Polisacáridos estructurales de

levadura. Glucanos y mananos

Los polisacáridos son una clase importante de biopolímeros que consis-

ten en largas cadenas de unidades de azúcares repetitivas. Ellos se carac-
terizan estructuralmente por el tipo de innidad monomérica, la longitud
de cadena, el tipo de unión glicosídica y el grado de ramificación. La
naturaleza sintetiza constantemente altas cantidades de polisacáridos,
los cuales sirven particularmente como componente estructural, tal como
la celulosa en plantas y la quitina en animales, como carbohidratos de
reserva en forma de almidón en plantas y de glucógeno en animales, o
como polisacáridos de pared celular en algas, plantas superiores, bac-
terias, hongos y levaduras.
La pared celular de las levaduras está constituida por el 80-90% de
polisacáridos que forman estructuras extraordinariamente complejas, en
especial las partes más externas (véase figura 2 del capitulo 12). Existe
una capa externa amorfa de mananos ligados a proteínas (mananopro-
teínas) fosforiladas en diferentes grados en dependencia de la especie
de.levadura, una capa media de P-glucanos álcali-solubles y una capa
interna, rígida, de glucanos insolubles. Esta última le confiere la for-
ma y la rigidez a la célula. La quitina, un polimero de N-acetilgluco-
samina, está presente en pequeña cantidad en la pared de S. cerevisiae,
aproximadamente el 2-4%. La rigidez de la pared celular depende del
ordenamiento de los glucanos, los cuales están parcialmente organiza-
dos en una estructura tipo red (Walter, 1998).
La estructura química de la capa más externa de mananos es carac-
terística de cada especie de levadura y se puede utilizar como auxiliar
en los estudios taxonómicos. La mayoría de las levaduras pertenecientes
a la familia de los Ascomycetos presentan una estructura de pared celu-
lar similar a la descrita; sin embargo, la estructura especifica de ambas
capas varía de una especie de levadura a otra. Por ejemplo, las levadu-
ras pertenecientes a la familia de los Basidiomycetos poseen quitina en
su estructura externa, en tanto que los Ascomycetos, en especial Saccha-
romyces cerevisiae, solo presentan este componente en las cicatrices del
proceso de gemación. Otras especies como la Schizosaccharomyces no
contienen quitina en la cicatrices sino un a-(1,3)-glucano.
La pared celular de las levaduras es multifuncional y tiene vincula-
ción con la supervivencia celular: protección física, estabilidad osmó-
tica, mantenimiento de la forma, interacciones celulares (por ejemplo,
floculación y aglomeración), barrera semipermeable, soporte de enzi-
mas, unión de cationes, esporulación, entre otras.
En relación con la capacidad de la pared celular de interactuar con
otros organismos y sustancias, ya en 1900, el barón von Dungern (Stone
y Clarke, 1992) demostró que la levadura panadera (Saccharomyces cerevi-
siae) interactuaba complementariamente con una proteina sérica involu-
crada en la destrucción de organismos infecciosos. Cuarenta años después
el Dr. Louis Pillemer encontró que el componente activo de la levadura
era una fracción insoluble de la pared celular conocida como P-(1,3) y
P-(1,6)- glucanos (Ecker et al., 1939). La misma fracción interactuaba
con el properdin, otra proteina sérica (Pillemer y Ecker, 1941), también
involucrada en la inactivación de organismos infecciosos.
El conocimiento científico se expandió a finales de la década de 1950
por los trabajos del Dr. Baruj Benacerraf y sus colegas, que demostra-
ron que el P-glucano tenía un efecto dramático en la estimulación del
sistema reticuloendotelial, un difuso sistema de células inmunes que
circulan por todo el cuerpo. Otros investigadores demostraron que los
P-glucanos eran capaces de proteger a los animales contra infecciones
experimentales.
En general, las sustancias inmunomoduladoras constituyen una fa-
milia muy heterogénea si se toman en consideración su origen, natu-
raleza química y actividad biológica especifica. Dentro de ellas ocupan
un lugar muy importante los agentes inmunopotenciadores, a los cuales
se les atribuyen dos funciones fundamentales: la estimulación de la re-
sistencia no específica del huésped contra las enfermedades infecciosas
y el cáncer; y por otra parte, la potenciación de la inmunogenicidad de,

a34 1 JORGE R. WAGNER. R U U S[ENI Y MIGUEL h. OTERO RAMBLA

las vacunas comerciales y de la respuesta de los animales de laborato-
rio durante la inmunización experimental con vistas a la producción de
antisueros (Stewart-Tull, 1989; Azuma, 1992).
Los adyuvantes son sustancias o preparados químicos que, incorpora-
dos al antígeno o inyectados simultáneamente con él, hacen más efectiva
la respuesta inmune. Con su empleo se logra una economía de antígeno
y de tiempo, así como un mayor nivel de anticuerpos específicos. Las
investigaciones realizadas han demostrado que virtualmente todos los
adyuvantes activan o estimulan los macrófagos (Roitt, 1991).

GLUCANOS

Los denominados usualmente "glucanos" o "P-glucanos" son un grupo

especial de poliglucosas unidas por una unión tipo B-(1,3) y P-(1,6).
Los B-glucanos se encuentran extendidos en todo el reino vegetal (setas,
algas y plantas superiores) y, particularmente, en los microorganismos,
como parte de las paredes celulares.
Entre sus muchas propiedades, los glucanos tienen la habilidad de
enlazar agua, y como su obtención es relativamente fácil (Williams et
al., 1991), las compañías de levadura han elaborado aislados que se han
usado como retenedores de agua, espesantes, sustitutos de grasas y otras
propiedades funcionales en la industria de alimentos (Lee, 2002; Jong,
2002). De este modo, los glucanos pueden emplearse en la elaboración
de helados, productos cárnicos y otros productos dietéticos.
En los últimos años han atraído la atención de la comunidad cien-
tífica, debido a su acción estimulante sobre la reacción del sistema in-
mune frente a antigenos en animales, humanos y peces (Otero et aL,
1994; Infante e t al., 1995). Esta acción está vinculada con la ya men-
cionada estimulación del sistema reticuloendotelial que conduce a una
producción mayor de macrófagos presentadores de antígenos, y a la vez
destruyen por fagocitosis la invasión de bacterias y otros microorganis-
mos patogénicos (Adachi et al., 1990). Estos especiales polímeros de
glucosa, tienen también un efecto en el sistema inmune de las plantas
en las que las llamadas fitoalexinas, glucanos de bajo peso molecular, se
producen como mecanismo defensivo y también en los invertebrados
en los que aparentemente los glucanos desencadenan un mecanismo de
defensa (polifenoloxidasa) (MacDonald, 1995).

POLISACARIDOS €STRUClURALES DE LEVADURA. GLUCANOS Y MANINOS 1 135

 El mecanismo del efecto de P-(1,3)-glucanos sobre la respuesta in-
mune no está todavía comprendido en su totalidad, pero sí se sabe que
probablemente dependa de su estructura molecular, la cual es influen-
ciada por el peso molecular, la presencia de cadenas ramificadas y de
grupos cargados y la conformación en hélices. Hay diferentes opinio-
nes sobre los requerimientos estmcturales para que se manifiesten los
efectos fisiológicos de los glucanos (Bohn y BeMiller, 1995; Kulicke ef
al., 1997). Aun así, los P-(1,3)-glucanos son usados clínicamente como
adyuvantes en la terapia del cáncer (Maeda y Chihara, 1999; Wasser y
Weis, 1999; Rau, 2002).
También se han informado otras propiedades bioactivas y medicinales
de los glucanos tales como actividades antiinflamatorias,antirnicrobianas,
antiinfecciosas, hipocolesterol6micas y radioprotectivas (Stone y Clarke,
1992). Se ha demostrado, por otra parte, que los glucanos de levadura
también reducen el colesteml LDL e inuementan el HDL en sangre dismi-
nuyendo el riesgo de patologías cardiovasculares, e igualmente han sido
usados con éxito pari combatir la obesidad (Biancardi et a[., 1989).
En las levaduras, los P-glucanos ocupan alrededor del 4% del peso
seco de la celula (Williams et aL, 1991). Actualmente la producción
mundial de levadura panadera y de cervecería, Saccharomyces cerevisiae,
excede los 2,s millones de toneladas (Dijkgraaf et al.,2002). Dada su
alta disponibilidad en el mercado, las paredes celulares de estas levadu-
ras son la fuente más importante de S-(19)-glucanos.
Algunas industrias cultivan las levaduras no sólo para panificación o
como iniciadores de fermentación alcohólica, sino también para elaborar
los productos conocidos como "extractos de levadura", los cuales pueden
ser obtenidos después de una lisis mecánica o una autólisis enzirnática.
Las partes internas de las células son aisladas y subsecuentemente uti-
lizadas como suplementos alimentarios o como potenciadores del sabor
debido a su alto contenido de proteínas hidrolizadas y nucleótidos.
Las partes externas e insolubles de las células de levadura, en su ma-
yor parte constituidas por restos de la pared celular, quedan como un
residuo de la obtención de extractos, el cual no tiene un destino co-
mercial establecido excepto como suplemento de la alimentación ani-
mal. Este residuo constituye entonces un excelente material crudo de
partida para la manufactura de P-(1,3)-glucanos. Es un material barato
y con un alto contenido de glucanos que puede estar entre el 30-60%
del peso seco (Duffus et al., 1982).

236 1 JORGE R. WIGHER, lAUU SCENI Y MIGUEL A. UTtRU RIMBU

 La primera preparación de un producto enriquecido en glucanos
a partir de levadura panadera fue llamada zymosan (Hassid et al.,
1941), la cual mostró poseer buenas propiedades promotoras de la
salud, conocidas como nutraccuticas. Su composición aproximada era
de 55% de B-glucanos, 19% de mananos, 15% de proteínas y 7% de
lípidos (DiCarlo y Fiore, 1958). Manners et a(. (1973) encontraron la
presencia de dos diferentes tipos de glucanos en la pared celular de
levadura: uno mayoritario (85%) formado por P-(1,3)-glucano con-
teniendo 3% de ramificaciones de P-(1,6)-glucopiranosa (figura .l) y
uno minoritario (15%) de P-(l,6)-glucano que contiene ramificacio-
nes glicosídicas P-(1,3).

FIGURA 1. Esmcnua química del &(1,3)-glucano con ramificaciones P-(1,6)- de

unidades glucopiranosil

Desde que fueron descubiertas las propiedades beneficiosas de los glu-

canos para la salud del hombre y de los animales, fueron propuestos
muchos procesos para el aislamiento y purificación de estos polisace~dos
de pared, tanto a partir de levadura como de pared. Los métodos de
aislamiento se basaron en sus propiedades de solubilidad.
Según Manners y Meyer (1977), la extracción alcalina/ácida de la
pared celular de S. cermisiae resulta en tres fracciones: 1) una fracción
soluble en álcali que contiene B-(1,3)-D-glucano, mananos y algo de
P-(1,6)-glucano; 2) una fracción álcali-insoluble y ácido-insoluble
compuesta por P-(1,3)-glucano ligado a quitina; y 3) una fracción
álcali-insoluble pero ácido-soluble constituida por P-(1,6)-glucano.
La mayoría de los métodos de preparación emplean áIcalis, ácidos o
una combinación de ambos medios, los cuales solubilizan tanto pro-
teínas como otros polisacáridos. El residuo remanente insoluble se lo
designa como "glucano de levadura" (yeast glucan).
Es sabido que las condiciones tanto ácidas como alcalinas extre-
mas conducen en mayor o menor grado a la degradación de cadenas
de glucosa y la solubilización de las fracciones ácido y áicali-solubles de
glucanos. De esto resulta un rendimiento bajo de glucanos y, por ende,
un precio elevado, así como también una pureza muy limitada.
Con el objetivo de mantener la estructura nativa de los glucanos, y
asegurar una mínima degradación de las cadenas, ha sido necesario de-
sarrollar procesos de manufactura más suaves, en los cuales las condi-
ciones drásticas sean evitadas pero a la vez se aumente el rendimiento
y se remuevan componentes contaminantes como son las proteínas, los
lípidos y otros polisacáridos.
En este sentido, Sauter et u/. (2002) desarrollaron un proceso de ais-
lamiento de P-(1,3)-glucano a partir de levadura panadera combinando
extracciones suaves en agua caliente y solventes orgánicos con tratamien-
tos enzimáticos. El proceso es simple, rápido y fácilmente transferible a
escala industrial. Su eficiencia fue demostrada aplicándolo sobre mues-
tras de pared celular de levadura panadera provenientes de la industria
(Freimund et al., 2003). El B-(1,3)-glucano se obtuvo con un alto rendi-
miento (87%) y una pureza del 92%. Durante el proceso de obtención de
glucano se obtiene adicionalmente como subproducto mananoproteinas,
las cuales tienen un interés como material bioactivo en la elaboración de
alimentos funcionales. En la figura 2 se puede observar que, partiendo del
sedimento proveniente del tratamiento proteolítico, previamente lavado
con agua, se pueden obtener glucanos de alta pureza según dos proce-
dimientos (A y B). Procedimiento A: el sedimento es lavado tres veces
con acetona y secado en vacio a 70 "C, obteniéndose un polvo amari-
llo pálido. Procedimiento B: el sedimento se suspende en agua y se seca
en spray, y el polvo fino es suspendido en etanol a reflujo durante 2 h,
filtrado, lavado el residuo con etanol y secado bajo vacio, obteniéndose
el glucano también como un polvo amarillo pálido. El rendimiento en
ambos procedimientos fue del 25-26% en glucanos y la composición de
los mismos fue: 8 3 4 5 % de glucosa y 6% de manosa (después de hidró-
lisis ácida), 5% de proteínas (determinadas por Lowry) y trazas de lípi-
dos (determinados por extracción con n-hexano-metanol). Los mismos
análisis realizados sobre el material de partida (pared celular de levadura
panadera) dieron 30% glucosa, 26% manosa, 22% proteinas y 13% de lí-

238 1 JORGE R. WAGNER. M U L A SCENI Y MIGUEL b. OTERO RAMBLA

pidos, lo cual indica la presencia de mananoproteínas y lípidos que füe-
ron eficientemente eliminados en los glucanos obtenidos.
Partiendo de pared celular de levadura de otra procedencia y com-
posición (23% glucosa, 16% manosa, 29% proteínas y 11% de lípidos)
y aplicando el procedimiento A pero a gran escala (150 kg de pared
celular libre de componentes solubles en agua) fue posible obtener un
glucano compuesto por un 92% de glucosa, 1% de manosa, 4% de pro-
teínas y trazas de iípidos (Freimund et a/., 2003).

FIGURA 2. Proceso esquemático de fraccionamiento de pared celular de levadura

según Freimund et al. (2003)

.c
sfdimcnm
Tra-iento con errnol70W Trnrsmicnrocon pmreasns,
pH 10.5.45 C , 5 h.cenrrihipi6n
1 1

P Polvo seco Traramiuim con Penona

Rlmci6n

Emneei6n con e m o l
Fdtrau6n
I
 Liu et al. (2008),basándose también en extracciones en agua caliente
y solventes orgánicos y proteólisis, propuso otro metodo a partir de leva-
dura residual en el cual se realiza previamente una autólisis inducida para
obtener la pared y una homogenización a alta presi6n para reducir el ta-
maño de partícula y mejorar la posterior extracción (figura 3). Los gluca-
nos obtenidos tuvieron un rendimiento de 91% y una pureza del 93%. La
composición de los glucanos fue de 95,896 de glucosa y 0,3% de manosa
(después de hidr6lisis ácida), 3% de proteínas (determinadas por Lowry) y
trazas de lipidos (determinados por extracción con &terde petróleo).

F16URA 3. Diagrama de obtenci6n de glucanos (Liu et al., 2066)

Levadura Pdcación Autólisis

residual preliminar inducida
11
.,
Extracción con
con acetona
Homogenizauón agua caliente

con proteasa Secado en spray Glucanos

Dado que las propiedades fisicoquimicas y la microestructura de los

glucanos pueden ser modificadas por efecto del medio y de la tempe-
raNra, el proceso de secado elegido puede afectar la actividad inmuno-
modulatoria. Recientemente, Hromádková et a(. (2003) han estudiado
la influencia del método de secado sobre las propiedades Esicas y la
actividad inmunomodulatoria de f3-(1,3)-glucano insoluble en agua (al
que denominan glucano particulado).
El glucano particulado fue obtenido a partir de levadura panadera
Saccharomyces cerevisiae por extracción con 6% de NaOH a 60 'C du-
rante 4 h, dilución con agua, agitación 30 minutos y centrifugación. El
sedimento fue suspendido en 3% NaOH y calentado a 90 "C durante
2 h. El material insoluble se lavó con agua y se extrajo con 4% ácido
fosfórico a temperatura ambiente durante 2 h.
El residuo insoluble constituido mayoritariamente por P-(1,3)-glucano
de pared celular fue separado por centrifugación, suspendido en agua y
decantado hasta reacción neutra. Alicuotas de una suspensión acuosa del
glucano particulado se secaron por medio de tres métodos diferentes: lio-
filización (GL), secado spray (GS)y precipitación por el agregado de cuatro
volúmenes de etanol95% seguido de lavado del precipitado con etanol y
secado por evaporación a temperatura ambiente (GE).
Las muestras fueron caracterizadas por microscopía óptica, espec-
troscopia FT-IR y determinaciones de la capacidad de hidratación y
comportamiento reológico. En tanto que la actividad inmunopoten-
ciadora fue determinada a través de ensayos de actividad mitogénica
y comitogénica sobre ratas. El método de secado afectó la microes-
tructura de las particulas de glucano; a difereilcia de G L y G E , las par-
tículas GS preservan la forma elipsoide de la pared celular y exhiben
un menor grado de interacción interparticula por puentes hidrógeno.
Las dispersiones de GS son menos viscosas que las G E y GL , las cuales
tienen un comportamiento reológico tipo gel resultante de una mayor
absorción de agua.
Las diferencias en las propiedades estructurales y fisicoquímicas de
las partículas de glucano repercuten sobre su actividad inmunomodula-
toria, la cual es dos veces superior en las muestras GS (secadas por spray)
que en las secadas por liofilización o cambio de solvente ( GL y GE).Los
resultados de estos estudios sugieren que para la aplicación de particulas
de P-(1,3)-glucano como inmunomodulador/adyuvante en forma de sus-
pensión acuosa es importante emplear preparaciones secadas por spray.

MANANOS
Los mananos se encuentran en la parte más externa de la pared celular
en su mayoría ligados a proteínas, las que se conocen como mananopro-
teínas, las cuales determinan las propiedades superficiales de la pared. La
mayoría de las mananoproteínas están hidrofóbica y/o covalentemente
ligadas a la capa media de glucanos álcali-solubles.

POUSAthRIOOS ESTRU(IURA1ES O t LEYAOURA. GLUCANOS Y MANANOS 1 241

 E n tanto que los P-(1,3)-glucanos se obtienen generalmente como
la fracción de pared insoluble en álcali, los mananos se preparan en
forma de concentrados como la fracción álcali soluble. Dado que en
estas condiciones también se solubilizan proteínas, sales, algunos glu-
canos y se dispersan lípidos provenientes de membrana, los llamados
comercialmente M OS (mananoligosacáridos) son una mezcla compleja
de componentes. Según las especificaciones dadas por Center for Food
and Nutrition Policy ( C ~ N PVirginia
, Tech-Alexandria, 2002), una com-
posición típica aproximada de MOS es: 20% inanosa, 30% proteína, 8%
cenizas (max), 5% humedad (max) y 5% Iípidos (max). Como caracte-
rísticas físicas debe ser un polvo marrón claro con un tamaiio de partí-
cula que pasen 100% a través de una maUa con 20 orificios por mm2 (20
mesh). Una micrografía electrónica de una muestra comercial de MOS
se puede ver en la figura 4. Las partículas obtenidas por secado spray
exhiben una alta porosidad lo que les otorga una elevada capacidad de
adsorción de agua (Pollio y Wagner, 2007) y mayor reactividad.

FIGURA 4. Micrografías electrónicas de barrido ambiental ( ESEM) de una muestra

comercial de mananoligosacáridos de levadura (MOS)

Los manano oligosacáridos han sido utilizados en las dietas de aves y

cerdos de engorde para mejorar el comportamiento y salud en animales

842 I IORGt R. WAGNtR, PAUlA SCtNI Y M l G U t l b . O E R O RAMBlA

jóvenes (MacDonald, 1995; Spring, 1998). Aunque el mecanismo a tra-
vés del cual se manifiesta esta respuesta no es enteramente conocido, el
manano dietético es capaz de reducir o prevenir la aparición de algunas
patologías bacterianas en el tracto intestinal en pollos de ceba (Spring,
1996), estimular la unión selectiva e inactivación de aflatoxinas en el
intestino, reducir la velocidad de intercambio de la mucosa intestinal,
mejorar la tasa de crecimiento en pavos y la producción de hucvos
en aves de corral (CFNP, Virginia Tech-Alexandria, 2002). Se informó
también un significativo impacto sobre la microflora gastrointestinal y
el sistema inmune (Newman, 1994).
Estos componentes de las paredes celulares son además importantes
en la producción de respuestas inmunológicas amplificadas contra virus,
bacterias y hongos parasitarios de animales y peces (Spring, 1998).
El empleo de estos polisacáridos puede constituir una nueva ruta nu-
tricional que ayude, en la cría intensiva de animales, a resistir las enfer-
medades y, por tanto, reducir las necesidades de antibióticos. Otro uso
para los glucomananos modificados es en la industria de granos como
adsorbente de micotoxinas (Charmley ct al., 1995).
E n su conjunto, los glucanos y mananos de pared celular pueden ser
empleados para la bioadsorción de metales. La presencia de grupos fos-
forilados, principalmente en las mananoproteínas, permite el empleo de
la pared celular para reducir la cantidad de cationes de metales pesados
como plomo, arsénico, cobre o cromo en efluentes industriales (biorre-
mediación) y así reducir su efecto contaminante. Del mismo modo, es
factible el uso de la pared celular de levadura como vehículo de coloran-
tes. Hobson y Greenshields (1997) informan de un método de manu-
factura de un colorante insoluble en agua a partir de glucano de pared
celular, el cual puede ser empleado como aditivo en alimentos.

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