PRINSIP KERJA HPLC

HPLC adalah kependekan dari High Performance Liquid Chromatography

yang diterjemahkan dalam bahasa Indonesia menjadi "KCKT" atau Kromatografi

Cair Kinerja Tinggi. Di beberapa laboratorium khususnya Laboratorium Kimia

Organik, Laboratorium Kimia Bahan Alam, atau laboratorium yang berhubungan

dengan bahan-bahan organik, perkataan HPLC lebih populer dibanding KCKT

(Chairul dan Tri, 2000).

Prinsip kerja HPLC adalah pemisahan dengan menggunakan tehnik

kromatografi. Pada HPLC system kromatografi yang digunakan adalah cair-

padat, fasa bergerak (mobile phase) berupa cairan yaitu pelarut dan fasa diam

(stationer phase) berupa padatan yaitu adsorban yang terdapat dalam kolom

analitik (Chairul dan Tri, 2000).

Gambar 1. Instrumen Dasar HPLC

Adapun prinsip kerja dari HPLC yaitu Dengan bantuan pompa fasa gerak

air dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran

fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan

komponen-komponen ampuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-

solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa
diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solute-solut yang kuat

berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solut tersebut akan keluar dari kolom

lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detector

kemudian direkam dalam bentuk kromatogram (Budiarti dkk., 2010).

ANALISIS KUALITATIF DAN KUANTITATIF DARI HPLC

Aplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kualitatif dan penentuan

kuantitatif. HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu

retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi

sampel dibandingkan dengan larutan standar (Budiarti dkk., 2010).

Sedangkan beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat

dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah (Budiarti dkk., 2010):

1. Parameter percobaan sama antara standar dan sampel

2. Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama

3. Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan

menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu. Yaitu

berdasarkan area kromatogram dan tinggi puncak kromatogram.

Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam

kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis

komponen dalam sample. Sample yang mengandung banyak komponen

didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak

jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam

identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample

jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang

siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi
biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif.

Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja (Budiarti dkk., 2010).

Gambar 2. Contoh Hasil Analisa HPLC

Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan jumlah komponen

sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran.

Komputer dapat digunakan untuk mengontrol kerja system HPLC dan

mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC. Efisiensi kolom

biasanya dinyatakan secara matematika dengan istilah plet teori, konsep yang

dipinjam dari teori distilasi. Penerapannya dalam kromatografi, jumlah teori plat

N, untuk kolom ditentukan dari lebar peak dan waktu retensi

(Budiarti dkk., 2010).

Untuk peak-peak berbentuk simetri seperti terjadi pada kebanyakan peak-

peak kromatografi gas, jumlah teori plat dapat diformulasi sebagai

(Budiarti dkk., 2010):

𝑡𝑟 menyatakan waktu retensi dan 𝑊1⁄ menyatakan leher peak pada setengah
2

tinggi. Akan tetapi untuk peak-peak yang tidak simetri disarankan menggunakan

persamaan (Budiarti dkk., 2010):

Peak asimetri dengan parameter A dan B untuk menghitung haraga N.

Gambar 3. Peak Asimetri

Berdasarkan gambar, 𝑡𝑟 adalah waktu retensi, 𝑊0,1 adalah lebar peak pada

ketinggian 10% atau A+B, A adalah lebar sebelah kanan, dan B adalah lebar

setengah peak sebelah kiri (Budiarti dkk., 2010).

Tujuan utama dari kromatografi cairan kinerja tinggi sama dengan

kromatografi gas adalah mendapat pemisahan yang sempurna. Derajat pemisahan

(Rs) dalam kromatografi cair kinerja tinggi-pun dinyatakan dengan istilah resolusi

yang di formulasi sebagai berikut (Budiarti dkk., 2010):

Berdasarkan persamaan di atas, terlihat bahwa resolusi dipengaruhi oleh tiga

factor yaitu efisiensi (N), selektivitas (α), dan retensi (k’). lebih sederhana dari

kromatografi gas, di sini selektivitas cukup dinyatakan sebagai

(Budiarti dkk., 2010):

Dimana:

α adalah selektivitas, 𝒌′𝟏 dan 𝒌′𝟐 adalah masing-masing factor kapasitas

senyawa 1 dan senyawa 2. Harga selektivitas dapat sama dengan satu atau lebih

besar dari satu. Bila harga 𝜶 = 𝟏 berarti senyawa 1 dan 2 keluar dari kolom

bersama-sama. Dengan kata lain senyawa 1 tidak dapat dipisahkan dari senyawa

2, sebaliknya bila harga 𝜶 > 1 maka senyawa 1 keluar dari kolom lebih cepat dari

pada senyawa 2. Semakin besar harga 𝜶, semakin baik pemisahan.

Tingkat efisiensi pemisahan dengan kromatografi tercermin pada pek-peak

kromatogram yang dihasilkan. Semakin lebar suatu peak kromatogram maka

dapat dikatakan pemisahan semakin kurang efisien. Parameter efisiensi pemisahan

dinyatakan dlam bentuk HETP (height equivalent to a theoretical plate) yang

diformulasikan sebagai berikut (Budiarti dkk., 2010):

𝑳
𝐇=
𝑵
Dimana: H : HETP (height equivalent to a theoretical plate)

L : panjang kolom dalam centimeter

N : jumlah total theoretical plate

Nilai H menunjukkan ukuran efisiensi yang diberikan kolom tiap unit

panjang kolom. Nilai H yang kecil menyatakan kolom yang lebih efisien dan nilai

N yang besar. Objek yang paling penting dalam KCKT adalah meminimalkan

nilai H sehingga nilai N maksimum dan efisiensi kolom paling tinggi.

Nilai H menurun dengan (Budiarti dkk., 2010):

1. Ukuran partikel kolom yang kecil

2. Laju alir fase gerak yang rendah

3. Fase gerak yang kurang kental

4. Pemisahan pada temperature tinggi

5. Molekul-molekul sample yang kecil

6. Meningkatkan panjang kolom.

Jarak diantara puncak maksimal menunjukkan selektivitas system. Lebar

punak kromatografi menunjukkan efisiensi. Efisiensi dan selektivitas merupakan

descriptor pelengkap yang tergantung pada parameter-parameter kromatografi

yang berbeda-beda. Efisiensi lebih tergantung pada kualitas packing kolom,

ukuran partikel, laju alir, dan optimasi instrumental, sedangkan selektivitas lebih

tergantung pada komponen fasa diam dan analit itu sendiri (Budiarti dkk., 2010).
DAFTAR PUSTAKA

Chairul dan Tri M., Mengenal Hplc: Peranannya dalam Analisa dan Proses Isolasi

Bahan Kimia Alam, Berita Biologi, 5(2): 262-271.

Budiarti, S., Rusmawati, D.I., dan Mhda, F., 2010, Kromatografi Cair Kinerja

Tinggi Atau Hplc (High Performance Liquid Chromatography), Jurusan

Kimia, Universitas Negeri Semarang.