You are on page 1of 16

MAKALAH FITOKIMIA

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Disusun Oleh
KELOMPOK IX :
INGGRIT ROA 17.01,039
WILDA NILAM SARI 17.01.410
RESTIA PERWITA MAHARRANTI 17.01.442
MUH IRSYAD KHAIRULLAH YASIR 17.01.451
NURLIATI 17.01.461
ELISABETH BUREM 16.01.312
NITA PATIUNG 14.01.087
NUR HADJA LULUN 17.01.
SAKINATUL HUSNA 17.01.

SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI KEBANGSAAN
MAKASSAR
2017
DAFTAR ISI
Halaman
Halaman Judul .................................................................................... 1
BAB I Pendahuluan
1.1. Latar Belakang ............................................................................ 3
1.2. Rumusan Masalah ....................................................................... 3
1.3. Maksud dan Tujuan ..................................................................... 4
BAB II Teori Umum
2.1. Klasifikasi Tumbuhan Sekunyit ................................................... 5
2.2. HPLC ........................................................................................... 5
2.2.1 Komponen-komponen HPLC ............................................. 6
2.2.2 Senyawa Yang Bisa Digunakan Dalam HPLC ................... 8
2.2.3 Teknik-teknik HPLC ........................................................... 8
BAB III Metodologi Penelitian
3.1. Alat dan Bahan ............................................................................ 9
3.1.1 Alat ........................................................................................ 9
3.1.2 Bahan .................................................................................... 9
3.2. Cara Kerja .................................................................................... 9
BAB IV Hasil dan Pembahasan
1.1. Hasil ............................................................................................ 12
1.2. Pembahasan ................................................................................ 12
BAB V Penutup
5.1. Kesimpulan .................................................................................. 16
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................
LAMPIRAN..........................................................................................

2
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Sekunyit (Fibraure tinctoria Lour) merupakan salah satu
tumbuhan obat yang sudah digunakan oleh masyarakat. Akar dan
batang tumbuhan ini dilaporkan berkhasiat dapat menyembuhkan
beberapa penyakit seperti konjungtivitas, disentri, diabetes dan kanker.
Keberadaan spesies ini masih banyak ditemukan di daerah provinsi
Riau. Berdasarkan eksplorasi yang dilakukan oleh Badan Litbangkes
Kemenkes RI bekerja sama dengan Universitas Riau, spesies ini
ditemukan di beberapa kabupaten berbbeda yaitu Kabupaten
Bengkalis, Rokan Hulu, Inderagiri Hulu dan Pelalawan.
Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk
bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi
sampel diantara suatu rasa gerak yang bisa berupa gas ataupun cair
dan rasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan.
Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas
berdiameter besar, pada dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu
analisis lama dan segala prosedur biasanya sangat membosankan.
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi telah berhasil dikembangkan dari
usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan
kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan
suatu bentuk hasil keahlian membuat instrumentasi dan pengepakan
kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini dengan teknik yang
sudah matang dan dengan cepat KCKT mencapai suatu keadaan yang
sederajat dengan kromatografi gas.
1.2 Rumusan masalah
Berapakah kadar barberin yang terkandung dalam esktrak
etanol akar dan batang Fibraure tinctoria Lour.

3
1.3 Maksud dan Tujuan
Untuk mengetahui kadar senyawa barberin yang terkandung
dalam ekstrak etanol akar dan batang Fibraure tinctoria Lour.

4
BAB II
TEORI UMUM
2.1 Klasifikasi Tumbuhan Sekunyit ( Fibraurea tinctoria Lour )
Tumbuhan Fibraurea tinctoria Lour merupakan spesies
tumbuhan yang termasuk kedalam famili Manispermaceae. Adapun
taksonomi tumbuhan ini menurut Burkill (1966) diklasifikasikan
sebagai berikut :
Kingdom : plantae
Divisi : Spermatophyta
Kelas : Angiospermae
Bangsa : Ranunculales
Suku : Manispermaceae
Marga : Fibraurea Lour
Spesies : Fibraurea tinctoria Lour
Nama Daerah : Sekunyit
2.2 HPLC
HPLC (High Performance Liquid Cromatography) atau
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan sistem
pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini
karena didukung oleh kemajuan dalam teknologi kolom, sistem
pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif dan beragam.
KCKT mampu menganalisa berbagai cuplikan secara kualitatif
maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun
campuran (Ditjen POM, 1995).
Kromatografi cair kinerja tinggi adalah salah satu teknik
analisis yang paling banyak digunakan di industri. Digunakan untuk
memisahkan dan analisis melalui perpindahan massa analit antara
fase diam dan fase gerak. Teknik ini digunakan dalam berbagai
aktifitas, seperti analisis makanan, oba- obatan dan agrokimia. Teknik
HPLC menggunakan fase gerak cair untuk memisahkan komponen-
komponen dari sebuah campuran (Elizhabeth, 2003)

5
Pada awalnya, tekanan dipilih sebagai kriteria dasar pada
teknik kromatografi cair yang modern ini sehingga HPLC merupakan
singkatan dari “ High Pressure Liquid Chromatography”. Hal ini
mengakibatkan adanya pandangan ini tidak sepenuhnya benar. Pada
kenyataanya, performa tinggi dihasilkan oleh banyak faktor bukan
hanya tekanan tinggi saja seperti :
1. Ukuran partikel yang sangat kecil yang terdistribusi secara
sempit
2. Keseragaman ukuran dan ditribusi pori
3. Teknik slurry packing ( pengisian kolom ) bertekanan tinggi
4. Injektor yang akurat dalam memasukkan sampel dengan
jumlah sangat kecil
5. Detektor yang sensitive bahkan pada volume yang sangat
rendah
6. Dan tentu saja sistem yang baik ( Rubiyanto Dwiarso, 2013)
2.2.1 Komponen-komponen HPLC
1. Pompa (Pump)
Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan
(constant pressure) dan pemindahan konstan (constant
displacement)
2. Injektor (injector)
Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :
a. Stop-Flow : Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja
atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi.
b. Septum: Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan
yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat
digunakan pada kinerja sampai 60 -70 atmosfir.
c. loop valve : Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk
menginjeksi volume lebih besar dari 10 μ dan dilakukan
dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor

6
yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan
secara manual).
3. Kolom (Column)
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya
suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi
percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua
kelompok :
a. Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom
tergantung pada jenis material pengisi kolom. Untuk
kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100
cm
b. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau
lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm.
4. Detektor (Detector)
Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254
nm
5. Elusi Gradien
Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa
gerak selama analisis kromatografi berlangsung.
6. Pengolahan Data (Data Handling)
Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam
bentuk kromatogram pada rekorder.
2.2.2 Keuntungan dan Kerugian HPLC
1. Keuntungan :
a. mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
b. mudah melaksanakannya
c. kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
d. dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan
yang dianalisis
e. Resolusi yang baik
f. dapat digunakan bermacam-macam detektor

7
g. Kolom dapat digunakan kembali
h. mudah melakukan "sample recovery"
2. Kerugian :
a. Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu
b. Hanya bisa digunakan untuk asam organik
c. Harus mengetahui kombinasi yang optimumantara pelarut,
analit, dan gradien elusi
d. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup
penelitian yang terbatas
2.2.3 Senyawa yang bisa digunakan dalam HPLC
a. senyawa organik
b. senyawa anorganik
c. senyawa biologis
d. analisi ketidakmurnian
e. analisis senyawa nonvalotil
2.2.4 Teknik-teknik dalam HPLC
Terdapat 4 jenis utama teknik HPLC
a. HPLC fase normal (Normal Phase Chromatography)
b. HPLC fase terbalik (Reversed Phase HPLC)
c. HPLC penukar ion (Ion Exchange Chromatography)
d. HPLC Size Exclusion Chromatography

8
BAB III
METODE PENELITIAN

3.1 Alat dan bahan
3.1.1 Alat
 Gelas ukur
 Pipet
 Oven
 Grinder
 Bejana maserasi
 Rotary evaporator
3.1.2 Bahan
 Simplisia akar dan batang tanaman Sekunyit
 Etanol
3.2 Cara Kerja
1. Penyiapan Ekstrak
Akar dan batang dari tumbuhan Fibraureatinctoria Lour
diambil di Desa Pranap, Kabupaten Inderagiri Hulu, Propinsi Riau.
Sampel tumbuhan diidentifikasi di Laboratorium Botani Jurusan
Biologi Universitas Riau. Akar dan batang sekunyit dibersihkan dari
pengotor kemudian dikeringkan menggunakan oven dengan
temperatur 400C. Sampel yang telah kering dihaluskan
menggunakan grinder, lalu dimaserasikan dengan pelarut etanol.
Proses maserasi dilakukan selama tiga hari sebanyak tiga kali
pengulangan sehingga didapatkan maserat etanolnya. Maserat
tersebut kemudian dipekatkan menggunakan rotary evaporator
sehingga diperoleh ekstrak kental etanol.
2. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Sebanyak 2 mg sampel berberin standar dilarutkan dalam 5
ml akuades hingga diperoleh larutan berberin 100 ppm. Selanjutnya
dibuat untuk konsentrasi 10 dan 1 ppm. Serapan diukur

9
padapanjang gelombang 200-800 nm dan ditentukan panjang
gelombang maksimum berberin.
3. Uji Kesesuaian Sistem Fase Gerak
Metoda penentuan fase gerak dilakukan berdasarkan
modifikasi dari penelitian sebelumnya. Fase gerak yang digunakan
adalah campuran fase gerak phosphate buffer pH 6,8dengan
metanol (gradien elusi) dengan laju aliran1 ml/menit dengan volume
penyuntikan masing-masing sampel 20 μl dan menggunakan kolom
RPC18, pada panjang gelombang 346 dan 266 nm.
4. Pembuatan Kurva Kalibrasi Standar Berberin
Sebanyak 25 mg senyawa berberin standar dilarutkan dalam
25 ml metanol hingga diperoleh larutan berberin 1000 ppm.
Selanjutnya 0,62 mllarutan berberin 250 ppm dipipet ditambahkan
dengan metanol dalam labu ukur sampai 25 ml. Kemudian
dilanjutkan variasi konsentrasi untuk1; 10; 50; 75 dan 200 μg/ml,
diultrasonikasi dan disaring dengan filter milipore 0,2 μm. Filtratnya
masing-masing diinjeksikan ke sistem KCKT dengan volume
penyuntikan 20 μl menggunakan fase gerak buffer posfat pH 6,8
dengan metanol(gradien elusi) dengan laju aliran (flow rate) 1 ml/
menit, deteksi dilakukan pada panjang gelombang 346 dan 266 nm.
Pengulangan dilakukan sebanyak lima kali. Dari data pengukuran
dibuat kurva kalibrasi dengan menggunakan persamaan garis
regresi linier (y = 174947,6292 + 308884,6864) untuk berberin,
dimana x adalah konsentrasi berberin dan y adalah luas puncak
perbandingan.
5. Penetapan Kadar Berberin Ekstrak
Ekstrak etanol ditimbang sebanyak 2 mg dilarutkan dalam 5
ml metanol HPLC grade, kemudian diultrasonikasi dan disaring
dengan filter milipore 0,2 μm. Pengukuran pada sistem KCKT
(Shimadzu 20 AD) dilakukan dengan prosedur yang sama dengan
pengukuran berberin standar.

10
6. Analisis data
- Analisa kualitatif
Data kualitatif ditentukan dengan melihat perbandingan
kromatogram senyawa berberin standar dengan ekstrak etanol
dan dilihat pada waktu retensi yang sama.
- Analisa kuantitatif
Analisa kuantitatif dengan menghitung kadar dari
persamaan regresi :

Y = a+bx

Kemudian, perbandingan luas area konsentrasi dan kadar total
senyawa berberin dihitung dalam jumlah gram ekstrak :

berat berberin
% Berberin = x 100%
berat ekstrak

11
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
Pada penelitian ini, analisa senyawa berberin dilakukan
menggunakan KCKT fase terbalik. Untuk dapat memberikan hasil
analisis yang baik, pengujian menggunakan KCKT memerlukan
optimasi terlebih dahulu yang meliputi panjang gelombang analisa,
komposisi fase gerak dan laju alir. Penentuan panjang gelombang
maksimum analisa senyawa berberin dilakukan menggunakan
spektrofotometer UV-Vis. Sebanyak 2 mg senyawa berberin standar
dilarutkan dalam 5 ml metanol diukur pada panjang gelombang 200
sampai 800 nm. Diperoleh serapan tertinggi senyawa berberin pada
panjang gelombang 346 dan 266 nm. Panjang gelombang ini
kemudian digunakan pada instrument KCKT untuk mendeteksi sampel
yang akan dianalisa.
4.2 Pembahasan
Pada penelitian sebelumnya panjang gelombang 266 nm telah
digunakan untuk mendeteksi senyawa berberin sesuai dengan
literatur [8]. Analisa senyawa berberin juga telah dilakukan pada
panjang gelombang 346 nm [9]. Untuk itu panjang gelombang 266 nm
tetap dilakukan dan pengukuran dilanjutkan pada panjang gelombang
346 nm.
Penentuan komposisi fase gerak dan laju alir dilakukan juga
berdasarkan modifikasi dari penelitian yang telah dilaporkan [8,9].
Campuran metanol dan phosphate buffer (pH 6,8) memberikan
kromatogram terbaik. Dengan sistem fase gerak ini menghasilkan
puncak yang lebih sedikit pada garis alas dan cepat mencapai kondisi
kromatografi yang stabil. Penggunaan buffer posfat dengan pH 6,8
sebagai campuran dalam fase gerak adalah untuk mempertahankan
atau mendapatkan pH yang stabil untuk berberin. Penambahan buffer
posfat yang sesuai dengan pH stabilitas analit bertujuan untuk

12
mencegah terurainya atau terionnya analit yang akan menyulitkan
proses pemisahan analit oleh fase gerak. Konsentrasi metanol dalam
fase gerak berpengaruh terhadap waktu retensi senyawa berberin
standar. Hal ini disebabkan kekuatan pelarut, dimana pada
kromatografi faseterbalik, konsentrasi metanol yang lebih besar dapat
mengakibatkan fase gerak semakin kuat dan elusi menjadi semakin
cepat, makanya waktu retensi menjadi lebih singkat

Gambar 1.Kurva kalibrasi berberin standar

Dari hasil penyuntikan senyawa berberin standar diperoleh
waktu retensi dengan 1 puncak yaitu 7,533 menit. Sedangkan waktu
retensi yang diperlihatkan oleh puncak berberin dalam ekstrak
adalah 7,691 menit. Pada sampel ekstrak etanol Untuk penetapan
kadar senyawa terlebih dahulu dilakukan pembuatan kurva
kalibrasi. Hasil kurva kalibrasi diperoleh hubungan yang linear antara
konsentrasi dan serapan dengan persamaan regresi y =
308884,6864x + 174947,6292 dan nilai koefisien korelasi (r) adalah
0,984. Linieritas dari kurva kalibrasi juga dilihat dengan menghitung
koefisien variasi dari fungsi regresi (Vxo). Linearitas antara

13
konsentrasi dan serapan menunjukkan hubungan yang cukup baik
yang juga dapat dilihat dari nilai koefisien variasi dari fungsi (Vxo)
0,20% dimana syarat dari nilai Vxo untuk senyawa murni < 2% [10].
Parameter selanjutnya yang menggunakan data kurva kalibrasi yaitu
parameter batas deteksi dan batas kuantitasi. Batas deteksi (LOD)
adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi
yang masih memberikan respon signifikan. Hasil batas deteksi
adalah 61,331 ppm, Sedangkan batas kuantitas (LOQ) merupakan
parameter pada analisa sebagai kuantitas terkecil analit dalam
sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama.

Gambar 2. Kromatogram berberin standar menggunakan
fase gerak
metanol:buffer posfat pH 6,8 pada panjang gelombang 346 nm

Hasil batas kuantitas adalah 204,438 ppm. Dari hasil
tersebut masih bisa memberikan kecermatan yang baik. Hasil nilai
batas deteksi dan batas kuantitas ini dapat dipengaruhi oleh pelarut
yang digunakan, kelarutan dari senyawa dalam pelarut yang
digunakan, dalam proses pengerjaan seperti pengadukan yang

14
tidak stabil, tidak konstan dan suhu yang sangat mempengaruhi
besar kecilnya nilai batas deteksi. Hasil pengujian KCKT ekstrak
etanol menghasilkan kadar berberin sebesar 25,8 %.

15
BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan analisa ekstrak etanol akar dan batang sekunyit
(Fibraurea tinctoria Lour) menggunakan metode KCKT dengan fase
gerak berupa campuran eluen metanol : buffer fosfat pH 6,8 (gradien
elusi), laju alirnya 1 ml/menit dideteksi dengan detektor UV pada
panjang gelombang 346 nm yang telah dilakukan dapat disimpulkan
bahwa ekstrak mengandung senyawa berberin dengan kadar 25,8%.

16