Professional Documents
Culture Documents
BIOLOGI UMUM II
KEGIATAN 6
EKSTRAKSI DNA
Disusun Oleh:
B. LATAR BELAKANG
Sampai awal tahun 70an, DNA merupakan molekul seluler yang paling sulit
dianalisis, karena strukturnya yang panjang dan secara kimiawi monoton. Sebagai
materi genetik suatu organisme, nukleotida hanya dapat dianalisis secara tidak
langsung melalui analisis urutan protein dan RNA melalui analsis genetik. Kini
menjadi hal yang mungkin untuk mengisolasi suatu region spesifik dari suatu
genome, yaitu total informasi genetik yang dimiliki oleh suatu organisme; dan
untuk memproduksi jumlah kopi yang tidak terbatas dari region tersebut, atau untuk
mendeterminasi urutan nukleotida dari region tersebut hanya dalam semalam,
dengan kecepatan pembacaan 1000 nukleotida per detik.
DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan
komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan
pasangan basa. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan
bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap dari
materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi
kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan.
Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA.
Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan
teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya.
Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung
dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung.
Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu
supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Presipitasi merupakan
langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran. Pada
praktikum kali ini, kami akan mencoba untuk mengisolasi DNA dengan metode
sederhana dengan menggunakan sampel daging buah pisang .
C. DASAR TEORI
1. Isolasi DNA
Untuk mendapatkan DNA murni dari suatu sel dalam jaringan tubuh
makhluk hidup dapat dilakukan suatu tekhnik yang disebut isolasi DNA.DNA
pada makhluk hidup dapat diisolasikan secara sederhana.Pengisolasian DNA
secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran
plasma dan membran inti, baik secara mekanik maupun secara kimiawi.Isolasi
DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni
yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan (Klug, 2008:58).
Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari
DNA.Prinsipnya ada dua yaitu sentrifungsi dan presipitasi.Sentrifungsi
merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekulnya.
Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah
tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas.
Hasil sentrifungsi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah yaitu
supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell, 2002:115).
Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu
komponen dari campuran (Albert, 1994:254).
Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini bertujuan
untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Proses ini
harus dilakukan dengan hati-hati sehingga tidak menyebabkan kerusakan DNA.
Untuk mengeluarkan DNA dari sel, dapat dilakukan dengan memecahkan
dinding sel, membran plasma, dan membran inti dengan cara mekanik maupun
kimiawi.
a. Mekanik
Dilakukan dengan pemblenderan atau penggerusan menggunakan mortar
dan pistil.
b. Kimiawi
Dilakukan dengan pemberian detergen.Penambahan sabun dan garam
adalah unuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan DNA.
Menurut Jamilah (2005:38) saat penghancuran, terjadi pelepasan senyawa
polifenol dan polisakarida. Polivenol yang teroksidasi akan terikat kovalen
dengan DNA, sedang polisakarida mengalami koprespitasi dengan asam nukleat
dengan penambahan alkohol, terbentuk matriks seperti lem. Hal ini menyebabkan
DNA kental.
Presipitor DNA terlihat seperti serabut putih yang terkumpul di atas larutan
karena massa jenis air. Menurut Jamilah (2005) DNA dapat mengalami
denaturasi dan renaturasi. Tahapan isolasi DNA yaitu : preparasi ekstrak sel,
pemurnian DNA , dan
presipitasi DNA. Jika isolasi
DNA dilakukan dengan
sampel buah yang kadar
airnya berbeda, hasilnya
berbea pula. Buah berkadar
air tinggi menghasilkan
anisolat berbeda dengan kadar
Gambar 2. Proses isolasi DNA
air rendah. Makin tinggi air, maka sel yang terlarut makin sedikit, sehingga DNA
yang terpresipitasi sedikit.
Cara pemekatan yang sering dilakukan adalah presipitasi etanol. Dan dengan
adanya garam (kation kovalen seperti Na+) dan pada suhu di bawah 20º C atau
kurang, etanol absolut akan mempresipitasi asam nukleat polimerik dengan baik.
Pemekatan ini dilakukan dengan penambahan etanol pada lapisan atas sampel
sehingga terjadi presipitasi DNA pada pembatasan kedua larutan. Dalam proses
ini, Na+akan membentuk ikatan dengan kutub negatif ion fosfor DNA. Kutub
tersebut bila menyebabkan bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak
menolak satu sama lain sehingga pada saat ion Na+ membentuk ikatan dengan
kation kutub negatif fosfat DNA, DNA akan berkumpul (Jamilah, 2005). Selain
itu, garam berperan penting untuk menghilangkan protein dan karbohidrat karena
garam dapat menyebabkan keduanya terpresipitasi, dan bersama dengan
detergen, keduanya berfungsi sebagai lysing buffer.
Penambahan detergen menyebabkan
rusaknya membran sel melalui ikatan yang
dibentuk melalui sisi hidrofobik detergen
dengan protein dan lemak pada membran
membentuk senyawa “lipi protein-detergen
kompleks”.Senyawa tersebut dapat terbentuk
karena protein dan lipid memiliki ujung
hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga
dengan detergen sehingga dapat membentuk
ikatan kimia. Gambar 3. Misel sabun mengikat lemak
Sumber:yulianusi.wordpress.com/category
D. ALAT DAN BAHAN
a. Alat
1. Pisau 6. Beker Glass
2. Alas untuk memotong 7. Objek Glass
3. Plastik 8. Mikroskop
4. Gelas Beker 9. Gunting
5. Pengaduk 10. Tusuk gigi
b. Bahan
1. Pisang
2. Deterjen cair
3. Aquades
4. Garam
5. Etanol dingin
E. CARA KERJA
Menggunting ujung plastik setelah pisang lumat kemudian memasukkan lumatan pisang
ke dalam beker glass
Menambahkan etanol dingin dengan mengalirkannya pada dinding beker glass secara hati-
hati, setelah itu mengamati apa yang terjadi
F. HASIL PENGAMATAN DAN ANALISIS
1
2
3
Keterangan:
1. Larutan etanol dan lem DNA.
2. Lem DNA beserta substrat pisang yang massa jenisnya kecil.
3. Pisang halus yang massa jenisnya paling besar.
Berdasarkan gambar di atas (Kiri: Sebelum penambahan Etanol. Kanan:
sesudah penambahan etanol), bahwa setelah penambahan etanol, terbentuk apungan
seperti lem putih di permukaan dan beberapa bagian pada tengah larutan etanol,
namun sangat sulit teridentifikasi karena substrat pisang yang massa jenisnya kecil
ikut mengapung bersama dengan buih yang terbentuk saat pengadukan bersama
sabun, sehingga tidak begitu nampak dan sulit membedakan kumpulan DNA
dengan bahan lainnya.
G. PEMBAHASAN
Praktikum Biologi Umum II kegiatan 6 ini berjudul “Ekstraksi DNA”
merupakan kegiatan praktikum sederhana yang tanpa melibatkan prosedur yang
lama. Praktikum ini dilaksanakan pada hari senin, 20 april 2015, di laboratorium
IPA 2 FMIPA UNY. Adapun tujuan dari praktikum ini yaitu yang pertama dapat
mengetahui proses isolasi DNA dari sel-sel buah dan dapat memahami gambaran
umum DNA hasil isolasi sebagai unit hereditas.
Alat yang digunakan dalam praktikum ini yaitu, plastik untuk tempat
melumatkan pisang, gelas bekker untuk wadah proses ekstraksi DNA digunakan,
pisau untuk memotong pisang, gunting untuk menggunting plastik setelah pisang
dilumatkan, pengaduk (sendok kaca) untuk mengaduk larutan etanol dan pisang
lembut serta sabun cair supaya homogen, tusuk gigi untuk mengambil ekstrak DNA
yang ada, serta Mikroskop dan perangkatnya untuk mengamati struktur dari DNA
yang dapat teramati dari sampel yang telah diambil. Untuk bahan yang digunakan
yaitu antara lain, pisang sebagai bahan sampel, larutan etanol dingin untuk
mempresipitasi asam nukleat polimerik dengan baik dan terakhir yaitu larutan
garam dan sabun untuk memecah membran dan dinding sel serta membran inti
supaya materi dalam sel dapat keluar.
Langkah pertama yang dilakukan yaitu mengupas 1 buah pisang ambon
yang telah tersedia, lalu menaruh sebagian buah pisang tadi ke dalam plastik dan
melumatnya hingga halus. Saat penghancuran, terjadi pelepasan senyawa polifenol
dan polisakarida. Langkah kedua yaitu meletakkan pisang yang telah lembut tadi ke
dalam beker glass dan menambahkan larutan garam serta sabun cair. Tujuan
penambahan ini adalah untuk memecah membran plasma, dan dinding sel serta
membran inti pada sel. Setelah semua larutan tadi homogen, ditambahkan etanol
dingin secukupnya. Tujuan dari penambahan etanol ini adalah presipitasi DNA
yaitu memisahkan segala materi yang ada dengan DNA sehingga DNA dapat naik
karena massa jenis DNA lebih kecil daripada materi lain dengan penambahan etanol
ini.
Bahasan kali ini akan diuraikan menurut proses dalam isolasi DNA dengan
ekstraksi DNA langkah per langkah. Hal tersebut dilakukan praktikan untuk
memperjelas dan menjabarkan step by step dalam setiap langkah ini, dikarenakan
setiap langkah dalam praktikum ini sangatlah mempengaruhi hasil akhir dari
keberhasilan ekstraksi DNA secara sederhana ini.
4. Penambahan Etanol
Setelah ion Na+ pada garam mengumpulkan, selanjutnya lebih
dipekatkan lagi oleh etanol.
Pemekatan yang sering dilakukan
adalah presipitasi etanol. Dan dengan
adanya garam (kation kovalen seperti
Na+) dan pada suhu di bawah 20º C
atau kurang, etanol absolut akan
mempresipitasi asam nukleat
polimerik dengan baik. Pemekatan ini dilakukan dengan penambahan etanol
pada lapisan atas sampel sehingga terjadi presipitasi DNA pada pembatasan
kedua larutan. Alkohol dingin berfungsi untuk pengikatan strand DNA yang
telah terkumpul kerena pemekatan oleh garam, karena kerapatan alkohol lebih
kecil dibandingkan kerapatan air maka alkohol akan berada di bagian atas
larutan pada tabung reaksi. Strand-strand DNA yang terikat oleh alkohol akan
nampak sebagi benang-benang putih yang terapung di atas filtrat. Berikut ini
proses presipitasi DNA oleh etanol,
a. Ethanol precipitation of nucleic acids is all about solubility.
First we need to know why nucleic
acids are soluble in water. Water is a polar
molecule – it has a partial negative charge
near the oxygen atom due the unshared pairs
of electrons, and partial positive charges near
the hydrogen atoms (see the diagram on the
right).
Because of these charges, polar molecules, like DNA or RNA, can
interact electrostatically with the water molecules, allowing them to easily
dissolve in water. Polar molecules can therefore be described as
hydrophilic and non-polar molecules, which can’t easily interact with water
molecules, are hydrophobic. Nucleic acids are hydrophilic due to the
negatively charged phosphate (PO3-) groups along the sugar phosphate
backbone.
b. The role of the salt in ethanol precipitation.
Ok, so back to the protocol. The role of the salt in the protocol is to
neutralize the charges on the sugar phosphate backbone. A commonly used
salt is sodium acetate. In solution, sodium acetate breaks up into Na+ and
[CH3COO]-. The positively charged sodium ions neutralize the negative
charge on the PO3- groups on the nucleic acids, making the molecule far
less hydrophilic, and therefore much less soluble in water.
c. The role of the ethanol.
The electrostatic attraction between the Na+ ions in solution and the
PO3- ions are dictated by Coulomb’s Law, which is affected by the
dielectric constant of the solution. Water has a high dielectric constant,
which makes it fairly difficult for the Na+ and PO3- to come together.
Ethanol on the other hand has a much lower dielectric constant, making it
much easier for Na+ to interact with the PO3-, shield it’s charge and make
the nucleic acid less hydrophilic, causing it to drop out of solution.
d. The role of temperature in ethanol precipitation.
Incubation of the nucleic acid/salt/ethanol mixture at low
temperatures (e.g. -20 or -80C) is commonly cited in protocols as necessary
in protocols. However, according to Maniatis et al this is not required, as
nucleic acids at concentrations as low as 20ng/mL will precipitate at 0-4C
so incubation for 15-30 minutes on ice is sufficient.
e. The wash step with 70% ethanol.
This step is to wash any residual salt away from the pelleted DNA.
(Oswald, 2007: http://bitesizebio.com/253/the-basics-how-ethanol-
precipitation-of-dna-and-rna-works/)
6. Kesalahan Percobaan
Praktikum kali ini tidak luput dari banyak kesalahan. Kesalahan tersebut
disebabkan oleh beberapa faktor yang mempengaruhi. Berikut ini faktor-faktor
yang mempengaruhi kegagalan praktikum:
a. Pelumatan Pisang yang kurang sempurna dan hanya dilakukan secara
manual, seharusnya pelumatan akan lebih optimal jika menggunakan
blender.
b. Larutan garam yang digunakan praktikan tidak mengetahui konsentrasinya,
sehingga untuk keberhasilannya pun praktikan tidak tahu.
c. Saat pengadukan, praktikan mengaduk antara larutan garam, pisang, dan
sabun cair terlalu cepat sehingga pada campuran homogen terdapat busa
yang banyak dan menutupi permukaan bahan uji. Inilah faktor yang
menurut praktikan paling fatal karena proses selanjutnya menjadi tidak
dapat dilaksanakan secara baik dan praktikan harus membuang gelembung
tersebut.
d. Penambahan etanol dilakukan dua kali oleh praktikan, padahal seharusnya
langsung dan jumlahnya cukup.
e. Saat pengambilan sampel, praktikan bingung membedakan antara pisang
dan DNA karena massa jenis pisang yang berada pada bagian atas pisang
hampir sama dengan masa jenis etanol, sehingga ketika DNA mulai
terpresipitasi, pisang juga ikut naik.
b. Pembentuk Protein
Fungsi kedua adalah sebagai perancang utama proses sintesis protein
(Pembentukan protein). Selama proses sintesis protein, terjadi proses
penerjemahan informasi yang dikode di dalam gen menjadi urutan asam
amino, yang dikenal dengan ekspresi gen.
c. Fungsi Perubahan
Fungsi DNA ketiga adalah DNA sewaktu-waktu harus dapat
mengalami perubahan sehingga organisme yang bersangkutan akan mampu
melakukan adaptasi dengan kondisi lingkungan yang berubah. Tanpa
adanya perubahan pada DNA, maka evolusi tidak akan pernah
berlangsung. Fungsi ini juga menyebabkan suatu perubahan pada gen.
d. Fungsi Evolusioner
DNA sangat membantu makhluk hidup pada proses adaptasi,
sehingga makhluk hidup dapat bertahan hidup di lingkungannya.
H. KESIMPULAN
1. Proses isolasi DNA dari sel-sel buah dapat dilakukan dengan 2 cara yaitu cara
mekanik dan kimiawi. Cara mekanik dengan melumatkan buah yang akan
diisolasi DNA nya. Sedangkan cara kimiawi dengan penambahan-penambahan
reagen, yaitu detergent, NaCl, dan etanol dingin. Tahap-tahap isolasi DNA ada
tiga yaiu yang pertama melumatkan buah yang akan digunakan. Tahap
selanjutnya melisiskan sel dengan menambahkan air garam (NaCl) dan
detergent kedalam buah yang sudah dilumatkan. Pemberian detergent berfunfsi
untuk membuka atau memecah membran sel (baik membrane sitoplasma
maupun membrane nukleus). Tahap terakhir adalah pemurnian DNA dengan
menambahkan etanol dingin ke dalam campuran. Etanol ini berfungsi untuk
memisahkan DNA dari molekul-molekul lain seperti protein.
I. JAWABAN PERTANYAAN
1. Tidak ada struktur yang tampak dari hasil isolasi DNA yang telah dilakukan,
hanya berupa garis yang memanjang, tetapi menurut teori yang ada hasil dari
isolasi DNA akan terlihat benang-benang DNA. Dari hasil percobaan yang
dilakukan hanya ditemukan larutan yang berlendir dibagian atas beaker glass.
J. DAFTAR PUSTAKA
Campbell, Neil A. dkk. 2002. Biologi Jilid 1 Edisi 3. Jakarta: Erlangga.
Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan
Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA
Beragai Macam Buah sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika.
Malang: UNM.
Jusuf, M. 2001. Genetika 1 Struktur dan Ekspresi Gen. Jakarta : Sagung Seto.
Oswald, Nick. 2007. Ethanol Precipitation of DNA and RNA: How it works.
http://bitesizebio.com/253/the-basics-how-ethanol-precipitation-of-dna-and-
rna-works/. Diunggah pada hari Ahad, 26 april 2015 pukul 21.00.
Pierce, A. G.et al. 2005. At A Glance Ilmu Bedah. Jakarta: Erlangga.
Raven, Peter H.et al. 2002. Biology 6th Edition. Boston: Mc Graw-Hill.
Suryo. 2012. Genetika Strata 1. Yogyakarta: UGM Press.
SUMBER GAMBAR:
ulianusi.files.wordpress.com/2013/04/how_surfactants_work1
metawede.files.wordpress.com/2011/05/cara-kerja-surfaktan-deterjen-terhadap
www.phcogrev.com
K. LAMPIRAN
Gambar Gambar
lampiran 1. lampiran 2.
Proses Proses
pelumatan penambahan
pisang Larutan
garam
Gambar Gambar
lampiran 3. lampiran 4.
Proses Proses
penambahan pengadukan
sabun cair