You are on page 1of 9

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Preparasi DNA Sel Total

Dasar-dasar preparasi DNA paling mudah dipahami jika lebih dahulu

membahas mengenai pemurnia DNA yang paling sederhana, yaitu bila dibutuhkan

seluruh komplemen DNA sel bakteri. Modifikasi yang diperlukan untuk preparasi

DNA plasmid dan fag dapat diuraikan kemudian. Prosedur preparasi DNA total

dari kultur sel bakteri dapat dibagi menjadi 4 tahap, yaitu:

a. Kultur bakteri ditumbuhkan dan kemudian dipanen

b. Sel dilisis untuk membebaskan isinya

c. Ekstrak sel ini diberi perlakuan untuk menghilangkan semua komponen

kecuali DNA

d. Larutan DNA yang dihasilkan kemudian dipekatkan

Gambar 1. Langkah-langkah dasar pada preparasi DNA sel total dari kultur
bakteri

1
2.1.1 Menumbuhkan dan Memanen Kultur Bakteri

Kebanyakan bakteri dapat ditumbuhkan tanpa bakteri kesulitan dalam

medium cair (broth culture). Medium untuk kultur harus memberikan campuran

nutrien penting yang seimbang pada konsentrasi yang memungkinkan bakteri

tumbuh dan membelah secara efisien. Medium sin merupakan contoh medium

tertentu yang semua komponennya diketahui. Medium ini mengandung campuran

nutrien anorganik untuk memberikan elemen-elemen penting seperti nitrogen,

magnesium dan kalsium, juga glukose sebagai sumber karbon dan energi.

Untuk menyiapkan suatu ekstrak sel, bakteri harus diperoleh dalam

volume yang sekecil mungkin dan oleh karena itu pemanenan dilakukan dengan

memutar kultur dalam sentrifus. Kecepatan sentrifugasi yang cukup rendah akan

mengendapkan bakteri pada dasar tabung sentrifus sehingga medium kultur

diatasnya dapat dituang.

2.1.2 Preparasi Ekstrak Sel

Sel bakteri terbungkus dalam membran sitoplasma dan dikelilingi oleh

dinding sel yang kuat. Pada beberapa spesies, termasuk E.coli, dinding sel

mungkin dilapisi oleh membran kedua di sebelah luar. Teknik-teknik untuk

memecah dan membuka isi sel bakteri dapat dibagi menjadi cara fisik dan cara

kimiawi. Cara fisik, yaitu sel dipecahkan dengan kekuatan mekanis dan cara

kimiawi, yaitu sel dilisis dengan memaparkannya pada senyawa kimia yang dapat

merusak integritas barier sel. Lisis secara kimia biasanya dilakukan dengan satu

senyawa yang merusak dinding sel dan senyawa lain yang merusak membran sel.

Senyawa yang akan dipakai tergantung pada spesies bakteri yang digunakan.

2
2.1.3 Pemurnian DNA dari Ekstrak Sel

Disamping DNA, ekstrak sel bakteri mengandung protein dan RNA dalam

jumlah yang cukup besar. Berbagai prosedur dapat digunakan untuk

menghilangkan kontaminan tersebut sehingga tertinggal DNA dalam bentuk yang

murni. Pada beberapa ekstrak sel kandungan protein begitu besar sehingga

ekstraksi tunggal dengan fenol tidak cukup untuk memurnikan asam nukleat

dengan sempurna. Masalah ini dapat diatasi dengan melakukan beberapa kali

ekstraksi fenol, tetapi hal ini tidak dianjurkan karena setiap pencampuran dan

sentrifugasi mengakibatkan pecahnya molekul DNA dalam jumlah tertentu.

Beberapa molekul RNA, terutama mRNA akan hilang dengan pemberian

fenol, tetapi kebanyakan molekul ini akan tetap bersama DNA dalam lapisan

akuosa. Satu-satunya cara yang efektif untuk menghilangkan RNA adalah dengan

enzim ribonuklease yang akan memcah molekul ini dengan cepat menjadi subunit

ribonukleotida.

2.1.4 Konsentrasi Sampel DNA

Preparasi yang baik sering menghasilkan larutan DNA yang sangat pekat

yang tidak memerlukan pemekatan lebih lanjut. Tetapi kadang-kadang didapatkan

larutan yang encer sehingga dalam hal ini penting untuk menggunakan cara untuk

menaikkan konsentrasi DNA.

Cara pemekatan yang paling sering digunakan adalah presipitasi etanol.

Dengan adanya garam (kation monovalen seperti Na+) dan pada temperatur -20 oC

atau kurang, etanol absolut akan mempresipitasikan asam nukleat polimerik

dengan baik. Pada larutan DNA yang pekat larutan etanol dapat ditambahkan pada

lapisan atas sampel sehingga menyebabkan terjadinya presipitasi pada perbatasan

3
antara kedua larutan. Salah satu cara yang dapat digunakan adalah dengan cara

memasukkan batang kaca melalui etanol sampai larutan DNA. Ketika kaca ini

ditarik molekul DNA akan melekat dan tertarik keluar dari larutan dalam bentuk

serabut yang panjang.

2.1.5 Pengukuran Konsentrasi DNA

Dalam melakukan eksperimen kloning gen sangat penting diketahui

dengan tepat berapa banyak DNA yang ada dalam larutan. Konsentrasi DNA

dapat diukur secara tepat dengan spektrofotometri absorben ultraviolet.

Banyaknya radiasi ultraviolet yang diserap oleh larutan DNA berbanding lurus

dengan banyaknya DNA dalam sampel. Biasanya absorben diukur pada 260 nm.

Absorben ultraviolet dapat juga digunakan untuk mengetahui kemurnia DNA.

Pada suatu sampel DNA yang murni rasio absorben pada 260 nm dan 280 nm.

2.1.6 Preparasi DNA Sel Total dari Organisme Selain Bakteri

Bakteri bukan satu-satunya organisme untuk memperoleh DNA yang

diperlukan. DNA sel total dari tanaman atau hewan akan diperlukan jika tujuan

rekayasa genetik adalah untuk mengklon gen organisme tersebut. Walaupun

langkah-langkah dasar pada pemurnian DNA adalah sama, tetapi beberapa

modifikasi mungkin harus dilakukan sehubungan dengan ciri-ciri khusus sel yang

akan digunakan.

Jelas bahwa pertumbuhan sel dalam medium cair tidak selalu memadai

walaupun kultur sel tanaman dan hewan menjadi semakin penting dalam

biologi. Modifikasi utama mungkin diperlukan pada tahap pemecahan sel.

Senyawa-senyawa yang digunakan untuk memecah bakteri tidak selalu dapat

4
digunakan untuk organisme lain, misalnya lisozim yang berpengaruh pada sel

tanaman. Enzim-enzim degradatif yang spesifik telah tersedia untuk kebanyakan

jenis dinding sel, tetapi sering teknik secara fisik, seperti penumbukan bahan yang

padat dengan penumbuk, sering lebih efisien. Dilain pihak kebanyakan sel hewan

tidak mempunyai dinding sel sama sekali dan dapat dihancurkan dengan

penambahan deterjen saja.

2.2 Preparasi DNA plasmid

Untuk pemurnian dari kultur digunakan cara yang sama seperti pada

preparasi DNA sel total, kultur sel yang mengandung plasmid ditumbuhkan dalam

medium cair, kemudian dipanen, dan dibuat ekstrak sel. Ekstrak ini dihilangkan

protein dan RNAnya, kemudian DNA dipekatkan dengan cara presipitasi etanol.

Meskipun demikian terdapat perbedaan penting antara pemurnian plasmid dan

preparasi DNA sel total. Pada preparasi plasmid perlu pemisahan DNA plasmid

dari DNA kromosom bakteri yang besar jumlahnya yang juga terdapat dalam sel.

Meskipun kedua jenis DNA tersebut mungkin sangat sulit, tetapi hal

sangat penting bila yang akan digunakan untuk wahana cloning adalah plasmid.

Adanya kontaminasi DNA kromosom dalam jumlah kecil pun pada percobaan

cloning gen dapat dengan mudah memberikan hasil yang tidak dikehendaki.

Untung terdapat beberapa cara untuk menghilangkan DNA kromosom pada waktu

pemurnian plasmid daan penggunaan cara ini, baik dengan satu cara maupun

dengan cara kombinasi, dapat menghasilkan isolasi plasmid yang sangat murni.

Cara-cara tersebut didasarkan atas beberapa perbedaan fisik antara DNA

plasmid dan DNA kromosom, terutama dalam hal ukurannya. Plasmid yang

5
paling besar ukurannya hanya merupakan 8% ukuran kromosom E.coli dan

kebanyakan plasmid lebih kecil dari ukuran ini. Oleh karena itu teknik yang dapat

memisahkan molekul DNA yang kecil dari molekul yang besar akan sangat efektif

untuk memurnikan plasmid. Disamping ukuran, DNA plasmid dan kromosom

berbeda dalam konformasinya. Untuk polimer seperti DNA, maka istilah

konformasi berarti keseluruhan konfigurasi molekul dalam ruang, dua konformasi

yang paling sederhana adalah bentuk linear dan sirkular, plasmid dan kromosom

bakteri adalah sirkular, tetapi pada waktu preparasi ekstrak sel kromosom akan

selalu pecah menjadi fragmen-fragmen yang linear. Dengan demikian suatu cara

yang dapat memisahkan molekul sirkular dari molekul linear akan menghasilkan

plasmid yang murni.

2.2.1 Pemisahan berdasarkan ukuran

Tahap yang biasanya dipakai dalam usahan berdasarkan ukuran adalah

waktu preparasi ekstrak sel, jika sel dilisiskan di bawah kondisi yang dikontrol

dengan seksama, maka kerusakan yang terjadi pada DNA akan sangat sedikit.

Fragmen DNA yang dihasilkan akan masih sangat besar, yaitu lebih besar

daripada plasmid, dan akan dapat dihilangkan bersama debris sel dengan cara

sentrifugasi. Proses ini dipermudah karena kromosom secara fisik melekat pada

selubung sel dan fragmen-fragmen akan selalu mengendap bersama debris sel bila

perlekatan tersebut tidak pecah. Oleh karena itu pemecahan sel harus dilakukan

dengan pelan-pelan untuk mencegah pemecahan DNA bakteri secara menyeluruh.

Penambahan EDTA dan lisozim dilakukan bersama dengan sukrosa, yang

mencegah pecahnya sel secara cepat. Pada keadaan ini terbentuk sferoplas, yaitu

sel yang sebagian tidak berdinding yang masih mempunyai membrane sitoplasma

6
yang utuh. Lisis sel kemudian diinduksi dengan deterjen non-ionik seperti Triton

X-100 (deterjen ionic, seperti SD, menyebabkan pecahnya kromosom). Cara ini

mengakibatkan kerusakan yang sangat kecil pada DNA bakteri, sehingga

sentrifugasi selanjutnya akan menghasilkan lisat jernih yang mengandung hamper

seluruhnya DNA plasmid. Meskipun demikian lisat yang jernih akan selalu masih

mengandung DNA kromosom. Lagi pula jika plasmid sendiri merupakan molekul

yang besar maka plasmid ini dapat juga mengendap bersama debris sel. Oleh

karena itu pemisahan berdasarkan ukuran jarang memuaskan dan kita harus

mempertimbangkan cara-cara lain untuk menghilangkan kontaminasi DNA

bakteri.

2.2.2 Pemisahan berdasarkan bentuk (konformasi)

Pelilitan penting dalam preparasi plasmid karena molekuk yang berlilitan dapat

dengan mudah dipisahkan dari molekul DNA tidak berlilitan. Umumnya

digunakan dua macam cara yang berbeda. Keduanya dapat memurnikan DNA

plasmid dari ekstrak sel, walaupun dalam praktek hasil yang paling baik diperoleh

bila lebih dahulu dibuat lisat yang jernih.

7
2.2.3 Amplifikasi plasmid

Preparasi DNA plasmid dapat dihambat oleh kenyataan bahwa plasmid

hanya merupakan bagian kecil dari DNA total dalam sel bakteri. Hasil DNA darri

kultur bakteri mungkin sangat sedikit jumlahnya. Amplifikasi plasmid

memberikan cara untuk meningkatkan hasil ini. Tujuan amplifikasi adalah untuk

meningkatkan jumlah kopi plasmid. Beberapa plasmid multikopi memiliki sifat

yang menguntungkan karena mampu mengadakan replikasi tanpa sintesis protein.

2.3. Preparasi DNA bakteriofag

perbedaan pokok antara pemurnian DNA fag dan preparasi DNA sel total

atau DNA plasmid adalah bahwa bahan permulaan yang digunakan untuk fag

biasanya bukan ekstrak sel. Hal ini disebabkan karena partikel bakteriofag dapat

diperoleh dalam jumlah besar dari medium ekstrasel pada kultur bakteri akan

mengendap dan partikel fag tertinggal dalam suspense. Kemudian partikel fag

dapat dikumpulkan dari suspense dan DNAnya diekstraksi dengan cara

deproteinasi untuk menghilangkan kapsid fag.

8
9