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UNIVERSIDAD NACIONAL DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD


LABORATORIO CLINICO E HISTOPATOLOGICO
CATEDRA DE BIOLOGÍA MOLECULAR

TEMA:

BIOLOGÍA MOLECULAR

INTEGRANTES:
 Viviana Allauca

PERIODO ACADEMICO
OCTUBRE 2018 -FEBRERO 2019
RIOBAMBA – ECUADOR
LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
Laboratorio de biología molecular, cuenta con diferentes zonas de trabajo para extracción
de ADN y ARN, diseño de ARN interferente y síntesis in vitro de ARN, análisis de
expresión génica mediante PCR convencional y en tiempo real (Real Time), clonación de
genes y construcción de plásmidos. Para ello dispone del equipamiento básico necesario
como son termocicladores, Nanodrop, equipos de electroforesis, transiluminador, horno
de hibridación, estufas de cultivo, incubadores, centrífugas refrigeradas y
microcentrífugas, concentrador mediante vacío (Speed Vac) y equipamiento general
(pHmetro, balanzas, vórtex, microondas, etc). Además, dispone de un equipo de
quimioluminiscencia que permite, entre otras aplicaciones, la cuantificación de moléculas
implicadas en procesos de apoptosis durante el envejecimiento.
ESTRUCTURA DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR

La estructura del laboratorio de biología molecular está condicionada por la técnica


principal. La realización de una PCR implica:
 Preparación de reactivos
 Extracción y purificación de ADN de una muestra biológica
 Reacción de amplificación propiamente dicha
 Análisis de los productos de la reacción mediante electroforesis y documentación
del gel.

Estas actividades deben realizarse en un área de trabajo independiente y con su propio


equipamiento y material de trabajo.
Un laboratorio de biología molecular de constar, como mínimo cuatro salas
independientes:

1. Sala de preparación de reactivos

Se considera el área limpia, es decir, sin ADN. Además, en ella se preparan todos los
reactivos que se van a utilizar en el laboratorio incluyendo la mezcla de reacción de PCR.
Es fundamental que no se contaminen y para ello es imprescindible que se disponga de
una cabina de bioseguridad.

2. Sala de preparación de muestras y extracción de ADN.

Esta es un área sucia, es decir, con ADN, por ello debe tener una presión negativa para
evitar una contaminación. Debe contar con una cabina de bioseguridad y un
espectrofotómetro.

3. Sala de PCR.

Esta es un área sucia, en la cual tiene una importante fuente de contaminación. Dispone
de equipos de electroforesis.
4. Sala de Post-PCR.

Esta sala dispone de termocicladores para realizar la PCR y otro espacio para añadir
muestras de ADN. [1]
NORMATIVA ECUATORIANA RELACIONADA CON LOS LABORATORIOS
CLÍNICOS
La ISO 15189:2012, norma de referencia para la acreditación de laboratorios clínicos,
cuenta con lineamientos técnicos que se han convertido en el pilar fundamental para el
funcionamiento de estos laboratorios, los cuales siguen pautas de calidad establecidas en
la norma y les permite alcanzar la competencia técnica para emitir diagnósticos médicos,
rigurosos y confiables.
Roberto Carboni (Chile), bioquímico y experto en esta área, dictó en el SAE un curso de
capacitación, relativo a los requisitos, documentos, criterios y procedimientos de la
norma, para formar a profesionales del área clínica y personal técnico del SAE, en
acreditación de laboratorios clínicos.
Uno de los puntos de partida para conocer la aplicación de la norma ISO 15189, es saber
que se elaboró tomando como referencia las normas ISO/IEC 17025 e ISO 9001. Por
tanto, se puede asegurar que los laboratorios, que han obtenido la acreditación según ISO
15189, cuentan con un sistema de gestión de calidad reconocido, que reduce la necesidad
de repetir evaluaciones y ofrecen resultados confiables y de calidad a sus clientes.
La normativa se divide en dos partes, la de gestión que corresponde a los requisitos para
la certificación del sistema de calidad y la parte técnica que describe los requisitos para
el personal, instalaciones, equipos, procedimientos, garantía de calidad, informes y toma
de decisiones. La norma además tiene dos anexos, uno referente a las recomendaciones
para la protección de los sistemas de información del laboratorio y otro sobre la ética en
el laboratorio clínico.
Los participantes coinciden en que el punto, de mayor interés, abordado en el curso fue
la gestión de riesgos en los laboratorios clínicos. En la última actualización de la norma
ISO 15189, se enfatiza en la prevención y control de riesgos, nuevas técnicas y
herramientas para atender este aspecto crítico, que debería aplicarse, de manera
obligatoria, para la seguridad del paciente.
Solo la acreditación aporta confianza, tanto en la competencia del laboratorio para emitir
resultados confiables, al disponer de los recursos humanos, equipos y materiales y de la
experiencia necesaria, como en su capacidad de proporcionar un servicio calificado
adecuado a las necesidades de médicos y pacientes. [2]
EQUIPAMIENTO GENERAL DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA
MOLECULAR.

 Plataforma de pipeteo (Freedom EVO 75 (TECAN))


DESCRIPCIÓN.
Robot para el manejo de líquidos. el sistema dispone de jeringas y dilutores de 100
microlitros para dispensación de liquidos que cubren un rango de volumen entre 0.5 y
100 microlitros. El equipo permite trabajar con volumenes de 0.5 microlitros a 5 ml.
APLICACIONES.

 Extracciones de ácidos nucleicos.


 Ensayos ELISA.
 Preparacion de PCR.
 Diluciones seriadas.

 Equipo Light Cycler 480 II Roche

DESCRIPCIÓN
Combinando una extraordinaria precisión con la más alta velocidad en PCR en tiempo
real, el LightCycler 480 II es la más novedosa plataforma de RAS para análisis de
expresión génica y detección de mutaciones mediante curvas de fusión.
Basado en una innovadora combinación de hardware y software, el LightCycler 480 es
un equipo modular capaz de analizar 96 ó 384 muestras simultáneamente, destinado a la
detección cuantitativa o cualitativa de ácidos nucleicos, genotipado, "gene scanning"y
análisis de mutaciones.
El equipo cuenta con un innovador sistema de control de temperatura, que conduce a una
extraordinaria homogeneidad pocillo a pocillo y maximiza la reproducibilidad intra-
ensayo e inter-ensayo.
COMPOSICIÓN
El nuevo sistema óptico de alto rendimiento proporciona la máxima sensibilidad para
todos los formatos en los 6 canales de detección (500 nm, 533 nm, 568 nm, 610 nm, 640
nm, 670 nm), asegurando la recogida uniforme de la señal fluorescente con independencia
de la posición o del volumen de la muestra.
Roche Applied Science ha desarrollado un avanzado módulo de Softwares para adaptarse
a las necesidades del usuario LightCycler 480 y obtener la información más completa de
cada experimento de PCR en tiempo real: Detección cualitativa, Cuantificación absoluta,
Cuantificación relativa, Tm calling, Genotipado, Gene Scanning, LIMS.
El instrumento se completa con reactivos específicamente desarrollados y dirigidos a
aplicaciones específicas. Estos reactivos, basados en la tecnología Fast Start, aseguran
una óptima reproducibilidad y el máximo rango dinámico.
APLICACIONES
Cuantificación o genotipado, detección mediante SYBRGreen, R27 o sondas, análisis de
curvas de fusión de alta resolución: HRM

 Equipo Eppendor Realplex

DESCRIPCIÓN
Sistema modular para PCR Cuantitativa a tiempo real, Eppendorf Realplex con dos filtros
de emisión y termociclador PCR Eppendorf modelo Mastercycler ep Gradient S. Incluye
PC Dell Optiplex con pantalla plana de 17’.

COMPOSICIÓN
Sistema óptico: Excitación por 96LEDs, longitud de onda de 470 nm, detección por
fotomultiplicadores CPM con 2 (Realplex2) o 4 filtros de emisión para Multiplex.
Software sencillo e intuitivo con posibilidad de monitorización de los datos de la PCR a
tiempo real y 5 módulos de análisis de los resultados: Cuantificación (absoluta y relativa
basada en método ΔΔCt), Análisis de Curva de disociación. Además el software permite
definir subensayos para poder correr dos ensayos de PCR diferentes e independientes a
la vez, que comparten el mismo programa de PCR. Posibilidad de trabajar con 4
fluorocromos y 96 muestras simultáneamente. Posibilidad de trabajar en gradientes de
temperatura.
UTILIDAD
PCR cuantitativa usando sondas específicas o mediante curvas de disociación para la
detección y análisis de expresión de dianas.

APLICACIONES
Aplicaciones en genética, bioquímica, biología celular, biomedicina, microbiología, etc.
Estudios de la expresión génica midiendo cantidad de mensajeros mediante rtPCR
cuantitativa. Cuantificación de dosis génica y amplificación de genes. Detección de
mutaciones.

 Equipo Lector de Placas Synergy HT Y Synergy HTX

Lector de Placas Synergy HT Lector de Placas Synergy HTX

DESCRIPCIÓN
Lector de microplacas, modelo Synergy HT, marca BioTek. con capacidad de multi-
detección (espectrofotómetro, fluorímetro y luminómetro).
El equipo utiliza un diseño único de doble-óptica. Cuando existe la necesidad de realizar
medidas de fluorescencia o luminiscencia, el equipo emplea una lámpara halógena de
tungsteno con filtros interferenciales en conjunción con un detector fotomultiplicador.
Cuando requerimos medidas de absorbancia, se cambia a una lámpara flash de xenon y a
un monocromador para seleccionar la longitud de onda deseada. El uso de una lámpara
flash de xenon permite realizar medidas de absorbancia tanto en el UV como en el visible.

COMPOSICIÓN
El lector admite todo tipo de placas, desde 6 a 386 pocillos. También existe la posibilidad
de emplear tubos de PCR y placas Terasaki.

UTILIDAD
Realizar medidas de luz emitida por la muestra analizada. Al poseer inyector, pude
introducirse el sustrato una vez la muestra se encuentra dentro, mejorando la medición.

APLICACIONES
Fundamentalmente en las áreas de genética y biología celular. Medidas de actividad
luciferasa sobre cultivos celulares.
 Ultracentrífuga de sobremesa Óptima MAX

DESCRIPCIÓN
Ultracentrifuga de sobremesa, modelo OPTIMA MAX, marca Beckman Coulter, puede
generar hasta 130.000 rpm. con un valor máximo de 1.019.000 g, puede albergar
volúmenes de muestra por tubo desde 0,2 a 8 ml. Equipada con los rotores:
- Rotor de ángulo fijo de titanio tipo MLA-80. Velocidad máxima 80.000 rpm. Fuerza
máxima 444.000 g. Capacidad máxima 64 ml. en 8 tubos de 8 ml. Factor K de 29.
Completo, con todos los accesorios necesarios para su uso.
- Rotor basculante de Aluminio/Titanio tipo TLS-55. Velocidad máxima 55.000 rpm.
Fuerza máxima 259.000 g. Capacidad máxima 8,8 ml. en 4 tubos de 2,2 ml. Factor K de
50. Completo, con todos los accesorios necesarios para su uso.
- Rotor de ángulo fijo de titanio tipo TLA-110. Velocidad máxima 110.000 rpm. Fuerza
máxima 657.000 g. Capacidad máxima 40,8 ml. en 8 tubos de 5,1 ml. Completo, con
todos los accesorios necesarios para su uso.
- Kit Selladora de Tubos (comprobar los accesorios y ver si coincide la referencia).

ADAPTADORES Y TUBOS
- Ver tabla.

UTILIDAD
Separación gravimétrica de muestras en general. Fraccionamiento celular, separación de
fases.

APLICACIONES
Biología molecular y celular, fisiología animal y vegetal, ciencias químicas, ecología,
genética y microbiología. [1]
NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BIOLOGÍA
MOLECULAR
Normas básicas de bioseguridad en el laboratorio
1. Leer la guía de laboratorio para comprender los objetivos, los conceptos básicos y el
procedimiento a seguir durante la actividad.
2. Preparar y reservar los materiales, equipos y reactivos o soluciones necesarias para el
desarrollo de la práctica. Leer las Fichas Técnicas y de Seguridad (MSDS, por sus siglas
en inglés) de los reactivos que van a ser usados durante la experimentación.
3. Utilizar elementos de protección (bata de laboratorio, guantes, gafas de seguridad,
máscaras para gases y zapatos con suela antideslizante). La bata y los zapatos deben
mantenerse bien cerrados para evitar accidentes.
4. No consumir alimentos ni bebidas en el laboratorio.
5. Trabajar en un área con buena ventilación.
6. No pipetear con la boca.
7. En caso de presentarse algún derrame o salpicadura, se debe limpiar inmediatamente,
empleando el equipo de seguridad adecuado. Si hay contacto con la piel o los ojos debe
lavar inmediatamente durante al menos 10 minutos con abundante agua. Todo accidente
o incidente debe ser informado al coordinador de la práctica.
8. Lavarse las manos con agua y jabón antes y después de la práctica.
9. Limpiar y organizar el área de trabajo al finalizar.

Normas de bioseguridad para los Laboratorios de Biología, Genética, Química,


Biotecnología y Bioquímica y Nutrición Animal.
El laboratorio debe ser un lugar seguro para trabajar donde no se deben permitir descuidos
e indisciplina. Para ello se tendrán siempre presente los posibles riesgos asociados al
trabajo con materiales peligrosos. Nunca hay excusa para los accidentes en un laboratorio
bien equipado en el cual trabaja personal bien informado. A continuación, se exponen una
serie de normas que deben conocerse y seguirse en el laboratorio:
 Durante la estancia en el laboratorio el alumno debe ir provisto de bata, gafas de
seguridad, tapabocas, polainas y guantes de látex. La bata, el tapabocas y las polainas
deberán emplearse durante toda la estancia en el laboratorio. Las gafas de seguridad
siempre que se manejen productos peligrosos, se realice siembra de tejidos en cámara y
durante el calentamiento de disoluciones. Los guantes deben utilizarse obligatoriamente
en la manipulación de productos tóxicos o cáusticos y para la desinfección, siembra y
manipulación de material sujeto a estudio o investigación.
 Quítese todos los accesorios personales que puedan comprender riesgos de accidentes
mecánicos, químicos o por fuego, como son anillos, pulseras, collares, gorras y
sombreros, y además, para crear un ambiente aséptico adecuado. LA
RESPONSABILIDAD POR LAS CONSECUENCIAS DE NO CUMPLIR ESTA
NORMA DENTRO DEL LABORATORIO ES ENTERAMENTE DEL ESTUDIANTE.
 Está PROHIBIDO FUMAR, BEBER O COMER en el laboratorio, así como dejar
encima de la mesa del laboratorio algún tipo de prenda.
Mantenga las uñas recortadas. El cabello largo se llevará siempre recogido.
 Utilizar siempre zapato cerrado.
 Debe conocerse la toxicidad y riesgos de todos los compuestos con los que se trabaje.
Debe consultarse siempre las etiquetas y libros sobre reactivos en busca de información
sobre seguridad.
 Como regla general no se debe pipetear nunca con la boca utilizar peras o pipeteadores.
Los volúmenes de ácidos, bases concentradas y disolventes orgánicos se medirán con
probetas, en el caso de que se deban medir los volúmenes exactos se deben utilizar pipetas
de vidrio o micropipetas.
 Mantenga sólo el material requerido para la sesión sobre la mesa de trabajo. Los frascos
de reactivos deben permanecer en los estantes respectivos. Los demás objetos personales
o innecesarios deben guardarse o colocarse lejos del área de trabajo (a la entrada del
laboratorio).
 Los frascos de los reactivos deben cerrarse inmediatamente después de su uso, durante
su utilización los tapones deben depositarse siempre boca arriba sobre la mesa.
 No deben manipularse jamás productos o disolventes inflamables cerca a mecheros.
 Si algún reactivo se derrama, debe retirarse inmediatamente dejando el lugar
perfectamente limpio. Las salpicaduras de sustancias básicas deben neutralizarse con un
ácido débil (por ejm. Ácido cítrico) y las de sustancias ácidas con una base débil
(bicarbonato sódico). Consultar con el laboratorista para el uso del Chemisorb.
 Cuando se tengan dudas sobre las precauciones de manipulación de algún producto debe
consultarse al profesor antes de proceder a su uso.
 No calentar nunca enérgicamente una disolución. La ebullición debe ser siempre suave.
 El mechero debe cerrarse, una vez utilizado, tanto de la llave del propio mechero como
la toma del gas de la mesa o si es manual tapándolo.
 Las disoluciones y recipientes calientes deben manipularse con cuidado. Para la
introducción y extracción de recipientes de hornos y estufas deben utilizarse las pinzas y
guantes adecuados (asbesto).
 Las HERIDAS Y QUEMADURAS deben ser tratadas inmediatamente. En el caso de
salpicaduras de ácidos sobre la piel lavar inmediatamente con agua abundante, teniendo
en cuenta que en el caso de ácidos concentrados la reacción con el agua puede producir
calor. Es conveniente retirar la ropa para evitar que el corrosivo quede atrapado entre la
ropa y la piel.
 Deben conocerse la situación específica de los elementos de seguridad (lavaojos, ducha,
extintor, salidas de emergencia,) En el laboratorio, así como todas las indicaciones sobre
seguridad expuestas en el laboratorio.
 No debe llevarse a la boca ningún material de laboratorio; si algún reactivo es
accidentalmente ingerido, avise de inmediato al Profesor o a la persona encargada.
Normas de trabajo
 Cada estudiante es responsable del material que se le asigne, además del equipo especial
(por ejemplo centrífugas, balanzas, cámaras de flujo laminar, agitadores, ollas de
esterilización, estufas, peachímetros, entre otros.) En caso de pérdida o daño, el docente
deberá reportar el hecho al encargado del laboratorio o de lo contrario deberá responder
por ello, y llenar la correspondiente ficha (Formatos ISO). Antes de empezar con el
procedimiento experimental o utilizar algún aparato revisar todo el material, y su manual
de funcionamiento en su caso (Formatos ISO).
 Al finalizar cada sesión de prácticas el material y la mesa de laboratorio deben dejarse
perfectamente limpios y ordenados.
 Las disoluciones de reactivos, que no sean patrones ni muestras, se almacenan en
botellas de vidrio o plástico que deben limpiarse y rotularse perfectamente.
 Los reactivos sólidos deben devolverse al lugar de donde se tomaron inmediatamente
después de su uso.
 Las balanzas deben dejarse a cero y perfectamente limpias después de finalizar la
pesada.
 Cerca de las balanzas sólo deben permanecer los estudiantes que se encuentren pesando
(uno por balanza).
El material asignado a cada práctica debe permanecer en un lugar adecuado para ella.
No se debe coger material destinado a prácticas distintas a la que se está realizando. Bajo
ningún concepto se sacarán reactivos o material de prácticas fuera del laboratorio.
Calentar y destilar
 Para recoger recipientes calientes como cápsulas, crisoles, vasos, entre otros, utilizar las
correspondientes pinzas. También nos podremos ayudar de un paño.
 Cuando se calienten líquidos, evitar que la posible proyección pueda alcanzar a
cualquier persona o reactivo incompatible. Al calentar una solución en un tubo de ensayo,
debe hacerse bajo el nivel del líquido y constantemente agitando. No debe apuntarse con
el tubo al compañero o a sí mismo, pues puede proyectarse.
 Al calentar vidrio, dejar enfriar antes de cogerlo. Colocarlo sobre un material
térmicamente aislante, el vidrio caliente tiene el mismo aspecto que el vidrio frío.
 No manipular productos inflamables (benceno, tolueno, éter, etc.) en presencia de
mecheros encendidos. No destilar éter con llama o en presencia de mecheros encendidos.
Gases
 Las reacciones en las que se prevea un desprendimiento de gases, deben realizarse
siempre en una cámara extractora.
 No se deben oler directamente los productos químicos, si debe realizarse, abanicarse
hacia sí con la mano.
Puesto de trabajo
 Conservar siempre limpios los aparatos y el puesto de trabajo. Evitar derrames de
sustancias, pero si ocurre accidentalmente, informar al docente o persona encargada para
llevar a cabo la adecuada recolección.
 Todas las prácticas deberán realizarse con limpieza, al terminar la sesión, toda el área
de trabajo deberá quedar ordenada y limpia. Manejo de sustancias
 No deben manipularse productos químicos con las manos. Usar papel, espátulas, etc.
Usar guantes para el manejo de reactivos corrosivos y/o altamente tóxicos. No comer y
no fumar en el laboratorio, y antes de hacerlo fuera del mismo, lavarse las manos.
 Al usar cualquier tipo de reactivos, asegúrese que es el necesario para la práctica y lea
su etiqueta. Si es transferido de recipiente etiquételo de nuevo.
Deben utilizarse las pipetas rotuladas para cada reactivo, no intercambiarlas, esto evita la
contaminación de los mismos.
 Todos los reactivos deberán manejarse con el equipo perfectamente limpio. Al pipetear
líquidos transfiéralos a otro recipiente para su uso. Los reactivos no usados no se
devuelven a los frascos originales; pedir asesoría.
 Dilución de ácidos: añadir lentamente el ácido al agua contenida en un recipiente,
agitando constantemente y enfriándolo. Nunca añadir agua al ácido.
 Al agitar moderadamente un tubo de ensayo golpee con la punta del dedo la base del
tubo. Cuando requiera una agitación vigorosa por inversión del recipiente, tápelo con un
tapón de vidrio esmerilado o papel parafilm o vinilpel. Nunca lo haga con la mano.
Residuos
Con el objetivo de minimizar, controlar y evitar la contaminación ambiental por residuos
químicos en los laboratorios de Química, Bioquímica, Suelos y Tejidos Vegetales existen
diagramas de flujo de cada práctica, éstos indican el recipiente adecuado para la
disposición de cada grupo de residuos. Su manejo se indica la primera semana de clases.
 Los residuos líquidos deben disponerse en recipientes especiales para cada uno de ellos.
El personal encargado del laboratorio procederá a su debido tratamiento.
 Depositar los residuos sólidos como agar, papeles de cromatografía, papel filtro, entre
otros, en la caneca roja o en el recipiente destinado para ello.
 El material de vidrio roto deberá descartarse en el recipiente especial para ese efecto,
informando del hecho al encargado del laboratorio, pues es material de inventario.

Bibliografía

[1] L. D. B. M. Y. CITOGENÉTICA. [En línea]. Available:


http://www.juntadeandalucia.es/csalud/larcel/content/laboratorio-de-biologia-molecular.

[2] «Servico de Acreditacion,» 25 Agosto 2017. [En línea]. Available:


http://www.acreditacion.gob.ec/iso-15189-sistemas-de-gestion-de-la-calidad-en-
laboratorios-clinicos/.

[3] USE. [En línea]. Available:


https://investigacion.us.es/scisi/sgi/servicios/biologia/equipamiento/molecular-i.