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Ictiopatología
Alicia Gibello, María del Mar Blanco, Lucas Domínguez y José F. Fernández-
Garayzábal
Departamento de Patología Animal I (Sanidad Animal). Facultad de Veterinaria.
Universidad Complutense de Madrid. Avda. Puerta de Hierro s/n. 28040 Madrid (España)
Resumen
Las enfermedades infecciosas constituyen uno de los principales problemas en piscicultura, tanto desde el
punto de vista sanitario como económico. Realizar de forma rápida el diagnóstico de los animales enfermos y
evitar el desarrollo de ciertas enfermedades mediante la detección de los animales portadores del patógeno
constituyen, junto con la vacunación y las buenas prácticas de manejo, las medidas más eficaces de prevención
de estas patologías. En las últimas décadas se han desarrollado diversas técnicas de diagnóstico rápido basadas
en métodos genéticos, entre los que destaca la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En este trabajo se
evalúan las ventajas e inconvenientes de la utilización de la técnica de PCR en la detección de los
microorganismos patógenos para los peces.
Abstract
From a sanitary and an economical point of view, infectious diseases are one of the most important problems
in pisciculture. The rapid establishment of the diagnosis of diseased animals, as well as the detection of carrier
fish can provide a highly eficiency system to prevent these diseases. In the last decades, several diagnostic
methods based on genetic technology have been developed, but PCR is more frecuently used than any other
nucleic acid based techniques. The purpose of this review is to examinate the use of PCR as an approach to
diagnosis of fish pathogens.
Introducción
La cría de peces en condiciones intensivas genera factores de estrés ligados a las propias
condiciones de producción, a las altas densidades de los animales y a la calidad del agua,
que favorecen la aparición de enfermedades de tipo ambiental, toxicológicas e infecciosas
(Reno, 1998). Las enfermedades infecciosas constituyen una de las causas más importantes
de las pérdidas económicas en cualquier piscifactoría. La aplicación de vacunas es el
método de elección para el control de estas enfermedades; sin embargo, la obtención de
vacunas eficaces para prevenir enfermedades de etiología vírica es difícil, siendo la
tendencia actual el desarrollo de vacunas de ADN, cuya efectividad sólo se ha demostrado
hasta el momento a nivel experimental (Boudinot y col., 1999). En el caso de las
enfermedades de etiología bacteriana, sólo algunas de ellas (boca roja, forunculosis,
vibriosis y enterosepticemia del pez gato) se han podido controlar utilizando vacunas
tradicionales (bacterias inactivadas) (Rocha y Coll, 2000). Además, el control y
erradicación de las estas patologías de origen bacteriano resulta cada vez más difícil debido
a la limitación del uso de antibióticos en acuicultura (Cacho, 1999), y al fenómeno cada
vez más frecuente del aumento de antibiorresistencias (Toranzo y col., 1984; Inglis y col.,
1991; Teshager y col., 2000). Esta situación resulta aún más compleja si consideramos que
en muchas de las patologías infecciosas, gran parte de los animales que sobreviven a la
enfermedad pueden resultar portadores del patógeno durante largos períodos de tiempo.
Estas circunstancias hacen que las condiciones de manejo y el diagnóstico rápido de los
animales enfermos y/o portadores, constituyan una de las medidas más eficaces en la
prevención de estas patologías (Blanco y col., 2000). En este sentido, el examen de la
muestra, el aislamiento del agente etiológico y su identificación, y la determinación de un
tratamiento adecuado constituyen los pasos indispensables del diagnóstico clínico
microbiológico en cualquier laboratorio de referencia.
En la actualidad, los métodos de diagnóstico de algunas de las enfermedades víricas
(basados en el cultivo celular y la posterior identificación del virus) y parasitarias, como la
PKD o la enfermedad del torneo, continúan siendo complejos y requieren un mayor tiempo
de realización que los empleados en general para las enfermedades de origen bacteriano.
En este sentido, los medios de aislamiento selectivos y los sistemas de identificación
rápida, han supuesto un gran avance para el diagnóstico bacteriológico. No obstante, la
detección de algunas bacterias patógenas mediante los métodos microbiológicos
tradicionales presenta diversos inconvenientes, entre los que se pueden citar:
Simplicidad y rapidez
Especificidad
Sensibilidad
Especificidad
La especificidad de la reacción de PCR va a estar condicionada por el carácter restrictivo
del fragmento de ADN a amplificar entre las estirpes de una misma especie, entre las
especies de un mismo género y entre un grupo de microorganismos filogenéticamente
relacionados. En este sentido, existen reacciones de PCR encaminadas a la detección de un
género, como en el caso de las Pseudomonas (Widmer y col., 1998); en otras ocasiones se
pretende la detección de una especie o subespecie, como en el caso de Photobacterium
damselae (Osorio y col., 2000); incluso se pueden buscar estirpes virulentas de un
patógeno, como por ejemplo la detección de las cepas virulentas de Aeromonas
salmonicida subsp. salmonicida, para lo cual se ha desarrollado una reacción de PCR
basada en la amplificación de un gen que sintetiza una proteína de la envuelta A
(Gustafson y col., 1992).
Las reacciones de PCR pueden diseñarse para la amplificación de fragmentos de genes
basados en caracteres genéticos (la existencia de un transposón, ARN ribosómico),
bioquímicos (una enzima del metabolismo), o factores de patogenicidad (hemolisinas,
fimbrias etc.). En función del gen elegido, varía el número de copias del ácido nucleico a
amplificar existente en el microorganismo, incidiendo por tanto en la sensibilidad de la
reacción. Así por ejemplo, para la detección de Y. ruckeri se han descrito dos sistemas de
PCR basados respectivamente en la amplificación de un gen cromosómico del sistema
"quorum sensing" (Temprano y col. 2001), y en la amplificación de una región del ADN
que codifica el ARN 16S (Gibello y col. 1999); ambos métodos son específicos de esta
especie, pero el ADN que codifica el ARN ribosómico presenta mayor número de copias
por célula y por tanto, una mayor sensibilidad en su aplicación sobre muestras de tejidos.
La especificidad de la PCR requiere la optimización de las fases de la reacción
(fundamentalmente en la temperatura de hibridación), y un buen diseño de los iniciadores.
Así pues, una vez determinada la zona de ADN a amplificar, la elección de los iniciadores
debe realizarse teniendo en cuenta dos requisitos fundamentales:
Figura 3: Esquema del ARN ribosomal 16S bacteriano. Se muestran las regiones que
presentan variabilidad entre las distintas especies de bacterias (regiones V). En la
secuencia de ADN de estas regiones se basa el diseño de los oligonucleótidos
iniciadores empleados en las PCRs utilizadas en el diagnóstico de determinadas
bacterias patógenas para peces (ver Tabla 1)
Figura 4: Reacción de PCR específica para la detección
de Yersinia ruckeri
Línea 1: Y. ruckeri (cepa de colección)
Línea 2: control negativo
Línea 3: patrón de peso molecular
Líneas 4-7: Y. ruckeri (aislados clínicos)
Líneas 8-10: otras especies de Yersinia
No obstante, la alta sensibilidad de la PCR puede dar lugar en algunos casos, a resultados
falsos-positivos (Vaneechoutte y Eldere). Entre las causas más frecuentes de este problema
está la contaminación de la muestra a analizar con ADN procedente de otras muestras
clínicas o de los productos de PCR obtenidos en amplificaciones previas (Wilson, 1997).
La adopción de medidas de seguridad que eviten el riesgo de contaminación, como la
preparación de la reacción de PCR en un lugar distinto al sitio donde se procesan las
muestras, la utilización de puntas de pipeta con filtro, etc. pueden evitar estos problemas de
contaminación (Orego, 1990).
La estabilidad molecular del ADN puede también dar lugar a la obtención de resultados
falsos-positivos. Los ensayos de PCR no diferencian entre el ADN procedente de células
vivas o muertas, y este hecho puede dar lugar a la obtención de resultados erróneos (Hiney
y Smith, 1998), como la amplificación del ADN de bacterias muertas tras un tratamiento
efectivo con un antibiótico, o en animales vacunados con microorganismos inactivados (la
presencia de microorganismos muertos puede ser debida no sólo al tratamiento con un
antibiótico, sino también a la lisis del microorganismo en el interior del macrófago). Se ha
constatado la amplificación por PCR del ADN de células muertas de A. salmonicida,
presentes en órganos de peces vacunados frente a forunculosis (Hoie y col. 1997). Sin
embargo, no todos los ensayos de PCR presentan este inconveniente, por ejemplo, en
truchas no infectadas y vacunadas frente a boca roja no se han detectado amplificaciones
frente a Y. ruckeri (Altinok, 2001). Por tanto, una cuestión importante en la detección de
ciertos patógenos por PCR, es la diferenciación entre las bacterias viables y las células
muertas que dan lugar a reacciones positivas.
Parásitos
Agente Tipo de ensayo Gel amplificado Referencia
C. shasta PCR ARNr 18S Palenzuela y col., 1999
M. seriolae y relacionados PCR ARNr 18S Bell y col., 1999
M. cerebralis PCR ARNr 18S Andreé y col., 1998
Tetracapsula bryosalmonae PCR ARNr 18S Saulnier y Kinkelin, 1997
Tabla 1: Sistemas de PCR desarrollados para la detección de organismos patógenos para peces.
ISA: anemia infecciosa del salmón; VHS: septicemia hemorrágica vírica;
VER: retinopatía y encefalopatía vírica; IPN: necrosis pancreática infecciosa;
IHN: necrosis hemorrágica infecciosa; CC: viremia del pez gato;
SD: enfermedad del sueño.
A pesar de que se han descrito métodos de PCR de alta sensibilidad capaces de detectar
menos de 20 UFC por gramo de órgano (Gustafson y col., 1992; Wiklund y col., 2000), la
PCR realizada a partir de muestras clínicas presenta, en general, una sensibilidad bastante
menor a la obtenida a partir de ADN purificado o de microorganismos aislados. En el caso
de patógenos bacterianos, el límite de sensibilidad a partir de muestras de tejidos oscila
entorno a 104-105 UFC por ml o g de muestra comparados con 102-103 UFC por ml
obtenido con el ácido nucleico purificado (McIntosh y col. 1996, Urdaci y col. 1998,
Gibello y col. 1999) (Figura 5). Esta reducción en la sensibilidad de la técnica se atribuye a
la existencia de sustancias inhibidoras en los tejidos y órganos de los animales. Los
inhibidores más frecuentes de las muestras clínicas incluyen diversos componentes de los
fluidos corporales y tejidos (hemoglobina y proteínas séricas de la sangre, grasas,
glicógeno, etc.) y determinados reactivos añadidos durante el procesado de la muestra
(heparina, etc.). Aunque se han descrito un amplio número de inhibidores, su identidad
concreta y modo de acción son en general inciertos (Wilson, 1997). No obstante, las
sustancias que inhiben la reacción de PCR actúan a distintos niveles:
Valoración final
La sintomatología y lesiones de muchas de las enfermedades infecciosas de los peces
carecen de la especificidad suficiente como para establecer un diagnóstico definitivo del
posible agente etiológico. Esto hace que sea necesario la identificación laboratorial precisa
del agente etiológico. Cualquier sistema de diagnóstico clínico debe permitir la
identificación fiable y específica del agente causal, en el menor tiempo posible, para poder
utilizarse de manera rutinaria. La técnica de PCR cumple estos requisitos, y por ello en
estos momentos existen diversas técnicas de PCR descritas para la totalidad de los agentes
infecciosos o parasitarios de mayor significación clínica en acuicultura. Aunque la técnica
de PCR se utiliza cada vez con mayor frecuencia en los laboratorios de Microbiología
clínica, esto no significa que sea, ni deba ser, una técnica sustitutiva del diagnóstico
tradicional basado en el aislamiento y posterior identificación del agente etiológico. La
utilización de la técnica de PCR como sistema de diagnóstico rutinario deberá ser evaluada
en cada caso concreto, teniendo en cuenta las características de cada laboratorio y las
dificultades de aislamiento y/o identificación que presenten los diferentes microorganismos
patógenos.
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