You are on page 1of 5

LP NR.1 M.G.

MICROSCOAPELE FOTONICE

Microscopul fotonic (optic) este un aparat optic de mărit care utilizează ca sursă
de radiaţie fotonul. Se compune din două părţi şi anume partea mecanică şi cea
optică.

1. Partea mecanică cuprinde piciorul microscopului şi coloana microscopului.


Piciorul microscopului : este partea pe care se sprijină microscopul şi cuprinde
sursa de lumină reprezentată de un bec de 6V, un diafragm, o oglindă şi două
şuruburi.
Coloana microscopului : are ataşate de ea mai multe componente.
a. Măsuţa (platina) este formată dintr-o parte superioară mobilă şi o parte
inferioară fixă; are un sistem de cleme (valeţi) cu ajutorul cărora se fixează
lama pe măsuţă; are două scale gradate şi şurubul măsuţei cu ajutorul căruia
se mişcă preparatul în direcţia dorită.
b. Tubul microscopului are ataşat în partea superioară sistemul ocular. În
interiorul tubului se găsesc prismele microscopului, iar în partea inferioară se
găseşte revolverul format dintr-o parte superioară fixă şi una inferioară mobilă
de care se ataşează sistemul obiectiv.
c. Sistemul de vize (şuruburi). Macroviza este şurubul mare negru; realizează
mişcări grosiere ale coloanei microscopului (de ordinul centimetrilor). SE
FOLOSEŞTE CU OBIECTIVUL DE 10X (sau mai mici : 2x, 4x, 6x).
Macroviza se foloseşte pentru prinderea imaginii preparatului. Microviza
(şurubul mic argintiu) realizează mişcări fine ale coloanei microscopului (de
ordinul micronilor), întreaga cursă a coloanei fiind de 2mm. Se foloseşte
pentru obţinerea unei imagini perfect clare a preparatului. Se utilizează cu
oricare dintre obiective.
Şurubul condensorului, şurub mic, negru (vezi sistemul de transmis lumina)

2. Partea optică a microscopului cuprinde sistemul ocular, sistemul obiectiv şi


sistemul de transmis lumina.
a. Sistemul ocular se află în partea superioară a tubului microscopului.
Microscoapele pot fi monoculare sau binoculare. Sistemul ocular este format
dintr-un sistem de lentile. Puterea de mărire a ocularului este de 10x. Prismele
se află în interiorul tubului, au puterea de mărire de 1,6x. Între oculare există o
scală gradată care ajută la reglarea distanţei pupilare a examinatorului.
b. Sistemul obiectiv este ataşat de partea inferioară a revolverului. Există două
tipuri de obiective - uscate (obiectivele de 10x,20x,40x,60x)
- umede sau de imersie (90x)
Sistemul obiectiv este format dintr-un sistem de lentile. Lentila inferioară
numită lentila frontală este plan convexă şi este orientată cu faţa spre preparat.
Obiectivele umede necesită între lentila frontală şi preparat un mediu lichid

1
(ulei de cedru). Sunt obiective citologice, se folosesc pentru examinarea
frotiurilor sangvine.

c. Sistemul de transmis lumina cuprinde


- sursa de lumină reprezentată de becul de 6V
- diafragmul situat în piciorul microscopului, cu rol de a regla intensitatea
fascicolului luminos
- oglinda situată în piciorul microscopului, cu rol de a reflecta raza luminoasă în
axul optic
- condensorul situat sub platină; este format dintr-un sistem de lentile care au
rolul de a focaliza razele luminoase pe preparat, astfel încât lumina să fie
optimă şi uniform repartizată. La nivelul condensorului se află un diafragm,
numit diafragm iris, care funcţionează la fel ca irisul uman. Are un şurub cu
ajutorul căruia se coboară sau se ridică condensorul, reglându-se astfel
intensitatea fascicolului luminos.

PUTEREA DE REZOLUŢIE A MICROSCOPULUI

Puterea de rezoluţie sau puterea de separare a microscopului reprezintă


capacitatea microscopului de a evidenţia două puncte ca distincte. Este distanţa
minimă la care două puncte pot fi văzute ca distincte. Puterea maximă de rezoluţie a
microscopului optic este de 0,2µ comparativ cu puterea de rezoluţie a ochiului uman
emetrop care este de 0,2mm.

PUTEREA DE MĂRIRE A MICROSCOPULUI

Puterea de mărire a microscopului este dată de produsul dintre puterea de


mărire a ocularului, a prismelor şi a obiectivului.

REGULI DE BAZĂ PRIVIND EXAMINAREA LA MICROSCOP

1. conectarea la reţea
2. se aduce în axul optic obiectivul de 10x
3. cu ajutorul valeţilor se fixează lama pe platină
4. privind din lateral se aduce fragmentul de ţesut examinat în dreptul spotului
luminos
5. cu ajutorul macrovizei (ob. 10x) se coboară coloana microscopului atât cât
este posibil
6. privind în oculare se reglează distanţa pupilară şi cu ajutorul macrovizei se
ridică uşor coloana microscopului până când se obţine imaginea preparatului
7. cu ajutorul microvizei se obţine imaginea perfect clară
8. se reglează condensorul astfel încât lumina să fie optimă şi uniformă
2
9. fără să mai atingem macroviza, rotim revolverul şi aducem în axul optic
obiectivul de 20x; cu microviza obţinem imaginea perfect clară
10. la fel se procedează şi cu obiectivele de 40x,60x,90x
11. la sfârşitul examinării se aduce în axul optic obiectivul de 10x, se
îndepărtează lama de pe platină şi se deconectează microscopul de la reţea.

MICROSCOPUL CU CONTRAST DE FAZĂ

Este un microscop special care măreşte contrastul între diferitele structuri ale
unui preparat proaspăt sau nativ (celulele sunt vii, preparatul nu este fixat, colorat).
Atunci când unda luminoasă traversează structuri cu consistenţe diferite,
aceasta este supusă unui proces de defazare. Microscopul cu contrast de fază
transformă diferenţa de drum a razelor luminoase în diferenţă de amplitudine,
perceptibilă vederii. Pentru examinarea în contrast de fază, unui microscop obişnuit i
se ataşează obiective speciale cu inel de fază, un diafragm inelar şi un microscop
ajutător.
Acest microscop permite studiul celulelor în stare vie, observându-se astfel
viabilitatea celulară (mişcările ciliare, flagelare, diviziunea celulară, reacţii celulare
la diferiţi stimuli fizici şi chimici). Permite de asemenea studiul culturilor de celule.

MICROSCOPUL CU LUMINĂ POLARIZATĂ

Cu acest microscop se studiază fenomenul de birefringenţă (dublă refracţie).


Prezintă două prisme speciale numite nicoli, confecţionate dintr-un material numit
spath de Islanda. Cele două prisme poartă numele de polarizor şi analizor.
Birefringenţa se studiază în poziţie de nicoli încrucişaţi, atunci când planurile
celor doi nicoli sunt perpendiculare. Astfel, câmpul microscopului devine întunecat
iar dacă structurile studiate sunt birefringente acestea apar intens strălucitoare.
Acest microscop se utilizează pentru examinarea structurilor cu compoziţie
chimică macromoleculară cu aspect liniar (ex. fibrele de colagen, fibrele de mielină,
fibra musculară striată), structurile cu simetrie radială (ex. granule proteice, lipidice,
colesterol) şi pentru studiul structurilor (ex. membrane biologice).

MICROSCOPUL CU LUMINĂ FLUORESCENTĂ

Acest microscop studiază fenomenul de fluorescenţă, fenomen luminos care ia


naştere în structuri biologice primare (naturale) sau secundare (artificiale). Metoda
se bazează pe proprietatea unor substanţe care, iradiate cu un fascicol de lumină cu o
lungime de undă mică şi cu frecvenţă înaltă, emit radiaţii cu o lungime de undă mare
şi o frecvenţă joasă – lumina fluorescentă.
Microscopul cu lumină fluorescentă este un microscop special care are ca sursă
de lumină o lampă tubulară de cuarţ cu vapori de mercur sub tensiune înaltă.
3
Microscopul este dotat cu filtre speciale şi anume filtrul de excitaţie situat în
piciorul microscopului, între oglindă şi condensor, cu rolul de a opri toate radiaţiile
în afara U.V. şi filtrul de protecţie situat la nivelul ocularelor, cu rol de a proteja
retina.
Aşa cum am amintit, fluorescenţa unui preparat poate fi clasificată în două
categorii :
a. fluorescenţa primară – naturală sau autofluorescenţa, este produsă de
substanţe care se găsesc în mod natural în celule sau ţesuturi : dintele
natural, clorofila (roşu), anumite virusuri, bacilul Koch (verde
strălucitor), amine biogene
b. fluorescenţa secundară – artificială, provocată, este indusă prin tratarea
ţesuturilor cu fluorocromi, folosind metoda fluorocromării cu acridin-
orange. Fluorocromii sunt substanţe chimice cu proprietatea de a se fixa
de anumite structuri din preparat şi de a emite de la nivelul acestora
lumina indusă. Cu ajutorul fluorocromării se pot identifica acizii
nucleici (ARN - roşu, ADN - verde-gălbui), fibre de colagen elastice şi
de reticulină (verde), nucleii leucocitelor (verde), etc.
Coloraţia cu acridin orange se mai utilizează în citodiagnosticul precoce al
cancerului (studiul acizilor nucleici în condiţiile unui proces tumoral)
Cea mai importantă aplicaţie este imunofluorescenţa care se bazează pe
cuplarea unui acid cu un fluorocrom; prin fluorescenţa indusă poate fi identificată
reacţia antigen-anticorp, localizarea antigenelor în celulă.

ETAPELE CONFECŢIONĂRII PREPARATULUI PERMANENT

1. Recoltarea – recoltarea materialului biologic se poate efectua fie de la


organisme vii (biopsie), fie de la cadavre (necropsie). Fragmentul recoltat nu
trebuie să fie mai mare 0,5 cm.
2. Fixarea – constă în menţinerea, conservarea structurilor recoltate într-o
formă cât mai apropiată de cea existentă în organismele vii. Prin fixare se
stopează procesele vitale şi se împiedică fenomenele de descompunere.
Fixarea se realizează prin diferite metode : fizice (flambare, congelare cu
zăpadă carbonică la -30ºC, freon la -270ºC, azot lichid); chimice – fixatorii
pot fi simpli (formol, alcool metilic, alcool etilic) sau în amestec (Bouin -
pentru studiul organitelor şi produşilor de secreţie, Carnoy - pentru studiul
acizilor nucleici, reticulului endoplasmic, Da Fanno, Ramon y Cajal - pentru
studiul mitocondriilor).
3. Deshidratarea – se fac 3 băi succesive de alcool cu concentraţie crescătoare
70º,90º şi absolut.

4
4. Includerea – mediul de includere este parafina cu punct de topire la +56ºC,
rezultând blocurile de parafină.
5. Secţionarea – se realizează cu ajutorul microtomului cu ajutorul căruia se
obţin secţiuni de ordinul micronilor (5-7µ).
6. Lipirea secţiunilor pe lamă – se realizează într-o baie de apă caldă; lama se
pregăteşte în prealabil cu albumină Mayer; secţiunea se întinde pe lamă şi se
lasă în termostat 24h pentru uscare.
7. Deparafinarea – se realizează cu xilen, cu ajutorul căruia se îndepărtează
parafina.
8. Hidratare – 3 băi consecutive în alcool cu concentraţii descrescătoare –
absolut, 90º, 70º.
9. Colorarea – există mai multe categorii de coloranţi :
 Bazici (nucleari) – hematoxilina (colorează nucleul în albastru-violet),
albastru de metilen
 Acizi (citoplasmatici) – eozina (colorează citoplasma în roşu), fuxina acidă
 Neutri – May Grümwald Giemsa (specific pentru frotiurile de sânge)
 Indiferenţi – Sudan III, Sudan IV (pentru produşii lipidici)
10. Deshidratarea – idem cu punctul 3.
11. Clarificarea – se realizează cu xilen, cu ajutorul căruia se îndepărtează
surplusul de colorant.
12. Montarea – se pune o picătură de balsam de Canada peste preparat, se
aşează lamela şi se elimină eventualele bule de aer. Preparatul astfel obţinut
se aşează în termostat la 37ºC
13. Etichetarea.