LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế
phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các
lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm, lượng
enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500
triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau. Khoảng 75% chế phẩm là
enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Protease là
enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế
biến thực phẩm (đông tụ sữa làm fomat, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất
lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực
phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp… Vì tầm quan trọng
của protease trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong công nghệ thực phẩm, nên nhóm
chúng tôi đã lựa chọn ứng dụng của protease trong công nghệ thực phẩm làm đề tài
báo cáo.

3
 DANH MỤC BẢNG, HÌNH, SƠ ĐỒ
Trang
Bảng 1: Một số enzyme đông tụ sữa trong sản xuất Fomat.......................... 14
Bảng 2: Tỉ lệ nước, muối trong ướp cá......................................................... 27
Hình 1: Mô hình phân tử enzyme protease (papain)...................................... 6
Hình 2: Cấu trúc không gian enzym protease (renin).................................... 7
Hình 3: Bào tử xạ khuẩn............................................................................... 10
Hình 4: Sản xuất Fomat.................................................................................. 13
Sơ đồ 1: Các giai đoạn trong quá trình thu nhận protease............................ 10
Sơ đồ 2: quy trình chế biến nước mắm bằng phương pháp cổ truyền........... 25
Sơ đồ 3: qui trình chế biến nước mắm bằng phương pháp vi sinh vật.......... 26
Sơ đồ 4: Các giai đoạn trong sản xuất nước chấm lên men chìm................. 28
Sơ đồ 5: Quy trình sản xuất nước tương theo phương pháp vi sinh vật........ 29
Sơ đồ 6: Quy trình sản xuất nước tương theo phương pháp thủy phân......... 30

4
 NỘI DUNG
Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp
protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn.
Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử
dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất. Các chế phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy
sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm 20
– 30%. Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến phương pháp tách và tinh chế enzyme nhằm
thu được chế phẩm có độ tinh khiết cao rất cần thiết.
Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme
ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và
xạ khuẩn… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất
enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp và đời sống.
Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp
trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân
(75%), và protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công
nghiệp (60%).

1. TỔNG QUAN VỀ PROTEASE

1.1. Giới thiệu chung
Nhóm enzyme protease (peptidase) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết
peptid (-CO-NH-) trong phân tử protein, polypeptid đến sản phẩm cuối cùng là các
acid amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận
chuyển acid amin.
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ
tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi
sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ
dày bê...). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc
điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao
gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên
rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất.

5
 Hình 1: Mô hình phân tử enzyme protease (papain)

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ
tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi
sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ
dày bê...). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc
điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao
gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên
rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất.
Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử
dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết peptitd
định trước. Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm carboxyl
hoặc nhóm amin được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm,…
Trong cơ thể protein thực phẩm được phân giải ở bộ máy tiêu hóa bởi các
enzyme phân giải protein, đầu tiên là pepsin trong dịch dạ dày và sau đó là các
protease được tiết ra ở tuyến tụy và từ các tế bào ở màng nhày thành ruột. Các acid
amin tự do và các peptid ngắn được hấp thụ và đi qua các tế bào hình lông ở thành
ruột. Phần lớn các peptid được hấp thụ bị thủy phân ở các tế bào thành ruột. Các
acid amin được hấp thụ sẽ đi vào gan và sau đó tham gia vào quá trình chuyển hóa.
Quá trình thủy phân protein đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nhiều loại
thực phẩm. Quá trình này có thể được thực hiện nhờ chính protease của thực phẩm
đó hay do các protease vi sinh vật được đưa vào trong quá trình chế biến thực phẩm.

6
 Trong nhiều trường hợp các tính chất protein thực phẩm được cải thiện nhờ
thủy phân hạn chế hoặc sâu sắc nhờ các enzyme protease. Sự thủy phân hạn chế có
tác dụng tăng khả năng nhũ hóa và tạo bọt của protein (do tăng tính hòa tan và khả
năng khuếch tán đến bề mặt phân chia).

Hình 2: Cấu trúc không gian enzym protease (renin)

1.2. Phân loại protease

 Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) trong hệ thống
phân loại các nhóm enzyme;
 Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase;
 Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptit, exopeptidase được phân chia
thành hai loại:
 Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptit ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptit để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặc một
tripeptit;
 Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu C của
chuỗi polypeptid và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptid.
 Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn
nhóm:
 Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine
trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động

7
 xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và
subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như
chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi
khuẩn như Subtilisin Carlsberg, Subtilisin BPN. Các serine proteinase
thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất
tương đối rộng.
 Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm
hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin,
bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein
proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất
rộng.
 Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm
pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin,
cathepsin, rennin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung
tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
 Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm
thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo
proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới
tác dụng của EDTA.
 Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
 Protease acid: pH = 2 – 4;
 Protease trung tính: pH = 7 – 8;
 Protease kiềm: pH = 9 – 11.
1.3. Nguồn thu protease vi sinh vật
Trong công nghiệp protease có thể thu từ nhiều nguồn chủ yếu từ vi sinh vật
như: vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn.
1.3.1. Vi khuẩn:
Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn,
chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng.
Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase
hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó

8
protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới
80% các liên kết peptid trong phân tử protein.
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus
subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi
Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất. Các vi
khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và
kiềm yếu.
Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5 – 8)
và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein
thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các
protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm.
Chúng được sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và
một số giống thuộc chi Clostridium.
Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân
tử từ 20.000-30.000. Ổn định trong khoảng pH 6 – 12 và hoạt động trong khoảng
pH rộng 7 – 12.
1.3.2. Nấm mốc:
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng
dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola,
A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum… Các loại nấm mốc này có khả
năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp
chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5 – 3.
Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti…
cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất
fomat.
1.3.3. Xạ khuẩn:
Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi
khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả
năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. trerimosus...

9
 Hình 3: Bào tử xạ khuẩn

Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được
tách chiết từ S. grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy
phân tới 90% liên kết peptit của nhiều protein thành amino acid. Ở Liên Xô (cũ),
người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ S. grieus có tên là protelin.
Từ S. fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin. Ở
Mỹ, chế phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da. Protease từ S.
fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công nghiệp
chế biến thịt.
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật
thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.
1.4. Thu nhận protease từ vi sinh vật
Sự thu nhận protease từ vi sinh vật trải qua các giai đoạn chính có thể tóm tắt
thành sơ đồ như sau:

Sơ đồ 1: Các giai đoạn trong quá trình thu nhận protease

10
 1.4.1. Tuyển chọn chủng:
Yêu cầu tuyển chọn chủng tổng hợp được enzyme cần thiết, với lượng đáng
kể và hoạt tính cao. Đối với việc thu protease thì thu từ nguồn như nấm mốc, vi
khuẩn, xạ khuẩn.
Môi trường tuyển chọn phân lập thường từ đất, nước, lương thực, thực
phẩm…Tuy nhiên các chủng phân lập theo phương pháp thông thường chỉ tổng hợp
được một lượng nhỏ enzyme (enzyme bản thể), người ta cần tiến hành gây đột biến
bằng phương pháp sinh học, lý, hóa học… để tạo chủng có khả năng “siêu tổng hợp
enzyme”. Vi sinh vật sau khi được tuyển chọn cần được nhân giống và nuôi trong
điều kiện tối ưu để chúng sinh sản và phát triển tốt, tổng hợp nhiều enzyme.
1.4.2. Môi trường và phương pháp nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp
Protease:
Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh
hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành
phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của
vi sinh vật và tổng hợp enzyme.
Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện
tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì
chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng phong
toả của chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không
bị cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là
cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp.
Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn,
Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác.
Về phương pháp nuôi cấy hiên nay người ta thường dùng hai phương pháp
sau:
 Nuôi bề mặt (môi trường nuôi dạng rắn) hay trên bề mặt dạng lỏng;
 Nuôi bề sâu (nuôi chìm) – môi trường nuôi dạng lỏng.
1.4.3. Phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme:
Tách chiết enzyme theo các công đoạn như sau:
 Phá vỡ màng tế bào để giải phóng enzyme: có thể dùng các phương pháp vật
lý, hóa học, cơ học…;
11
  Dùng dung môi chiết enzyme: thường dùng nước, NaCl, dung dịch đệm có
pH ổn định và phù hợp với enzyme;
 Lọc, ly tâm;
 Kết tủa enzyme: có thể dùng dung môi hữu cơ (ethanol, acetol), dùng muối,
điểm đẳng điện pH = pI;
 Ly tâm, tách tủa;
 Sấy kết tủa cho đến khô.
Qua các bước như trên ta thu được enzyme chưa tinh khiết, cần qua giai đoạn
tinh sạch enzyme để được enzyme tinh khiết. Có nhiều phương pháp tinh sạch như
sau:
 Phương pháp thẩm tích Dialise: là phương pháp sử dụng màng lọc bán thấm
chỉ cho những chất có khối lượng phân tử nhỏ đi qua;
 Phương pháp kết tủa phân loại: thay đổi nồng độ chất kết tủa;
 Phương pháp điện di;
 Phương pháp lọc gel (gel Sephadex);
 Phương pháp sắc ký.

2. ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

2.1. Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa
2.1.1. Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa [4]:
Sữa là loại thực phẩm chứa các chất dinh dưỡng đầy đủ và cân đối nhất. Các
sản phẩm từ sữa là rất đa dạng và phổ biến. Từ nguyên liệu sữa, người ta đã cho ra
vô vàn các sản phẩm có cấu trúc, trạng thái và hương vị khác nhau.
Sữa chứa hầu hết các men có trong tự nhiên. Các men này vào sữa theo tuyến
sữa và từ các vi sinh vật trong không khí hay dụng cụ chứa sữa như lipase, protease.
Protease tham gia vào quá trình thủy phân protein tạo thành các sản phẩm
như pepton, acid amin,.... Một số peptone được hình thành có thể gây vị đắng trong
sữa. Protease được hình thành tự nhiên trong sữa và chúng không bị phân hủy hoàn
toàn khi thanh trùng ở nhiệt độ 76 ÷ 78oC.
Khi điều kiện vệ sinh không tốt, một số men tạo ra từ các nguồn vi sinh vật
xâm nhập vào gây tác hại đến sữa. Chúng có thể làm giảm nghiêm trọng chất lượng

12
của sữa ban đầu. Sự có mặt một số men trong sữa được dùng làm chỉ tiêu trong
kiểm tra chất lượng sữa.
Các sản phẩm từ sữa có thể ở dạng rắn như các fomat với kết cấu hình thù và
tính cảm vị đặc trưng, dạng hạt đơn điệu như trong các sữa bột, dạng đặc mịn màng
như trong các sữa chua, dạng lỏng như trong các sữa cô đặc với đường.
Trong đó, mảng sản phẩm lên men truyền thống từ sữa vô cùng phong phú
và chiếm một vị trí quan trọng trong ngành công nghiệp chế biến các sản phẩm sữa.
Có thể kể ra đây là bơ, fomat, kefir, yoghurt,…do đó các enzyme sử dụng trong
công nghiệp sữa ngày càng được nghiên cứu và ứng dụng, có thể kể đến như rennin
(chymosin), pepsin có thể làm đông tụ sữa được dùng trong sản xuất fomat, sữa
đông tụ…
2.1.2. Ứng dụng trong việc sản xuất fomat:

13
 Hình 4: Sản xuất Fomat

Fomat là sản phẩm chế biến từ sữa có sử dụng quá trình lên men lactic. Đây
là môt thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, bảo quản được lâu, rất phổ biến và
thích hợp khẩu vị người châu Âu, châu Mỹ.
Protease ngoài khả năng thuỷ phân protein đều có khả năng đông tụ sữa tuỳ
mức độ khác nhau, mạnh nhất là rennin, sau đó là pepsin và các protease khác. Quá
trình đông tụ sữa được ứng dụng trong sản xuất fomat. Protease được thu nhận từ
một số vi sinh vật như Asp. candidus, P. roquerti, Bac. mesentericus,…

Bảng 1: Một số enzyme đông tụ sữa trong sản xuất Fomat

Nhóm Nguồn gốc Tên enzyme
Chymosin A, pepsin và
Dạ dày bê
gastriscin
Động vật Dạ dày cừu Chymosin và pepsin
Dạ dày dê Chymosin và pepsin
Dạ dày heo Pepsin A, B và gastricin
Cyprosin 1, 2, 3 hoặc
Thực vật Cynara cardunculus
cardosin A, B
Rhizomucor miehei
Vi sinh vật R. pusillus Aspartic protease
Cryphonectria parasitica
Vi sinh vật chuyển gen Aspergillus niger
Chymosine B
Chymosin từ bê Kluyveromyces lactis

2.1.2.1. Rennin:
 Khái niệm chung:
 Năm 1951, Heinz khám phá ra enzyme đông tụ sữa ở dịch tiêu hoá
ngăn thứ tư dạ dày bê gọi là rennin.
 Rennin có trong dịch dạ dày của động vật đang bú mẹ (trâu, bò, dê…
mới đẻ), đặc biệt ngăn thứ tư dạ dày bê. Khi con vật lớn hơn 5 tháng tuổi, bắt
đầu ăn, hàm lượng rennin giảm dần và được thay thế bằng pepsin.

14
  Từ năm 1971, người ta đã thành công trong việc dung chymotrypsin
cố định trên carboxylmethylcellulose để làm dông tụ sữa thay cho rennin đắt
tiền [3].
 Phân loại:
 Rennin là một protease acid tính, số phân loại E.C.3.4.4.3. Rennin đặc
biệt có khả năng đông tụ sữa cao và phân giải protein (chủ yếu casein của
sữa).
 Rennin là enzyme thuỷ phân liên kết peptit trong protein có trọng
lượng phân tử khoảng 33.000 – 34.000 Da. Rennin tinh khiết có dạng tinh
thể hình lập phương. Về mặt cấu tạo phân tử, rennin có mạch polypeptit có
gắn glycine trong mạch có vòng cacbon. Các liên kết hydro có thể đóng vai
trò quan trọng trong việc bảo vệ cấu trúc bậc 2, 3 của rennin ở dạng hoạt
động. Trong thành phần hoá học, rennin chứa nhiều amino acid có tính acid
nhưng ít hơn pepsin. Do đó, rennin thể hiện tính acid yếu hơn pepsin.
 Đặc tính và khả năng thuỷ phân của rennin:
 Rennin tinh khiết có đặc tính của một globulin. Điểm đẳng điện của
rennin pI = 4,5. Rennin thấm chọn lọc qua màng tế bào nhưng không thấm
qua màng tế bào ở môi trường kiềm.
 Đặc hiệu thuỷ phân:
 Rennin chỉ thuỷ phân các liên kết peptit và không làm ảnh hưởng đến
liên kết ester và amin. Rennin đặc biệt có tác động mạnh lên các liên kết
được tạo nên bởi tyrosine và phenylalanine.
 Rennin tác động lên cơ chất casein của sữa bò và những loại sữa khác.
Đặc tính thuỷ phân casein của rennin phụ thuộc rất nhiều vào pH. Ở pH = 6,8
rennin phân cắt trung bình 1/33 còn ở pH = 2,3 thì phân cắt 1/8 số liên kết
peptit trong phân tử casein.
 Sự hoạt hoá prorennin thành rennin:
 Prorennin là một chuỗi protein đơn chứa 3 cầu nối disulfite được giữ
lại trong phân tử rennin hỗ trợ cho hoạt động của enzyme.
 Quá trình hoạt hoá prorennin giống sự hoạt hoá pepsinogen, ở pH < 3
quá trình chuyển hoá từ prorennin thành rennin xảy ra rất mạnh. Nhưng quá

15
 trình hoạt hoá prorennin không phải là quá trình tự xúc tác và peptit được
giải phóng ra không thể có tác động kìm hãm với rennin.
 Các yếu tố ảnh hưởng:
 Hoạt động xúc tác tối ưu của rennin ở pH = 3,7; pH tối ưu của rennin
nằm ở vùng pH acid yếu hơn so với pepsin và thay đổi tuỳ theo cơ chất vào
khoảng 3,4 – 4. Đặc điểm của rennin là tác động ở môi trường acid vừa phải
và cần có sự hiện diện Ca2+. Ở pH = 3,7, các ion Ca2+ làm tăng hoạt độ
rennin, những cation hoá trị 1+ làm giảm hoạt độ của nó.
 Ở pH = 7 có sự tự phân huỷ và hoạt tính thuỷ phân của rennin ở pH
này rất thấp. Hoạt tính bị giảm khi pH > 6 kèm theo sự xuất hiện protein kết
tủa trong dung dịch ở nhiệt độ cao.
 Rennin tiếp xúc trong môi trường kiềm yếu pH = 9 sẽ bị bất hoạt dần
nhưng trong môi trường acid mạnh sẽ bất hoạt nhanh chóng.
 Bảo quản rennin:
 Dịch rennin có màu hổ phách nhạt đến màu nâu đậm hoặc bột màu
trắng đến nâu nhạt.
 Rennin tinh khiết được bảo quản ở 15oC. Dịch rennin được bảo quản ở
nồng độ cao 14 – 20% và có thể thêm Na – benzoate và propylene – glycol
để bảo quản.
 Thu nhận enzyme rennin:
 Nguyên liệu thu rennin là ngăn thứ tư dạ dày bê non (dạ múi khế)
dưới 5 tháng tuổi.
 Xử lý sơ bộ: tách mỡ, rửa sơ: Lấy phần múi khế của bao tử bê và lộn
ngược một cách nhẹ tay để bỏ hết thức ăn dư, tách bỏ phần mỡ, cân trọng
lượng. Rửa nhẹ bằng nước lạnh , không nên rửa quá kỹ sẽ làm mất enzyme,
sau đó rửa bằng dung dịch muối NaCl 15%.
 Xay nhuyễn: Dùng kéo cắt nhuyễn màng nhầy dạ dày thành miếng
nhỏ khoảng 1cm rồi xay nhuyễn đồng nhất nhằm phá vỡ các mô tế bào tạo
điều kiện cho quá trình trích ly.
 Chiết enzyme và chỉnh pH = 4:

16
  Bản chất của quá trình chiết tách enzyme từ màng nhầy dạ dày động
vật là sự phối hợp của ba giai đoạn: phá vỡ tế bào, hoạt hoá và chiết tách
enzyme.
 Có hai phương pháp là: phương pháp chiết và phương pháp tự phân.
Cả hai phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc: enzyme rennin được giải
phóng từ màng nhầy dạ dày động vật bằng cách chiết trong dung dịch acid
loãng hay nhờ sự tự phân trong môi trường acid.
• Phương pháp 1: phương pháp chiết: dạ dày rửa sạch, tách màng
nhầy, nghiền ngâm vào nước 5% butanol hay glycerin có cloroform để
tránh nhiễm khuẩn, thời gian ngâm 48 – 72 giờ, nhiệt độ thường. Sau đó
chế hoá bằng etanol để rennin kết tủa.
• Phương pháp 2: phương pháp tự phân:
♦Niêm mạc dạ dày xay nhỏ, dùng HCl hay H 3PO4, H2SO4 với
nồng độ thích hợp để chiết xuất và hoạt hoá prorennin thành rennin.
HCl là acid vô cơ quan trọng có trong thành phần dịch vị dạ dày
động vật giúp prorennin được hoạt hoá thành rennin. Thời gian tự
phân 30 giờ ở 40 – 42oC.
♦Dùng HCl để điều chỉnh pH môi trường về 4 sẽ cho hoạt tính
enzyme cao, khả năng hoà tan tốt.
♦Chiết enzyme dựa theo phương pháp tự phân do phương pháp
này có sự phá vỡ một cách triệt để cấu trúc tế bào, hiệu suất thu
enzyme cao hơn phương pháp chiết 5–7 lần.
 Phối trộn NaCl 12% vào dạ dày bê theo tỉ lệ 1: 3 giúp cho quá trình
chiết tách .
 Khuấy: khuấy đều, bổ sung thêm chất bảo quản Natri benzoat 1% để
tránh VSV phát triển trong dung dịch, chống oxy hoá,..
 Lọc: vớt bỏ hết lớp mỡ phía trên mặt, sau đó lọc qua nhiều lớp vải
mùn để thu được dịch enzyme.
 Kết Tủa: tiến hành tủa enzyme theo phương pháp diêm tích với muối
NaCl nồng độ bão hoà 25%. Cho muối từ từ, khuấy nhẹ đến khi dung dịch
bão hoà, để tủ lạnh 20 phút. Tủa bằng muối trung tính có nồng độ cao để kết
tủa thuận nghịch enzyme mà không làm giảm hoạt tính của chúng. Ngoài ra,
17
 có thể dùng các tác nhân tủa như: amon sulfate, cồn tuyệt đối, aceton,
izopropanol… Trong quá trình kết tủa bằng dung môi hữu cơ tạo ra một
nhiệt lượng lớn có thể làm mất hoạt tính enzyme. Do đó, dung dịch sau tự
phân đã lọc cùng dung môi được làm lạnh trước khi sử dụng và dung môi
phải được cho từ từ và tránh sự tăng nhiệt độ cục bộ bên trong hỗn hợp. Thời
gian 5–10 phút, nhiệt độ thấp 0–5oC.
 Ly tâm: hỗn hợp dung dịch sau khi kết tủa để yên đem ly tâm lạnh ở
4oC, trong 45 phút, tốc độ 5000 vòng/phút để thu tủa.

 Tinh sạch enzyme rennin:

Có thể sử dụng hai phương pháp sau:
 Phương pháp1: thẩm tích bằng màng bán thấm (cellophan)
Nguyên tắc:
Màng bán thấm (cellophane) có cấu tạo gồm nhiều lỗ nhỏ dùng để
tách muối và cho chất có phân tử lượng nhỏ qua túi và giữ lại những chất
có phân tử lượng lớn theo nguyên tắc khuyếch tán từ nồng độ cao (dung
dịch trong cellophane) đến nồng độ thấp (bên ngoài cellophane) cho đến
khi đạt cân bằng nồng độ.
Cho dịch rennin thô vào giấy cellophan, đặt vào nước cất lạnh có
nhiệt độ 0–4oC, khuấy và thay nước cất lạnh cho đến khi thử âm tính với
AgNO3, thời gian thẩm tích khoảng 2 ngày đêm.
 Phương pháp 2: phương pháp sắc ký lọc gel sephadex G–50
Nguyên tắc:
Khi cho một dung dịch chứa nhiều chất có phân tử lượng khác nhau
chạy qua cột chứa các hạt gel sephadex đã trương nở thì xảy ra quá trình
tách những phân tử có kích thước và trọng lượng khác nhau. Những chất
có phân tử lượng nhỏ sẽ lọt vào bên trong lỗ gel do đó sẽ di chuyển chậm
qua cột. Các chất có phân tử lượng lớn hơn sẽ di chuyển bên ngoài hạt gel
nên sẽ chuyển nhanh và giải phóng ra khỏi cột trước. Sau đó, chất có
phân tử lượng nhỏ sẽ lần lượt đi ra theo mức độ phân tử lượng của chúng.
Kết quả là tách được các chất có phân tử lượng khác nhau thành các phân

18
 đoạn theo trình tự: các phân đoạn có trọng lượng phân tử lớn ra trước, các
phân đoạn có trọng lượng phân tử nhỏ ra sau.
 Sấy đông khô:
 Nguyên tắc của quá trình sấy đông khô: Nguyên tắc của phương pháp sấy
đông khô là tách nước ra khỏi nguyên liệu bằng cách chuyển từ trạng thái
đá (rắn) vào trạng thái khí mà không qua giai đoạn lỏng (nước). Nhờ vậy,
nước được đưa ra khỏi nguyên liệu mà không làm hỏng nguyên liệu.
 Quá trình sấy đông khô: gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn 1– làm lạnh: đây là giai đoạn quan trọng làm lạnh nguyên
liệu xuống điểm eutectic - điểm có nhiệt độ thấp nhất mà tại đó pha lỏng
và pha rắn cùng tồn tại - đảm bảo cho quá trình thăng hoa xảy ra ở giai
đoạn kế tiếp.
Giai đoạn 2– sấy bậc 1: tạo áp suất chân không và hạ nhiệt độ xuống
-40oC để nước trong nguyên liệu thăng hoa ở trạng thái lạnh.
Giai đoạn 3– sấy bậc 2: giai đoạn này có nhiệt độ cao hơn giai đoạn
sấy bậc 1 để giúp cho nguyên liệu giữ nguyên các tính chất hoá lý. Giai
đoạn này áp suất chân không tiếp tục thúc đấy quá trình thăng hoa.
 Tính chất của sản phẩm sấy đông khô:
Nếu sấy ở nhiệt độ thường dễ làm enzyme bị hư hỏng, mất đi tính chất
ban đầu thì phương pháp này giúp cho enzyme giữ nguyên được tính chất
hoá lý và có thể bảo quản trong thời gian dài.
Sau khi sấy đông khô, enzyme thu được có dạng mảnh, màu trắng
hoặc phớt hồng.
2.1.2.2. Quy trình chế biến fomat:
 Giai đoạn lên men sữa, kết tủa casein:
Sữa sau khi đã thanh trùng Pasteur ở 85 – 95 oC từ 15 - 20 phút, dùng chế
phẩm men Rennin và vi khuẩn lactic để kết tủa sữa. Vi khuẩn lactic lên men sinh ra
acid lactic, làm giảm pH môi trường tạo điều kiện thuận lợi để casein kết tủa và
enzyme Rennin giúp cho sự kết tủa casein tốt hơn, casein lắng xuống và thu được
fomat. Ngoài tác dụng kết tủa, Renin còn thủy phân một phần casein thành pepton,
acid amin…

19
 Chú ý: Thanh trùng để tiêu diệt các loại vi trùng là cần thiết. Tuy nhiên,
thanh trùng đã phá vỡ cân bằng giữa các muối, làm giảm hàm lượng muối calci mà
kết quả là làm giảm khả năng đông tụ sữa bằng men sữa (rennin). Để khắc phục
nhược điểm này, người ta phải bổ sung calci dưới dạng CaCl2.
 Giai đoạn ép nén tách huyết thanh:
Phần casein kết tủa được ép từ 20 - 24 giờ, ở nhiệt độ 35 – 50oC. Trong thời
gian này sự lên men lactic vẫn tiếp tục mạnh mẽ. Sau khi ép huyết thanh ra khỏi cục
sữa kết tủa, Fomat lúc này có thành phần chủ yếu là casein và lipid. Huyết thanh
sữa bị loại ra chứa lacto, lactalbumin, lactoglobulin…

 Giai đoạn muối fomat:

Khối fomat sau khi tách huyết thanh sẽ cho vào bể nước muối nồng độ 24%
ngâm trong vài ngày để tăng vị mặn, tạo sự đồng nhất về thành phần cho khối fomat
và kìm hãm vi sinh vật có hại phát triển chủ yếu là trực khuẩn đường ruột.
 Giai đoạn ủ chín:
Sau khi muối xong, khối fomat được chuyển vào hầm lên men ở nhiệt độ 18
– 22oC, độ ẩm 80 - 90%. Quá trình lên men chậm dần do đường lactoza đã bị tách
hầu hết trong giai đoạn ép nén. Trong khối fomat, vi khuẩn Propionic hoạt động
mạnh, lên men lactic thành acid propionic, acid acetic và CO2. Cả hai acid này làm
cho Fomat có vị chua, hăng đặc biệt. Sự lên men propionic sẽ kết thúc sau 2 – 2,5
tháng. Giai đoạn này gọi là quá trình ủ chín. Tuy vậy, quá trình ủ chín Fomat vẫn
được tiếp tục một thời gian nữa cho fomat hoàn toàn chín. Trong thời gian này
casein tiếp tục được phân giải thành đạm dưới tác dụng của enzyme Rennin và vi
khuẩn lactic. Khi fomat chín thì 2/3 casein được phân giải thành pepton, acid amin
và một ít NH3.
Fomat được bảo quản lạnh, bao gói bằng một số vật liệu thích hợp, cách ẩm
và chống oxy hóa tốt để sử dụng lâu dài và vận chuyển đi xa.
2.2. Ứng dụng protease trong công nghệ sản xuất nước mắm
Nước mắm là loại thực phẩm, gia vị giàu dinh dưỡng, chứa nhiều loại acid
amin, đặc biệt là các loại acid amin không thay thế. Nhờ hệ enzyme có sẵn do hệ vi

20
sinh vật sống trong ruột cá, các protid của cá được thủy phân thành acid amin,
peptid.
Thành phần đạm có trong nước mắm:
Đạm toàn phần 13 – 30g/l
Đạm formon 12 – 18g/l
Đạm NH3 4 – 6g/l
2.2.1. Các hệ enzyme trong sản xuất nước mắm
Gồm 3 hệ enzyme lớn:
 Hệ enzyme Metalo-protease (Aminodipeptidase):
Hệ enzyme này tồn tại trong nội tạng của cá và chịu được nồng độ muối cao
nên ngay từ đầu nó đã hoạt động mạnh, giảm dần từ tháng thứ 3 trở về sau.
Loại enzyme này có hoạt tính khá mạnh, có khả năng thủy phân rộng rãi đối
với các loại peptid. Đây là nhóm thủy phân enzyme trung tính, pH tối thích
từ 5–7, pI = 4–5, nó ổn định với ion Mg2+, Ca2+và mất hoạt tính với Zn2+,
Ni2+, Pb2+, Hg2+..
 Hệ enzyme serin-protease:
Điển hình là enzyme trypsin, tồn tại nhiều trong nội tạng của cá. Ở giai đoạn
đầu của quá trình sản xuất nước mắm hoạt động của nó yếu đến tháng thứ 2
và phát triển dần đạt giá trị cực đại ở tháng tứ 3 rồi giảm dần đến khi chượp
chín (protein phân giải gần như hoàn toàn không còn ở dạng pepton). Hệ
enzyme này luôn bị ức chế bởi chuỗi acid amin trong cấu trúc của enzyme.
Để tháo gỡ chuỗi này phải nhờ đến hoạt động của men cathepsin B nhưng
men cathepsin B dễ bị ức chế bởi nồng độ muối cao. Vì vậy để men
cathepsin B hoạt động được người ta thực hiện phương pháp cho muối nhiều
lần. Enzyme serin-protease hoạt động mạnh ở pH từ 5–10, mạnh nhất ở
pH=9.
 Hệ enzyme acid-protease:
Có trong thịt và nội tạng cá, điển hình là enzyme cathepsin D. Hệ enzyme
này dễ bị ức chế bởi nồng độ muối khoảng 15% nên thường nó chỉ tồn tại
một thời gian ngắn ở đầu thời kỳ của quá trình thủy phân. Loại men này
đóng vai trò thứ yếu trong quá trình sản xuất nước mắm.
2.2.2. Quá trình sản xuất nước mắm xảy ra theo 3 pha

21
 Pha 1 (trong khoảng 25 ngày đầu): Có sự gia tăng thể tích của phần chất
lỏng nổi ở trên bề mặt sản phẩm và protein hòa tan.
 Pha 2 (80 – 120 ngày): Mô tế bào bị phá vỡ, protein của tế bào trở nên tiếp
xúc với enzyme, sản phẩm của quá trình tự phân protein được phóng thích.
Hầu như tất cả mô tế bào đều bị phân hủy và biến mất sau 120 – 140 ngày.
 Pha 3 (140 – 200 ngày): Enzyme phóng thích và tấn công vào các phần
protein hòa tan. Đây là nguyên nhân làm thay đổi hợp chất Nitơ.
Ngoài ra đường, chất béo cũng bị phân giải thành rượu và các acid
hữu cơ.

2.2.3. Nhân tố ảnh hưởng đến quá trình chế biến nước mắm
 Nhiệt độ:
Nhiệt độ tăng vận tốc phản ứng tăng, đến một nhiệt độ nào đó sẽ
không tăng nữa và có thể giảm xuống do nhiệt độ cao làm cho hệ enzyme
serin–protease mất hoạt tính. Quá trình thủy phân kém. Vì vậy phải tạo một
nhiệt độ thích hợp cho enzyme hoạt động.
Nhiệt độ 30 – 47oC thích hợp cho quá trình chế biến chượp. Chượp
càng phơi nắng nhiều nước mắm càng ngon, càng rút ngắn đườc thời gian
“chượp chín” tăng hiệu suất thủy phân.
Nhiệt độ 70oC trở lên hầu hết các hệ enzyme trong cá mất hoạt tính.
Đây là yếu tố điều chỉnh tốc độ phản ứng cho enzyme xúc tác, đơn
giản nhưng rất hiệu quả.
 pH:
Mỗi hệ enzyme có pH tối thích khác nhau, vì vậy phải xem loại
enzyme nào nhiều nhất và đóng vai trò chủ yếu nhất trong quá trình sản xuất
nước mắm để tạo pH thích hợp cho enzyme đó hoạt động. Qua thực nghiệm
cho thấy:
pH môi trường tự nhiên từ 5,5–6,5 enzyme trypsin và pepsin hoạt
động được, đồng thời ở pH này có tác dụng ức chế một phần vi khuẩn gây
thối. Vì vậy ở môi trường tự nhiên có pH thích hợp cho quá trình sản xuất
nước mắm hơn.
22
  Lượng muối:
Muối là nguyên liệu quan trọng cho quá trình sản xuất nước mắm,
thiếu muối nước mắm không hình thành được.
Yêu cầu của muối trong sản xuất nước mắm phải là loại muối ăn, càng
tinh khiết càng tốt, kết tinh hạt nhỏ có độ rắn cao, màu trắng óng ánh (không
vón cục, ẩm ướt, vị đắng chát).
Nồng độ muối thấp có tác dụng thúc đẩy quá trình thủy phân protein
nhanh hơn, chượp mau chín. Nồng độ muối quá cao có tác dụng ức chế làm
mất hoạt tính của enzyme, quá trình thủy phân chậm lại, thời gian thủy phân
kéo dài (protein bị kết tủa bởi muối trung tính bão hòa).
Thường lượng muối cho vào khoảng 20–25% so với khối lượng cá.
Nên thực hiện phương pháp cho muối nhiều lần và cần phải xác định số lần
cho muối, tỉ lệ muối của mỗi lần và khoảng cách giữa các lần cho muối để
không ảnh hưởng đến quá trình sản xuất nước mắm.
 Diện tích tiếp xúc:
Muốn phản ứng xảy ra nhanh phải có sự tiếp xúc tốt giữa enzyme và
cơ chất. Các enzyme trong cá tập trung nhiều ở nội tạng, nên để tăng tốc độ
thủy phân người ta tìm cách tăng diện tích tiếp xúc giữa enzyme và thịt cá.
Có thể dùng các biện pháp:
Phương pháp xay nhỏ cá:
 Ưu điểm: xay nhỏ cá diện tích tiếp xúc lớn, enzyme phân tán.
 Nhược điểm: protein dễ bị biến tính do tác dụng cơ học, làm
nồng độ enzyme loãng ra.
Phương pháp đập dập:
 Ưu điểm: Cá đập dập sẽ giữ được hình dạng ban đầu, cơ thịt
bên trong bị mềm ra, tổ chức cơ thịt lỏng lẻo giúp enzyme dễ ngấm vào trong thịt.
Cá đập dập xương cá không bị vỡ vụn, khi chượp chín kéo rút dễ dàng.
Phương pháp cắt khúc:
 Nhược điểm: thịt cá vẫn còn chắc nên enzyme khó ngấm
vào hơn phương pháp đập dập, protein ở mặt ngoài dễ bị biến
tính do tiếp xúc với dung dịch có nồng độ muối cao.

23
 Như vậy, để tăng diện tích tiếp xúc sử dụng phương pháp đập dập
kết hợp với đánh khuấy chượp là tốt nhất.
 Bản thân nguyên liệu:
Những loài cá khác nhau, thành phần hóa học và cấu trúc cũng khác
nhau, nhất là hệ enzyme trong cá vì vậy tạo ra loại nước mắm có chất lượng
khác nhau. Cá tươi chế biến chất lượng tốt hơn cá ươn.
Loại cá có kết cấu cơ thịt lỏng lẻo, mềm mại, ít vảy dễ chế biến hơn
loại cá cứng, chắc, nhiều vảy.
Nếu cá có nhiều mỡ thì nước mắm có mùi ôi khét khó chịu, mùi chua
(do sự thủy phân chất béo thành acid béo và glycerid) hoặc khét do oxy hóa
chất béo..
2.2.4. Các phương pháp chế biến nước mắm
2.2.4.1. Phương pháp chế biến nước mắm cổ truyền
 Nguyên lý:
Sử dụng enzyme protease có sẵn trong trong nguyên liệu cá [9] ban
đầu( do vi sinh vật trong ruột cá và mang cá), thủy phân protein cá thành axit
amin.
Có 3 phương pháp chế biến chượp cổ truyền
* Phương pháp đánh khuấy:
- Cho muối nhiều lần,
- Cho nước lã,
- Đánh khuấy liên tục.
* Phương pháp gài nén:
- Cho muối một lần hoặc nhiều lần,
- Không cho nước lã,
- Gài nén và không đánh khuấy.
* Phương pháp hỗn hợp:
- Kết hợp giữa 2 phương pháp gài nén và đánh khuấy,
- Lúc đầu thực hiện phương pháp gài nén,
- Sau đó thực hiện phương pháp đánh khuấy.

24
 Phương pháp:

25
 Sơ đồ 2: quy trình chế biến nước mắm bằng phương pháp cổ truyền

 Ưu điểm: nước mắm có hương vị thơm ngon đặc trưng,

không gây hại cho sức khỏe.
 Nhược điểm: thời gian lên men dài, có độ đạm thấp (khoảng
30 độ).
2.2.4.2. Chế biến nước mắm sử dụng protease vi sinh vật
Nhằm khắc phục thời gian sản xuất nước mắm cổ điển quá dài
(khoảng 9 tháng), phương pháp mới chỉ 1-1,5 tháng.
 Nguyên lý:
Trên cơ sở sản xuất nước mắm dân gian, dùng enzyme trong ruột,
mang cá. Đồng thời bổ sung thêm các enzyme từ vi sinh vật bên ngoài
nhằm tăng enzyme tổng số
Các chế phẩm enzyme sản xuất từ vi khuẩn Bacillus subtilis, nấm
mốc Asp. Orzyzae dạng bột, dạng lỏng.

26
 Phương pháp:

Sơ đồ 3: Qui trình chế biến nước mắm bằng phương pháp vi sinh vật

* Xử lý: cá phải rửa sạch bùn, đất, tạp chất, cá to phải cắt nhỏ.
* Thủy phân:
 Mốc: yêu cầu tốc độ sinh trưởng và phát triển nhanh, hình thái
khuẩn ty to và mập, tốt nhất là sau 2 ngày ở nhiệt độ và độ ẩm thích hợp.
Tỉ lệ giữa mốc và cá từ 3–4% tính theo chế phẩm mốc thô và cá xay nhỏ
trộn với mốc.
 Nước: cho vào 5–10% để vừa đủ ngấm mốc, giúp men hoạt
động tốt, nhiệt độ thủy phân 37–41oC, thời gian 10–15 ngày chượp sẽ
chín.
 Muối: sử dụng muối có tinh thể nhỏ, màu sáng, độ trắng cao,
không vón cục, không bị chát, lượng muối cho vào 4-6% so với khối
lượng cá
 Lọc: nước lọc và nước rửa bã bằng 30% so với khối lượng cá.
 Đun sôi: nhỏ lửa có tàc dụng khử mùi, vi sinh vật, chất bẩn.
 Thêm muối vào để đạt đến độ mặn nước chấm.
 Ưu điểm:

27
  Thiết bị đơn giản, dễ chế tạo, giá thiết bị không cao, phù
hợp điều kiện sản xuất ở địa phương, vốn đầu tư ban đầu không lớn.
Không cần sử dụng thiết bị chịu axit, chịu kiềm, chịu áp suất và nhiệt độ
cao.
 Không độc hại với công nhân và môi trưòng do không
sử dụng hóa chất.
 Điều kiện sản xuất nhẹ nhàng, ôn hòa: nhiệt độ khoảng
30 – 45oC, pH trung tính (hay acid yếu hay kiềm yếu), áp suất thường.
 Không tổn hao acid amin trong quá trình sản xuất
 Nhược điểm:
 Hiệu suất thủy phân không cao.
 Thời gian và quy trình sản xuất kéo dài
hơn phương pháp hóa giải, cần thêm công đoạn nuôi mốc giống cho quá
trình thủy phân.
Phương pháp cho muối nhiều đợt và thêm H2O:
Phương pháp cho muối nhiều đợt là làm cho protease không bị ức
chế bởi nồng độ NaCl cao ngay từ đầu, ở nồng độ muối thấp, quá trình
thủy phân xảy ra với tốc độ cao hơn. Người ta còn cho thêm nước vào
khối cá và muối ướp, tác dụng làm khối cá được mềm, loãng ra, dễ dàng
thủy phân hơn. Tỉ lệ nước – muối thường theo bảng sau:
Bảng 2: Tỉ lệ nước, muối trong ướp cá
Loại cá Cá (kg) Nước (lit) NaCl (kg)
Cá to 20cm 100 20 – 30 36 – 39
Cá vừa 8cm 100 15 – 25 35 – 36
Cá nhỏ 2 – 5cm 100 10 – 20 30 – 35
 Ướp muối đợt 1: làm cho nồng độ muối chung giảm đi, khối cá
loãng hơn và tạo điều kiện thích hợp cho sự thủy phân protit cá của
enzyme vi sinh vật.
 Ướp muối đợt 2, 3:
Sự cho muối lần 2, 3 đúng thời gian rất quan trọng, quyết định chất
lượng nước mắm thành phẩm.

28
 Toàn bộ thời gian cho muối đợt 1 đến 4 là 15 – 25 ngày (mùa hè);
20 – 30 ngày (mùa đông).
Cá ướp muối, được phơi nắng, khuấy đều luôn, với nhiệt độ ấm, sự
thủy phân sẽ nhanh hơn.
 Cơ sở khoa học phương pháp này là:
 Sự cho nước thêm vào chượp: tác dụng làm loãng nồng độ muối,
làm loãng chượp tạo điều kiện cho enzyme hoạt động tốt.
 Cho muối nhiều đợt: mục đích cho muối là để khống chế kìm
hãm hoạt động của vi sinh vật gây thối. Nhưng nếu cho tất cả lượng muối
cần cho sản xuất nước mắm vào một lúc thì nồng độ muối cao ngay từ
đầu sẽ ức chế đối với hoạt động của enzyme protease.
 Enzyme này chỉ hoạt động tốt khi không có muối hay muối lạt,
mặt khác với nồng độ muối cao thịt cá sẽ chắc lại khó thủy phân, do vậy
làm chậm tốc độ thủy phân protit cá.
 Nhược điểm: cho nước dễ tạo điều kiện xâm nhập, hoạt động
vi sinh
vật gây thối. Cần theo dõi sát sao quá trình sản xuất các hiện tượng bất
thường, tạo mùi vị xấu… để bổ sung kịp thời NaCl ngăn chặn sự hư hỏng
chượp cá.
2.3. Protease trong công nghệ sản xuất tương [1]
Xì dầu hay nước tương (phương ngữ miền Nam Việt Nam) là một loại nước
chấm được sản xuất bằng cách lên men hạt đậu tương, ngũ cốc rang chín, nước và
muối ăn. Nước chấm này, có nguồn gốc từ Trung Quốc, được sử dụng khá phổ biến
trong ẩm thực châu Á tại khu vực Đông Á và Đông Nam Á. Trong công nghiệp
nước tương thường được sản xuất từ bánh dầu đậu phộng (bã đậu phộng sau khi đã
ép dầu) hoặc bánh dầu đậu nành (bã đậu nành). Sản xuất nước chấm lên men nhìn
chung bao gồm các giai đoạn sau:

29
 Sơ đồ 4: Các giai đoạn trong sản xuất nước chấm lên men chìm
Nước tương có thể được chế biến theo 2 phương pháp chủ yếu: phương pháp
lên men vi sinh vật và phương pháp thuỷ phân bằng hoá chất.
2.3.1 Phương pháp lên men vi sinh vật
 Nguyên lý:
Chủ yếu dựa vào tác dụng của Enzym thu được từ mốc giống đã
chọn lọc, nuôi cấy để thuỷ phân protid và glucid của nguyên liệu thực vật.
 Phương pháp:

Sơ đồ 5: Quy trình sản xuất nước tương theo phương pháp vi sinh vật
Mốc giống được nuôi trong môi trường thạch sẽ được nhân ra và cấy
vào hỗn hợp khô đậu tương (bã đậu nành) hoặc khô lạc (bánh dầu đậu
phộng) và bột mì (bột làm bánh mì chớ không phải bột khoai mì) đã hấp
chín, đánh tơi ra và để nguội. Nấm mốc Aspergillus oryzae sinh ra các
enzym amylaz, invertaz, maltoz, proteaz và cataz có khả năng phân giải
tinh bột, protein thành đường, acid amin.
Ủ mốc ở nhiệt độ ấm (30 – 380C), nơi thoáng khí, có độ ẩm tương
đối của không khí hơn 90%.

30
 Khi giai đoạn phát triển mốc kết thúc, làm tơi nguyên liệu đã lên
mốc, pha trộn vào đó dung dịch nước muối 20% theo tỷ lệ từ 25 – 30%
và đem ủ ấm ở nhiệt độ 50 – 600C.
Sau đó chiết rút và pha tiếp nước muối vào và tiếp tục chiết rút nước
tương,.. (nước cốt hay nước 1, nước 2, nước 3,..)
 Ưu và nhược điểm:
Nước tương được sản xuất bằng phương pháp lên men do không có
phản ứng sinh ra Glycerin và không sử dụng axit HCl nên không tạo
thành 3-MCDP.
Tuy nhiên cần quan tâm đến độc tố Aflatoxin cũng là tác nhân gây
bệnh ung thư như 3-MCPD. Aflatoxin được sinh ra từ nấm Aspergylus
flavus lẩn trong nấm Aspergylus oryzae lên men tạo thành nước tương.
Mặt khác nước tương sản xuất từ phương pháp lên men thời gian kéo dài
và mùi vị khác so với phương pháp hoá giải.
2.3.2 Phương pháp thuỷ phân (hoá giải)
 Nguyên lý:
Thuỷ phân bằng enzyme trước rồi sau đó mới thuỷ phân bằng axit
hoặc thuỷ phân bằng axit rồi sau đó thuỷ phân bằng enzyme.
 Phương pháp:

 Ưu
điểm:
Giảm
thiểu sử dụng
hóa chất độc
hại, giảm
thiểu ô nhiễm

31
Sơ đồ 6: Quy trình sản xuất nước tương theo phương pháp thủy phân
 môi trường, rút ngắn thời gian sản xuất. Có thể sản xuất trên hệ thống
thiết bị sẵn có.
2.4. Protease trong sản xuất Chao
Chao là một thực phẩm đặc biệt của dân tộc Việt Nam và vùng châu Á, làm
từ đậu hũ bằng phương pháp lên men nhờ vi sinh vật. Chao không những giúp ta ăn
ngon miệng, dễ tiêu hóa, mà là một thực phẩm bổ, giàu dinh dưỡng vì thành phần
chính là acid amin, peptit (đạm dễ tiêu hóa), các chất thơm (ester thơm), chất béo,
NaCl, đặc biệt giàu acid amin không thay thế.
Quá trình sinh hóa cơ bản trong sản xuất chao là sự thủy phân protid thành
axit amin và peptid nhờ hệ enzyme protease của nấm mốc (Mucor), ngòai ra còn có
quá trình tạo ester thơm do chuyển hóa lipid, do vậy trong chao thường gặp là nấm
mốc Mucor như:
Actinomucor alegans (chủ yếu)
M. hiemalis
M. silvaticus
M. sultiliscimus
Quy trình sản xuất bao gồm các giai đoạn:
 Làm mốc giống (bột bào tử mốc)
 Nuôi mốc trên đậu hũ
 Ướp muối
 Lên men chính
 Lên men phụ - sản phẩm
 Đóng gói – bao bì – bảo quản
 Làm mốc giống (bột bào tử mốc)
Chủng nấm mốc Mucor được giữ giống trong môi trường thạch nghiêng,
cách chuẩn bị tương tự các môi trường thạch nghiêng nuôi vi sinh vật khác. Thành
phần môi trường có thể như sau:
- Thạch 18 – 20g (agar)
- Đường 20g
- Nước chiết giá đậu 300g/l H2O
- pH 4,5 – 5

32
 Thanh trùng 1,2kg/cm2/giờ . Để nguội, đặt nghiêng. Sau khi cấy chuyền, nuôi
ở 28 – 30oC trong 4 – 5 ngày rồi cấy chuyền ra môi trường trung gian (bình tam giác
hay khay, thành phần môi trường có thể dùng bã sản xuất đậu hũ 1kg, bột mì 0,5kg
H2O để có độ ẩm 70 – 72% pH 5,5 – 6. Thanh trùng 1,2kg/cm2/45 phút. Muốn sản
xuất bột bào tử, người ta trộn môi trường trung gian với bột mịn – sấy 40oC ta có
bột bào tử dùng dần cho sản xuất chao (bảo quản 0 – 3oC trong 7 – 10 ngày, trong
túi PE hay lọ thủy tinh, sành sứ… khô, sạch, kín.
 Nuôi mốc trên đậu hũ
Đậu hũ cắt thành miếng nhỏ 3x3x4cm hay 2x3x3cm trụng nước sôi
100oC/phút vớt ra cho ráo nước xếp so le, rắc bột bào tử mốc vào (phun bột mịn trên
bề mặt đậu hũ). Mục đích xếp theo dang so le giữa các miếng đậu để tăng bề mặt
thoáng tiếp xúc với không khí.
Đưa vào phòng nuôi mốc, độ ẩm 90%,nhiệt độ 28 – 30oC, nuôi 36 – 42 giờ
(nếu thấy bề mặt khô có thể phun tia nước sạch) trên bề mặt đậu hũ sẽ xuất hiện lớp
long tơ mịn trắng ngà.
Theo kinh nghiệm sản xuất dân gian, thì dùng hệ enzyme vi sinh vật trong
không khí rơi trên bề mặt miếng đậu để thủy phân protit mà không cần sản xuất bột
bào tử, tuy nhiên, trong sản xuất công nghiệp, qui mô lớn muốn sản xuất ổn định,
không bị nhiễm trùng vi sinh vật lạ làm hỏng sản phẩm thì giai đoạn nuôi mốc thuần
khiết và sản xuất bột bào tử là cần thiết và quan trọng, phải được lưu ý và tiến hành
chu đáo cẩn thận.
Quá trình sinh lý sinh hóa chủ yếu trong giai đọan này là tạo điều kiện cho
nấm mốc phát triển sinh sản, trên đậu hũ tổng hợp ra chủ yếu là enzyme protease
đồng thời bắt đầu thủy phân protid đậu hũ.
 Ướp muối và rượu
Sau khi mốc trắng mọc đều bề mặt miếng đậu hũ ta phải ướp muối để kìm
hãm vi sinh vật gây thối và phun rượu nhẹ tạo ester thơm.
Lượng muối 130 – 150g/kg đậu, xếp một lớp đậu một lớp muối, trên và dưới
cùng là lớp muối hay nhúng đậu vào dung dịch NaCl 30 – 32% trong 6 – 7 giờ, vớt
ra cho ráo cho vào phòng lên men. Lúc này cần phun ít rượu trắng vào đậu hũ hay
pha vào dung dịch NaCl để nhúng đậu – tác dụng tạo ester thơm. (2kg đậu hũ cần
150cc rượu trắng). Làm chao bánh tiến hành như trên, nếu làm chao nước, thì cho
33
 dịch muối ngập miếng đậu phơi nắng 10 ngày là có chao. Tuy nhiên càng để lâu
càng ngon.
 Giai đoạn lên men
Đây là giai đoạn quan trọng quyết định chất lượng sản phẩm, là giai đoạn
chính thủy phân protid của đậu hũ ra axit amin và ít peptid, phản ứng tạo
esterthơm… xúc tác là enzye của nấm mốc. Tiến hành lên men chính ở nhiệt độ 35
– 36oC trong phòng nuôi nhiệt độ 37 – 38oC trong 6 – 7 ngày.
Sau đó lên men phụ chủ yếu tạo hương ở nhiệt độ thường (25 – 30oC) trong 7
ngày. Chao thành phẩm thơm ngon, bổ, dễ tiêu hóa, bảo quản được khá lâu 4 – 5
tháng trong lọ thủy tinh với dung dịch NaCl ở nhiệt độ thường hoặc chao miếng gói
trong giấy kim loại và bào quản lạnh.
Hiện nay, người ta có thể sản xuất chao đỏ bằng cách cho thêm hồng cúc đỏ
nhuộm màu, cho đậu hũ vào dung dịch NaCl ngập miếng chao. Chao còn có tên là
đậu phụ nhự, đậu phụ lên men (đậu hũ lên men), người phương tây gọi là “pho mát
Trung Quốc”, người Nhật gọi là Sufu.
2.5. Protease trong công nghệ chế biến thịt và đồ hộp
2.5.1. Trong công nghệ chế biến thịt
Trong công nghiệp chế biến thịt, các enzyme phân giải protein cũng được sử
dụng trong việc làm mềm thịt. Kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có
vị tốt hơn. Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị thịt. Ngâm thịt
vào dinh dưỡng protease ở pH và nhiệt độ xác định- phương pháp này phổ biến và
thuận lợi nhất. Thịt thường giữ độ cứng khá lâu khi con vật chết. Để cho thịt có độ
mềm cần thiết, thường phải xử lý trong điều kiện lạnh 0± 20C từ 10 đến 14 ngày.
Trong điều kiện bảo quản như vậy cũng chỉ có 14 – 17% số thịt được đánh giá là
thịt loại I. Một điều kiện quan trong nhất để làm xuất hiện những chất lượng cần
thiết của thịt là làm phân giải một phần protein của thịt dưới tác dụng của enzyme
proteinase.
Ngày nay, papain và các enzyme proteolitic nguồn gốc vi khuẩn, nấm, thực
vật được sử dụng phổ biến trong xử lý thịt bảo quản. chủ yếu bằng 3 phương pháp
sau [3]:

34
  Ngâm trong dung dịch enzyme,
 Bôi bột làm mềm thịt có chứa enzyme cùng với mì chính,
muối ăn, tinh bột…
 Bơm dung dịch enzyme vào mô thịt.
Ưu điểm của việc thuỷ phân protease bởi enzyme là bảo toàn được vitamin
của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ
phân.
Các enzyme papain, bromelin, pepsin hoặc các protease vi khuẩn từ
Aspergillus, Bacillus…., được sử dụng làm mềm thịt, hòa tan các protein cá,…nói
chung thủy phân bằng protease làm tăng khả năng tiêu hóa của protein nên đặc biệt
có lợi cho những người bị mắc bệnh tiêu hóa kém hoặc làm mất tính mẫn cảm của
người sử dụng với protein.
Thủy phân protein trong điều kiện thích hợp lúc đầu thu được các peptid có
kích thước nhỏ sau đó xảy ra hiện tượng plastein hóa như sắp xếp lại các peptid
hoặc gắn thêm các acid amin không thay thế. Protease cũng được dùng để xử lý, tận
dụng các phế liệu từ thịt, hoặc các nguyên liệu có nguồn gốc từ protein (thịt vụn,
xương, gelatin…) để tạo ra các sản phẩm có giá trị như dịch protein, chất tăng vị,
chất cải thiện mùi…
Enzyme Papain [5]:
Papain là một protease điển hình được ứng dụng nhiều trong công nghệ chế
biến thịt, có trong cây đu đủ và đu đủ núi.
Cấu trúc: bao gồm 212 amino acid được ổn định bằng 3 cầu nối disulfide.
Cấu trúc không gian gồm 2 phần rõ rệt với 1 khe ở giữa. Khe này chứa vùng hoạt
động chứa đựng một “bộ ba xúc tác” được ví như chymotrypsin. Bộ 3 xúc tác được
làm từ 3 amino acid: cystein - 25, histidine - 159 và asparagines - 158.
Chức năng: Làm đứt liên kết peptit liên quan đến sự deproton của cys-25 bởi
his-159. Asn-158 giúp định hướng nhóm imido của his-159 cho phép sự deproton
diễn ra. Sau đó cys-25 thực hiện sự tấn công nucleophitic vào carbon carbonyl của 1
mạch peptid. Nhóm amino cuối cùng của mạch peptit được tự do acyl-enzyme đồng
hóa trị ngay lập tức. Enzyme bị deacylated bởi phân tử nước, giải thoát carboxy
cuối cùng của mạch peptid.

35
 Sử dụng: Ích lợi của nó là làm đứt những thớ thịt dai và đã được sử dụng
hàng ngàn năm ở Nam Mỹ. Nó được bán như là 1 thành phần trong bột làm mềm
thịt có sẵn ở hầu hết các siêu thị.
2.5.2. Trong công nghệ đồ hộp [2][4]
Hỗn hợp enzyme pectinase, protease, hemicellulase làm trong và tách dịch
quả. (3 – 6g/l, giữ ở nhiệt độ 40 – 450C trong 2 – 4giờ).
Trong công nghệ chế biến cá hộp, cần chú ý các điều kiện để ức chế các hoạt
động của vi sinh vật nhằm ngăn cản quá trình sản xuất enzyme thủy phân hóa các
protit có trong sản phẩm:

- Ngâm giấm:
Nồng độ H+ có tác dụng ức chế hệ vi sinh vật trong ruột cá.
pH = 6: vi khuẩn gây thối rữa bị khống chế.
pH = 4,5: vi khuẩn ngừng sinh sản.
pH = 3: các enzyme bị kiềm hãm.
- Ngâm dung dịch muối: Kiềm hãm sự tự phân của enzyme và vi khuẩn. Các
loại enzyme có trong thịt cá có hoạt tính mạnh nhất trong nước muối loãng nhưng ở
nồng độ cao chúng sẽ bị kiềm hãm.
- Nhiệt độ: Trong quá trình ướp muối, nhiệt độ cao sẽ làm cho các loại
enzyme và vi khuẩn hoạt động mạnh làm giảm chất lượng của cá.
Cá sau khi tê cứng dần dần trở lại mềm nhờ sự phân giải của enzyme. Quá
trình này do các loại enzyme có trong cá hoạt động phân giải. Trong quá trình này
có nhiều loại men tham gia nhưng chủ yếu là men Cathepsin, nó phân giải protid
thành pepton, peptid. Men trypsin, enterokinase tiếp tục phân giải thành acid amin.
Trong quá trình tự phân giải tổ chức cơ thịt sản sinh ra nhiều biến đổi về lý
hóa, cơ thịt mềm mại, hương vị thơm tươi, có độ ẩm lớn và dễ bị tác dụng của men
tiêu hóa hơn. Giai đoạn đầu của quá trình tự chín liên quan với quá trình ngược của
quá trình tê cứng vì lúc đó xuất hiện sự phân ly actomyosin phần nào thành actin và
myosin.
Sự phân ly này dẫn tới làm tăng số lượng trung tâm ưa nước của protein co
rút làm tăng khả năng liên kết nước của mô cơ. Tiếp theo là quá trình phân giải
protid của các enzyme làm cho mô cơ mềm dần ra.
36
 Quá trình chín sẽ làm tăng thêm hương vị của cơ thịt, để phát huy ưu điểm
đó chúng ta cần tiến hành quá trình chín ở nhiệt độ thấp (khoảng từ 1 – 4 oC) để hạn
chế sự xâm nhập của vi khuẩn gây thối rữa.
Những nhân tố ảnh hưởng đến quá trình phân giải :
- Giống loài
- Môi trường pH
- Ảnh hưởng của các loại muối
- Ảnh hưởng của nhiệt độ
2.6. Một số ứng dụng khác của protease
2.6.1. Trong sản xuất bánh mì [6]
Trong hạt mì cũng có chứa các protease làm giảm chất lượng bột nhào do sự
phân giải protein cấu trúc bậc ba khiến gluten bị vụn nát. Protease bột mì hoạt động
tối ưu ở nhiệt độ 45 – 47oC, pH = 4,5 – 5,6. Khi bổ sung chất khử thì hoạt độ của
protease tăng nhưng với chất oxy hóa và muối ăn thì bị kìm hãm.
2.6.2. Trong sản xuất bia [3]
Thủy phân protein trong bia bằng protease trong các cột chứa enzyme cố
định tương ứng.
- Proteinase: sẽ tấn công lên các phân tử protein nguyên thủy để tạo ra các
sản phẩm trung gian như: pepton, peptid, polypeptid, với pHopt = 5.1, topt = 50 -
550C.
- Peptidase: nó sẽ phân cắt các peptid có sẵn trong hạt đại mạch và những
peptit trong malt do proteinase phân giải để tạo thành các acid amin trong hạt malt,
với pHopt = 7.3 - 7.9, topt = 40 - 450C.
- Amidase: chúng sẽ tấn công các muối amid để hình thành NH3 và acid
amin, góp phần làm thay đổi tính chất và hàm lượng của protein trong hạt malt, các
enzyme amidase có pHopt = 7.3 - 8.0, topt = 45 - 500C.

37
3. KẾT LUẬN
Công nghệ enzyme nói chung và công nghệ protease nói riêng đã, đang và sẽ
có những bước phát triển đáng kể, mang lại những ứng dụng to lớn cho đời sống
con người. Trong đó thì công nghệ chế biến thực phẩm là lĩnh vực mà protease thể
hiện nhiều ứng dụng đặc sắc.
Thứ nhất: Nó khắc phục khiếm khuyết tự nhiên của nguyên liệu - chất lượng
sản phẩm được tạo ra từ nguyên liệu dao động rất lớn.
Thứ hai: Nâng cao giá trị thương phẩm của nguyên liệu.
Thứ ba: Là công cụ trong quá trình chuyển hóa trong dây chuyền chế biến
thực phẩm. Tham gia vào các giai đoạn chuyển hóa chính, các giai đoạn hoàn thiện
sản phẩm, để làm tăng đáng kể chất lượng cảm quan của sản phẩm; nếu không có sự
có mặt của nó thì quá trình chế biến không thành công.
Với những vai trò trên thì rõ ràng việc ứng dụng protease trong công nghệ
chế biến thực phẩm là không thể thiếu. Tuy nhiên nếu chỉ sử dụng protease thì hiệu
suất không cao và việc sử dụng kết hợp một cách hợp lý và hiệu quả với các phương
pháp khác là cần thiết để có hiệu suất cao, mở rộng quy mô sản xuất.

38
 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Sách:
1. Đồng Thị Thanh Thu, Sinh hóa ứng dụng, NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ
Chí Minh, 2003, trang 117 - 145.
2. Lê Mỹ Hồng, Giáo trình Công nghệ chế biến thực phẩm đóng hộp, Đại học
Cần Thơ, 2005, trang 19, 101-102.
3. Mai Xuân Lương, Giáo trình Enzym, Đại học Đà Lạt, 2005, trang 65-66, 75.
4. Trần Xuân Hiển, Giáo trình điện tử Nguyên liệu trong bảo quản và chế biến
nông sản thực phẩm, Đại học An Giang, 2005, chương 2, mục 2.5.3.

Một số website:
5. http://en.wikipedia.org/wiki/Papain
6. http://tamleftcseminar.googlepages.com/Banhmi.Doc
7. http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=1094
8. http://www.vietnhim.com/dongnhim/showthread.php?t=15576
9. http://www.vocw.edu.vn/content/m10610/latest/
10. http://www.dost.hochiminhcity.gov.vn/web/data/news/2007/6/2160/3-

39
 MỤC LỤC
Trang
Lời mở đầu......................................................................................................... 3
Danh mục bảng, hình, sơ đồ................................................................................4
NỘI DUNG........................................................................................................ 5
1. TỔNG QUAN VỀ PROTEASE..................................................................... 5
1.1. Giới thiệu chung....................................................................................... 5
1.2. Phân loại protease..................................................................................... 7
1.3. Nguồn thu protease vi sinh vật.................................................................. 8
1.3.1. Vi khuẩn........................................................................................... 8
1.3.2. Nấm mốc.......................................................................................... 9
1.3.3. Xạ khuẩn.......................................................................................... 9
1.4. Thu nhận protease từ vi sinh vật.............................................................. 10
1.4.1. Tuyển chọn chủng........................................................................... 11
1.4.2. Môi trường và phương pháp nuôi cấy vi sinh vật
tổng hợp Protease........................................................................... 11
1.4.3. Phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme.................................. 11
2. ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM.... 12
2.1. Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa......... 12
2.1.1. Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa...................................... 12
2.1.2. Ứng dụng trong việc sản xuất fomat................................................ 13
2.2. Ứng dụng protease trong công nghệ sản xuất nước mắm......................... 20
2.2.1. Các hệ enzyme trong sản xuất nước mắm....................................... 20
2.2.2. Quá trình sản xuất nước mắm xảy ra theo 3 pha.............................. 21
2.2.3. Nhân tố ảnh hưởng đến quá trình chế biến nước mắm.................... 22
2.2.4. Các phương pháp chế biến nước mắm............................................. 24
2.3. Protease trong công nghệ sản xuất tương................................................. 28
2.3.1. Phương pháp lên men vi sinh vật..................................................... 29
2.3.2. Phương pháp thuỷ phân (hoá giải)................................................... 30
2.4. Protease trong sản xuất Chao................................................................... 31

40
 2.5. Protease trong công nghệ chế biến thịt và đồ hộp.................................... 33
2.5.1. Trong công nghệ chế biến thịt......................................................... 33
2.5.2. Trong công nghệ đồ hộp.................................................................. 35
2.6. Một số ứng dụng khác của protease......................................................... 36
2.6.1. Trong sản xuất bánh mì................................................................... 36
2.6.2. Trong sản xuất bia........................................................................... 36
3. KẾT LUẬN................................................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................. 38

41