2.

¿Cuáles son los criterios principales para seleccionar una columna de HPLC y un buen
eluyente para un analito determinado?

La elección de la columna correcta en función del tipo de compuesto que se está tratando de
analizar es importante en el logro de los datos óptimos.

Instrucciones

1 Las perlas de sílice en la columna son porosas, y la elección del tamaño de los poros depende
del tamaño de las moléculas de ser separados. Las moléculas pequeñas requieren un tamaño de
poro de menos de 100 angstroms, y las grandes moléculas, tales como proteínas, requieren un
tamaño de poro mayor de 300 angstroms. Un tamaño de poro más pequeño aumentará el
rendimiento de la columna, pero generará más presión del sistema.

2 Determinar la longitud de la columna necesaria mediante la determinación de la cantidad de

compuestos y qué tipo de compuestos que tienen que separarse. longitudes de columna van de
5 a 25 centímetros. Largas columnas proporcionan una mejor resolución y la eficiencia, sino que
requieren mayores tiempos de retención y una presión más alta. Es preferible elegir la columna
más corta posible al tiempo que conserva una resolución adecuada.

3 Si la resolución es inadecuada, disminuyendo el diámetro interno de la columna será de ayuda.

diámetros más pequeños aumentarán la eficiencia y resolución, pero requiere un caudal menor
de disolvente y, por lo tanto, aumenta el tiempo de análisis. Tenga en cuenta que todas las
impurezas, tales como tierra, se obstruyen rápidamente la columna con pequeños diámetros
internos.

4 Determinar el tamaño de las perlas de sílice que desee usar para su columna. La mayoría de las
columnas tienen un tamaño de partículas de sílice de 5 μm. menor tamaño de partícula, tal como
3 μm, ofrecerá una mayor separación y disminuirá el tiempo de análisis. Sin embargo, las
partículas más pequeñas requieren una mayor cantidad de presión para empujar la mezcla a
través de la columna.

Los eluyentes generalmente utilizados son n-hexano, iso-octano, acetonitrilo, metanol, cloruro
de butilo, cloroformo, cloruro de metileno, tetrahidrofurano y 2-propanol. Los tres primeros
disolventes, pueden obtenerse muy puros y con una gran transparencia frente a la radiación
ultravioleta de bajas longitudes de onda, lo que los hace muy aptos para su utilización con el
detector de UV. Es muy frecuente la utilización como el eluyente de mezclas de dos a o mas
disolventes de diferente polaridad. En general, al disolvente de mayor polaridad se le denomina
modificador, y suele ir en pequeñas proporciones. Una regla general para elegir el disolvente a
utilizar como fase móvil es que la variación de 0.005 unidades de є° hace variar el factor de
capacidad (k') en 2- unidades.
3. ¿Qué aplicaciones tiene un gradiente de concentración en una determinación
cromatográfica de HPLC; mencione un ejemplo bien detallado
4. Haga un cuadro comparativo con al menos 5 diferencias entre la técnica de HPLC y
cromatografía de gases

HPLC Cromatografía de Gas

La fase Movible es un líquido La fase Movible es un gas

La Separación se basa en la acción recíproca del La Separación se basa sobre todo en los puntos de
soluto con el media de la cromatografía ebullición de las moléculas del soluto

Puede ser realizado en una hoja o una Columna Puede ser realizado solamente en una Columna

Puede ser utilizado para separar cualquier pasta Puede ser aplicado en la separación de pastas volátiles
soluble, Ejemplo: aminoácidos, proteínas, y de mezclas gaseosas
drogas, ácidos nucléicos, lípidos, antioxidantes,
hidratos de carbono, y polímeros naturales y
artificiales

Realizado Generalmente en las pastas tan Realizado en substancias inestables más altas de las
sensibles al calor de la temperatura ambiente temperaturas pudo conseguir tan térmicamente
puede ser analizado con seguridad usando la desnaturalizado
técnica

La retención del Soluto aquí se basa en la acción La Separación se basa en los puntos de ebullición de las
recíproca de solutos con las fases movibles y moléculas del soluto así que no es muy flexible en
estacionarias así que es fácil optimizar resultados términos de separación óptima

Esto es una técnica relativamente más lenta El análisis se mide más rápidamente y generalmente en
minutos, aunque pueda tomar tan poco como un par de
segundos

Da Generalmente un mayor pico o una banda Proporciona a una resolución comparativamente mejor
más amplia dando por resultado una resolución
más inferior

Los disolventes polares de las Aplicaciones tienen Utiliza cualquier disolvente que se vaporice
gusto del agua o del metanol