos
celulares diferentes: 1) La ruta del acetato/mevalonato en el citoplasma para la biosíntesis
de esteroles, sesquiterpenos y triterpenos; 2) La ruta de la 1-deoxi-D-xilulosa-5-fosfato
(DXOP) en los plastidios para la biosíntesis de isoprenoides plastídicos, carotenoides, fitol,
isoprenos, monoterpenos y diterpenos (Figura 4). La descripción de la ruta metabólica del
mevalonato está basada en las investigaciones realizadas sobre la biosíntesis de los

9
esteroles, principalmente en mamíferos y levaduras (Rohmer, 2003). La ruta de la DXOP se
inicia con la condensación entre el piruvato y el gliceraldehído-3-fosfato, productos del
metabolismo primario, para dar DXOP, en una reacción dependiente de tiamina y
catalizada por la 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa. En el siguiente paso, la 1-deoxi-D-
xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa reduce DXOP para formar 2-C-metil-D-eritriol-4-
fosfato (MEP), el cuál es fosforilado por la 2-C-metil-D-eritriol-4-fosfato citidiltransferasa
y de esta manera se obtiene 4-(citidina 5’-difosfato)-2-C-metil-D-eritriol, para después ser
fosforilado por la 4-(citidina 5’-difosfato)-2-C-metil-D-eritriol cinasa para formar 2-
fosfato-4-(citidina 5’-difosfato)-2-C-metil-D-eritriol. Subsecuentemente este compuesto es
transformado a 2-C-metil-D-eritriol-2,4-ciclodifosfato por una 2-C-metil-eritriol-2,4-
ciclodifosfato sintasa. El 2-C-metil-D-eritriol-2,4-ciclodifosfato es transformado a (E)-4-
hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato por la 4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato sintasa para
finalmente ser transformado a IPP por la 4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa. El
IPP es convertido a su isómero reactivo, el dimetilalil difosfato (DMAPP) por la IPP
isomerasa. La condensación de DMAPP con una molécula de IPP es llevada a cabo por la
dimetilalil-difosfato:isopentenil-difosfato dimetilaliltrans-transferasa y genera el geranil
difosfato (GPP), iniciándose de esta forma la biosíntesis de los monoterpenos
(Lichtenthaler et al., 1997, Lichtenthaler, 1999). Una vez sintetizado el GPP, éste es
transformado a geraniol por una fosfatasa, aunque se sabe poco de esta reacción química. El
geraniol resulta ser el punto de énlace de la ruta DXOP con la ruta de biosíntesis de los
iridoides (Figura 4).

La complejidad de los procesos genéticos, catalíticos y de transporte en la biosíntesis de los


iridoides, es uno de los retos intelectuales más estimulantes en el área de los metabolitos
secundarios. Falta aún elucidar un importante número de pasos metabólicos, para después
purificar las correspondientes enzimas e intentar clonar sus genes así como elucidar los
diversos aspectos de la regulación de biosíntesis de los iridoides tanto a nivel celular como
molecular y determinar su función en las plantas que los producen.

10
Figura 4. Metabolismo primario, metabolismo secundario, compartamentalización y sitio
de biosíntesis de los iriodoides. IPP: isopentenil pirofosfato; DMAPP: dimetilalil difosfato;
GPP: geranil difosfato; HMG-CoA: 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA-sintasa.

En la figura 5 se resumen los tres trabajos relacionados con la elucidación de la ruta de


biosíntesis del antirrhinósido en la especie Antirrhinum majus la cuál pertenece a la familia
Scrophulariaceae.

Breinholt et al. (1992) marcaron con deuterio el 8-epi-iridodial glucósido, 8-epi-iridotrial


glucósido y sus correspondientes aglicanos, y observaron que estos compuestos se
incorporaron en el antirrhinósido de A. majus. La mayor incorporación fue del 8-epi-
iridotrial sugiriendo que este es un intermediario en la biosíntesis del antirrhinósido.
Posteriormente marcaron con deuterio el ácido 8-epi-deoxilogánico, el ácido
deoxigeniposídico y el 6,10-dideoxiaucubina, y resultó que estos compuestos fueron
incorporados por A. majus para la biosíntesis del antirrhinósido. Al marcar solamente el 8-
epi-deoxilogánico con deuterio se observó que éste compuesto se hidroxiló en la posición 8
para formar el ácido mussaenosídico (Damtoft et al., 1993). Posteriormente Damtoft et al.
(1995) demostraron que en las últimas etapas de la biosíntesis del antirrhinósido de A.
majus está implicada una hidroxilación en la posición 6 de dideoxiaucubina para formar el
linárido (10-deoxiaucubina), seguida por una epoxidación para dar el 10-deoxicatalpol (5-
deoxiantirrhinósido) y finalmente la hidroxilación en la posición 5 para obtener el
antirrhinósido.

11
Figura 5. Biosíntesis del antirrhinósido. 9 Geraniol; 10 10-Oxocitral; 11 8-epi-iridodial; 12-
13 8-epi-iridotrial; 14 Ácido 8-epi-deoxilogánico; 15 Ácido mussaenosídico; 16 Ácido
deoxigeniposídico; 17 6,10-dideoxiaucubina; 18 Linárido; 19 10-deoxicatalpol; 20
Antirrhinósido.

12
1.3.3 Actividad antitumoral y quimiopreventiva de los iridoides

La aucubina inhibe la enzima citocromo P450 (Bartholomaeus y Ahokas, 1995) lo que


induce la apoptosis (muerte celular programada) en células cancerígenas. También induce
la degradación e inhibe la fosforilación de algunas moléculas señal, relacionadas con la
formación de tumores, lo que provoca que factores de transcripción (NF-kB) no se activen
para translocarse al núcleo (Jeong et al., 2002) teniendo como resultado final, la inhibición
de la producción de factores de necrosis tumoral (TNF-α) e interleucinas (IL-6) (Jeong et
al., 2002). Por otro lado, la aglicona de la aucubina posee actividad antitumoral ya que
inhibe la ADN polimerasa y la ARN polimerasa en células de hepatoma humano Hep G2
(Lee et al., 2001).

El genipósido inhibe la tumorigénesis al favorecer la acción de las enzimas como la


glutation-S-transferasa (GST) y glutamil-cistein sintetasa, enzimas que detoxifican los
carcinógenos (Wang et al., 1991) y también inhibe las enzimas citocromo P450 y
monooxigenasas microsomales que inducen la apoptosis (Kang et al., 1997). Además,
muestra una actividad antioxidante, al disminuir la peroxidación lipídica. También posee
una actividad antimutagénica (Nakamura et al., 1997), al proteger al ADN de la formación
de aductos con carcinógenos, como la aflatoxina B1 (Wang et al., 1991). El genipósido
inhibe enzimas involucradas en procesos oxidativos y tumorales, cómo la mieloperoxidasa
o la ornitin descarboxilasa (Lee et al., 1995). En ensayos in vivo, el genipósido inhibe el
crecimiento de tumores y potencia los efectos de la radioterapia, incrementando el nivel de
leucocitos y la respuesta blastogénica de las células del bazo. Ello hace posible considerar
que el genipósido podría ser un compuesto coadyuvante para estimular la respuesta
inmunitaria y reducir algunos de los efectos secundarios de la quimioterapia (Hsu et al.,
1997).

El genipósido penta-acetilado, un derivado sintético del genipósido obtenido por


acetilación, tiene actividad quimiopreventiva, ya que evita el ataque de carcinógenos (Ueda
e Iwashashi, 1991; Tseng et al., 1992; Lin et al., 2000). También tiene actividad
antitumoral, ya que inhibe la síntesis de ADN y ARN, lo cual provoca la disminución de la

13
velocidad de crecimiento de la línea celular de glioma C6 tanto in vitro como in vivo (Wang
et al., 1992; 1993). También induce la apoptosis activando señales proapoptóticas como p-
53 y c-myc e inhibiendo el Bcl-2 (Chang et al., 2002).

La genipina, aglicona del genipósido, mostró una mayor actividad quimiopreventiva como
inhibidor de la inducción de la formación de antígenos de EBV por TPA que el genipósido.
(Ueda y Iwashashi, 1991). Este compuesto tiene actividad antitumoral, ya que es
genotóxico y mutagénico (Ozaki et al., 2002).

El ácido geniposídico muestra una mayor actividad quimiopreventiva (Nakamura et al.,


1997) como antimutagénico y menor actividad antitumoral (Hsu et al., 1997) en
comparación con el genipósido.

Sobre la actividad biológica en especies del género Castilleja, solo se ha reportado que los
extractos de diferentes partes de C. linariaefolia presentaron actividad in vivo contra
carcinomas en ratas; en particular, el extracto de las flores. De esta parte de la planta se
aislaron los glicósidos: acteósidos e isoacteósidos, los cuales presentaron actividad
citotóxica (Pettit et al., 1990). Algunos iridoides de especies de la familia Scrophulariaceae
han mostrado actividad antitumoral e inmunoestimulante (Tabla 2).

Tabla 2. Ensayos realizados que prueban la actividad antitumoral, quimiopreventiva e


inmunoestimulante de los iridoides de especies de la familia Scrophulariaceae.

Especie Iridoides Actividad ensayada Referencia


Antitumoral:

-Inhibición de las topoisomerasas I y II. Rajeshkumar y Kuttan, 2001


Picrorhiza
Pricoliv -Reduce la síntesis de la proteín cinasa C Gaddipati et al., 1999
kurroa
(PKC).

-Inhibe selectivamente a tirosina cinasa


(TK).

14
Tabla 2 (Continuación). Ensayos realizados que prueban la actividad antitumoral,
quimiopreventiva e inmunoestimulante de los iridoides de especies de la familia
Scrophulariaceae.

Especie Iridoides Actividad ensayada Referencia


Inmunoestimulante: Sinha et al., 1998

-Incrementa la respuesta linfocitaria


frente a Mycobacteria.

Quimiopreventiva:

-Disminuye la expresión del Factor de Gaddipati et al., 1999


Crecimiento Endotelial Vascular
(VEGF) y del Factor Inducible por la
Hipoxia-1 (HIF-1).
Picrorhiza
Pricoliv
kurroa
-Induce la enzima glutation sintetasa Rastogi et al., 1995
(GSH).

-Inhibe la hepatocarcinogénesis Jose et al., 1999


inducida por N-nitrosodietilamina en Rajeshkumar y Kuttan,
ratas. 1999; 2000

-Inhibe la peroxidación lipídica. Chander et al., 1992; 1994

-Inhibe el crecimiento de tumores Rajeshkumar y Kuttan, 2000


transplantados en ratón.
Antitumoral:

Penstemina -Antriproliferativa en linfocitos de bazo


de ratón y hepatoma de hamster Wysokinska y Skrzypek,
Penstemon Penstemonósido 1992
Serrulatolósido mediante la inhibición de síntesis de
serrulatus
ADN.

Penstemonósido -Citostática para la línea celular de Jolad et al., 1976


leucemia linfocítica (P-388).

1.4 Cultivo de células y tejidos vegetales

1.4.1 Generalidades

Las plantas son fuente de diversas sustancias de interés para el hombre, en las que se
incluyen compuestos llamados metabolitos secundarios que son utilizados en la industria
como colorantes, saborizantes, fragancias y fármacos, entre otros. De manera general, en
las plantas, la acumulación de estos compuestos ocurre sólo en ciertas épocas del año y en

15
algunos órganos, lo que puede limitar su abastecimiento. Por ello, el cultivo de células y
tejidos vegetales (CCTV) ha sido considerado como una alternativa biotecnológica para la
producción de metabolitos secundarios (Verpoorte et. al., 2002). Después del desarrollo
comercial para la producción de la chiconina con cultivos de células de Lithospermum
erytrorhizon, varios son los trabajos sobre el establecimiento de cultivos de células y
tejidos vegetales y la identificación de compuestos con potencial para su producción
industrial (Zhao et al., 2005).

El CCTV es un conjunto de técnicas que presenta en común el hecho de que un explante


(semilla, órgano, tejido o célula viva) se inocula asépticamente en un medio artificial de
composición química definida y se incuba en condiciones controladas. Lo anterior se basa
en el principio de totipotencia celular, el cuál establece que a partir de una célula vegetal, es
posible regenerar un individuo fértil con las mismas características del individuo original,
manteniendo su información genética para realizar todas las funciones de una planta
completa (Kieran et al., 1997). Inicialmente las técnicas de cultivo de células y tejidos
vegetales fueron concebidas y empleadas como herramienta de investigación básica, para
estudiar la bioquímica y fisiología vegetal. Sin embargo, estas técnicas evolucionaron a
tecnologías comerciales para la micropropagación, el mejoramiento genético de especies y
la producción de metabolitos secundarios de interés industrial (Rodríguez-Monroy et al.,
1999).

El CCTV ofrece varias ventajas sobre la recolección de plantas silvestres y el desarrollo de


cultivos en campo, entre las cuales se pueden mencionar: 1) La independencia de las
condiciones ambientales; 2) Establecer condiciones para la obtención de productos
homogéneos; 3) Establecer un sistema de producción definido, en el lugar donde se
requiere del producto; 4) Obtención de productos en menor tiempo (Doran, 1999; Sajc et
al., 2000).

Para establecer un cultivo vegetal in vitro, se parte de la selección de la planta de interés y


de la colecta de material biológico (ejemplares completos y semillas). La elección del
explante apropiado para el establecimiento de cultivos de células y tejidos vegetales está

16
basada en el objetivo del cultivo. Si lo que se quiere es obtener plántulas asépticas (libres
de virus), el explante ideal es el meristemo (dependiendo de la especie de 0.2 – 0.5 mm de
longitud) o la germinación de semillas en condiciones asépticas. Para inducir respuesta de
callogénesis y/o morfogénesis, las células meristemáticas de los tejidos obtenidas de
plántulas en condiciones asépticas, se hacen crecer de forma desdiferenciada (masa amorfa
denominada callo) o diferenciada (organogénesis o embriogénesis), mediante la aplicación
de reguladores de crecimiento vegetal (CIAT, 1991).

1.4.2 Reguladores de crecimiento vegetal

Los reguladores de crecimiento vegetal (RCV) son sustancias orgánicas que a bajas
concentraciones influyen en los procesos fisiológicos de las plantas (Tabla 3)
(Frankenberger y Arshadm, 1995).

Tabla 3. Función de los reguladores de crecimiento vegetal en los cultivos de células y


tejidos vegetales.

RCV Compuesto Respuesta


Ácido 3-indolacético Formación de raíces adventicias
Ácido 3-indolbutírico Inducción de embriones somáticos
Auxinas
Ácido α-naftalenacético Formación y crecimiento de callos
Ácido 2,4-diclorofenoxiacético Inhibición de la elongación de raíces

6-bencilaminopurina Formación de brotes adventicios


Citocininas Cinetina Inhibición de la elongación de brotes
Zeatina Inhibición de la senesencia de las hojas

Estimulación de la elongación de hojas


Giberelinas Ácido giberélico
Rompimiento de la dormancia de semillas y brotes
Estimulación de la maduración de embriones
Ácido abscísico Ácido abscísico Promoción de la abscisión de hojas
Inducción de la dormancia de semillas, brotes y bulbos

Los RCV cuando son producidos por las plantas (endógena) se les denominan
fitohormonas, las cuales actúan como mensajeros químicos que regulan el crecimiento y

17
desarrollo de la planta. También regulan las respuestas a las señales ambientales (Morgan,
1990). El término regulador de crecimiento vegetal se refiere a un compuesto sintético o
natural que se aplica (exógena) para alterar el crecimiento y desarrollo de las plantas o
cultivos de células y tejidos vegetales. El término fitohormona y regulador de crecimiento
vegetal se utiliza alternativamente, particularmente cuando se refiere a auxinas, citocininas,
giberelinas y ácido abscísico (Frankenberger y Arshadm, 1995).

1.4.3 Cultivos de células desdiferenciados y diferenciados

Los cultivos de células desdiferenciados (callos y cultivos en suspensión) y los cultivos


diferenciados (cultivos de brotes y raíces), son utilizados con el objetivo de implementar
sistemas biológicos vegetales como un sistema alternativo a otros sistemas biológicos
(bacterias, levaduras o células animales) para la producción de moléculas de interés
industrial. La elucidación de las rutas biosintéticas de varios metabolitos secundarios y la
tecnología del ADN recombinante abren posibilidades para desarrollar sistemas biológicos
vegetales masivos de producción de metabolitos secundarios bioactivos (Bourgaud et al.,
2001; Verpoorte et. al., 2002).

Las suspensiones celulares están constituidas por células meristemáticas, las cuales son
inducidas a crecer de forma desdiferenciada en un medio de cultivo líquido en agitación
constante, lo que permite su disgregación, su proliferación y su continúo crecimiento. Los
cultivos en suspensión permiten estudiar los mecanismos bioquímicos que regulan la
permeabilización y la biosíntesis del metabolito secundario de interés; esto con la finalidad
de redireccionar el metabolismo secundario, mediante agentes permeabilizantes y el
incremento de la producción del metabolito de interés, mediante la modificación genética y
los inductores bióticos y abióticos (Bourgaud et al., 2001). Para seleccionar una suspensión
celular se necesitan caracterizar las cinéticas de crecimiento y la producción de metabolitos
secundarios de las diferentes líneas celulares. Idealmente se prefieren líneas celulares con
productividades altas del metabolito secundario de interés y que además sea un producto
extracelular y que esté asociado a su crecimiento.

18
En muchas ocasiones, los cultivos en suspensión no producen los compuestos de interés,
debido principalmente a que los metabolitos secundarios son producidos por células
especializadas y/o en distintas etapas del desarrollo de la planta (Balandrin et al., 1985). En
estos casos, el cultivo de órganos es una alternativa (Subroto et al., 1996; Mahagamasekera
y Doran, 1998).

El cultivo de raíces representa un sistema biológico para la producción de metabolitos


secundarios, debido a que: a) Su crecimiento puede ser tan rápido o incluso llega a ser más
rápido que los cultivos en suspensión (Charlwood y Charlwood, 1991; Flores et al., 1999),
b) El medio de cultivo no requiere RCV, c) Su capacidad biosintética para producir
metabolitos secundarios es similar a la planta madre aún cuando se acumulan en la parte
aérea, d) La producción de metabolitos secundarios está asociada a su crecimiento y
presentan estabilidad genética (Banerjee et al., 1998; Kittipongpatana et al., 1998; Kim et
al., 2002).

El cultivo de brotes es otra alternativa para la producción de metabolitos secundarios y al


igual que el cultivo de raíces, la producción de metabolitos secundarios está asociado a su
crecimiento y presentan estabilidad genética (Bourgaud et al., 2001).

Para obtener un cultivo de raíces y brotes, se inicia con la optimización el medio de cultivo
que permita la organogénesis vía indirecta o indirecta, la proliferación de biomasa y la
producción de metabolitos secundarios. Las raíces y los brotes se transfieren a medios
líquidos en agitación constante para continuar su crecimiento. Para seleccionar líneas de
raíces ó brotes, se caracterizan sus cinéticas de crecimiento y producción de metabolitos
secundarios. Al igual que en los cultivos en suspensión idealmente se prefieren líneas de
raíces o brotes con productividades altas del metabolito de interés y que además sea un
producto un producto extracelular y esté asociado a su crecimiento (Bourgaud et al., 2001).

No existen reportes de cultivos in vitro de C. tenuiflora, sin embargo la información


presentada en la tabla 4, indica que sea factible su implementación.

19
Tabla 4. Cultivos in vitro de especies de la familia Scrophulariaceae.

RCV
Especie Explante Medio Resultados Referencia
(µM)

Antirrhinum majus Entrenudos con tallo Poirier-Hamon et al. (1974) 2,4-D (2.2 – 9.0) Embriogénesis Poirier-Hamon et al., 1974

A. majus Brotes Murashige & Skoog (1962) BAP (4.4) Brotes Atkinson et al., 1989

A. majus Brotes Murashige & Skoog (1962) BAP (4.4) Callo Atkinson et al., 1989

Scrophularia yoshimure Entrenudos con tallo Murashige & Skoog (1962) BA (4.44) + ANA (1.07) Brotes Hsin-Sheng et al., 2001

S. yoshimure Tallo con nudos Murashige & Skoog (1962) BA (4.4 4) + ANA (1.07) Brotes Hsin-Sheng et al., 2001

S. yoshimure Brotes Murashige & Skoog (1962) BA (4.44) + ANA (1.07) Brotes Hsin-Sheng et al., 2001

S. yoshimure Hoja Murashige & Skoog (1962) BA (4.44) + ANA (1.07) Brotes Hsin-Sheng et al., 2001

20
2. JUSTIFICACIÓN

Castilleja tenuiflora es una planta mexicana usada tradicionalmente para tratar el cáncer
debido a las recomendaciones de la herbolaria, por lo que comúnmente se conoce como
“hierba del cáncer”. Es una especie demandada en el mercado y para su comercialización se
recolecta de manera no sostenible. En los extractos butanólicos de la parte aérea de esta
especie, se identificaron los iridoides glicosilados: bartsiósido, aucubina, metil éster del
ácido geniposídico, metil éster del ácido mussaenosídico y metil éster de shanzhisida.
Estudios demuestran que algunos de estos iridoides tienen actividad antitumoral,
quimiopreventiva e inmunoestimulante. En el interés de contar con sistemas
biotecnológicos para la eventual producción de los compuestos bio-activos, es necesario
establecer el cultivo in vitro de C. tenuiflora y analizar su composición de iridoides.

21
3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo general

Establecer el cultivo in vitro de C. tenuiflora y comparar su perfil de iridoides con la planta


silvestre.

3.2 Objetivos específicos

Obtener material vegetal de C. tenuiflora.

Inducir callogénesis y organogénesis mediante la manipulación de los reguladores de


crecimiento vegetal.

Obtener y comparar el perfil de iridoides de la planta silvestre con cultivos in vitro de


raíces, brotes y plántulas.

22
4. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1 Obtención de material silvestre de C. tenuiflora

Para obtener material silvestre de C. tenuiflora se utilizaron dos estrategias. La primera


consistió en revisar 175 ejemplares de C. tenuiflora depositados en el herbario MEXU-
UNAM en México con fecha de colecta entre 1990-2006. Los datos que se obtuvieron
fueron los siguientes:

a) Número de ejemplares colectados por estado.


b) Número de ejemplares colectados y fecha de colecta.

La segunda estrategia consistó en entrevistarse con colectores y vendedores de plantas


medicinales de los mercados de Sonora (D. F.), Ozumba (Edo. México) y Yautepec
(Morelos).

Se ubicó una población de C. tenuiflora en el km 37 Carr. Xochimilco-Oaxtepec,


Juchitepec, Edo. de México, el cuál fue el sitio de colecta. Entre Julio-Noviembre del 2006,
se colectaron 25 frutos con semillas y 15 plantas silvestres de 50 cm de altura; los frutos y
semillas se almacenaron en bolsas de papel a 25 °C. Las plantas se extrajeron de su hábitat
con un cepellón de 30 cm de ancho y 50 cm de profundidad, con la finalidad de no dañar la
raíz. Las plantas se traspasaron a bolsas de polietileno negro calibre 400 con suelo del
hábitat del que fueron extraídas. Una vez transplantadas en las bolsas de polietileno, se
humedeció la tierra con agua y la parte aérea se envolvió con papel periódico. De algunos
de los ejemplares colectados, la parte aérea se separó de la raíz y ambas partes se
envolvieron en papel periódico. Para evitar el marchitamiento de las plantas se
transportaron a las 4:30 a.m. del sitio de colecta al CEPROBI e inmediatamente se
colocaron bajo fotoperiodo de 16 h luz (150-200 µmol/m2s) a 25±2 ºC.

23
4.2 Germinación de semillas

Se probaron 3 formas de germinación de las semillas de C. tenuiflora; para cada prueba, se


determinó el número de semillas germinadas cada 24 h durante 30 días.

4.2.1 Prueba in vitro

Las semillas se lavaron con detergente durante 5 min y se enjuagaron en 3 ocasiones con
agua desionizada estéril. Después de sumergieron en NaOCl 0.5% durante 5 min y
posteriormente en etanol 70% durante 1 min y se enjuagaron 3 veces con agua desionizada
estéril. Las semillas se sembraron en cajas Magenta con 30 mL de medio de cultivo
Murashige y Skoog (MS, Murashige y Skoog, 1962) (Sigma, M5519) complementado con
3% de sacarosa y 0.2% de fitagel. El pH del medio se ajustó a 5.8 antes de esterilizar. En
cada caja se sembraron 10 semillas; se sembraron 250 semillas en total. Las semillas se
incubaron bajo un fotoperiodo de 16 h luz (150-200 µmol/m2s) a 25±2 ºC.

4.2.2 Prueba en papel filtro

Se esterilizaron 6 cajas Drigalski con papel filtro Whatman (No. 2 de 12.5 cm de diámetro
y cuadriculado 1 cm x 1 cm). Los frutos de C. tenuiflora secos (cápsulas) se colocaron en
bolsas de organza previamente esterilizadas y se sumergieron en etanol al 70% por
diferente tiempo de inmersión (0, 30 y 60 s) por duplicado. Posteriormente, las cápsulas se
enjuagaron en agua desionizada estéril durante 30 s. Las cápsulas desinfestadas se abrieron
con pinzas esterilizadas y se esparcieron las semillas (aproximadamente 100) en las cajas
Drigalski con papel filtro. Las semillas se incubaron bajo un fotoperiodo de 16 h luz (150-
200 µmol/m2s) a 25±2 ºC.

4.2.3 Prueba en sustrato

Se utilizaron 2 charolas germinadoras con 200 cavidades cada una. Las cavidades se
rellenaron con una mezcla de tepojal-turba estéril en una proporción 1:1. Las semillas se

24
separaron según su color (amarillo y café). En cada cavidad se colocaron 5 semillas. Una
charola germinadora correspondió a semillas amarillas y la otra a semillas cafés. Las
charolas se taparon con un domo de plástico transparente y se colocaron en una cámara de
cultivo bajo un fotoperiodo de 16 h luz (150-200 µmol/m2s) a 25±2 ºC. Diariamente se
rociaron las charolas con agua desionizada para mantener húmedo el sustrato, evitando
maltratar las plántulas.

4.3 Desinfestación de hojas de plantas silvestres

Antes de inocular en un medio cultivo, las hojas sin separar de los internodos se lavaron
con detergente comercial “Roma” durante 5 min y en 3 ocasiones con agua desionizada.
Después se sumergieron en una mezcla de NaOCl 1% y Tween 80 al 0.01% durante 5 min
y se lavaron 3 veces con agua desionizada estéril. Las hojas de aproximadamente 0.8 cm de
largo fueron sumergidas en etanol 70% y benomilo 1 g/L durante 30 s, respectivamente.

4.4 Inducción de cultivos in vitro

Para inducir callogénesis y organogénesis se utilizaron las auxinas: ácido 2,4-


diclorofenoxiacético (2,4-D) y ácido α-naftalenacético (ANA) y las citocininas: cinetina
(KIN) y 6-bencilaminopurina (BAP), en una concentración de 10 µM; la combinación de
los reguladores de crecimiento vegetal se hizo con un diseño experimental, en el que se
incluyeron experimentos sin regulador de crecimiento vegetal o con sólo uno de ellos
(Tabla 5). El pH de los medios se ajustó a 5.8 antes de esterilizar. En cada frasco de un
volumen nominal de 60 mL (Gerber), se agregó 30 mL de medio de cultivo y en cada uno
de ellos se colocaron 5 explantes de hoja (aproximadamente 0.4 × 0.8 cm). Se sembraron 5
frascos por cada combinación (n = 25 explantes).

25
Tabla 5. Combinación de auxinas y citocininas usadas para inducir callogénesis y
organogénesis.

a
Cada número representa un experimento que consiste en 5 frascos Gerber con 30 mL de
medio de cultivo y 5 explantes de hoja; n = 25 explantes.

Se hicieron observaciones cada 24 h y se registró el número de explantes que formaron


callo, raíz, brote y número de explantes sin respuesta. El porcentaje de inducción se
determinó con la siguiente ecuación:

Número de explantes que formaron callo/raíz /brote


% Inducción = x 100 (1)
Número total de explantes

4.5 Establecimiento y mantenimiento del cultivo in vitro de raíces

Las raíces formadas a partir de los experimentos descritos en la sección 4.4, se transfirieron
a frascos de boca ancha de 6 cm de diámetro y con volumen nominal de 200 mL, cubiertos
con tapa de rosca de plástico, a los cuales se le adicionaron 30 mL de medio MS líquido sin
reguladores de crecimiento vegetal y 3% de sacarosa. El pH del medio se ajustó a 5.8 antes
de esterilizar. Las raíces se cultivaron en agitación orbital de 100 r.p.m., iluminación
continua (150-200 µmol/m2s) y a 25±2 ºC. Se subcultivaron cada 20 días, en medio de

26
cultivo fresco, transfiriendo aproximadamente ¼ de la biomasa total de cada frasco en
medio de cultivo fresco.

4.6 Cultivo de brotes y plántulas

Los brotes formados a partir de los experimentos descritos en la sección 4.5, se


transfirieron a frascos de boca ancha de 6 cm de diámetro y con volumen nominal de 200
mL, cubiertos con tapa de rosca de plástico, a los cuales se les adicionaron 30 mL de medio
MS líquido sin reguladores de crecimiento vegetal y 3% de sacarosa. El pH del medio se
ajustó a 5.8 antes de esterilizar. Los brotes fueron cultivados en agitación orbital de 100
r.p.m., iluminación continua (150-200 µmol/m2s) y a 25±2 ºC. Se subcultivaron cada 20
días en medio de cultivo fresco.

Los brotes se segmentaron y cada segmento de aproximadamente 1.5 cm, se inoculó en


medio MS, con 3% de sacarosa, 0.2% de fitagel y sin reguladores de crecimiento vegetal.
El pH del medio se ajustó a 5.8 antes de esterilizar. Se cultivaron bajo fotoperiodo de 16 h
luz (150-200 µmol/m2s) y 25±2 ºC.

Las plántulas formadas a partir de los brotes, se resembraron cada 20 días en medio MS,
con 3% de sacarosa, 0.2% de fitagel y sin RCV. El pH del medio se ajustó a 5.8 antes de
esterilizar. Las plántulas estuvieron bajo fotoperiodo de 16 h luz (150-200 µmol/m2s) y a
25±2 ºC.

4.7 Cinética de crecimiento, pH y consumo de azúcares del cultivo in vitro de raíces

4.7.1 Condiciones experimentales

El comportamiento del crecimiento (base húmeda y seca), pH y consumo de azúcares del


cultivo in vitro de raíces de C. tenuiflora fue evaluado para un cultivo de 6 meses de
haberse iniciado. Se inoculó 1 g de raíces (base húmeda) en frascos de un volumen nominal
de 60 mL (Gerber) con 10 mL de medio de cultivo MS líquido con 3% de sacarosa y sin

27
RCV. La edad del inóculo fue de 15 días. Las raíces se cultivaron bajo las condiciones
descritas previamente (ver sección 4.5). Se analizaron cinco frascos cada 3-4 días, durante
31 días.

4.7.2 Determinación gravimétrica del crecimiento

La concentración de raíces en base húmeda (g/L), se determinó colectando la totalidad de


las raíces de cada frasco sobre un papel filtro Whatman (No. 1) de peso conocido; por
diferencia de peso se obtuvo la biomasa húmeda. Para determinar la biomasa seca (g/L), las
raíces colectadas sobre el papel filtro de peso conocido, se colocaron en una estufa al vacío
a una temperatura de 70 ºC, hasta alcanzar peso constante y por diferencia de pesos se
obtuvo la biomasa seca. Los resultados se reportaron en g/L.

4.7.3 Determinación del pH

Se midió el pH del medio de cultivo con un potenciómetro (JENCO, 1671).

4.7.4 Determinación de azúcares totales

El contenido de azúcares totales se midió en el medio con el método de fenol sulfúrico


propuesto por Dubois et al. (1956), que a continuación se describe. A partir de las muestras
de 1 mL de medio de cultivo filtrado, se realizaron diluciones 1:100. Se tomó 100 µL de la
dilución 1:100 de cada muestra y se colocaron en tubos de ensaye de 20 mL, se añadió 1
mL de fenol al 5% a cada tubo y después se agregaron 5 mL de H2SO4 concentrado.
Posteriormente se agitaron los tubos con un vortex. El control consistió en una muestra de
100 µL de agua destilada. Se leyó la absorbancia de las muestras a λ=490 nm en un
espectrofotómetro (Shimadzu UV-160). Se ajustó a cero con la mezcla de reacción que
contenía 100 µL de agua destilada. La curva patrón se realizó con sacarosa en un intervalo
de 0-200 µg/L. El contenido de azúcares totales de las muestras se calculó con la ecuación
2 y se reportó en g/L.

28
Abs 490 nm = 0.0087 [Azúcares totales] + 0.0161 (2)

4.7.5 Cálculo de parámetros cinéticos

El índice de crecimiento (Ic) se calculó según la ecuación 3.

X - Xo
Ic = (3)
Xo
Donde:
Xo: Biomasa inicial
X: Biomasa en un tiempo determinado

La velocidad de crecimiento (Vc), se calculó a partir de la pendiente de la línea recta


obtenida por una gráfica biomasa vs tiempo.

y = b + m⋅x

X = Xo + Vc ⋅ t (4)

El tiempo de duplicación (td) es un valor cinético, que indica el tiempo en que el cultivo
tarda en duplicar la biomasa correspondiente al inóculo. Se entiende inóculo a la cantidad
de biomasa con la que se inicia el cultivo es decir 2Xo.

La ecuación 5 describe el crecimiento de raíces linealmente y con base en la definición de


tiempo de duplicación, obtuvimos su valor de la siguiente manera:

2Xo = Xo + Vc ⋅ td

2Xo – Xo = Vc ⋅ td

Xo
td = (5)
Vc

29
El rendimiento de biomasa con base a sustrato (Yx/s), se calculó de acuerdo a la ecuación
6.

X - Xo
Yx/s = (6)
So - S
Donde:
So: Concentración de fuente de carbono inicial
S: Concentración de fuente de carbono en un tiempo determinado

4.8 Aislamiento de los iridoides

4.8.1 Preparación de extractos de parte aérea y raíz

El material vegetal (parte aérea y raíz) de C. tenuiflora fué secado bajo condiciones de
oscuridad a temperatura ambiente. El material vegetal seco fue molido por separado y
almacenado en bolsas de papel a temperatura ambiente hasta su uso. Se realizó una
extracción exhaustiva de ambas partes de la planta. Se maceraron 1800 g de parte aérea en
n-hexano, acetato de etilo y metanol durante 24 h para cada disolvente. Mientras que para
obtener el extracto de la raíz, se partió de 669.1 g que se maceró únicamente en metanol
durante 24 h. En todos los casos, los extractos se concentraron con un evaporador rotatorio
(Büchi®, R-114) a presión reducida, a una temperatura de 50-60 °C y los residuos obtenidos
se almacenaron en frascos color ámbar a 8±2 ºC.

4.8.2 Fraccionamiento de los extractos

El fraccionamiento de los extractos se llevó a cabo en una columna de vidrio de 40 cm de


altura y 4 cm de diámetro empacada con 180 g de sílica (0.063-0.200 mm) y utilizando
mezclas de n-hexano, acetato de etilo y metanol como eluyentes. Por cada 30 g de sílica se
colocó 1 g de extracto. Se utilizaron 6 g del extracto de acetato de etilo de la parte aérea. La
mezcla de los disolventes se realizó bajo un gradiente de polaridad (ascendente; menor
polaridad a mayor polaridad, Tabla 6). Se colectaron fracciones de 250 mL c/u, las cuales

30
se concentraron con un evaporador rotatorio (Büchi®, R-114) a presión reducida, a una
temperatura de 50-60 °C y se almacenaron en frascos color ámbar a 8±2 ºC hasta su
análisis.

Posteriormente, las fracciones se analizaron por cromatografía en capa fina y considerando


la similitud en los perfiles químicos, se agruparon.

Tabla 6. Mezcla de disolventes por gradiente de polaridad ascendente.

4.8.3 Preparación de los extractos de los cultivos in vitro

Las muestras de biomasa de raíces de la cinética, brotes (20 días) y plántulas (20 días) in
vitro fueron congeladas a -18±2 ºC y posteriormente se liofilizaron (Heto drywinner®,
modelo DW3). Se almacenaron en viales de plástico a -18±2 ºC, hasta su análisis por
HPLC. Los liofilizados (6 g) fueron macerados en metanol, en una relación 2:1 (p/v)
durante 24 horas. Los extractos se concentraron y almacenaron de acuerdo a lo descrito
previamente (ver sección 4.8.1). En el caso del cultivo in vitro de raíces, también se analizó
el sobrenadante filtrado previamente y congelado a -18±2 ºC.

4.8.4 Cromatografía en capa fina

Se utilizaron placas de sílica gel (cromatofolios Merck® de aluminio y sílica gel 60 F254
1.05554.0001), usando como disolvente mezclas de n-hexano:acetato de etilo (85:15) y
cloroformo:metanol (95:5; 90:10; 85:15). El revelado se realizó con el reactivo para
iridoides que consistió en una mezcla de ácido clorhídrico:ácido acético (80:20) (Wagner y
Bladt, 1996). Después de haber aplicado el revelador, las placas se colocaron en una

31
parrilla a 90 ºC durante 5 s. La coloración azul y café indicaba la presencia de iridoides. Se
usó como estándar de referencia a la aucubina (Sigma, MFCD00136026).

Se calculó el factor de retención (Rf) con la siguiente ecuación:

Distancia recorrida por el soluto


Rf = (7)
Distancia recorrida por el frente disolvente

4.8.5 Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)

Se utilizó un cromatógrafo de líquidos de alta resolución (Waters®, Delta Prep. 4000)


provisto con un detector de índice de refracción y una columna de fase reversa Lichrospher
RP-18 de 25 cm, 5 µM. Se utilizó acetonitrilo:agua como eluyente isocrático en una
proporción 15:85 respectivamente y un flujo de 1 mL/min, con un tiempo de elusión de 15
min. Las muestras filtradas fueron inyectadas (50 µL, 3 mg de extracto aforado a 1 mL de
metanol). El análisis de los cromatogramas se realizó considerando el tiempo de retención
(tR) y los espectros de absorción de los picos que eluyeron. Se utilizó la aucubina como
estándar de referencia (Figura 6).

Figura 6. Espectro de absorción de la aucubina; tR = 2.1 min, λmax = 195-205 nm.

32
4.9 Elucidación estructural mediante Resonancia Magnética Nuclear (RMN)

El espectro de RMN13C de la muestra problema se obtuvo a 400 MHz, utilizando


cloroformo deuterado (CDCl3) y como referencia interna tetrametilsilano, usando un
espectrómetro de RMN multinuclear (Varian®, Inova). El análisis de los espectros se
realizó comparando los desplazamientos químicos (δ) de RMN13C mediante el software
ACD/CNMR PREDICTOR Pv.5.10 de la muestra problema y de los iridoides reportados
por Jiménez et al. (1995).

33
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1 Obtención de material silvestre de C. tenuiflora

Con el objetivo de localizar poblaciones de C. tenuiflora cercanas al Centro de Desarrollo


de Productos Bióticos y disponibles todo el año, se utilizaron dos estrategias. La primera
consistió en revisar la colección de ejemplares de C. tenuiflora del herbario MEXU-
UNAM. Se revisaron 175 ejemplares de C. tenuiflora depositados en el herbario con fecha
de colecta entre 1990 y 2006. Esta revisión muestra que C. tenuiflora se distribuye en toda
la República Mexicana, excepto en sus penínsulas (Figura 7), lo que posibilita hallarla en
los estados de Puebla, Tlaxcala, Hidalgo, Guerrero, D.F. y Edo. de México, los cuales son
estados cercanos a Morelos. También la revisión de herbario muestra que C. tenuiflora es
una especie que se puede recolectar en cualquier mes del año (Figura 8).

Figura 7. Distribución de C. tenuiflora en México.

34
Figura 8. Frecuencia de colecta de C. tenuiflora en los distintos meses del año en México
de 1990 a 2006 (Datos obtenidos a partir de la revisión del herbario MEXU-UNAM).

La segunda estrategia consistió en entrevistas con colectores y vendedores de plantas


medicinales de los mercados de Sonora (D.F.), Ozumba (Edo. de México) y Yautepec
(Morelos). La información recabada con los informantes mostró que la planta
comercializada en estos tres mercados, se colecta en el Edo. de México durante todo el año
y que se usa para el tratamiento de tumores. Este dato coincide con la información recabada
con la revisión del herbario, ya que es uno de los estados donde se colectó C. tenuiflora
durante 1990-2006. También los informantes señalaron que esta especie es comercializada
en forma fresca durante todo el año aunque la mayor colecta ocurre durante septiembre-
octubre, lo cual provoca que disminuya su precio de venta, esto coincide con los meses en
que se encuentra más disponible esta especie, de acuerdo a los datos de la revisión del
herbario (Figura 8). Durante junio, escasea la planta, situación que provoca que el precio de
esta especie aumente, lo cual también coincide con los datos obtenidos de la revisión del
herbario (Figura 8).

35
Con la información del herbario y el acercamiento con los informantes, se ubicó una
población de C. tenuiflora en el km 37 Carr. Xochimilco-Oaxtepec, Juchitepec, Edo. de
México. La especie colectada fue determinada como Castilleja tenuiflora Benth. por el M.
en C. Rolando Ramírez, curador del Herbario HUMO del Centro de Educación Ambiental e
Investigación Sierra de Huautla (CEAMISH) de la Universidad Autónoma del Estado de
Morelos (UAEM). En dicho herbario, se depositó un ejemplar (HUMO25208).

5.2 Germinación de semillas

Las plántulas in vitro, son la alternativa más apropiada para obtener explantes que sirvan
para inducir cultivos in vitro, ya que los riesgos de contaminación son menores en
comparación al uso de material silvestre; además, el material joven responde más rápido
que el material adulto (CIAT, 1991). Por lo que se sembraron semillas de C. tenuiflora en
condiciones in vitro. Sin embargo, las semillas no germinaron (Tabla 7) debido quizás a un
efecto negativo de la manipulación y/o los agentes desinfestantes.

Para discriminar que las semillas no fueran capaces de germinar, se probó la germinación
en papel filtro (Figura 9A). El 82% de las semillas, cuyas cápsulas no fueron desinfestadas
germinaron en 30 días, mientras que las semillas, provenientes de cápsulas desinfestadas
con etanol presentaron menor germinación (42% y 59%). Estos resultados indican que las
semillas de C. tenuiflora son capaces de germinar pero presentan “sensibilidad” a la
desinfestación con etanol.

Otra alternativa para obtener plántulas de C. tenuiflora, consistió en germinar semillas en


sustrato tepojal-turba. Para esto, las semillas de C. tenuiflora colectadas se clasificaron por
su color en dos tipos amarillas y cafés (Figura 9C). Los resultados mostraron que las
semillas cafés no germinaron mientras que las semillas amarillas presentaron 67% de
germinación (Tabla 7). Sin embargo, las plántulas obtenidas presentaron crecimiento lento;
ya que a los 30 días alcanzaron 1 cm de alto y a los 45 días 1.5 cm (Figura 9D). Es posible
que la coloración de las semillas esté asociada con la integridad del embrión y por lo tanto
la coloración café de las semillas de C. tenuiflora podría ser un indicativo de que no son

36
viables. Debido a la nula germinación in vitro y al lento desarrollo de las plántulas
obtenidas por la germinación de semillas en sustrato, se decidió utilizar plantas silvestres
como fuente de explantes.

Tabla 7. Germinación de semillas de C. tenuiflora en diferentes condiciones.

% Germinación promedio
Prueba Número de semillas
(30 días)

In vitro 200 0

Papel filtro
Cápsulas 200 82
Sin tratamiento

Cápsulas 200 42
Sumergidas en etanol (30 s)

Cápsulas 200 59
Sumergidas en etanol (60 s)
Sustrato
Semillas amarillas 2000 67

Semillas cafés 1000 0

37
Figura 9. A Semillas de C. tenuiflora germinadas en caja Drigalski; B Fruto de C.
tenuiflora (Cápsula); C Semillas amarillas y cafés; D Plántulas obtenidas a partir de
semillas germinadas en tepojal-turba.

5.3 Inducción de callogénesis y organogénesis

En los cultivos in vitro se ha generalizado el uso de las auxinas para la formación de raíces
en tejidos no diferenciados, las citocininas para la formación de brotes adventicios y la
combinación de auxinas y citocininas en una misma concentración para la formación y
proliferación de callos (Rayen et al., 1999). Sin embargo, los tejidos de las distintas
especies vegetales presentan diferencias en su capacidad de respuesta por la edad, la etapa
fenológica, el tipo de explante, así como por la cantidad de hormonas endógenas y
proteínas receptoras. Por lo que es necesario realizar estudios que conlleven a conocer el
tipo y la dosis de RCV para la inducción callos, brotes y raíces para cada tipo de especie.

Con el método de desinfestación utilizado en el presente trabajo, se obtuvo un 85% de


explantes de hoja libre de contaminación. Inicialmente, se contempló también el uso de

38
entrenudos como explantes, sin embargo la contaminación de este material fue del 100%,
por lo que se descartaron.

Los primeros cambios en los explantes de hoja se observaron a partir de las dos semanas de
sembrarlos en los diferentes medios de cultivo. Estos consistieron en la formación de
callos, raíces y brotes, lo que dependió del tipo de auxina o citocinina, así como de su
combinación (Tabla 8). En el medio 2 (2,4-D) hubo formación de callos (Figura 10A) con
un 20% de inducción, sin embargo estas estructuras al ser resembradas en medio fresco no
crecieron. En los medios 6 y 9 (ANA en combinación con KIN o BAP) se formaron callos
con un 4% de inducción, éstos aparentemente presentaron crecimiento al resembrarse, sin
embargo se oxidaron (Figura 10B). En el medio 3 (ANA) se desarrollaron callos
rizogénicos (Figuras 10C-D). En los medios 1, 4 y 7 se formaron brotes con un 4% de
inducción (Figura 10E). En los medios 5 y 8, los explantes se necrosaron (Figura 10D).
Cabe señalar que los bajos porcentajes de inducción, para la formación de callos, raíces y
brotes, a partir de las hojas de plantas adultas de C. tenuiflora silvestre (Tabla 8), se
debieron quiza a la edad del explante y al efecto negativo de los agentes desinfestantes en
estos (necrosamiento).

Tabla 8. Tipo de respuesta y porcentaje de inducción de las hojas de plantas silvestres de C.


tenuiflora a los reguladores de crecimiento vegetal.

Auxina Citocinina
Experimento Tipo de respuesta % de inducción
(10 µM) (10 µM)
1 - - Brotes 4
2 2,4-D - Callos 20
3 ANA - Callos rizogénicos 4
4 - KIN Brotes 4
5 2,4-D KIN Necrosamiento -
6 ANA KIN Callos/Oxidación 4
7 - BAP Brotes 4
8 2,4-D BAP Necrosamiento -
9 ANA BAP Callos/Oxidación 4

39
Figura 10. Callogénesis y organogénesis a partir de hoja silvestre de C. tenuiflora. A Callo
formado con 10 µM de 2,4-D a las 2 semanas; B Callo oxidado con ANA y KIN; C-D
Callos rizogénicos formados con 10 µM de ANA a las 4 semanas; E Brote desarrollado con
10 µM de BAP; F Explante de hoja necrosado con 2,4-D en combinación con KIN o BAP.

40
En trabajos previos con especies de la familia Scrophulariaceae se ha observado el papel de
algunos RCV para inducir callos, raíces, brotes y plántulas. Para la micropropagación de
Scoparia montevidiensis se utilizó 0.25 mg/mL de BAP (Escandón et al., 2005). En otro
estudio con Mecardonia tenella utilizando como explantes los segmentos nodales, se
observó qué el incremento del valor de la relación de ANA/BAP indujo la formación de
callos rizogénicos, mientras que el decremento de dicha relación indujo la formación brotes
con raíces. Por otro lado, ANA y BAP en una misma proporción indujo la formación de
callos y el solo uso de BAP indujo la formación de brotes sin raíces (Escandón et al.,
2006). En Bacopa monniera se determinó el efecto de ANA sobre los brotes de esta especie
y se observó que estos reguladores inducen la formación de raíces en estas estructuras
(Singh et al., 2001). Estos resultados comparados con los obtenidos en este trabajo con C.
tenuiflora muestran que al parecer en las especies de la familia Scrophulariaceae la auxina
ANA induce la formación raíces mientras que la citocinina BAP induce la formación de
brotes.

5.4 Establecimiento del cultivo in vitro de raíces, brotes y plántulas

Con el objetivo de establecer un cultivo in vitro de C. tenuiflora, los bajos porcentajes de


inducción, la oxidación y el crecimiento nulo o lento de estas estructuras al ser
resembradas, fue una limitante. Para abatir dicha limitante se optó por hacer uso de las
raíces de los callos rizogénicos formadas a partir de explantes de hoja (Figura 11A), las
cuales se separaron y se transfirieron a medio MS líquido sin RCV y se cultivaron en
agitación. Estos segmentos se alargaron y desarrollaron raíces laterales, lo cual es
importante porque contribuyen a la absorción de agua y nutrientes, favoreciendo el
aumento de la biomasa (Figuras 11B-C). Inicialmente, se observó el oscurecimiento de
algunos segmentos de las raíces e incluso del medio de cultivo. Este oscurecimiento fue
más evidente en la zona más densa de raíces (centro del frasco), lo cuál pudo deberse a que
en esta zona la transferencia de oxígeno y/o nutrientes no es suficiente, y por ende dio
origen al necrosamiento de las raíces (Yang et al., 1997). Los segmentos y/o cultivos de
raíces necrosados fueron eliminados durante las resiembras. Las raíces fueron resembradas
en medio de cultivo fresco de manera periódica (20 días).

41
En un cultivo de 4 semanas de edad se observó la formación de brotes (Figura 11D), los
cuales se aislaron, transfirieron a medio de cultivo fresco sin RCV y mantuvieron en
agitación. Se observó la elongación y multiplicación de estas estructuras (Figura 11E); a los
30 días alcanzaron una altura de 7 cm, sin embargo se observó una “ligera” hiperhidricidad
ya que mostraban una apariencia vidriosa. Los brotes se resembraron en medio de cultivo
fresco de manera periódica (20 días) durante 8 meses, conservando su capacidad de
multiplicación.

Los segmentos de brotes, incluyendo hoja y entrenudo, se sembraron en medio MS


semisólido sin RCV, estas estructuras se alargaron y multiplicaron dando lugar a la
formación de plántulas (Figura 11F). En 20 días, las plántulas midieron 7 cm de alto y no
presentaron la sintomatología de plantas hiperhídricas. De manera similar a lo observado en
medio líquido, los brotes conservaron su capacidad de multiplicación y conversión a
plántulas durante 8 meses.

Estos resultados muestran que las hojas de plantas adultas de C. tenuiflora silvestre son
fuente de explantes para establecer cultivos in vitro de esta especie.

42
Figura 11. Cultivo in vitro de raíces, brotes y plántulas de C. tenuiflora. A Callo rizogénico;
B-C Raíces; D-E Brotes; F Plántulas.

43
5.5 Cinética de crecimiento, pH y consumo de azúcares del cultivo in vitro de raíces

El cultivo in vitro de órganos, como es el caso de raíces o brotes, es considerado una


alternativa al cultivo de células desdiferenciadas (callos y suspensiones) porque acumulan
niveles más altos de metabolitos secundarios y son más estables en cuanto a crecimiento y
producción de los compuestos químicos (Joao y Brown, 1994; Baiza et al., 1999). Sin
embargo, existen reportes contradictorios. Por ejemplo, el crecimiento y la producción de
alcaloides de raíces de Datura stramonium fue estable durante 5 años (Maldonado-
Mendoza et al., 1993). Mientras que en cultivos in vitro de raíces de Duboisia myoporoides
se observó la disminución de la velocidad de crecimiento en cada ciclo de cultivo
(Yukimune et al., 1994). Por ello, en una primera instancia resulta necesario caracterizar el
crecimiento de los cultivos in vitro de raíces para posteriormente determinar su estabilidad
a un largo plazo.

En este trabajo se caracterizó, la cinética de crecimiento, el pH y el consumo de azúcares,


de un cultivo in vitro de raíces de C. tenuiflora de 6 meses. Las figuras 12 y 13 muestran
que el crecimiento de las raíces de C. tenuiflora, no presentó fase de adaptación. Entre 0-28
días la concentración de biomasa, tanto en base húmeda como seca, tuvo un incremento
lineal y en el día 28 se alcanzó la concentración de biomasa seca máxima (Xmáx), la cual fue
de 25.14±1 g/L. El índice de crecimiento (Ic) en el intervalo de 0-28 días del cultivo de
raíces fue de 2.02, lo cual significa que el inóculo se triplicó; las raíces crecieron con una
Vc de 0.49 g/L día correspondiente a un td de 19 días (Tabla 9). Cabe señalar que a partir
del día 29, se observó la formación de brotes, por lo que para evitar tener un cultivo mixto,
los análisis se suspendieron en el día 31.

44
400

Biomasa húmeda (g/L) 300

200

100

0
0 10 20 30
Tiempo (Días)

Figura 12. Caracterización del crecimiento de raíces in vitro de C. tenuiflora en base


húmeda. Cultivo de 6 meses (n = 5). Se reportan valores promedio, las barras representan la
desviación estándar.

30
Biomasa seca (g/L)

20

10

0
0 10 20 30
Tiempo (Días)

Figura 13. Caracterización del crecimiento de raíces in vitro de C. tenuiflora en base seca.
Cultivo de 6 meses (n = 5). Se reportan valores promedio, las barras representan la
desviación estándar.

45
Tabla 9. Parámetros cinéticos del crecimiento del cultivo in vitro de raíces de C. tenuiflora.

Xo Xmáx
Evaluación Vc td
(g/L) (g/L) Ic
(Inóculo de 15 días) (g/L día) (días)
0 días 28 días
Cultivo 6 meses
8.29±1 25.14±1 2.02 0.49 19
n=5

De acuerdo con los parámetros cinéticos, el crecimiento del cultivo in vitro de raíces de C.
tenuiflora coincidió con el crecimiento de raíces secundarias de Hyoscyamus niger (Yang et
al., 1997). Sin embargo en trabajos futuros, sería importante determinar la morfología de
las raíces y establecer un método de corte de raíces adecuado para reducir la variabilidad y
obtener cultivos de raíces homogéneos, ya que Yang et al. (1997) observó que la
heterogeneidad en la morfología de la raíces (raíces primarias, secundarias y terciarias)
influye en el crecimiento de los cultivos de raíces in vitro de Hyoscyamus niger. Por tal
motivo propuso un método de corte que permite obtener cultivos de raíces con relaciones
constantes entre raíces primarias, secundarias y terciarias (cultivos de raíces homogéneos).

El pH aumentó de 5.1 en el día 0 a 6.3 en el día 28 lo cual coincide con la fase lineal del
crecimiento (Figura 14). Por otro lado, entre el día 28-31, el pH disminuyó de 6.3 a 6.0 lo
que coincide con la formación de brotes a partir de las raíces.

En cuanto a la concentración de azúcares residuales, se mantuvo constante durante 0-3 días,


momento en que comenzó a disminuir hasta agotarse en el día 24 (Figura 15). La ausencia
de azúcares en el medio precedió el inicio de la fase estacionaria, lo que sugiere que el
desarrollo del cultivo de raíces pudo estar limitado por la fuente de carbono. El rendimiento
de las raíces con base a sustrato fue de Yx/s = 0.42 gbiomasa/gazúcares residuales.

46
7

6
pH

4
0 10 20 30
Tiempo (Días)

Figura 14. pH durante el crecimiento del cultivo in vitro de raíces de C. tenuiflora. Cultivo
de 6 meses (n = 5). Se reportan valores promedio, las barras representan la desviación
estándar.

50

40
Azúcares totales (g/L)

30

20

10

0
0 10 20 30
Tiempo (Días)

Figura 15. Concentración de azúcares totales residuales durante el crecimiento del cultivo
in vitro de raíces de C. tenuiflora. Cultivo de 6 meses (n = 5). Se reportan valores
promedio, las barras representan la desviación estándar.

47
5.6 Obtención de estándares de la planta silvestre

5.6.1 Rendimiento de las extracciones

Los rendimientos de las extracciones con n-hexano, acetato de etilo y metanol a partir de
1800 g de la parte aérea de la planta silvestre y el rendimiento de la extracción metanólica a
partir de 669.1 g de la raíz silvestre de C. tenuiflora se muestran en la tabla 10.

Tabla 10. Rendimientos de las extracciones de C. tenuiflora.

Extracto Rendimiento
Parte de la planta Disolvente
(g) (%)
n-hexano 7.9 0.4
Parte aérea
Acetato de etilo 10 5
(1800 g)
Metanol 18.8 10
Raíz
Metanol 49 7
(669.1 g)

5.6.2 Análisis por cromatografía en capa fina

El análisis por cromatografía en capa fina de los 3 extractos de la parte aérea indicó la
presencia de iridoides (por la coloración café y azul al revelar). El extracto hexánico
contiene el perfil de iridoides menos polar y el metanólico el más polar. Dado que en el
extracto de acetato de etilo se observó la presencia de iridoides con una gama amplia de
polaridad, este fue seleccionado para el fraccionamiento. A partir de éste, se obtuvieron 127
fracciones, las cuales fueron analizadas por cromatografía en capa fina y agrupadas de
acuerdo a la similitud de sus perfiles; de esta manera se obtuvieron 42 fracciones, de las
cuales la fracción F-37 de la parte aérea (F-37A) y la fracción F-40 de la parte aérea (F-
40A) presentaron los perfiles mayoritarios de iridoides, siendo además de las más polares
(Figura 16).

48
F7 F8 F9 REF F10 F11 F12 F19 F20 F21 REF F22 F23 F24 F36 F37 F38 REF F39 F40

Figura 16. Cromatografía en capa fina. Fracciones del extracto de acetato de etilo de la
parte aérea de C. tenuiflora. A Fracciones F-7-F-12. Fase móvil: cloroformo-metanol
(85:15); B Fracciones F-19-F-24. Fase móvil: cloroformo-metanol (95:5); C Fracciones F-
36-F-40. Fase móvil: cloroformo-metanol (95:5). Fase estacionaria: SiO2. Revelador
iridoides: ácido clorhídrico-acido acético (80:20). REF: extracto de acetato de etilo sin
fraccionar.

En otro análisis por cromatografía en capa fina, usando como fase móvil cloroformo-
metanol (80:20), se observó que la fracción F-37A contiene un compuesto cuyo Rf fue de
0.6. En la fracción F-40A se detectaron dos compuestos con un Rf de 0.2 y 0.6
respectivamente, de los cuales el compuesto con el Rf 0.2 fue el mayoritario. La aucubina
(estándar) mostró un Rf de 0.2; lo cual indicó que este compuesto se encontraba en la
fracción F-40A (Figura 17). Estos resultados indican que uno de los iridoides que acumula
mayoritariamente C. tenuiflora en la parte aérea es la aucubina.

El análisis del extracto de acetato de etilo de la parte aérea mostró que los iridoides
mayoritarios son de alta polaridad, por lo que para la raíz silvestre, se preparó y analizó el
extracto metanólico de ésta. Se obtuvieron dos fracciones, las cuales fueron denominadas
F-37R y F-40R debido a que mostraron un perfil similar a las del extracto de acetato de
etilo de la parte aérea (Figura 17). En ambas fracciones se detectaron al menos dos
compuestos cuyo Rf coincide con el observado en la parte aérea. Estos resultados
demuestran que la raíz de C. tenuiflora acumula iridoides, coincidiendo los mayoritarios,

49
con los que se acumulan en la parte aérea, entre los que se encuentra la aucubina. Este es el
primer reporte sobre la composición química de la raíz de C. tenuiflora.

Figura 17. Cromatografía en capa fina. Aucubina, F-37A y F-40A del extracto de acetato de
etilo de la parte aérea, F-37R y F-40R del extracto metanólico de raíz. Fase estacionaria:
SiO2. Fase móvil: cloroformo-metanol (80:20). Revelador iridoides: ácido clorhídrico-acido
acético (80:20). EMR: extracto metanólico de raíz.

5.6.3 Análisis por HPLC

Las fracciones F-37A, F-40A y F-40R fueron analizadas por HPLC. La aucubina (1)
presentó un tR=2.1 min (Figura 18A) y λmax=195 nm y fue identificado tanto en la parte
áerea como en la raíz de C. tenuiflora (Figuras 18C y D). Este resultado junto con el
análisis por cromatografía en capa fina corrobora que la parte aérea y la raíz de C.
tenuiflora acumula mayoritariamente a la aucubina.

50
Figura 18. Cromatogramas de HPLC. A Aucubina; B F-37A; C F-40A; D F-40R de la planta silvestre de C. tenuiflora.

51
Por otro lado, en las fracciones se detectaron otros tres picos principales (Figuras 18B-D).
El denominado (2) presentó tR=2.8 min y λmax de 208 nm, (3) presentó tR=3.9 min y λmax de
196-197 nm, mientras que para el (4) tR=5.6-5.7 min y λmax fue 238 nm. Se decidió elucidar
la estructura química de al menos uno de estos tres compuestos.

5.6.4 Elucidación estructural mediante Resonancia Magnética Nuclear (RMN13C)

Los desplazamientos químicos (δ) de la fracción F-37A obtenidos experimentalmente


(Anexo 2 y 3) y los del bartsiósido (Figura 19) obtenidos teóricamente (Anexo 1) son
similares (Tabla 11). Esto demuestra que el bartsiósido es otro de los iridoides que acumula
mayoritariamente C. tenuiflora en la parte aérea, lo cual coincide con lo reportado por
Jiménez et al. (1995).

Tabla 11. Desplazamientos químicos (δ) de RMN13C del bartsiósido y F-37A.

Átomo δC δC
F-37 Bartsiósido
Aglicona
1 96.5 96.0
2 - -
3 139.7 140.1
4 107.3 110.1
5 34.9 33.6
6 39.1 39.50
7 128.3 130.1
8 142.9 142.6
9 48.7 48.8
10 60.4 60.8
Glucosa
1’ 99.0 99.8
2’ 73.3 74.2
Figura 19. Estructura del bartsiósido 3’ 77.2 77.5
4’ 69.4 71.0
5’ 77.2 77.1
6’ 61.0 62.10

52
El análisis de la fracción F-37A, por cromatografía en capa fina, HPLC y RMN, sugiere
que el compuesto (3) con un tR=3.9 min y una λmax=196-197 nm corresponde al bartsiósido
(Figura 18B-C). Esta suposición se basa en que en la fracción F-37A el compuesto cuyo Rf
es 0.6, es más abundante en comparación a F-40 (Figura 17). Por otro lado, el tamaño del
pico (3) presentó el mismo comportamiento (Figura 18B-C). La estructura del compuesto
(4) no fue elucidada debido a su baja concentración. El compuesto (2) presenta λmax=208
nm y espectro de absorción similar al de la aucubina. Esto sugiere que se trata de un
iridoide de estructura semejante al de la aucubina y sería interesante elucidar su estructura
química en trabajos futuros.

5.7 Análisis químico de los cultivos in vitro y comparación con la planta silvestre

La figura 20 muestra el análisis por HPLC de los extractos metanólicos del cultivo in vitro
de raíces, brotes y plántulas. Estos cromatogramas muestran que los cultivos in vitro
acumulan varios compuestos químicos, algunos de los cuales pueden corresponder a
iridoides, de acuerdo con su espectro de absorción. Los principales compuestos (más
abundantes) fueron seleccionados y se compararon con base en su tR y espectro de
absorción con los identificados en la planta silvestre (Tabla 12).

Al igual que la planta silvestre, las plántulas in vitro de C. tenuiflora acumulan aucubina (1)
y bartsiósido (3), lo que no ocurrió en los brotes. En el cultivo de raíces, se detectó
aucubina pero únicamente en el sobrenadante (0 y 7 días del cultivo), lo cuál es un
indicativo de que este compuesto esta siendo excretado. Por otro lado, el compuesto (5) fue
detectado en la planta silvestre y en los cultivos in vitro pero no se detectó en la raíz
silvestre. En el sobrenadante del cultivo de raíces se detectaron los compuestos (6) y (7)
cuyo espectro de absorción sugiere se trata de iridoides. De estos dos compuestos, el (6) fue
detectado en la parte aérea de la planta silvestre. Resultaría interesante elucidar su
estructura química en trabajos posteriores.

53
Figura 20. Cromatogramas de los extractos metanólicos de cultivos in vitro de C. tenuiflora. A Sobrenadante del cultivo de raíces de
14 días; B Sobrenadante del cultivo de raíces de 28 días; C Brotes de 20 días; D plántulas de 20 días.

54
Tabla 12. Comparación de los principales compuestos detectados por HPLC en los
extractos metanólicos de la parte aérea y la raíz de la planta silvestre con los cultivos in
vitro de raíces, brotes y plántulas de C. tenuiflora.

Planta silvestre Cultivos in vitro


tR
Compuesto λmáx Parte aérea Raíz Brotes Plántulas Raíces
min nm (20 días) (20 días) Biomasa Sobrenadante
(1)aucubina 2.1 195 +a + − + − + (0, 7) b
(2) 2.8 208 + − − − − −
(3)bartsiósido 3.9 196 + + − + − −
(4) 5.7 238 + − − − − −
(5) 2.9 199 + − + + + (21) + (21)
(6) 7.2 204 + − − − − + (14)
(7) 12.2 206 − − − − − + (28)
a
+ Significa que el compuesto está presente; − significa que no se encuentra.
b
El número entre paréntesis corresponde al día en que se detectó.

Los resultados del presente trabajo coinciden parcialmente con lo reportado para
Scrophularia nodosa. Tanto en la planta silvestre (hojas, tallo, flor y raíces) como en los
cultivos in vitro de brotes de esta especie vegetal se identificaron los iridoides: aucubina,
harpagósido y catalpol en nivles similares, mientras que en los cultivos in vitro de raíces y
callos no se detectaron (Sesterhenn et al. 2006)

En la planta silvestre y cultivos in vitro de C. tenuiflora se identificaron iridoides, entre los


que están incluidos la aucubina y el bartsiósido. El contenido de aucubina en los brotes y
plántulas de C. tenuiflora fue aparentemente mayor que en el cultivo de raíces, además de
que en este último caso sólo se identificó en el sobrenadante. Las rutas de biosíntesis de los
metabolitos secundarios están compartamentalizadas tanto intracelularmente como al nivel
de la planta (Wink, 1989). La ruta de biosíntesis de los iridoides de C. tenuiflora no se
conoce pero de acuerdo a lo reportado para A. majus (Damtoft et al., 1995) y S. nodosa
(Sesterhenn et al. 2006), se esperaría que los últimos pasos de la biosíntesis de estos
compuestos ocurran en la parte aérea, quizás las hojas, y la raíz participe únicamente como

55
órgano de acumulación. Esto explicaría al menos en parte, las diferencias entre los perfiles
cromatográficos de los cultivos in vitro con órganos aéreos (brotes y plántulas) y el de
raíces.

56
6. CONCLUSIONES

La auxina ácido α-naftalenacético induce callogénesis y rizogénesis en explantes de hojas


de plantas silvestres adultas de C. tenuiflora. Esta auxina en combinación con las
citocininas cinetina y 6-bencilaminopurina induce callogénesis.

Las citocininas cinetina y 6-bencilaminopurina inducen brotes en explantes de hojas de


plantas silvestres adultas de C. tenuiflora.

Se estableció el cultivo in vitro de raíces, brotes y plántulas de C. tenuiflora a partir de


explantes de hojas de plantas silvestres adultas.

El cultivo in vitro de raíces de C. tenuiflora presentó un crecimiento lineal.

Se estableció una metodología para extraer y analizar por métodos cromatográficos, los
iridoides de C. tenuiflora.

Las plantas silvestres de C. tenuiflora acumulan los iridoides aucubina y bartsiósido en la


parte aérea y en la raíz. De estos dos iridoides, la aucubina es acumulada en plántulas y el
cultivo de raíces. Mientras que el bartsiósido se acumuló únicamente en las plántulas.

57
7. RECOMENDACIONES

Estudiar la morfología de las raíces in vitro de C. tenuiflora y establecer un método de corte


de estas.

Optimizar el crecimiento de los cultivos in vitro de raíces, brotes y plántulas de C.


tenuiflora.

Elucidar la estructura de los compuestos extraídos de la planta silvestre (parte aérea y raíz)
y de los cultivos in vitro (raíces, brotes y plántulas) de C. tenuiflora.

Establecer un método de cuantificación de iridoides.

Optimizar la producción de iridoides de los cultivos in vitro de raíces, brotes y plántulas de


C. tenuiflora.

Probar la actividad biológica de los iridoides de la planta silvestre y de los cultivos in vitro
de C. tenuiflora.

58
8. BIBLIOGRAFÍA

Adler, L., Schmitt, J. y Bowers, M. 1995. Genetic variation in defensive chemistry in


Plantago lanceolata (Plantaginaceae) and its effect on the specialist herbivore Juconia
coenia (Nymphalidae). Oecologia 101:75:85.

Atkinson, N., Ford-Lloyd, B. y Newbury, H. 1989. Regeneration of plants from


Antirrhinum majus L. callus. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 17:59-70.

Baiza, A., Quiroz-Moreno, A., Ruiz, J. y Loyola-Vargas, V. 1999. Genetic stability of hairy
root cultures of Datura stramonium. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 59:9-17.

Balandrin, M., Klocke, J., Wurtele, E. y Bollinger, W. 1985. Natural plant chemicals:
sources of industrial and medicinal materials. Science 228:1154–1160.

Banerjee, S., Rahman, L., Uniyal, G. y Ahuja, P. 1998. Enhanced production of


valepotriates by Agrobacterium rhizogenes induced hairy root cultures of Valeriana
wallichii DC. Plant Science 131:203–208.

Bartholomaeus, A. y Ahokas, J. 1995. Inhibition of P450 by aucubin: is the biological


activity of aucubin due to its glutaraldehyde-like aglycone. Toxicology Letters 80:75-83.

Bates, R., Eisenbraun, E. y Mcelvain, S. 1958. The configurations of the nepetalactones and
related compounds. Journal of the American Chemical Society 80:3420-3424.

Bianco, A. 1994. Recent developments in iridoids chemistry. Pure & Applied Chemistry
66:2335-2338.

Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., Gontier, E. 2001. Production of plant secondary
metabolites: a historical perspective. Plant Science 161:839-851.

59
Bowers, M. y Stamp, N. 1993. Effects of plant age, genotype and herbivory on Plantago
performance and chemistry. Ecology 74:1778-179.

Breinholt, J., Damtoft, S., Demuth, H., Jensen, S. y Nielsen, B. 1992. Biosynthesis of
antirrhinoside in Antirrhinum majus. Phytochemistry 31:795-797.

Chander, R., Kapoor, N. y Dhawan, B. 1992. Effect of Picroliv on glutathione metabolism


in liver and brain of Mastomys natalensis infected with Plasmodium berghei. Indian
Journal of Experimental Biology 30:711-714.

Chander, R., Kapoor, N. y Dhawan, B. 1994. Picroliv affects gamma-glutamyl cycle in


liver and brain of Mastomys natalensis infected with Plasmodium berghei. Indian Journal
of Experimental Biology 32:324-327.

Chang, Y., Tseng, T., Lee, M., Hsu, J. y Wang, C. 2002. Induction of apoptosis by penta-
acetyl geniposide in rat C6 glioma cells. Chemico-Biological Interactions 141:243-245.

Charlwood, B. y Charlwood, K. 1991. Terpenoid production in plant cell culture. pp: 95-
132. En: Harborne, J. y Tomas-Barberan, F. (Ed.) Ecological chemistry and biochemistry
of plant terpenoids. Clarendon, Oxford.

CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical). 1991. Cultivo de tejidos en la


agricultura: Fundamentos y Aplicaciones. pp: 19-40. En: Roca, W. y Mroginski, L. (Ed.)
Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales in vitro. Cali, Colombia.

Damtoft, S., Jensen, S. y Jessen, C. 1993. Intermediates between 8-epi-deoxyloganic acid


and 6, 10-dideoxy aucubin in the biosynthesis of antirrhinoside. Phytochemistry 33:1087-
1088.

Damtoft, S., Jensen, S. y Schacht, M. 1995. Last stages in the biosynthesis of


antirrhinoside. Phytochemistry 39:549-551.

60
Doran, M. 1999. Design of mixing systems for plant cells suspensions in stirred reactors.
Biotechnology Progress 15:319-335.

Dubois, M., Guilles, A., Hamilton, K., Rebers, A. y Smith F. 1956. Colorimetric method
for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry 28:350-356.

Escandón, A., Kato, A., Mori, M. y Alderete, M. 2006. Establishment of an in vitro


micropropagation protocol for Mercadonia tenella. Electronic Journal of Biotechnology
Disponible: http://www.ejbiotechnology.info/content/vol9/issue3/full/6/index.html. ISSN
0717-3458.

Escandón, A., Miyajima, I., Alderete, M., Hagiwara, J. Faccciuto, G., Mata, D. y Soto, S.
2005. Wild ornamental germplasm exploration and domestication base on biotechnological
approaches. In vitro colchicine treatment to obtain a new cultivar of Scoparia
montevidiensis. Electronic Journal of Biotechnology Disponible: http://www.ejbiotechnol
ogy.info/content/vol8/issue2/full/2/index.html. ISSN 0717-3458.

Flores, H., Vivanco, J. y Loyola-Vargas, V. 1999. Radicle biochemistry: the biology of


root-specific metabolism. Trends in Plant Science 4:220–226.

Frankenberger, W. y Arshadm, M. 1995. Phytohormones in Soils, Microbial Production


and Function. CRC Press, New York.

Gaddipati, J., Madhavan, S., Sidhu, G., Singh, A., Seth, P. y Maheshwari, R. 1999.
Picroliv-a natural product protects cells and regulates the gene expression during
hypoxia/reoxygenation. Molecular and Cellular Biochemistry 194:271-281.

Graham, G., Quinn, M., Fabricant, D. y Farnsworth, N. 2000. Plants used against cancer: an
extension of the work of Jonathan Hartwell. Journal of Ethnopharmacology 73:347–377.

61
Heintze, A., Riedel, A., Aydogdu, S. y Schultz, G. 1994. Formation of chloroplast
isoprenoids from pyruvate and acetate by chloroplasts from young spinach plants. Evidence
for a mevalonate pathway in immature chloroplasts. Plant Physiology and Biochemistry
32:791-797.

Hirschhorn, H. 1982. Botanical remedies of south, central America, and the Caribbean, an
archival analysis. Part 2. Conclusion. Journal of Ethnopharmacology 5:163–180.

Hsin-Sheng, T., Fu-Shin, C., Chao-Lin, K. y Sagare, A. 2001. De Novo Regeneration of


Scrophularia yoshimurae YAMAZAKI (Scrophulariaceae) and quantitative analysis of
harpagoside, and iridoid glucoside, formed in aerial and underground parts of in vitro
propagated and wild plants by HPLC. Biological and Pharmaceutical Bulletin 24:1311-
1315.

Hsu, H., Yang, J., Lin, S. y Lin, C. 1997. Comparisons of geniposidic acid and geniposide
on antitumor and radioprotection after sublethal irradiation. Cancer Letters 113:31-37.

Jensen, S., Franzyk, H. y Wallander, E. 2002. Chemotaxonomy of the Oleaceae: iridoids as


taxonomic markers. Phytochemistry 60:213-231.

Jeong, H., Koo, H., Na, H., Kim, M., Hong, S., Eom, J., Kim, K., Shin, T. y Kim, H. 2002.
Inhibition of TNF-α and IL-6 production by aucubin through blockade of NF-κB activation
in RBL-2H3 mast cells. Cytokine 18:252-259.

Jiménez, M., Padilla, M., Reyes, R., Espinosa, L., Meléndez, E. y Rocha, A. 1995. lridoid
glycoside constituents of Castilleja tenuiflora. Biochemical Systematics and Ecology
23:455-456.

Joao, K. y Brown, T. 1994. Long-term stability of root cultures of tomato transformed with
Agrobacterium rhizogenes R1601. Journal of Experimental Botany 45:641-647.

62
Jolad, S., Hoffmann, J., Wiedhopf, R., Cole, J., Bates, R. y Kriek, G. 1976. Antitumor
agent from Penstemon deutus dougl. Ex lindl. (Scrophulariaceae): penstemide, a novel
iridoid-type glucoside. Tetrahedron Letters 46:4119.

Jose, J., Joy, K. y Kuttan, R. 1999. Effect of Emblica officinalis, Phyllantus amarus and
Picrorhiza kurroa on N-nitrosodiethylamine induced hepatocarcinogenesis. Cancer Letters
136:11-16.

Kang, J., Wang, H., Liu, T., Chen, Y. y Ueng, T. 1997. Modulation of cytochrome P-450
dependent monooxygenases, glutathione and glutathione S-transferase in rat liver by
geniposide from Gardenia jasminoides. Food and Chemical Toxicology 35:957-965.

Kieran, P., Mc. Loughlin, P. y Malone, D. 1997. Plant cell suspension cultures: some
engineering considerations. Journal of Biotechnolgy 59:39-52.

Kim, Y., Wyslouzil, B. y Weathers, P. 2002. Secondary metabolism of hairy root cultures
in bioreactors. In Vitro Cellular and Development Biology - Plant 38:1-10.

Kittipongpatana, N., Hock, R. y Porter, J. 1998. Production of solasodine by hairy root,


callus, and cell suspension cultures of Solanum aviculare Forst. Plant Cell, Tissue and
Organ Culture 52:133–143.

Klockars, G., Bowers, M. y Cooney, B. 1993. Leaf variation in iridoid glycoside content of
Plantago lanceolata (Plantaginaceae) and oviposition of the buckeye, Jumonia coenia
(Nymphalidae). Chemoecology 3:72-78.

Kordana, S., Nowak, D. y Drozdzynska, M. 1998. Influence of NPK fertilization on the


crop and content of aucubin in herb of narrow-leaved plantain (Plantago lanceolata L.).
Herba Polonica 44:183-187.

63
Lee, D., Cho, I., Park, M., Kim, K., Chang, I. y Mar, W. 2001. Studies on the possible
mechanism of protective activity against α-amanitina poisoning by aucubin. Archives of
Pharmacal Research 2001:55-63.

Lee, M., Hsu, J. y Wang, C. 1995. Inhibition of 12-O-tetradecanylphorbol-13-acetate-


caused tumor promotion in benzo[a]pyrene-initiated CD-1 mouse skin by geniposide.
Anticancer Research 15:411-416.

Lichtenthaler, H. 1999. The 1-Ddeoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway of isoprenoid


biosynthesis in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology
50:47-65.

Lichtenthaler, H., Rohmer, M. y Schwender, J. 1997. Two independent biochemical


pathways for isopenthyl diphosphate and isoprenoid biosynthesis in higher plants. Physiologia
Plantarum 101:643-652.

Lin, Y., Hsu, J., Chou, F., Lee, M., Shiow, S. y Wang, C. 2000. Suppressive effect of
penta-acetyl geniposide on the development of γ-glutamyl transpeptidase foci-induced by
aflatoxin B1 in rats. Chemico-Biological Interactions 128:115-126.

Mahagamasekera, M. y Doran, P. 1998. Intergeneric co-culture of genetically transformed


organs for the production of scopolamine. Phytochemistry 47:17–25.

Maldonado-Mendoza, I., Ayora-Talavera, T. y Loyola-Vargas, V. 1993. Establishment of


hairy root cultures of Datura stramonium. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 33:321-
329.

Marak, H., Biere, A. y Van Damme, J. 2002a. Systemic, genotype-specific induction of two
herbivore-deterrent iridoid glycosides in Plantago lanceolata L. in response to fungal
infection by Diaporthe adunca (ob.) Niessel. Journal of Chemical Ecology 28:2429-2448.

64
Marak, H., Biere, A. y Van Damme, J. 2002b. Two herbivore-deterrent iridoid glycosides
reduce the in-vitro growth of a specialist but not of a generalist pathogenic fungus of
Plantago lanceolata L. Chemoecology 12:185-192.

Mccloud, E. y Berenbaum, M. 1999. Effects of enhanced UV-B radiation on a weedy forb


(Plantago lanceolada) and its interactions with a generalist and specialist herbivore.
Entomologia Experimentalis et Applicata 93:233-247.

Mondragón, J. y Vibrans, H. Malezas de México, Castilleja tenuiflora. 2005. Disponible:


http://www.conabio.gob.mx/malezasdemexico/scrophulariaceae/castilleja−tenuiflora/fichas
/ficha.htm,10 de Julio del 2007.

Morgan, P. 1990. Effects of abiotic stresses on plant hormone systems. pp: 113-146. En:
Alscher, R. y Cumming, J. (Ed.) Stress responses in plants: adaptation and acclimation
mechanisms. Plant Biology. Wiley-Liss, USA.

Murashige, T. y Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15:473-497.

Nakamura, T., Nakazawa, Y., Onizuka, S., Satoh, S., Chiba, A., Sekihashi, K., Miura, A.,
Yasugahira, N. y Sasaki, Y. 1997. Antimutagenicity of Tochu tea (an aqueous extract of
Eucommia ulmoides leaves). The clastogen-suppressing effects of Tochu tea in CHO cells
and mice. Mutation Research 388:7-20.

Nieminen, M., Suomi, J., Van Nouhuys, S., Sauri, P. y Riekkola, M. 2003. Effect of iridoid
glycoside content on oviposition host plant choice and parasitism in a specialist herbivore.
Journal of Chemical Ecology 29:823-844.

Ozaki, A., Kitano, M., Furusawa, N., Yamaguchi, H., Kuroda, K. y Endo, G. 2002.
Genotoxicity of gardenia yellow and its components. Food and Chemical Toxicology
40:1603-1610.

65
Pardo, F., Perich F., Torres, R. y Delle, F. 1998. Phytotoxic iridoid glucosides from the
roots of Verbascum thapsus. Journal of Chemical Ecology 24:645-653.

Pettit, G., Numata, A., Takemura, T., Ode, R., Narula, A., Schmidt, J., Cragg, G. y Pase, C.
1990. Antineoplastic agents, 107. Isolation of acteoside and isoacteoside from Castilleja
linariaefolia. Journal of Natural Products 53:456-458.

Poirier-Hamon, S., Rao, S. y Harada, H. 1974. Culture of mesophyll protoplasts and stem
segments of Antirrhinum majus (Snapdragon). Journal of Experimental Botany 25:725-
760.

Rajeshkumar, N. y Kuttan, R. 1999. Effect of iridoid glycoside Picroliv on the inhibition of


hepato-carcinogenesis induced by N-nitrosodiethylamine. Amala Research Bulletin 19:74-
81.

Rajeshkumar, N. y Kuttan, R. 2000. Inhibition of N-nitrosodiethylamine-induced


hepatocarcinogenesis by Picroliv. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research
19:459-465.

Rajeshkumar, N. y Kuttan, R. 2001. Protective effect of Picroliv, the active constituent of


Picrorhiza kurroa, against chemical carcinogenesis in mice. Teratogenesis Carcinogenesis
and Mutagenesis 21:303-313.

Rastogi, R., Saksena, S., Garg, N. y Dhawan, B. 1995. Effect of Picroliv on antioxidant
system in liver of rats after partial hepatoctomy. Phytotherapy Research 9:364-367.

Rayen, P., Evert, R. y Eichhorn. 1999. Biology of Plants. W.H. Freeman and Company
Worth Publishers.

66
Rodríguez-Monroy, M., Jiménez-Aparicio, A., Sepúlveda-Jiménez, G., Trejo-Tapia, G.,
Salcedo-Morales, G., Martínez-Bonfil, B.P. y De Jesús-Sanchez, A. 1999. Cultivo genético
de colorantes de interés industrial. Investigación Hoy 89:10-17.

Rohmer, M. 2003. Mevalonate-independent methylerythritol phosphate pathway for


isoprenoid biosynthesis. Elucidation and distribution. Pure and Applied Chemistry 75:375-
387.

Rzedowski, G. C. de, J. Rzedowski y colaboradores, 2001. Flora fanerogámica del Valle de


México. 2a ed. Instituto de Ecología y Comisión Nacional para el Conocimiento y Uso de
la Biodiversidad, Michoacán.

Sajc, L., Grubisic, D. y Vunjak-Novakovic, G. 2000. Bioreactors for plant engineering; an


outlook for further research. Biochemical Engineering Journal 4:89-99.

Sesterhenn, K., Distl, M. y Wink, M. 2006. Occurrence of iridoid glycosides in in vitro


cultures and intact plants of Scrophularia nodosa L. Plant Cell Reports DOI
10.1007/s00299-006-0233-3.

Singh, D., Tiwari, N. y Tiwari V. 2001. Comparative studies of cytokinins on in vitro


propagation of Bacopa monniera. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 66:9-16.

Sinha, S., Mehrotra, J., Bala, L., Jaiswal, A. y Dhawan, B. 1998. Picroliv, the iridoid
glycoside fraction of Picrorhiza kurroa, selectively augments human T cell response
mycobacterial protein antigens. Immunopharmacology and Immunotoxicology 20:579.

Stermitz, F. y Mead, E. 1993. Content of iridoid glycosides in different parts of Castilleja


integra. Phytochemistry 32:1155-1158.

67
Stermitz, F. y Pomeroy, M. 1992. Iridoid glycosides from Castilleja purpurea and C.
indivisa, and quinolizidine alkaloid transfer from Lupinus texensis to C. indivisa via root
parasitism. Biochemical Systematics and Ecology 20:473-475.

Stermitz, F., Harris, G y Arslanian, L. 1985. Some iridoid glucosides, including the new 6-
deoxycatalpol, from Indian paintbrush species related to Castilleja miniata. Journal of
Natural Products 48:957-961.

Stermitz, F., Harris, G. y Jing, W. 1986. Iridoids and alkaloids from Castilleja host plants
for Platyptilia pica. Rhexifoline content of P. pica. Biochemical Systematics and Ecology
4:499-506.

Subroto, S., Kwok, K., Hamill, J. y Doran, P. 1996. Co-culture of genetically transformed
roots and shoots for synthesis, translocation, and biotransformation of secondary
metabolites. Biotechnology and Bioengineering 49:481–494.

Tamura, Y. 2001. Effects of temperature, shade and nitrogen application on the growth and
accumulation of bioactive compounds in cultivars of Plantago lanceolata L. Japanesse
Journal of Crop Science 70:548-553.

Tamura, Y. y Nishibe, S. 2002. Changes in the concentrations of bioactive compounds in


plantain leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry 50:2514-2518.

Trim, A. y Hill, R. 1952. The preparation and properties of aucubin, asperuloside and some
related glycosides. Biochemical Journal 50:310-319.

Tseng, T., Chu, C. y Wang, C. 1992. Inhibition of penta-acetyl geniposide on AFB1-


induced genotoxicity in C3H10T1/2 cells. Cancer Letters 62:233-242.

Ueda, S. y Iwashashi, Y. 1991. Production of anti-tumor-promoting iridoid glucosides in


Genipa Americana and its cell cultures. Journal of Natural Products 54:1677-1680.

68
Verpoorte, R., Contin, A. y Memelink, J. 2002 Biotechnology for the production of plant
secondary metabolites. Phytochemistry 1:13-25.

Wagner, H. y Bladt, S. 1996. Plant drug analysis. Springer, Alemania.

Wang, C., Chu, C., Tseng, T. y Lin, J. 1993. Penta-acetyl geniposide inhibits the growth
and development of C-6 glioma cells in rats. Cancer Letters 70:113-118.

Wang, C., Tseng, T. y Lin, J. 1992. Penta–acetyl geniposide: isolation, identification and
primary effect on C6 glioma cells in vitro. Anticancer Research 12:911-916.

Wang, C., Wang, S. y Lin, J. 1991. Suppresive effect of geniposide on the hepatotoxicity
and hepatic DNA binding of aflatoxin B1 in rats. Cancer Letters 60:95-102.

Wiilinger, G. y Dobler, S. 2001. Selective sequestration of iridoid glycosides from their


host plants in Longitarsus flea beetles. Biochemical Systematics and Ecology 29:335-346.

Wink, M. 1989. Genes of secondary metabolism: differential expression in plants and in


vitro cultures and functional expression in genetically transformed microorganisms.pp:
239-251. En: Kurz, W. (Ed.). Prymary and secondary metabolism of plant cell cultures II.
Springer, Berlin Heidelberg.

Wysokinska, H. y Skrzypek, Z. 1992. Studies on iridoids of tissue cultures of Penstemon


serrulatus: isolation and their antiproliferative properties. Journal of Natural Products
55:58-63

Yang, W., Park, M. y Woo H. 1997. Induction of branch roots by cutting method in
Hyoscyamus niger root culture. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 48:131-134.

Yukimune, Y., Yara, Y. y Yamada, Y. 1994.Tropane alkaloid production in root cultures of


Duboisia myoporoides obtained by repeated selection. Bioscience, Biotechnology and
Biochemistry 58:1443-1446.

69
Zhao, J., Davis, L. y Verpoorte, R. 2005. Elicitor signal transduction leading to
production of plant secondary metabolites. Biotechnology Advances 23:283-333.

Zamora, M. y Torres, J. 2002. Estado actual de la información sobre productos forestales


no madereros. pp: 222. En: Información para el Desarrollo Forestal Sostenible (Ed.)
Monografía de paises. FAO, Santiago, Chile. Disponible: ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/006/A
D398S/AD398S00.pdf, 10 de Julio del 2007.

70
9. ANEXOS

Anexo 1. Espectro de RMN13C del bartsiósido obtenido por el software ACD/CNMR


PREDICTOR Pv.5.10.
13/Jun/2007 12:36:30 ACD/CNMR (v.5.10)

HO

O OH

O O
OH OH
OH
HO
120

115

110
77.94 62.60 46.07
105 141.49 130.27 105.72 99.90 97.22 82.74 74.81 71.44 61.32 47.89

100

95

90

85

80

75

70

65

60

55

50

45

40

35

30 147.95

25

20

15

10

0
150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40

71
Anexo 2. Espectro de RMN13C de F-37A.

72
Anexo 3. Espectro de RMN13C de F-37A (continuación).

73

You might also like