Técnicas de

análisis de
proteínas
 Técnicas análisis de proteínas
1. Expresión de proteínas
2. Métodos espectroscópicos
3. Determinación de la estructura de proteínas:
3.1. Resonancia magnética nuclear (RMN)
3.2. Cristalografía y difracción de rayos X
3.3. Microscopía crioelectrónica (Cryo-EM)
3.4. Modelado por homología
1. Expresión de proteínas
Homogenado y fraccionamiento subcelular
1) CROMATOGRAFÍA

Cromatografía en columna
2) ELECTROFORESIS (SDS-PAGE)
 Sobre-expresión de proteínas en
sistemas modelo

E.Coli BL21 S.Cerevisiae Sf9 cells

La PCR hace posible la clonación rápida
Obtención de un clon genómico o de cDNA por PCR
Inserción de un fragmento de DNA en un plásmido
Amplificación del fragmento de DNA clonado
Producción de grandes cantidades de una
proteína a partir de un clon de cDNA
Kerpe, K. Appl Microbiol Biotechnol (2006) 72:211–222
Kerpe, K. Appl Microbiol Biotechnol (2006) 72:211–222
Inducción de la expresión por IPTG

IPTG (isopropil tiogalactosa)

Inducción de la expresión por IPTG
Inducción de la expresión por IPTG
Kerpe, K. Appl Microbiol Biotechnol (2006) 72:211–222
Sistemas de expresión bacterianos para proteínas
eucariotas
• Uso de codones

• Cuerpos de inclusión

• Ausencia de glicosilación

• Expresión de proteínas ricas en puentes disulfuro

• Expresión de proteínas de membrana

• Empleo de sistemas eucariótas: S.cerevisiae, P.

pastoris, células Sf9 (Spodoptera frugiperda)
Sf9/baculovirus: Sistema de expresión eucariótico

Spodoptera frugiperda
Etiquetado de proteínas para purificación: cola
de poli-His (6 His)

La cola de poli-His facilita

la purificación
Otras etiquetas: MBP (maltose binding protein), GST
(glutation-S-Transferasa)
Eliminación de la etiqueta
El etiquetado puede facilitar la detección

Epitope of HA tag peptide

 2. Métodos
espectroscópicos
 Métodos espectroscópicos

 = f = c/l

Espectroscopía: Absorción o emisión de la radiación

Absorbancia UV/Visible

A = e.C.l Ley de Beer-Lambert

• Radiación UV/visible absorbida por cromóforos

• Trp, Tyr y Phe (280 nm): medida de la [proteínas]

• NADH (340 nm): medida de actividades enzimáticas

Dicroísmo circular (DC)
• Radiación UV para detectar moléculas/estructuras
quirales
• Oscilador piezoeléctrico: alternancia de luz UV polarizada
• Caracterizar el contenido en estructura 2ª de las
proteínas
• Cinética de plegamiento
• Cambios estructurales
Fluorescencia
• Excitación (UV)→ emisión (calor, luz de mayor l (visible))
• Rendimiento cuántico ˂ 1
• Hay pocas biomoléculas fluorescentes
• Unión covalente de fluoróforos fluorescentes a proteínas:
inmunofluorescencia, citometría de flujo, qPCR, etc
 GFP: Green fluorescent protein

https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/illpres.html
Fluorescencia
• Reconocimiento de proteínas con anticuerpos-
Fluorescentes

inmunofluorescencia

Citometría
de flujo
FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching)
FRET (Fluorescence resonance energy transfer)
Aplicaciones del FRET
3. Determinación de la
estructura de proteínas
Determinación de la estructura de proteínas
Alta resolución ( ˂ 3Å)

• RMN

• Cristalografía y difracción de rayos X

Media/baja resolución

• Microscopía crio-electrónica

• Dispersión de rayos X de bajo ángulo (Small-

Angle X-ray Scattering o SASX)

• Modelado por homología

 Métodos espectroscópicos

 = f = c/l

Espectroscopía: Absorción o emisión de la radiación

3. Determinación de la
estructura de proteínas:
3.1. Resonancia magnética
nuclear (RMN)
Resonancia magnética nuclear (RMN)
Nº Nº Protones+ Espín Ejemplos
protones neutrones neutrones nuclear (I)

par Par Par 0 12C, 16O

par Impar Impar 1/2 1H, 13C,

15N

impar par impar >= 1 2D, 14N

• Absorción de energía para producir una

transición entre los dos estados

• Detección de voltaje inducido cuando

se absorbe energía a una determinada
radiofrecuencia
DE = kH0
Base de la espectroscopía de RMN
Resonancia magnética nuclear
FID (Free induction decay)

RMN H1 : No todos los H1 absorben igual

• Apantallamiento/desapantallamiento:
densidad electrónica

• Desplazamiento químico (d): (CH3)4Si

RMN H1 unidimensional

Acoplamiento espín-espín
• Acoplamiento escalares (J): a través de enlaces

• Acoplamientos dipolares: a través del espacio

Constante de acoplamiento J (Hz): Separación entre los picos.

Depende de la distancia entre los distintos H
RMN H1 unidimensional

Acoplamiento espín-espín
• Acoplamiento escalares (J): a través de enlaces

• Acoplamientos dipolares: a través del espacio

NOE (Nuclear Overhauser effect)

Función de la distancia (rij-6)
Cambio en la intensidad de una resonancia
por la irradiación de otra resonancia
Parámetros que gobiernan las señales de RMN
• Intensidad del pico (área integrada)
nº de núcleos
implicados en la señal

• Desplazamiento químico Entorno en el que se

encuentra el núcleo

• Constante de acoplamiento J

• Tiempo de relajación longitudinal (T1)

• Tiempo de relajación transversal o spin-spin (T2)

• NOE: Cambio en la intensidad de una resonancia por la

irradiación de otra resonancia
RMN aplicada a proteínas: el problema de la
asignación
• Proteínas en solución (1-2 mM)
• RMN homonuclear H1 (~120-140 aa)
• RMN homonuclear H1 unidimensional (1D):
Identificación de todos los H1 de la proteína (d)
 Determinación de los d H1 de los aa en péptidos
modelo
 d muy similares: Superposición de señales
 En proteínas plegadas: d pueden desviarse de los
esperados
• RMN heteronucleares: H1, C13, N15 (>120 aa)
Desplazamiento químico H1 de aminoácidos

HN: H1 amida
HA: H1 Ca
HB: H1 R

¡¡Superposición de señales de muchos H1!!

RMN aplicada a proteínas: el problema de la
asignación
• Proteínas en solución (1-2 mM)
• RMN homonuclear H1 (~120-140 aa)
• RMN homonuclear H1 unidimensional (1D):
Identificación de todos los H1 de la proteína (d)
 Determinación de los d H1 de los aa en péptidos
modelo
 d muy similares: Superposición de señales
 En proteínas plegadas: d pueden desviarse de los
esperados
• RMN heteronucleares: H1, C13, N15 (>120 aa)
Espectro homonuclear 1D de la ubiquitina (RMN H1)

¡Muy difícil hacer una asignación completa!

RMN aplicada a proteínas: el problema de
la asignación
• RMN homonuclear H1 (1D) → RMN homonuclear H1
(2D): Se reduce la superposición espectral

• 2ª Dimensión: Pulsos sucesivos → magnetización entre

núcleos:

 A través de enlace: acoplamientos escalares

(COSY, TOCSY)

 A través del espacio: acoplamientos dipolares

(NOESY)
RMN 2D homonuclear: Transferencia de
magnetización entre núcleos

Nuclear Overhausser Acoplamientos

effect spectroscopy dipolares

Correlated
spectroscopy
Acoplamientos
escalares
Total correlated
spectroscopy
RMN aplicada a proteínas: el problema de
la asignación
• RMN homonuclear H1 (1D) → RMN homonuclear H1
(2D): Se reduce la superposición espectral

• 2ª Dimensión: Pulsos sucesivos → magnetización entre

núcleos:

 A través de enlace: acoplamientos escalares

(COSY, TOCSY)

 A través del espacio: acoplamientos dipolares

(NOESY)
 Gráficos de contorno 2D COSY y TOCSY de
algunos aminoácidos

Acoplamientos escalares (2-3 enlaces): “interacciones

intra-residuo” → Asignación completa de las resonancias
de los H1
RMN 2D homonuclear: Transferencia de
magnetización entre núcleos

Nuclear Overhausser Acoplamientos

effect spectroscopy dipolares

Correlated
spectroscopy
Acoplamientos
escalares
Total correlated
spectroscopy
 NOESY homonuclear 2D

Interacciones entre núcleos a través del

espacio separados por menos de 6 Å
Las estructuras secundarias regulares dan
lugar a NOEs característicos

NOESY homonuclear 2D: base de la

determinación de estructura
RMN aplicada a proteínas: el problema de la
asignación
• Proteínas en solución (1-2 mM)
• RMN homonuclear H1 (~120-140 aa)
• RMN homonuclear H1 unidimensional (1D):
Identificación de todos los H1 de la proteína (d)
 Determinación de los d H1 de los aa en péptidos
modelo
 d muy similares: Superposición de señales
 En proteínas plegadas: d pueden desviarse de los
esperados
• RMN heteronucleares: H1, C13, N15 (>120 aa)
 Desplazamientos químicos del C13 del esqueleto
polipeptídico y grupos amida de cadenas laterales
Desplazamientos químicos del N15 de los grupos
amida del esqueleto polipeptídico

RMN 3D y multidimensionales:
• ↑↑ nº de asignaciones
• ↑↑ NOEs (restricciones estructurales)
• Proteínas de hasta 30-40 kDa
Wüthrich, Kurt, Prof. Dr
Institute of Molecular Biology and
Biophysics
Zurich
P. Nobel de Química en 2002
 Algunas de las primeras estructuras
determinadas por RMN H1 homonuclear
Como se genera la estructura a partir de los
datos de RMN
1) Asignación: determinar qué aa hay en los espectros
“Asignación secuencial” (Kurt Wüthrich)

2) Asignación específica → Restricciones de distancias y

ángulos

3) Derivación de un modelo tridimensional de la proteína:

múltiples conformaciones posibles, compatibles con
los datos experimentales

4) “Estructura media”: Desviación entre la “media” y los

distintas conformaciones posibles (RMSD)
 “Asignación secuencial” (Kurt Wüthrich)

• Identificación de los H de cada residuo e identificar la

cadena lateral
• No permite distinguir entre Ser16, Ser28 o Ser31 (Lac rep)
Como se genera la estructura a partir de los
datos de RMN
1) Asignación: determinar qué aa hay en los espectros
“Asignación secuencial” (Kurt Wüthrich)

2) Asignación específica → Restricciones de distancias y

ángulos

3) Derivación de un modelo tridimensional de la proteína:

múltiples conformaciones posibles, compatibles con
los datos experimentales

4) “Estructura media”: Desviación entre la “media” y los

distintas conformaciones posibles (RMSD)
 Asignación específica de secuencia

NOESY homonuclear 2D

• Asignación específica (NOEs): residuos cercanos en el

espacio
• Identificación de péptidos cortos. Ej: aa 28-30: Ser-His-Val
• ¡¡Imprescindible conocer la secuencia 1ª de la proteína!!
• Restricciones de distancia: Identificación de estr. 2º
 Restricciones de distancia

Fácil identificación de los elementos de

estructura secundaria
Como se genera la estructura a partir de los
datos de RMN
1) Asignación: determinar qué aa hay en los espectros
“Asignación secuencial” (Kurt Wüthrich)

2) Asignación específica → Restricciones de distancias y

ángulos

3) Derivación de un modelo tridimensional de la proteína:

múltiples conformaciones posibles, compatibles con
los datos experimentales

4) “Estructura media”: Desviación entre la “media” y los

distintas conformaciones posibles (RMSD)
Una familia de estructuras: 25 estructuras
posibles para un dedo de Zn
Como se genera la estructura a partir de los
datos de RMN
1) Asignación: determinar qué aa hay en los espectros
“Asignación secuencial” (Kurt Wüthrich)

2) Asignación específica → Restricciones de distancias y

ángulos

3) Derivación de un modelo tridimensional de la proteína:

múltiples conformaciones posibles, compatibles con
los datos experimentales

4) “Estructura media”: Desviación entre la “media” y los

distintas conformaciones posibles (RMSD)
Estructura media Vs cada una de
las posibles estructuras: RMSD
Como se genera la estructura a partir de los datos
de RMN

• Conocemos la estructura 1ª de la proteína

• Espectros H1 COSY/TOCSY: identificar los H
de los aa e identificar las cadenas laterales.
• Espectros H1 NOESY: Asignación específica,
restricciones de distancia
• Estructuras 2ª tienen NOEs característicos
• Construcción de los modelos 3D de la
proteína compatibles con los datos
• RMSD (root mean square deviation)
3. Determinación de la
estructura de proteínas:
3.2. Cristalografía y
difracción de rayos X
Cristalografía y difracción de Rayos X
• Método más productivo para determinar la estructura
proteica
• Proteínas cristalizadas
• Whilem C. Röntgen (Nobel, 1901): Descubre los R.X
• Max Von Laue (Nobel, 1914): naturaleza ondulatoria de
los R.X, estructura regular de los cristales y fenómeno
de difracción.
 Experimento de Von Laue

Patrón de
dispersión

SO4Cu

• Los R.X son ondas o radiaciones electromagnéticas

• Fenómeno de difracción
• Los cristales se comportan como rendijas de difracción
l de los R.X (Å) adecuada para estudiar la
estructura atómica
Cristales: repetición ordenada de millones
de unidades

Celda unidad
Los cristales difractan los rayos X
Los cristales amplifican la difracción de Rayos X
dando patrones característicos
Ley de Bragg (P. Nobel, 1915 W.H. Bragg & W.L. Bragg)

2d.sen  = l

• Patrón de difracción → Estructura interna del cristal

• Los rayos X se reflejan desde planos adyacentes (interferencia
constructiva)
• La resolución depende del nº de reflexiones (spots)
15.000 → 1,8Å
150 aa
50.000 → 1,2Å
 Cristalización de proteínas

• Precipitantes: alcoholes de cadena corta, polientilenglicoles, sales,

iones metálicos, etc
• Conservar los cristales en sus tampones
• Congelación rápida (N2); crioprotectores
• Difracción de rayos X a baja temperatura (-180ºC)
• Proteínas de membrana son un gran desafío
 Fuentes de Rayos X
Generadores de Rayos X de
ánodo giratorio

Anillos de almacenamiento de sincrotrón

Time-resolved crystallography
¿Cómo se obtiene la estructura de la proteína a
partir del patrón de difracción?
 El problema de fases en la difracción de
rayos X

• Amplitud → intensidad del spot

• l, determinada por la fuente de rayos X
• ¡Las fases se pierden!
El problema de fases en la difracción de
rayos X
El problema de fases en la difracción de
rayos X

Función que define la densidad electrónica en un punto de

coordenadas (x,y,z) en la celdilla elemental
 Mapa de densidad electrónica y
construcción del modelo

El patrón de difracción de un Mapa de densidad Construcción del modelo

objeto es la Transformada de electrónica estructural dentro del mapa de
Fourier del objeto densidad electrónica

Fase
h , k ,l  
1
 ( x, y, z )   F ( h
Vunitcell h,k ,l 
, k , l ) e i ( h , k ,l )  2  i ( hx ky lz )
e

módulo
Métodos para el cálculo de las fases
• MIR (Multiple Isomorphous Replacement): Zn, Hg, Sm

Mapas de
Patterson

Función de densidad electrónica Función de Patterson

Relación entre el cuadrado de la amplitud del factor de estructura y su intensidad. K es un factor de escala, A es el factor de
absorción de los rayos X por el cristal, L es el factor de Lorentz, y p representa el factor de polarización
Métodos para el cálculo de las fases
• MIR (Multiple Isomorphous Replacement): Zn, Hg, Sm
• MAD (Multiwavelenght Anomalous Diffraction)
• MR (Molecular Replacement)
 Mapa de densidad electrónica y
construcción del modelo

El patrón de difracción de un Mapa de densidad Construcción del modelo

objeto es la Transformada de electrónica estructural dentro del mapa de
Fourier del objeto densidad electrónica

Fase
h , k ,l  
1
 ( x, y, z )   F ( h
Vunitcell h,k ,l 
, k , l ) e i ( h , k ,l )  2  i ( hx ky lz )
e

módulo
Construcción del modelo a partir de mapa
de densidad electrónica

Resolución
• Mínima distancia entre 2
puntos en el espacio
recíproco
• Espacio real: ≈ d

15.000 → 1,8Å
150 aa
50.000 → 1,2Å
Construcción del modelo a partir de mapa
de densidad electrónica
1.2 Å 2Å

3Å 6Å
Validación del modelo
• Distancias interatómicas y ángulos de enlace
• Geometría del enlace peptídico
• Ángulos de torsión compatibles (Ramachandrán)
• Factores térmicos físicamente aceptables

Medidas de calidad
• Factor R: Patrón de difracción observado Vs calculado (˂20%).
• Factor B o factor térmico: área de localización de un átomo
Resumen de las Etapas en la cristalización y
difracción de rayos X
Purificación Obtención de Obtención del patrón de
de la proteína cristales de proteína difracción

Análisis y evaluación de los Construcción del mapa Cosntrucción del

datos de densidad electrónica modelo

Validación

Modelo
final
Dispersión de rayos X de bajo ángulo (SAXS: small-
angle X-ray scattering)

Ventajas:
• Proteínas en solución
• SAXS no requiere cristales ni preparación especial de la muestra
• No está limitada por el peso molecular y es aplicable casi bajo
condiciones fisiológicas
• Permite el estudio de transiciones estructurales y cambios
conformacionales (función biológica)
• Permite análisis cuantitativo de la cinética del proceso

Desventajas:
• Baja resolución
• Se necesita el Sincrotron como fuente de rayos X
Dispersión de rayos X de bajo ángulo (SAXS: small-
angle X-ray scattering)
Dispersión de rayos X de bajo ángulo (SAXS: small-
angle X-ray scattering)
3. Determinación de la
estructura de proteínas:
3.3. Microscopía
crioelectrónica (Cryo-EM)
Cryo-EM
• Visualización de especímenes congelados con
un ME de transmisión
• Lente objetivo magnética: imagen ampliada
¿Cómo se consigue suficiente contraste?

Recubrimiento con Congelación

metales pesados instantánea en “capa
fina”
¿Cómo se consigue suficiente contraste?

Recubrimiento con Congelación

metales pesados instantánea en “capa
fina”
Trends in Biochemical Sciences 2015 40, 49-57DOI: (10.1016/j.tibs.2014.10.005)
Cryo-EM
• Examinar estructuras no cristalinas
• Pequeña cantidad de muestra
• Moléculas solubles
• Resolución: ~3 Å – 3 nm
• Cryo-EM y cristalografía pueden
complementarse
3. Determinaicón de la
estructura de proteínas:
3.4. Modelado por homología
Modelado por homología
50% de identidad → RMSD < 1Å (Ca)
1) Construir una plantilla para el núcleo estructural de la
proteína (proteína(s) de estructura similar como molde)
2) Alinear la secuencia de la proteína de interés con esa
plantilla
3) Construir los lazos de la superficie
4) Añadir las cadenas laterales en conformaciones
mutuamente compatibles
5) Refinar el modelo

https://swissmodel.expasy.org/
Modelado por homología
50% de identidad → RMSD < 1Å (Ca)
1) Construir una plantilla para el núcleo estructural de la
proteína (proteína(s) de estructura similar como molde)
2) Alinear la secuencia de la proteína de interés con esa
plantilla
3) Construir los lazos de la superficie
4) Añadir las cadenas laterales en conformaciones
mutuamente compatibles
5) Refinar el modelo

https://swissmodel.expasy.org/