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Tecnologías para el enriquecimiento de

aceites de pescado en EPA y DHA

José Luis Guil Guerrero


Área de Tecnología de Alimentos
Universidad de Almería
Pesada carga de calorías y
grasa saturada

Temp-A.ppt 11/10/2013 2
Vs.

EPA+DHA% Ventajas Inconvenientes

- Estructura de triglicérido - Más calorías/dosis


- Menor alteración - Sensorialmente pobre
- Más barato - ¿Metales pesados?
ACEITE ≈25 - ¿Presencia de - ¿Presencia de
insaponificable/colesterol? insaponificable/colesterol?

- Menos calorías - Mayor coste


- Ausencia de metales - Posibilidad de alteración
pesados oxidativa
CONCENTRADO ≈40-90 - Eliminación de saturados - No suele estar en forma de
triglicéridos

≈ 100% Se trata de un producto para ensayos farmacológicos,


PURIFICADO EPA ó DHA tratamientos de algunos casos de cáncer, o de uso como
reactivo de laboratorio
Un poco de historia…
Uno de los primeros procedimientos para
concentrar EPA y /o DHA fue el método de
formación de cristales con urea
Response Surface Methodology

Proceso tóxico debido a la


presencia de metil / etil-
carbamatos
Temp-A.ppt 11/10/2013 6
Obtención de EPA / DHA
1.3e4
18:1n918:3n6 18:4n3
16:0 18:2n618:3n3
17:0
1.2e4 (patrón
interno)
1.1e4 18:0

1.0e4

9000
Biomasa
8000

7000

6000

5000
20:0
20:
1
4000

3000
5 5
10
Time (min.)
15 1020 Extracto lipídico
11.444
9.815
1.747

1.3e4
1.2e4

1.1e4

1.0e4

9000 Ácidos grasos


8000
7000
2.343

6000
5000
10.651
4.847
3.386

7.582

4000

3000
5 10 15 20
Time (min.) Concentrados de EFAs
9.459
1.722

1.4e4
1.3e4
1.2e4
1.1e4
1.0e4
9000
8000 EPA ó DHA
7000
6000
10.295
8.721

5000
4000
5 10 15 20
Time (min.)

EFA 98% pureza


Obtención de EFAs
Biomasa
Extracción /
Saponificación
Extracción: /presión/ disolventes/
Simultánea
FSC

Extracto lipídico

Saponificación-HCl / Enzimas

Ácidos grasos

“Winterization” Cristalización con urea


Ésteres Sales
etílicos Na/K
Diferencias
de solubilidad
Concentrados de EFAs
Destilación molecular
HPLC
Cromatografía Cromatografía líquida columna
líquida en columna abierta
abierta/ Purificación
Purificación EPA ó DHA enzimática
enzimática/
Cromatografía FSC
Procesado de pescado para obtener concentrados de DHA y EPA
Concentración de EPA/DHA: “Winterization”

Aceite pescado + Solvente • Acetona


• Hexano
1.3e4
18:1n918:3n6 18:4n3
16:0 18:2n618:3n3
17:0
1.2e4 (patrón
interno)
1.1e4 18:0

1.0e4

1 9000
2
2 8000
1 3 3 7000

6000

5000
20:0
2
0:
4000 1

3000

β’ β
5 10
5 15 1020
Time (min.)

Centrifugación
10 min, 6.000 Xg
Cristalización (-70 a 4º C)
Ácidos grasos libres

Triglicéridos

Wanasundara, U.N. (1996)


‘Marine Oils: Stabilization,
Structural Characterization
and Omega-3 Fatty Acid
Concentration’, Ph.D. thesis,
Memorial University of
Newfoundland, St. John’s, NF,
Canada

Enriquecimiento de ácidos grasos ω3 totales de aceite de grasa de foca mediante cristalización a baja temperatura.
A, forma de triglicéridos, B, forma de ácidos grasos libres
Procesado de pescado para obtener DHA y EPA
Transesterificación de aceite de pescado

AG1
Q, 60 min
Destilación
AG2 + CH3-COCl + EtOH AG-COOEt molecular
AG3 Ésteres etílicos
Cloruro de Etanol
Glicéridos, aceite acetilo
de pescado

Reacilación enzimática
Las lipasas pueden catalizar la esterificación, hidrólisis o intercambio de ésteres de ácidos
grasos.
La reacción es reversible y, en condiciones de baja actividad de agua, las enzimas
funcionan “al revés”, sintetizan un enlace éster en lugar de su hidrólisis.

OH Lipasa AG1
inespecífica
OH + AG-COOEt AG2 + EtOH
OH Ésteres etílicos AG3
Glicerina
Triglicéridos
Destilación molecular:
concentración de ésteres de
EPA y DHA
Equipado con un condensador
interno.

Es útil para aislar componentes de


líquidos sensibles al calor o para
separar sustancias con un punto de
ebullición muy alto.

•La mezcla es destilada a presión


reducida, de 1 a 0001 mbar, por lo que
disminuye Tª de ebullición.
En la destilación molecular, el material se destila bajo alto vacío;
•El tiempo es disminuido exponiendo las
la distancia recorrida por las moléculas entre la evaporación y la sustancias al calor.
condensación es corto •El proceso de enfriamiento es acelerado.
La degradación térmica de etil-EPA comienza a 159 °C
y alcanza un máximo a 206 °C; etil-DHA comienza a
166 °C y es máxima a 217 °C
Métodos enzimáticos concentración y
purificación de EPA y/o DHA
Hidrólisis selectiva de los TAGs

AG1 Lipasa OH
sn-1,3 específica
DHA + 2H2O DHA + AG1 +AG2
AG2 OH
2-MAGs

El efecto de torsión de EPA y DHA, debido a la


presencia de los dobles enlaces, aumenta el efecto
de impedimento estérico, por lo tanto, las lipasas no
pueden actuar en la unión éster entre estos ácidos
grasos y glicerol.

DHA
OH
DHA
OH
2-MAGs

Lipasa
OH CA
sn-1,3 específica
DHA + CA DHA + H2O
OH CA
Posibilidad de obtención de triglicéridos estructurados
Wanasundara, U.N. and Shahidi, F.
(1997) ‘Lipase Assisted Concentration
of ω3-Polyunsaturated Fatty Acids in
Acylglycerols Form from Marine Oils’
in J. Am. Oil Chem. Soc. 75, 945–951
hidrólisis

Saponificación suave

Fracción enriquecida en ω3
Grasa de foca

Aceite de lacha

“… all lipases were effective in


increasing the n-3 PUFA
content of the remaining
Candida cylindracea Rhizopus oryzae acylglycerols…
Enriquecimiento de ω3 total, EPA y DHA de grasa de foca y aceite de lacha
después de 75 h de hidrólisis mediante diferentes lipasas microbianas
Extracción-saponificación-concentración
simultáneas
Procesos de máxima seguridad se
desarrollan con la ayuda de
biocompatible etanol

EtOH Residuo
Filtración

EtOH

NaOH EtOH + EFAs


(sales sódicas)

Biomasa Enfriamiento a T programada


(deshidratada)

Reactor, 60 ºC

Guil-Guerrero, Jose Luis; Campra-Madrid, Pablo; López-Martínez, Juan Carlos. MÉTODO RÁPIDO Y
BIOCOMPATIBLE DE EXTRACCIÓN, SAPONIFICACIÓN Y CONCENTRACIÓN DE ÁCIDOS
GRASOS POLIINSATURADOS (PUFAS) POR DIFERENCIAS DE SOLUBILIDAD A PARTIR DE
BIOMASA. Fecha de publicación 28/12/2007
AGUA
EtOH RESIDUO
EtOH HCl

BIOMASA (1)

NaOH EtOH +
PUFAs(SAL)

ENFRIAMIENTO
FILTRACIÓN A T programada MEZCLADOR
REACTOR CONDENSADOR

HEXANO

(2)

HEXANO
+ PUFA
DESTILADOR

MEZCLADOR FILTRACIÓN A-70 ºC (3 ) CENTRIFUGACIÓN EXTRACTOR


SONICAR

OPCIONAL

ENFRIAMIENTO A - 70 ºC ºC
OPCIONAL RESIDUO
PUFA
(4 )
Se superan las
concentraciones
alcanzadas por
la destilación
molecular
Fraccionamiento de ésteres etílicos mediante cromatografía en columna

Fractionation of Shortfin Mako (Isurus oxyrinchus) Liver Oil

Ésteres etílicos
Cromatografía
Fase estacionaria: (SiO2-AgNO3)

95% 90A% 90B% 90C% Eluyentes


% Hex:Acet (v/v)
Variables a optimizar
EPA • Polaridad de eluyentes
Pureza (%) 89 75 1 - • Carga de la columna
Rendimiento (%) 60 38 1 - • Tipo de éster
DHA
Pureza (%) 8 25 99 100
Rendimiento (%) 3 8 57 29
Isolation of some PUFA from edible oils by argentated silica gel chromatography
By J.L. Guil-Guerrero*, P. Campra-Madrid and R. Navarro-Juárez. Grasas y Aceites
116 Vol. 54. (2003), 116-121.
Concentración mediante FSC

Válvula reductora
Columnas de Extracción

Cambiadores
de calor

Separadores
Refrigerante
Extracto Extracto

Tanque de CO2 CO2


Bomba

Intercambiador de calor
Temp-A.ppt 11/10/2013 25
Product Overview
Package Description:
60 Softgels
Serving Size:
2 Softgels
Number of Servings:
30 (30 day supply)
Potency per Serving:
1,000 mg of Super Critical Fish Oil
Recommended Dosage:
Take 2 Softgels daily
Country of Manufacturer:
United States of America
Customer Ratings:
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Omega Select Fish Oil
Each Serving Provides:
View Supplement Facts
Aislamiento de fracciones
funcionales de aceites
Interesterificación química

Interesterificación enzimática
Triglicéridos
complejos
Aislamiento de
AAA ALO HPLC cromatograma
fracciones funcionales PLO Aceite: triacil gliceroles

de aceite rico en ácido Fraccionamiento e


araquidónico identificación de picos por
GLC

Araquidónico
puro en forma de
triglicérido

AAA

Fracción remanente

Fracción funcional
Tridocosahexaenoil glycerol purification
Tri-DHA
Fracción remanente

Tri-
DHAA

Tri-DHA

Aceite: triacil gliceroles


Fraccionamiento e identificación de
picos por GLC
in press
Importante: escalamiento eficaz

Factor de escalamiento (f) mediante la expresión:

f = (D2)2L2 / (D1)2L1

Donde D1 y L1 son, respectivamente, el diámetro y la longitud del reactor de menor


tamaño y D2 y L2 el diámetro y la longitud del reactor de mayor tamaño.
Importante: control de calidad

Espectro UV-visible Espectrometría de masas

Espectro obtenido
1,2

1
Absorbancia

0,8

0,6
Dienos Trienos
0,4
Espectro del patrón
0,2

0
185 210 235 260 285 310

l (nm)

1000

800

Índice de peróxidos 600


PV (mEq/kg)

Ff,Aa,H
LØvaas, (1992). 400 FAh
Fah
Espectrofotometría con Triyoduro (I-3) 200
fAh
fah

PV = 5-10 mEq O2/kg 0


0 4 8 12 16 20 24 28
días
Tecnologías para el enriquecimiento de
aceites de pescado en EPA y DHA

José Luis Guil Guerrero


Área de Tecnología de Alimentos
Universidad de Almería