www.referat.

ro

www.referat.ro

‘UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRONOMICE ŞI

MEDICINĂ VETERINARĂ BUCUREŞTI FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII SPECIALIZAREA BIOTEHNOLOGII MEDICAL-VETERINARE

PROIECT DE DIPLOMĂ

Şef lucrări dr.chimist LUMINIŢA IONESCU CSI dr. chimist : GETA AVRAM

Absolvent : Marinescu Georgiana

BUCUREŞTI 2010 UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRONOMICE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ – BUCUREŞTI FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII SPECIALIZAREA BIOTEHNOLOGII MEDICAL VETERINARE

STUDII PRIVIND BIOSINTEZA UNUI COMPLEX MULTIENZIMATIC UTILIZABIL CA ADITIV FURAJER

Coordonator Ştiinţific : LUMINIŢA IONESCU CSI dr. chimist : GETA AVRAM

Absolvent : Marinescu Georgiana

BUCUREŞTI
2010

Cuprins

REZUMAT……………………………………………………………………………… …………..3 INTRODUCERE................................................................................................................7 PARTEA I.........................................................................................................................11 STUDII DOCUMENTARE.............................................................................................11 Capitolul 1. Enzime hidrolitice de uz furajer şi microorganisme producătoare.......11 α-amilaza........................................................................................................................11 Celulazele.......................................................................................................................13 1.3. Hemicelulazele....................................................................................................14 1.4. Microorganisme producătoare de enzime hidrolitice de uz furajer....................16 Capitolul 2. Utilizarea deşeurilor şi/sau subproduselor agricole în medii de biosinteză a enzimelor hidrolitice de uz zootehnic........................................................20 Capitolul 3.........................................................................................................................24 CERCETĂRI EXPERIMENTALE...............................................................................27 Capitolul 4. Materiale şi metode.....................................................................................27 4.1 Tulpini de lucru........................................................................................................27 4.2. Obţinerea culturilor de intreţinere...........................................................................27 .................................................................................................27 4.3. Cultivarea în laborator şi testarea activităţii hidrolitice ....................................28 4.4. Determinarea activităţilor enzimatice.................................................................30 4.5. Testarea produsului enzimatic în hrana animalelor de fermă.............................39 Capitolul 5. Rezultate şi discuţii.....................................................................................42 5.1. Compoziţia mediilor pentru cultura de întreţinere .................................................42 5.2 Analiza comparativă a biosintezei enzimelor hidrolitice cu tulpini Aspergillus niger şi Trichoderma viride pe diferite medii.........................................................................42 5.3. Temperatura optimă de cultivare............................................................................45 5.3 Alegerea pH-ului optim de cultivare........................................................................47 5.4. Testarea complexului enzimatic ca aditiv furajer.................................................51 CONCLUZII.......................................................54 BIBLIOGRAFIE .............................................................................................................56

REZUMAT

Numeroase nutreţuri ieftine sunt limitate ca utilizare în hrana animalelor datorită disponibilităţii reduse a nutrientilor pe care îi contin. Astfel, anumite reţete pe bază de cereale, care, de altfel, se folosesc şi în ţara noastră, conţin cantităţi importante de poliglucide neamidonoase PNA (polizaharide fără amidon). Acestea sunt reprezentate în principal de beta-glucani (în orz şi ovăz), arabinoxilani (în grâu şi tărâţe), polimeri pe bază de rafinoză (în şrotul de soia) celuloză şi hemiceluloză (şrotul de floarea soarelui), fapt care limiteaza sever folosirea lor în hrana animalelor. PNA din cereale şi tărâţele acestora manifesta o activitate antinutritivă când sunt prezenţi în cantităţi mari în hrana păsărilor şi porcilor. Ele nu pot fi degradate de enzimele din tubul digestiv al acestor animale. Efectele antinutritive ale PNA se concretizeaza în diminuarea digestibilitatii amidonului, proteinelor şi grăsimilor, determinând astfel un efect general de reducerea ratei de creştere şi de valorificare a hranei. PNA măresc vâscozitatea conţinutului intestinal şi împiedica difuzia enzimelor endogene şi mixarea aceatora în masa continutului digestiv. Având în vedere structura complexă a PNA din materiile prime furajere, este evident că un singur tip de activitate enzimatică nu poate asigura disponibilizarea tuturor substanţelor nutritive din componentele hranei, fiind necesară combinarea mai multor produse diferite (de unde necesitatea obţinerii unor complexe multienzimatice). În acest context, in proiectul de faţã s-a urmărit selecţia unor tulpini fungice cu capacitate crescutã de producere a unui complex de enzime hidrolitice prin utilizarea unor formule noi de substraturi nutritive, precum şi stabilirea condiţiilor optime de biosinteză a acestor enzime cu microorganismele selecţionate. In prima parte a lucrării sunt prezentate studii documentare referitoare la enzime hidrolitice de uz furajer şi microorganisme producătoare ale acestora, utilizarea deşeurilor şi/sau subproduselor agricole în medii de biosinteză a enzimelor hidrolitice de uz zootehnic, caracteristici ale proceselor de fermentatie cu microorganisme producatoare de enzime hidrolitice utilizabile ca aditivi furajeri.

activitatea xilanazică 1366. În scopul determinării condiţiilor optime de cultivare a tulpinii de Aspergillus niger CMGB-401 pentru biosinteza enzimelor hidrolitice (amilaze. pe 4 medii de cultură preluate din literatura de specialitate. s-a observat că tulpina de Aspergillus niger CMGB-401 conduce cele mai bune activităţi enzimatice.6 UDNS/g. în urma cultivării la pH = 5. xilanaze). având următoarea compoziţie (g%): Făină de porumb-2%. cele mai bune rezultate s-au obţinut cu mediul lichid M 4. MgSO4x7H2O-0. xilanaze) utilizabil ca aditiv furajer.05%.În cadrul cercetărilor experimentale prezentate în proiect s-au testat două tulpini de Aspergillus niger şi o tulpină Trichoderma viridae din colecţia Centrului de Biotehnologii Microbiene şi respectiv a Facultăţii de Biologie.5 şi la temperatura de 280C (activitatea amilolitică 141. au fost cercetaţi o serie de parametrii care au o importanţă semnificativă pentru acest tip de bioprocese şi anume: compoziţia mediul de cultură. Rezultatele obţinute au evidenţiat capacitatea bioproductivă superioară a tulpinii Aspergillus niger CMGB-401 în ceea ce priveşte complexul enzimatic studiat.95 UP/g. proteaze. Universitatea Bucureşti. (NH4)2HPO4-0.5%. În ceea ce priveşte compoziţia mediului de cultură. în ceea ce priveşte capacitatea acestora de a produce un complex de enzime hidrolitice (proteaze. CaCl2-0. celulaze. concentrare şi adsorbţie pe CaCO3 tehnic) s-a evaluat comparativ cu preparatul KEMZYME®VP DRY (Belgia).27 UC1-Cx/g. pH-ul mediului de cultură şi gradul de agitare şi aerare al culturii.33 U/ml). activitatea proteolitică 1. celulaze. Făină de soia-3%. dintre cele cinci medii testate (patru medii lichide şi un mediu semisolid pe bază de tărâţe de grâu). activitatea celulozolitică 2. activitatea polienzimatica a mediilor de fermentaţie şi a produselor finite (obţinute prin filtrarea mediului de fermentaţie. temperatura. amilaze. Cele trei tulpini de fungi au fost cultivate în sistem submers.1% În cazul diferitelor variante de pH şi temperatură folosite. .

Consumul specific la loturile de purcei la care s-a utilizat preparat enzimatic este cu 1. posibil din cauza faptului că nutreţul combinat a fost optimizat în principii nutritivi specifici acestei categorii de porcine. Rezultatele obţinute sugerează eficienţa utilizării preparatelor enzimatice în recepturi de nutreţ combinat deficitare în principii nutritive. De peste 60 de ani domeniul aditivilor furajeri este explorat prin numeroase cercetări. INTRODUCERE Odatã cu integrarea în Uniunea Europeanã.04% mai mic faţă de martor. România s-a aliniat la Standardele Europene în ceea ce priveşte asigurarea calitãţii nutreţurilor cu un impact deosebit asupra sãnãtãţii animalelor şi în consecinţã a oamenilor. − surse neconvenţionale. cum sunt proteinele furnizate de microorganisme: mucegaiuri.4. Testarea ca aditiv furajer a produsului polienzimatic condiţionat a evidenţiat faptul că utilizarea acestuia nu a influenţat semnificativ greutatea corporală şi sporul mediu zilnic a purceilor în perioada crizei de înţărcare. tratarea cu CaCO3 a concentratului şi uscarea sub vid a amestecului rezultat. s-a interzis utilizarea pulberilor de origine animalã în furajarea animalelor şi prin urmare s-au căutat alte cãi pentru ca necesarul de proteinã furajerã sã fie acoperit. Printre sursele alternative de proteine furajere se numără: − surse semiconvenţionale. in funcţie de cantitatea de produs introdusă în raţia zilnică.Condiţionarea produsului polienzimatic s-a realizat prin concentrarea mediului integral din finalul fermentaţiei. bacterii. cum sunt proteinele seminţelor de oleaginoase (soia) şi din concentratele de peşte. drojdii. alge. timp în care au fost elaborate şi testate o multitudine de produse experimentale .52% . utilizate curent astãzi în diferite ţãri.

aceasta nouă clasă de compuşi a devenit una din principalele căi de sporire şi eficientizare a performanţelor de valorificare a hranei de către animalele de interes zootehnic. proteinelor si grasimilor. PNA din cereale si tarâtele acestora manifesta o activitate antinutritiva când sunt prezenti în cantitati mari în hana pasarilor si porcilor. conţin cantităţi importante de poliglucide neamidonoase PNA (polizaharide fără amidon). cele mai multe pot fi separate si-si pot continua activitatea in vitro. Astfel. . Ca rezultat. dejecţii lipicioase sau cu umiditate ridicată (care afectează negativ microclimatul). În acelaşi timp pentozanii si betaglucanii se pot combina cu enzime specifice ale tractusului digestiv. consum excesiv de apă. Ele nu pot fi degradate de enzimele din tubul digestiv al acestor animale. O soluţie pentru diminuarea efectului negativ al PNA asupra producţiei animaliere este reprezentată de adiţia de enzime în hrana animalelor. care. de altfel. digestibilitatea nutreţurilor se reduce şi apar o serie de tulburări ca: diaree (simptom asociat frecvent cu prezenta grâului în cantităţi mari în raţii).şi comerciale. PNA maresc vâscozitatea continutului intestinal si împiedica difuzia enzimelor endogene si mixarea aceatora în masa continutului digestiv. Acestea sunt reprezentate în principal de beta-glucani (în orz si ovaz). Desi ele se formeaza si functioneaza ca si catalizatori doar in celule vii. Efectele antinutritive ale PNA se concretizeaza în diminuarea digestibilitatii amidonului. arabinoxilani (în grâu si tarâte). De la simple substanţe de tipul acizilor organici pâna la sisteme de aditivi cu peste 10 substanţe active încorporate. polimeri pe bază de rafinozã (în şrotul de soia) celuloză si hemiceluloză (şrotul de floarea soarelui). Enzimele sunt catalizatori biologici de natura proteica care participa la numeroase reactii chimice ce au loc in sistemele vii şi fara de care viata nu ar putea exista. anumite reţete pe bază de cereale. sporul mediu zilnic fiind redus. fapt care limiteaza sever folosirea lor în hrana animalelor. Numeroase nutreturi ieftine sunt limitate ca utilizare în hrana animalelor datorita disponibilitatii reduse a nutrientilor pe care îi contin. Astfel eficienţa conversiei hranei este redusă şi costul/kg spor este ridicat. reducându-le activitatea. a proceselor de crestere a tesuturilor la animale si pasari. Ele au rol important in reglarea matabolismului substantelor nutritive. se folosesc şi în ţara noastră. determinând astfel un efect general de reducerea ratei de crestere si de valorificare a hanei.

este evident că un singur tip de activitate enzimatică nu poate asigura disponibilizarea tuturor substanţelor nutritive din componentele hranei. unde predomină arabinoxilanii este necesar ca în complexul enzimatic utilizat. astfel că. costuri scazute de productie. stabilitate marita la pastrare. de exemplu. eforturile cercetatorilor din intreaga lume s-au indreptat spre studierea efectului enzimelor de natura exogena in cresterea disponibilitatii si digestibilitatii substantelor nutritive si valorii energetice a nutreturilor. incluzând β-D-glucani necelulozici. se poate realiza creşterea performanţelor productive şi. la grâu şi secară. care sunt asociate cu celuloza si intra in constitutia peretelui celular vegetal. manoză (galactogluco. Acesta este formată dintr-un grup de heteropolizaharide solubile în mediu alcalin. rezistenta mare la inactivare prin tratament termic. Cerintele noilor enzime furajere sunt: activitati specifice mari in conditiile de lucru impuse. Prin încorporarea enzimelor exogene specifice în nutreţul combinat pentru porci sau păsări. imbunatatirea performantelor productive. activitatea esenţială să fie orientată spre acest substrat. protejarea mediului prin reducerea conţinutului excretei în azot şi fosfor.şi glucomanani) şi xiloză (arabinoglucurono. Având în vedere structura complexă a PNA din materiile prime furajere. sunt în general denumite cu termenul de hemiceluloze. pH scazut si la actiunea enzimelor proteolitice. reducerea costurilor hranei pe unitatea de produs. heteropolizaharidele cu un grad de polimerizare redus (100 – 200 unităţi) comparativ cu al glucozei (10000 – 14 0000).În ultima perioada. Aceste aspecte sunt susţinute de cercetările de specialitate care demonstrează. De exemplu. De fapt. totodată. Principalii componenţi glucidici ai . chiar dacă pentru cele mai multe din dietele pe bază de proteine vegetale este necesară adăugarea de alfagalactozide şi pectinaze.şi glucuronoxilani). Hemiceluloza este o componentă a fracţiunii polizaharidice care se găseşte la un nivel ridicat în peretele celular al plantei. fiind necesară combinarea mai multor produse diferite (de unde necesitatea obţinerii unor preparate enzimatice complexe). substanţe pectice (poligalacturonani) şi mai multe heteropolizaharide cum sunt cele formate în mod predominant din galactoză (arabinogalactani). corelaţia între progresul genetic la porc şi schimbările în raţiile specifice categoriei şi vârstei. răspunsul animalelor la adiţia de enzime nu depinde numai de substrat dar şi de capacitatea fiziologică a animalelor de a utiliza nutrienţii.

Lfucoza şi diferite glucide O-metilate. În acest context. în dietele furajere. D-glucoza. xilanaza. celulaza. in proiectul de faţã s-a urmărit selecţia unor tulpini fungice cu capacitate crescutã de producere a unui complex de enzime hidrolitice prin utilizarea unor formule noi de substraturi nutritive. oferă nutriţioniştilor posibilităţi multiple pentru stimularea proceselor digestive şi metabolice la animale. Dintre aceştia β-glucanii şi arabinoxilanii sunt recunoscuţi ca factori antinutritivi în cereale. D-manoza. L-arabinoza. cu microorganisme specifice genului Aspergillius. contribuind la ridicarea eficienţei biologice şi economice a hranei.heteropolizaharidelor hemicelulozice sunt: D-xiloza. acidul D-glucuronic. . Datele din literatura de specialitate atestă faptul că enzimele hidrolitice susmenţionate se obţin fie prin fermentaţie în sistem submers. pe baza utilizãrii reziduurilor agricole ca materii prime în procesele fermentative precum şi stabilirea condiţiilor optime de biosinteză a acestor enzime cu microorganismele selecţionate. Adiţia enzimelor exogene precum amilaza. D-galactoza. acidul D-galacturonic şi mai puţin L-rhamnoza. proteaza. fie pe substraturi solide.

începe printr-o slăbire a legăturii C1-O4 în vederea hidrolizei.9. situându-se între 4. Ele sunt sunt proteine mici.2. Mecanismul hidrolizei. care se comportă ca donor de proton pentru O4.4-D-glucan-4-glucohidrolaza EC 3. Enzime hidrolitice de uz furajer şi microorganisme producătoare α-amilaza α-amilazele (α-1. pH-ul optim al α-amilazelor depinde de originea acestora. Bacillus licheniformis (tabelul 1). Situsul catalitic al α-amilazelor este format din doi aminoacizi (Asp şi Glu) care se găsesc în zona de legare a substratului [2].0). Această legătură continuă să fie slăbită prin acţiunea unuia din cei doi aminoacizi.1. În final. urmată de formarea complexului enzimă-substrat. Temperatura optimă de activitate variază şi ea în funcţie de originea enzimei. Valori extreme de pH se întâlnesc la α-amilaza acidă din Bacillus subtilis (pH 3.PARTEA I STUDII DOCUMENTARE Capitolul 1. 1).1. Temperatura medie este de 40-500C.5) sau α-amilaza bazică din Bacillus licheniformis (pH 9. . asemănător celui întâlnit în cazul lizozimului. animale) realizând hidroliza substraturilor amidonoase până la oligozaharide. Bacillus subtilis. Prezenţa ionilor de calciu favorizează uneori creşterea stabilităţii enzimei în condiţii extreme de pH. cu mase moleculare cuprinse între 50. plante. Ruperea legăturii glicozidice duce la formarea unui ion intermediar oxicarbonic (stare de tranziţie) care este stabilizat de încărcătura negativă a celorlalţi aminoacizi.000 şi 60.000.) se întâlnesc în toate organismele vii (microorganisme. acest ion reacţionează cu o moleculă de apă şi cele două oligozaharide formate părăsesc situsul catalitic (fig.8 şi 6. dar poate ajunge până la 70-800C în cazul αamilazelor bacteriene din Bacillus stearothermophilus.

600 pH optim 6.1) Originea enzimei Animală Pancreas de porc Vegetala Malţ de orz Microbiană Bacillus amyloliquefqciens B.000 47.5 – 6.000 52.Figura 1.0 5.9 4.9 Temperatura optima (0C) 37 50 . Proprietăţile α-amilazelor (E. Mecanismul propus pentru reacţia de hidroliză catalizată de α-amilază Tabelul 1.1 5.4 5. subtilis A.4 5.000 59. stearothermophilus B.000 22.500 49.9 5. 3.7 – 5.0 – 9.500 49.2.3 – 6.55 65 76 70 50 40 .C. oryzae Masa moleculara 50.4 – 6. licheniformis B.1.

3.Celulazele Celulazele. cu diferite specificităţi de hidroliză a legăturilor glicozidice. deschizând astfel calea celobiohidrolazelor. ele pot fi împărţite în trei clase majore: endoglucanaze sau endo-1. Celobiohidrolazele indepărtează mono. celulazele sun proteine formate din mai multe domenii. În general. deseori denumite carboximetilcelulozo (CM)-celulaze iniţiază atacul aleatoriu la multiple situsuri din interiorul regiunilor amorfe ale fibrei celulozice. reprezentând aproximativ 40-70% din proteina celulazică totală şi se caracterizează prin faptul că hidrolizează celuloza cristalină. Se consideră că endoglucanazele. enzimele responsabile de hidroliza celulozei.C.3.şi dimeri de la capătul lanţului celulozic.C.4).4-β-glucanaze (E. endoglucanazele şi celobiohidrolazele acţionează în mod sinergic. dar detaliile mecanismelor lor de acţiune încă nu sunt cunoscute.C.21). Definiţia curentă şi clasificarea “adevăratelor” celulaze este încă incertă [3].2. β-glucozidaza hidrolizează dimerii şi în anumite cazuri. celo-oligozaharide la glucoză.1. celobiohidrolaze (E. formează componenta majoră a sistemului celulazic fungic.2. În funcţie de activitatea lor enzimatică. deseori denumite exoglucanaze. Celobiohidrolazele. Ca şi hemicelulazele.1. Se pare că microorganismele au mai multe variante distincte de endo.3. .2.1.şi exoglucanaze. sunt compuse dintr-un amestec complex de proteine enzimatice.91) şi β-glucozidaze (E.

respectiv hemiceluloza. Degradarea enzimatica a celulozei 1. sunt proteine alcătuite din mai multe domenii. Structura hemicelulozei . ca multe alte enzime care hidrolizează polizaharide. Hemiceluloza este un polimer complex.Figura 2. în special xiloză şi arabinoză şi care mai conţine şi hexoze (în special manoză) şi câţiva acizi glucidici (figura 2).3. din peretele celular al plantelor. în componenţa căruia predomină molecule de glucide cu 5 atomi de carbon. Figura 3. Hemicelulazele Hemicelulazele.

. fie carbohidrat esteraze (CEs)[4]. Cele mai importante module necatalitice constau în domenii de legare a carbohidraţilor (CBD) care facilitează fixarea acestora.alte xilanaze si α-D-glucuronidaze: hidrolizează legătura α-1. fie de suprafaţa celulei microbiene. hemicelulazele sunt fie glicozid-hidrolaze (GHs). Acestea din urmă hidrolizează legăturile esterice ale acetatului sau ale esterilor acidului ferulic şi. ele au fost grupate în diferite familii.xilanaze: hemicelulaze majore care ataca legăturile β-1. în funcţie de omologia secvenţei lor primare.β-xilozidaze: hidrolizeaza xilooligomerii la xiloza. În funcţie de specificitatea de subtract. hemicelulazele se împart în: . O-2 si/sau O-3 ale arabinofuranozidelor ca si supra legăturilor O-2 şi O-3 din xilanii dublu substituiţi.4-manooligomeri mici. care actioneaza asupra legaturilor dintre xiloza si arabinoza (Lee şi colab. .. formată cu acid 4-O-metil-D-glucuronic . Feruloil esterazele contribuie la ruperea legaturilor dintre hemiceluloza si . acţionând asupra uneia din legăturile O-5. fie de complexe enzimatice precum celulozomul Shallom şi Shoham. .Hemicelulazele conţin în general module catalitice şi necatalitice structural distincte.4-mano-oligomeri la manoză -α-L-arabinofuranozidaze si α-L-arabinanaze: hidrolizează arabinofuranozilhemicelulozele. liganzi interdomenii şi module dockerin care mediază legarea domeniului catalitic al enzimei.4-glicozidice din scheletul xilanului → xilooligomeri. . În funcţie de secvenţa de aminoacizi sau de acizi nucleici specifică modulelor lor catalitice.feruloil esteraze: hidrolizează legătura esterică dintre substituenţii arabinozei si acidul ferulic.β-manozidaza: hidrolizeaza β-1. unele au o specificitate largă de substrat.acetil esteraze: hidrolizează substituenţii acetil de pe molecula xilozei . prin interacţii de coeziunedockerin. .β-mananaze: hidrolizează hemicelulazele pe bază de manan → β-1.xilozidaz-arabinozidaze: GHs bifunctionale.2-glicozidică din catena laterală a xilanilor. 2003) si au o secventa primara asemanatoare cu unele dintre β-xilozidaze.

1. Enzime implicate in degradarea hemicelulozei O clasificare comprehensivă a hemicelulazelor şi a altor hidrolaze este disponibilă pe site-ul http:/afmb. Este cunoscut faptul cã rentabilitatea bioproceselor depine în mare masurã de potenţialul productiv al suşelor producãtoare.4. Figura 4. Mãrirea gradului de eficacitate a tehnologiilor de biosintezã se realizeazã astãzi pe scarã largã.lignină. polizaharidulul devenind accesibil biodegradării ulterioare de către glicozidhidrolazele specific[5]. prin utilizarea tehnicilor de recombinare geneticã. . cnrs-mrs.fr/CAZY. Microorganisme producătoare de enzime hidrolitice de uz furajer O preocupare permanentã a cercetãtorilor din domeniul biotehnologiilor o constituie ridicarea potenţialului productiv al tulpinilor implicate în procesele de biosinteza.

Demain şi N. capabile sã sintetizeze biocatalizatorul cu o ratã crescutã. secretã enzime degradative conducând în cele din urma la descompunerea şi transformarea substratului pe care se dezvoltã. ci în cursul deviziunii mitotice. cu specificaţia cã recombinarea nu are loc în meioza. Fungii apartinând genului Aspergillus sunt alãturi de cei din genul Penicillium. microorganisme eucariote. Acest ciclu ambiguu asemãnãtor cu cel sexual. microorganisme modificate genetic. Din punct de vedere taxonomic. fungii. . Datele recente din literaturã indicã obţinerea de enzime hidrolitice în special cu ajutorul fungilor de Aspergillus niger. au un ciclu de viatã sexuat şi sunt denumiţi în mod obişnuit fungi imperfecţi. sunt utilizate tot mai des mutante. studiindu-se posibilitatea îmbunãtãţirii procesului de fermentaţie sau selecţia de noi tulpini producãtoare. Tehnicile utilizate în scopul schimbãrii structurii genetice a microorganismelor constau în mutaţii şi selecţii tehnice recombinare in vitro şi tehnici de inginerie geneticã. într-un timp mai scurt şi pe medii de culturã cât mai ieftine. cele mai importante microorganisme folosite în biotehnologiile de obţinere a enzimelor. ca tulpini producãtoare de enzime. Solomon (1985) în Biology of Industrial Microorganisms [6]: − Diviziunea Anastigomycotina − Subdiviziunea Deuteromycotina − Clasa Deuteromycetes − Subclasa Hypomycotidae − Ordinul Moniliales − Familia Monialiaceae − Genul Aspergillus Majoritatea speciilor din genul Aspergillus prezintã miceliu septat. în special în etapa de recombinare a materialului genetic. Utilizarea mucegaiurilor pentru producerea de enzime hidrolitice prezintã o serie de avantaje: − avand o structurã filamentoasã pot fi separate mai usor din mediul de culturã faţã de drojdii şi bacterii. Fungii filamentoşi invadeaza substraturile solide.A.În plus. în ultima perioadã. Mai pot fi încadrati şi la fungii perfecţi datorita prezenţei ciclului de viaţã parasexual.L. pot fi încadrate dupã clasificarea datã de A.

ca şi de enzime pectinolitice. β-amilaze. în conformitate cu urmãtoarele condiţii: (a) tulpina Aspergillus niger nu este toxicã sau patogenicã pentru oameni sau animale.3-glucanaze. A fost . proteinaze şi ligninperoxidaze.4-xilanaza hidrolizeazã arabinoxilanul. În industria alimentarã xilanazele au fost propuse pentru modificarea celulozei şi hemicelulozei prin hidroliza parţialã. − pot asimila din substrat oligozaharidele. Hidroliza totalã a celulozei în glucozã. arabinani şi arabinogalactani). 1. Multe dintre microorganismele folosite produc aceste enzime extracelular. Carbohidrolazele şi enzimele celulozolitice derivate din Aspergillus niger pot fi utilizate în siguranţa ca aditiv în hrana. ceea ce usureazã foarte mult condiţiile de prelucrare industrială pentru obţinerea de enzime.4-glucanaze si anume celobiohidrolaze si β-glucanaze.− au un conţinut mult mai mic de acizi nucleici decât bacteriile şi drojdiile. Studiile asupra activitãţii enzimelor celulozolitice au evidenţiat 2-endoβ-1. Mucegaiurile pot fi cultivate pe substraturi lichide sau solide bogate în glucide. Aceste doua carbohidrolaze au fost izolate şi au fost determinate proprietãţile lor catalitice şi moleculare. Trichoderma (Trichoderma viridae. Arabinofuranozidazele sunt enzime care scindeazã substituienţii arabinozici din hemiceluloze (arabinoza la arabinoxilani. se poate finaliza cu cu fermentaţia glucozei la etanol. Aspergillus oryzae). Enzimele celulozolitice derivate din Aspergillus niger IBT-90 par sã atace celuloza într-un mod sinergic. Trichoderma koningii). Fusarium. un constituent major al peretelui celular al cerealelor şi de curand aceastã enzimã este utilizatã în mare mãsura în procesele biotehnologice. În afarã de enzimele celulozolitice. pH-ul optim şi greutatea molecularã. incluzand temperatura. A fost stabilitã şi standardizatã o metodã de biosintezã a enzimelor celulozolitice cu o tulpinã de Aspergillus niger IBT-90 [7]. Trichoderma reesei. cele mai importante genuri fiind: Aspergillus (Aspergillus niger. (b) aditivul nu este folosit în exces. Penicillium si Rhizopus. fiind necesare cantitãţi minime pentru a produce efectul dorit. care nu sunt accesibile drojdiilor. fungul mai produce cantitãţi considerabile de hemicelulaze. Endo-β-1. izopropanol sau butanol.

Dupã 4 zile de incubare. Procentul de umiditate iniţial. au reprezentat parametrii optimi pentru producţia de xilanazã prin fermentaţie în stare solidã. cunoscutã ca producãtoare de xilanazã. facilitând un sistem de purificare al enzimelor relativ simplu[9]. mãrimea inoculului şi concentraţia mediului de bazã au fost optimizate în vederea producţiei de xilanaze de cãtre Aspergillus niger prin fermentaţie în stare solidã. accentuând potenţialul comercial al producţiei enzimelor xilanazice. a fost studiatã de cãtre P. Activitatea şi producţia de xilanazã dupã 5 zile de fermentaţie utilizând ca sursã de carbon paie de orez a fost de 5. Activitatea xilanazicã estimatã prin modelul polinomial a fost de 5.V. preparatele xilanazice au îndepãrtat fracţia hemicelulozicã din toate deşeurile lignocelulozice testate. Cultura filtratã proaspãtã a fost utilizatã pentru hidroliza diferitelor deşeuri lignocelulozice.C.secvenţializatã parţial şi purificatã arabinofuranozidaza din Aspergillus niger crescut pe mediul de cultura cu pulpa de sfecla de zahar/tãraţe de grâu. activitatea xilanazicã a fost de 74. Kamat [9] pentru obţinerea de xilanazã (E. .5 IU/ml.1. S-a demonstrat cã timpul de cultivare şi concentraţia mediului de bazã reprezintã factorii cei mai importanţi care afecteazã activitatea xilanazicã.8) prin fermentaţie în stare solidã.Y. Mediul optim pentru Aspergillus niger a fost: tãrâţe de grâu în proporţie 1:5 cu solutţe mineralã Mandels şi Strenberg (continând 0. Aspergillus sp. pe diferite substraturi lignocelulozice.1% extract de drojdie) la 35ºC şi concentraţia inoculului fiind de 2x107-2x108 spori/5g substrat. a produs xilanaza cu un nivel scazut al activitãţii celulozolitice.071 IU/g respectiv 14. Mãrimea inoculului de 52x105 spori/g. 3. umiditatea de 65%.790 IU I-1h-1. Gawande si M. timpul de cultivare.2. Ca substrat lignocelulozic utilizat pentru producţia de xilanazã cel mai bun a fost tãrâţele de grâu. timpul de cultivare de 5 zile şi de 10 ori mai concentrat mediul bazal care conţine 50% extract de grâu.484 IU/g de paie de orez [8]. Tulpina de Aspergillus niger 44 . În timpul zaharificãrii.

Dintre acestea. 3 KH2PO4. Mediul de cultură (g/l) a avut urmatoarea compoziţie: 10 (NH4)2SO4. tãiţei de sfecla de zahãr epuizaţi). bazic sau enzimatic a deşeurilor celulozice [10]. Utilizarea deşeurilor şi/sau subproduselor agricole în medii de biosinteză a enzimelor hidrolitice de uz zootehnic Biomasa lignocelulozicã (în special deşeurile agricole) este cunoscutã ca fiind o excelentã sursã de carbon pentru productia enzimelor microbiene. reziduuri de banană. Pentru separarea celulozei din complexul lignocelulozic se aplică tratamente mecanice şi cu vapori de apă. coajă de orez. păstaie de soia. ştiulete de porumb. unele subproduse ale industriei alimentare (pulpe epuizate de fructe. paie de grâu. etc. si 0. furajele şi lemnele neutilizabile reprezintã o rezervã şi insuficient valorificatã de glucide fermentescibile.5 CaCl2xH2O. împreună cu hemiceluloza şi lignina intra în structura pereţilor celulelor vegetale.pulpă de sfecla de zahăr. Reziduurile agro-industriale sunt în general considerate ca cele mai bune substraturi pentru obţinerea de enzime prin fermentaţie în stare solidă. Marele avantaj al acestor surse naturale de carbon este că sunt disponibile în cantităţi industriale şi că au un preţ scăzut. 0.Capitolul 2. coceni de porumb). resturile de plante medicinale. paie de orez. În ultimul deceniu s-au făcut eforturi considerabile în privinţa valorificării superioare a biomasei lignocelulozice(BLC). sunt utilizate ca surse de carbon în producţia de enzime. cocean de porumb. Celuloza. tărâţele de grâu sunt cel mai frecvent utilizate în diferite procese. Substratul pe care se cultivă fungii se obţine în urma hidrolizei în mediu acid.5 MgSO4x 7H2O. Câteva substraturi cum ar fi tărâţe de grâu. S-a constatat că fungul Aspergillus niger 38 poate fi cultivat prin fermentaţie în strat solid pentru obţinerea celulazelor folosind ca sursa de carbon deşeuri agricole uşor de procurat cum ar fi tărâţele de grâu şi paiele de grâu în diferite proporţii. tărâţe de orez. Biomasa lignocelulozicã constituitã din reziduuri agricole (paie. .

(NH4)2SO4 0.4. uree 0. nivelele maxime endopoligalacturonase au variat de la 223-876 unităţi/gram pe mediu uscat indicand că trebuie să se aibă grijă când se alege acest component al mediului[12]. Maximul activităţii pectolitice a fost atins folosind 6 şi 10 % pectină purificată ca inductor. Mediul de cultură pentru cresterea microorganismului Trichoderma reesei ZU-02 a avut urmatoarea compoziţie (%): ştiulete de porumb 66. În funcţie de originea pectinei comerciale folosită ca inductor.05. s-a obţinut o activiate endonucleazică de 14.0x104 si ZnSO4 6. Aspergillus oryzae CCT3940.5 si un raport paie de grâu tărâţe de grâu de de 9:1. producţia de zahăr este peste 84%. MgSO4 0.80 UI/ml (unităţi internaţionale/ml).) au fost comparate pentru a vedea capacitatea lor de a produce endopoligalactouranaze în fermentaţie în stare solidă. KH2PO4 0.45. Cu o umiditate de 74%. Cinci tulpini de fungi filamentoşi (tulpinile Aspergillus niger NRRL 3122 şi T00050007-2. Când doza de celulază este peste 20 IFPU/g substrat. Tărâţele de grâu au fost utilizate ca suport şi ca unică sursă de carbon peste care s-au adăugat 45 ml soluţie de săruri minerale conţinând (%): KH2PO4 0.5-5. FeSO4 6.5.Tărâţele de grâu şi paiele de grâu s-au folosit în proporţii diferite (9:1 la 1:9). CaCl2xH2O 0. deşeuri lignocelulozice din industria xilozei. MgSO4x7H2O 0.2x10-4 pentru fiecare 100g tărâţe. Raportul o parte paie de grâu şi nouă părţi tărâţe de grâu a prezentat cea mai bună activitate.5. tărâţe de grâu 30. MnSO4 1. Alti autori [11] au folosit fungul Trichoderma reesei ZU-0 2 pentru obţinerea de celulază prin fermentatie în stare solidă.1. pentru a produce mediul bazic de tărâţe de grâu. un domeniu al pH-ului de fermentaţie cuprins între 4. CoCl2 0. Trei tipuri de pectine comerciale purificate şi patru de pectine neprelucrate au fost folosite pentru a evalua efectul pectinei asupra producţiei de endopoligalacturonase de Aspergillus niger T00050007-2. Aspergillus awamori NRRL3112 şi Trichoderma sp. Enzimele koji produse prin acest proces au putut fi utilizate direct în hidroliza ştiuleţilor de porumb. utilizând ca substrat reziduuri agricole: ştiulete de porumb.5.2. Activitatea pectolitică a fost atinsă după 72 de ore de creştere cele mai bune tulpini de fungi fiind Aspergillus niger T00050007-2 şi Aspergillus oryzae CCT3940. . Substratul solid a fost reutilizat de cel puţin trei ori în sistem”batch” şi s-a constatat că activitatea celulozolitică cea mai mare a fost obţinută (158 IFPU/g koji) în a doua fermentaţie batch.3x10-4. (NH4)2SO4 2.

amilaze. Aceşti doi factori limitează utilizarea lor în hrana păsărilor şi porcilor. Aspergillus niger. Celuloza a fost redusă semnificativ în toate deşeurile agro de către toţi fungii după 14 zile. Aspergillus niger a prezentat cel mai mare procent de reducere al celulozei datorită creşterii sale mai rapide şi prin urmare abilităţii de a produce mai multe enzime celulozolitice într-o perioadă mai scurtă. necostisitoare şi uşor de adaptat şi utilizarea acestora în hrana păsărilor şi porcilor [14]. Rezultatele acestui studiu au indicat posibilitatea sporirii valorii nutriţionale a acestor bioproduse printr-o tehnică simplă. Aceast proces este realizabil prin utilizarea enzimelor microbiene degradative din fungi. Reducerea procentuală cea mai mare a fost realizată de Aspergillus niger în toate deşeurile agro: 36. Totuşi. Aspergillus flavus si Penicillium sp. Fungii au capacitatea de a produce numeroase enzime. hemicelulaze. prin creşterea procentului de până la 50%. Este absolut necesar să se sporească valoarea nutritivă a acestor bioproduse prin desfacerea polizaharidelor neamidonoase. sector care constituie un mare consumator de furaje comerciale[13]. maximul activităţii pectolitice a fost 250-300 unităţi/gram. pectinaze şi xilanaze. Aceste enzime ajută la degradarea polizaharidelor neamidonoase din substrat până la glucide solubile. catalaze. Resturile de grâu.87% pentru grăunţe uscate şi 35. 35.51% pentru deşeuri de grâu. După 14 zile nivelul zahărului a început să scadă şi nu a mai existat o degradare semnificativă a celulozei. grăunţele uscate şi silozul de porumb sunt bioproduse ale prelucrării porumbului şi grâului având un conţinut scăzut de proteină şi un conţinut ridicat de fibre crude.80% pentru siloz de porumb. deschizând astfel posibilitatea scăderii costului mediului pentru producerea de endopoligalacturonaze. După 14 zile creşterea procentuală cea mai mare în proteină (41%) a fost obţinută din deşeuri de grâu inoculat cu Aspergillus niger. glucide şi celuloză a trei bioproduse agro-industriale prin fermentare în stare solidă cu Aspergillus niger. maximul endopoligalacturonazei a fost de 919 unităţi/gram. . Aspergillus flavus şi Penicillium sp . sunt menţionate ca fiind cele mai bune surse de celulaze. Au fost determinate modificări în proteină.Când pectinele crude au fost folosite ca inductori la aceeasi concentraţie ca pectina purificată. Protenia totală din deşeurile agro-industriale a crescut semnificativ.

.

au fost iniţiate studii privind obţinerea de proteaze acide cu mucegaiuri din genul Aspergillus (A. Preparatele enzimatice obţinute sunt complexe.1% extract de drojdie). pentru ambele tulpini de Aspergillus.C. comparativ cu procedeul de cultivare în sistem SSF. oryzae) prin cultivare în sistem submers sau SSF. facilitând un sistem de purificare al enzimelor relativ simplu. pectinaze. Aspergillus sp. randamentele de obţinere a preparatului enzimatic sunt mai scăzute [10]. Tărâţele de grâu s-au remarcat ca cel mai bun substrat lignocelulozic utilizat pentru producţia de xilanază. conţin pe lângă proteaze şi amilaze (α-amilaza şi glucoamilaza). a produs xilanază cu un nivel scăzut al activităţii celulozolitice. Kamat au studiat influenţa temperaturii de cultivare asupra obţinerii de xilanază (E. concentraţia inocului fiind de 2x107-2x108 spori /5 g substrat. . Alături de tulpina microbiană şi compozţtia mediului de cultură. celulaze. P. 3. Gawande şi M. precum şi gradul de agitare [15]. a fost atins la temperatura de 35°C.8) prin fermentaţie în stare solidă pe diferite substraturi lignocelulozice. printre factorii importanţi care influenţează procesul de biosinteză a enzimelor hidrolitice se numără aeraţia. temperatura şi pH-ul mediului de biosinteză. xilanaze. Caracteristici ale proceselor de fermentatie cu microorganisme producatoare de enzime hidrolitice utilizabile ca aditivi furajeri Începand din anul 1970.V. În cazul culturilor submerse. s-a constatat că maximul producţiei de xilanază. cu 2 tulpini de Aspergillus sp.terreus si A.Capitolul 3. niger 44). dovedintu-şi astfel potenţialul commercial. (A. După terminarea procesului fermentative. A.Y. Luiza Jecu [16] a constatat că fungul Aspergillus niger 38 poate fi cultivat prin fermentaţie în strat solid. Anterior zaharificării. preparatele xilanazice au îndepărtat fracţia hemicelulozică din toate deşeurile lignocelulozice testate. niger.1. cunoscute ca producătoare de xilanază. Mediul optim pentru Aspergillus niger a fost: tărâţe de grâu în proporţie 1:5 cu soluţie minerală Mandels şi Strenberg (conţinând 0. pentru obţinerea celulazelor folosind ca sursă de carbon deşeuri agricole uşor de procurat cum ar fi tărâţele de grâu şi paiele de grâu în diferite proporţii.2.

nu în ultimul rând. la un pH de 4. sau a altor tipuri de proteine[17]. În general. Fiecare specie are definit un anumit interval de pH în care poate creşte. optimă.5 CaCl2xH2O. Influenţa valorii pH-ului asupra dezvoltarii culturilor microbiene poate fi urmarită în două direcţii principale si anume : asupra vitezei de creştere a microorganismelor şi asupra randamentului de conversie a substratului la produsul polienzimatic. care pot avea urmări nedorite asupra procesului de biosinteză. Cu o umiditate de 74% a substratului conţinând paie de grâu/tărâţe de grâu în proporţie de 9/1. 0. alături de temperatură. Valoarea pH-ului este. asupra vitezei de creştere microbiană.80 UI/ml (unităţi internaţionale/ml). Raportul o parte paie de grâu şi nouă pări tărâţe de grau a prezentat cea mai bună activitate. pH-ul optim de dezvoltare este cuprins între 4.Mediul de cultură (g/l) a avut urmatoarea compoziţie: 10 (NH 4)2SO4. În timpul dezvoltării unei culturi microbiene apar deviaţii ale pH-ului de la valoarea considerată optimă. Temperatura este un factor care acţionează în mod direct asupra microorganismului viu. în care cele mai multe specii de bacterii nu se dezvoltă. . Temperaturile ridicate pot dăuna microorganismelor prin denaturarea enzimelor. Formarea produsului dorit în urma procesului poate să fie legată de desfaşurarea bioprocesului într-un domeniu foarte strict de pH..5. Temperatura mediului în care are loc procesul de biosinteză a enzimelor hidrolitice este un factor extrem de important pentru activitatea microorganismelor. microorganismele au un domeniu optim de pH pentru dezvoltare. Aceste modificări se pot datora fie consumării unui nutrient. Fungii prezintă avantajul de a creşte convenabil în medii de cultură acide. si 0. asupra cerinţelor nutritive ale microorganismului şi compoziţiei biomasei obţinute şi. fie producerii unui acid organic de către microorganism.5-6.5-5. un parametru important în procesele de biosinteză. Pentru corectarea pH-ului la valoarea prescrisă se folosesc diverse substanţe chimice (acizi sau baze)[18].5. a proteinelor transportatoare. s-a obţinut o activitate endonucleazică de 14.5 MgSO4x7H2O. Tărâţele de grâu şi paiele de grâu s-au folosit în proporţii diferite (de la 9:1 la 1:9). în care viteza specifică de creştere atinge valoarea maximă. În cazul fungilor. Variaţiile de temperatură au efect asupra randamentului de transformare a substratului în produsul finit. precum şi un pH optim de dezvoltare.. 3 KH2PO4.

.

Trichoderma viride CBGM-405.5g .1 Tulpini de lucru În vederea obţinerii unui complex enzimatic hidrolitic (amilaze.2. Obţinerea culturilor de intreţinere 4.2. xilanaze) s-au utilizat tulpini de fungi din Colectia de Microorganisme a Facultatii de Biotehnologii – USAMV Bucureşti si din Colecţia de Microorganisme a Facultăţii de Biologie a Universităţii Bucureşti. celulaze. 1.3. Aspergillus niger CMGB-405 au fost activate prin treceri succesive pe mediu înclinat Czapek-Dox simplu şi pe mediul Czapek-Dox .Universitatea Bucureşti Facultatea de Biologie .PARTEA A II A CERCETĂRI EXPERIMENTALE Capitolul 4. tulpinile de Aspergillus niger CBM-1. Materiale şi metode 4. NaNO3.Universitatea Bucureşti 4.0g . . proteaze.30. MgSO4. Sursa Facultatea de Biotehnologii – USAMV Bucureşti Facultatea de Biologie . prezentate in continuare: Denumire tulpină Aspergillus niger CBM-1 Aspergillus niger CMGB-401 Trichoderma viride CMGB-405 .0g . Mediul Czapek-Dox (g/l) : zaharoză.1. Medii de întreţinere Înainte de utilizare.0.extract de malţ.

0g . După această perioadă sporii se pot utiliza imediat sau se pot conserva la frigider la +4ºC. Agar. precum şi puritatea acesteia. obţinându-se o suspensie de spori[19].4 corectat cu NaOH 40%. se raclează foarte bine pentru desprinderea sporilor. După preparare. K2HPO4-1.extract de malţ (g/l) : de 30 de minute. Au fost testate mai multe medii de cultura având următoarele compoziţii: . Apă distilată-1000ml. mediul s-a repartizat în eprubete şi s-a sterilizat la 110ºC timp 2.3. lucrările s-au axat pe studiul diferitelor medii de cultură în vederea stabilirii unui mediu optim pentru dezvoltarea microorganismului selecţionat şi pentru biosinteza enzimelor hidrolitice precum şi pe stabilirea parametrilor de bioproces optimi. 4. Eprubetele cu mediu însamanţat s-au incubat la 28-30ºC timp de 7 zile.2. Cultivarea în laborator şi testarea activităţii hidrolitice La nivel de laborator. Extract de malţ 20.2.01g . eprubetele s-au examinat privind gradul de sporulare al culturii.0. acesta s-a însămânţat cu o suspensie de spori în apă distilată.0. La sfarşitul perioadei de incubare. Tuburile corespunzătoare au constituit cultura de întreţinere.- KCl.2.0 g . pH-ul mediului fiind de 6. 4. Mediul Czapek-Dox. Componentele mediului Czapek-Dox.0g . Pentru obţinerea inoculului pe mediu solid s-a folosit următoarea tehnică de lucru : peste cultura de întreţinere bine sporulată s-a pipetat 5ml apă distilată sterilă.5g FeSO4. Conservul vegetativ După verificarea sterilităţii mediului prin menţinerea sa la termostat la 37ºC. timp de 48 ore.

01% Mediu 3 (g/100ml) Amidon solubil -1% Peptonă-0.5% Extract drojdie -0.Mediu 1 (g/100ml) Făină de soia -2% Amidon solubil-1% Tărâţe de greu-0. Pentru urmărirea bioprocesului. mediile de cultură sterilizate şi răcite la 35ºC. la intervale de 24 ore s-au determinat următorii parametri: . Incubarea s-a făcut la termostat la 28-30ºC.0.5% CaCl2-0. s-au însă mânţat cu o cultură de inocul sub formă de suspensie de spori obţinută din cultura de întreţinere.5 ml suspensie pentru 50 ml mediu.5% MgSO4x7H2O.01% Mediu 2 (g/100ml) Amidon solubil-2% Făină de soia -0.5% CaCl2-0.1% Mediu 4 (g/100ml) Făină de porumb-2% Făină de soia -3% (NH4)2HPO4-0.1% MgSO4x7H2O-0.02% CaCl2-0.1% MgSO4x7H2O-0.1% MgSO4x7H2O -0.1% După preparare.1% KH2PO4-0.5% KH2PO4 -2. Cultivarea s-a efectuat 72 ore la baloane agitate(220 rpm) cu 50 ml mediu de cultura/balon.05% CaCl2-0.5% KH2PO4 -0. Raportul de însamanţare este de 0.

4. activitatea enzimatică a mediului . Se adaugă 400ml soluţie NaOH 1N şi 300g tartrat de sodiu şi potasiu. Conform acestei metode o unitate amilazică corespunde unui mmol de maltoză eliberat de 1g preparat enzimatic într-un minut la 30ºC. Soluţie etalon de maltoză . Valoarea de pH se verifică cu pH-metrul.58g NaCl se dizolvă şi se aduc la 1 litru soluţie cu apă distilată. cu formare de acid nitroaminosalicilic de culoare roşie-portocalie. Reactiv acid dinitrosalicilic (DNS). Soluţie amidon 1% in solutie tampon(1) . Determinarea activităţilor enzimatice 4. 4.- pH-ul mediului de cultura.Ph=6. dezvoltarea macroscopică si microscopică a tulpinii de la care s-a pornit.2.9 si la temperatura de 30ºC.C.72g KH2PO4 + 0.1. 2. Se aduce la semn într-un balon cotat de 1 litru. 10g acid dinitrosalicilic se dizolvă la cald în aproximativ 300ml apă distilată. Hidrolizatul format în special din maltoză reactionează. 3. 7. Reactivi necesari : 1.16g Na2HPO4 x 12 H2O + 2. datorită grupărilor reducătoare semiacetalice.2M. măsurată colorimetric. 4.3.5dinitrosalicilic. . Determinarea activităţii α-amilazice (E.1) Pentru dozarea activiăţii α -amilazei produsă de fungi s-a aplicat metoda descrisă de Hostettler şi colaboratorii [20] metodă care se bazează pe hidroliza enzimatică a amidonului la pH=6. Soluţie tampon fosfat 0. este proporţională cu activitatea enzimatică. cu maximum de adsorbţie la 546nm. Concentraţia de acid diaminosalicilic format.4.1. cu acidul 3.9 .

3 0.5 0. apoi se tine în baie de apă la fierbere 5 minute. înainte de începerea reacţiei enzimatice.4 0. 5.2 1.24 4.1 1.96 11. Soluţie probă de determinat.2g maltoză monohidrat (0. Tabelul 3.9 0. astfel încât să conţină 0. Proba se dizolvă cu CaCl2. Reprezentarea schematică a modului de lucru pentru dozarea activităţii .48 6.8 1. soluţie maltoză (ml) 0.19g maltoză anhidră) se dizolvă în apă îtr-un balon cotat de 100ml. apă distilată (ml) 2.6 2. Se răcesc şi se diluează pana la 12 ml cu apă distilată.72 8.1 Conc. Datele oţinute se trec într-un grafic pentru construirea curbei de etalonare.5-1. Se citeşte densitatea optică la 546nm dupa 20 de minute.0.0 Vol. maltoză (µmoli) 2. Prepararea diluţiilor de maltoză Număr eprubetă 1 2 3 4 5 6 Vol.7 1. Modul de lucru este prezentat schematic în tabelul 2. Pe abcisă se trec valorile reprezentând densitatea optică citită la spectrofotometru corespunzătoare concentraţiei de maltoză înscrisă pe ordonată.2 În fiecare eprubetă se adaugă 2ml DNS. Mod de lucru Construirea curbei de etalonare Din soluţia etalon de maltoză(4) se pipetează în 6 eprubete după cum urmează : Tabelul 2. Dozarea activităţii enzimatice Paralel cu proba de analizat se face o probă martor pentru a determina concentraţia de maltoză existentă în probă.5 unităţi DNS.

acid citric 0.α-amilazice Proba de analizat Proba martor 0. Metoda se bazează pe dozarea glucidelor reducătoare eliberate de enzimă în urma acţiunii asupra substratului respectiv carboximetil celuloza (CMC). Reactivi şi soluţii: 1. .4. Soluţie tampon Na2HPO4. Diluare până la 12ml cu apă distilată Citirea valorilor absorbanţei la spectrofotometru la 546 nm Calculul rezultatelor Activitatea enzimatică se calculează şi se exprimă după formula : Unităţi DNS/ml = mxD/vx10 unde : m = µmoli de maltoză. D = factorul de diluţie al probei luate în lucru . Răcire. pH=6. Determinarea activităţii celulazice Principiul metodei Determinarea activităţii celulozolitice se efectuează dupa metoda descrisă de Petterson şi Porath [21].5ml proba Incubare 10 minute la 30ºC 2ml DNS Incubare 5 minute pe baie de apă.4 . 10 = timpul de incubare (minute). V = volumul (ml) de soluţie probă luată în lucru .2.5ml soluţie tampon(1) 0. 4.5ml soluţie tampon(1) 1ml soluţie amidon 1%(2) 1ml soluţie amidon 1% (2) 0.1N. determinaţi din curba de etalonare ca fiind diferenţa dintre µmoli de maltoză din probă şi µmoli de maltoză din martor .5ml proba 2ml DNS(3) -agitare –agitare 0.

care dă cu reactivul DNS acea densitate optică ca 1mg glucoză.mg glucoză martor) x5 x1/10 = U/ml/min/50ºC Unitatea de activitate Cx este acea cantitate de enzimă care în condiţiile metodei eliberează dintr-o solţtie de CM-celuloză o cantitate de glucide reducător. Se dizolvă în 1 litru NaOH 2%.5 dinitrosalicilic. 5.2. apa distilată (ml) Cant. Se citesc extincţiile probelor la 640 nm şi se trasează un grafic. Preparat enzimatic cu activitate celulazică . Martorii sunt şi ei colorimetraţi la 640 Vol. 0. 3.2 ml preparat enzimatic (3).1% preaparată proaspăt în apă distilată. este incubat 10 minute la temperatura de 50ºC. Amestecul de reacţie. soluţia se aduce la 2 litri cu apă distilată. notând pe abcisă extincţia citită la spectrofotometru. răcite şi colorimetrate faţă de apa distilată. în care dozăm glucidele reducătoare preexistente în amestecul de reacţie prin introducerea reactivului nm faţă de apa distilată. 4g fenol proaspat distilat. soluţie 5 (ml) Vol. 1g carboximetil celuloza se dizolvă în 100ml tampon(1) . Calculul rezultatelor Valorile densităţii optice măsurate la spectrofotometru pentru probe şi martori se transformă cu ajutorul curbei etalon în mg glucoză. ce constă din 2ml soluţie de substrat (2). răcite şi colorimetrate la 640 nm faţă de apa distilată. după care reacţia enzimatică este stopată cu 3 ml rectiv DNS. Soluţie CMC 1%. (mg glucoză probă. Tabelul 4. Reactiv DNS (20g acid 3. 1g sulfit de sodiu. Fiecare probă este însoţită de un martor. Prepararea diluţiilor de glucoză DNS înaintea preparatului enzimatic cu activitatea celulozolitică.0% (5) se fac o serie de diluţii în apa distilată. Probele sunt incubate 15 minute pe o baie de apă la fierbere. iar pe ordonată mg glucoză. 400g tartrat de sodiu şi potasiu). Probele sunt incubate apoi 15 minute pe o baie de apă la fierbiere. Construcţia curbei de etalonare Din soluţia de glucoză 1. la care se adaugă reactiv DNS (câte 3 ml DNS/eprubeta cu diluţie). 4. Solţtie glucoză 0. Glucoză (mg) .

şi se aduce la 100ml cu apa . Soluţie HCl 0.8 0.06N-0.6 0.9 1. pH=7.2M + 61. 6. adăugat în picături sub continuă agitare.0 (39. Tampon fosfat 0. Soluţie acid tricloracetic 5% . Soluţie caseină 1%.4 0.2 0.6 0.3 0.9 1.3.0 ml soluţie Na2HPO4 0. Principiul metodei Enzimele proteolitice catalizează hidroliza caseinei permiţând formarea unor compuşi solubili în acid tricloracetic.5 1.4 0. 3. 5.0 1. Determinarea activităţii proteazice Activitatea proteolitică se determină după metoda Anson modificată [22] pe substrat de cazeină.3 0. 2.3 1. este determinată spectrofotometric cu reactivul Folin-Ciocâlteu.4 1.8 1.2N) .19 mg de tirozină în 1000ml HCl soluţie 0.1 2. Soluţie de L.0 ml NaH2PO4 0.2 0. 1g de caseină se dizolvă pe un agitator magnetic în cca 30 ml NaOH 1N.2N .9 1.8 0.0 4.5 0.1 0. Reactivi şi soluţii: 1. Soluţie NaOH 0.6 1. Se neutralizează cu H3PO4 10%.tirozină 1mM ( se dizolvă 181. Conţinutul în triozina şi triptofan . din aceşti compuşi.01N-0.2 0.5N .1 0.0.7 0. Reactiv Folin-Ciocâlteu (se dizolvă 10 g Na2 WO4 x 2H2O + 2. 7.4. 4.5g Na2MoO4 x 2 H2O + 15 g Li2SO4 + 10 ml HCl + 5ml H3PO4 conc.0 2.2 M .5 0. Se aduce la pH-ul dorit şi se completează cu tampon fosfat (pH= 7în cazul proteazelor neutre).7 0.2M) .7 1.

80 1.92 1.450 0.32 0. Înainte de utilizare se diluează o parte din această soluţie cu două părţi apă distilată . 8.2N.55 0.043 0. 1 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 11 L-Tyr (ml) 2 0 0. menţionate în tabelul 4.5ml filtrat se adaugă 0. Obţinerea diluţiilor de L-tirozina Eprubeta nr.76 1.5 N şi reactiv Folin – Ciocâlteu diluat 1 :2.5 ml HCl 0.2 M (pH=7) se incubează la 37º C timp de 10 minute. NaOH 0. Mod de lucru Amestecul de reacţie format din 0.68 1.2 Extinctia 7 0.22 0. Amestecul de reacţie se menţine 30 minute la temperatura camerei şi apoi se filtrează.08 0.29 0.32 0.5ml soluţie enzimatică (mediu de cultură separat de biomasă) şi 1 ml solţtie caseină 1% în tampon fosfat 0. În continuare se lucrează identic ca la proba de determinat. în condiţii de agitare puternică.20 0.26 0.16 0.72 1.2 1.2 1. cu excepţia că în amestecul de reacţie se introduce acid tricloracetic imediat peste soluţia de caseină.12 0. La 0.88 1.16 0.04 0.24 0.2 N.2 1.2 1.84 1.20 0.28 0.40 L-Tyr (µmoli) 3 0 0. Se lasă 30 minute la temperatura camerei şi se măsoară extincţia la 578nm faţă de martor.distilată ).2N(ml) 4 2.32 0. Tabelul 5. La proba martor se lucrează asemănător . Reacţia enzimatică se stopează cu 2 ml acid tricloracetic 5%. 2ml NaOH 0.2 1.2 1. Soluţie enzimatică.08 0.04 0. după care.375 0.12 0.34 0.2 1.00 1.64 1. se introduce reactivul Folin-Ciocâlteu.60 NaOH 0.28 0.5N.26 0.24 0.96 1.125 0.475 .2 1.2 1. Construirea curbei etalon Se pipetează în 11 eprubete volumele de tirozină. HCl 0. se lasă în repaus 30 minute la temperatura camerei şi apoi se introduce soluţia enzimatică.2 1.082 0.40 HCl 0.5N(ml) 5 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 F-C (ml) 6 1.

micromoli Tyr martor) x 3.Se lasă la temperatura camerei 30 minute. Valorile citite pe grafic vor fi introduse în următoarea formulă: (micromoli Tyr proba. Tampon acetat de sodiu 0.apoi se citeşte extincţia la spectrafotomertu Spekol la 578 nm .05M. Principiul metodei Xilanaza catalizează hidroliza iar zaharurile reducătoare formate (xiloza) sunt determinate spectrofotometric cu reactiv DNS la 540 nm.volumul de lichid filtrat luat în lucru .5/10 x 0.4. Reactiv DNS (se dizolvă 10 g acid 3.4.volum total amestec .5 = micromoli Tyr/ml/min unde: 3. 0. Mod de lucru .3 2. 1/10.5.volumul de lichid cu activitate proteolitică luată în lucru .factorul de transformare pentru un minut de reacţie enzimatică . având la bază metoda ‘clasică’ a lui Miller ce foloseşte reactiv DNS [23]. se adaugă 400ml NaOH 1N şi 300g tartrat de sodiu şi potasiu şi se aduce la 1 litru). 0.5. Se construieşte un grafic cu extincţia citită la 578 nm pe ordonată şi µmoli L-tyr pe abcisă. pH 5.0025 M în apă distilată 4.5 x 0. Calculul rezultatelor Din curba de etalonare se determină µmoli tirozină corespunzători extincţiei măsurate.6% în tampon acetat 3.5. 4. Soluţie enzimatică în tampon acetat.5 dinitrosalicilic în 300 ml apă distilată. O unitate de activitate proteazică este definită ca fiind cantitatea de enzimă care în condiţiile de reacţie indicate eliberează 1µmol tirozină pe minut. Soluţie de D-xiloza 0. Reactivi şi soluţii: 1. faţă de apa distilată. Determinarea activităţii xilanazice Activitatea xilanazică s-a determinat printr-o metodă combinată. Soluţie xilan (Fluka) 0. 5.

Reacţia enzimatică se stopează cu 1 ml reactiv DNS. . după care se introduc 0. timp de 30 de minute. ce se incubează pe baie de apă la 40ºC. Construirea curbei etalon Se pipetează în 11 eprubete volumele de soluţie de xiloză menţionate în tabelul 5. La proba martor se lucrează asemănător.5 ml soluţie enzimatică şi 0. În continuare se lucrează identic ca la proba de determinat.3). Amestecul de reacţie se fierbe 5 minute pe baie de apă. La fiecare probă se face şi un martor. cu excepţia că în amestecul de reacţie se introduce reactivul DNS imediat peste soluţia de substrat şi apoi se introduce soluţia enzimatică.5 ml substrat (soluţie xilan) şi 1 ml reactiv DNS.În eprubetele prevăzute cu dop se introduce amestecul de reacţie format din 0. se aduce la 5 ml cu apă distilată şi se măsoară extincţia la 540 nm faţă de apa distilată.6% în tampon acetat (pH=5.5ml soluţie substrat (xilan 0.

Se construieşte un grafic cu extincţia citită la 540 nm pe ordonată şi nmoli Dxiloza pe abcisă.1491 0.05 0.1208 0.0 1.5 0. faţă de apa distilată.10 0.30 0.3285 Se adaugă 3 ml apă distilată şi se lasă la temperatura camerei pentru răcirea eprubetelor.05 0.15 0.5 DNS (ml) 1.00 Xilan (ml) 0.0 1.40 0.5 0.5 0.5 0.2843 0.20 0.5 0.5 0.5 0.0 1.10 0.5 0.15 0.5 0.0 Extincţia 0.0438 0.0 1.30 0.40 0.0 1.45 0.35 0.0631 0.2351 0.0 1.0 1.5 0.35 0.1800 0.Tabelul 6.45 0.039 0. conform diagramei următoare : Figura 5.25 0.20 0. Obţinerea diluţiilor de D-xiloza Eprubeta nr.2200 0.5 0. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 D-Xiloza (ml) 0 0.25 0.50 D-Xiloza (nmoli) 0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 Apa (ml) 0. apoi se citeşte extincţia la spectrofotometru JASCO la 540 nm .0 1.1004 0.0 1. Curba etalon de xiloză .0 1.

întocmirea documentaţiei de realizare a furajului. a schemei şi a procedurii de evaluare a conformităţii [24]. Figura 6. Tineret porcin din loturile experimentale . evaluarea efectelor tehnico-economice.5. Testarea produsului enzimatic în hrana animalelor de fermă Testarea produsului enzimatic în hrana animalelor de fermă a implicat stabilirea dozei optime. Valorile citite pe grafic vor fi introduse in urmatoarea formula: (nmoli xiloza probă – nmoli xiloza martor) x 1/30= U/ml/min unde 1/30.Calculul rezultatelor Din curba de etalonare se determină nmoli xiloza corespunzători extincţiei măsurate.factorul de transformare pentru un minut de reacţie enzimatică . O unitate de activitate xilanazică este definită ca fiind cantitatea de enzimă care în condiţiile de reacţie indicate eliberează 1nmol xiloza/ml/minut la 40ºC. 4.

Caracterizarea activităţii enzimatice a preparatului enzimatic Specificaţie Amilolitică Proteolitică Celulozolitică Xilanazica Activitate 105. a fost verificat în cadrul unui biotest pe tineret porcin. Doza de includere în structura reţetei de nutreţ combinat a fost de 2 respectiv 5 kg / tona de nutreţ combinat.36UDNS/g 1. Durata experimentului a fost de 18 zile. Tabelul 7. variabila constituind-o cantitatea de enzima inclusă în premixul vitamino-mineral într-o pondere diferită la cele două loturi experimentale (E1-2 kg /to de NC.35 U/g 3. Testul biologic s-a derulat pe un număr de 54 purcei din rasa Marele Alb conform schemei experimentale din tabelul 8.95 U/g În scopul cuantificării efectului administrării preparatului enzimatic în hrana animalelor s-au format trei loturi omogene şi s-au elaborat noi soluţii nutriţionale.01 UP/g 1.5 kg/ to de . Schema experimentală Specificaţie Număr de animale (cap) Durata experimentului (zile) Variabila (cantitatea de preparat enzimatic) Kg / tona de NC* *NC. cu înregistrarea zilnică a consumului de nutreţ combinat. loturile experimentale şi observaţiile fiind realizate în condiţiile de fermă la IBNA Baloteşti. Preparatul enzimatic s-a obţinut din culturi de Aspergillus niger şi reprezintă un amestec de enzime cu activitate amilolitică.nutreţ combinat M 18 18 - LOT E1 18 18 2 E2 18 18 5 A fost utilizată o receptură de nutreţ combinat unică pentru cele trei loturi. celulozolitică şi xilanayică (tabelul 7).Produsul enzimatic realizat în urma cercetărilor abordate în cadrul proiectului. E2. Animalele au fost cântărite la începutul şi sfârşitul experimentului. proteolitică. Tabelul 8.

90 LOT E1 28.20 0.10 1.10 1.20 0.62 3320 13.90 1.20 0.90 E2 27. Ca ingrediente cerealiere s-a utilizat grâul (acesta fiind caracterizat printr-un conţinut ridicat xilani şi arabinoxilani).70 1.00 4.20 21. Tabelul 9.10 0.10 0.00 15.10 0.49 0.50 0.00 0.90 1.70 1.50 0.00 0.70 1.00 8.00 10.00 0.89 1.50 0. Structura recepturilor de nutreţ combinat şi indicii calitativi ai acestora pentru purcei Ingrediente % Porumb Grâu Şrot soia Full fat soia Lapte praf Făină peşte Lizină Metionină Premix colină Fosfat monocalcic Carbonat de calciu Sare Premix vitamino-mineral P1 Enzimă Proteină brută (%) Energie metabolizabilă Kcal Mj/kg NC Lizină (%) Metionină + cistină (%) Calciu (%) Fosfor (%) M 28.10 0.00 15.00 10.89 1.62 3320 13.00 15.62 3320 13.10 1.00 0.00 8.10 1. în vederea unei mai bune echilibrări energetice a reţetei.50 21.00 Indici calitativi 21.31 30.90 .10 0.89 1.00 4.10 0.21 30. ponderea de includere fiind de 30% şi porumbul.00 8.49 0.NC) (tabelul 8).00 4.90 1.10 1.81 30.00 0.00 10.49 0.10 1.

Caracterizarea activităţii enzimatice a produsului KEMZYME®VP DRY 3.C 3. celulaze (E.28).C 3. Rezultate şi discuţii 5.2. Tulpina de Trichoderma viride nu s-a dezvoltat pe mediul Czapek-Dox simplu [25].50 Activitate amilolitică UDNS/g 620 Activitate proteolitică U/g 1. un complex multienzimatic destinat a fi utilizat în reţetele de hrană care conţin un nivel ridicat de cereale şi proteine vegetale (şrot de soia). KEMZYME®VP DRY Activitatea celulozolitică (C1-Cx) U/g 2. Conţine surse stabilizate de endo-1.8).C 3. Astfel.4.1. Activitate secundară: lipaza [25] Tabelul 10.4-beta-xilanaze (E. alfa-amilaze (E.1.1. la temperatura optimă de dezvoltare (28ºC).C 3.24.C şi endo-1. după 7 zile.1). Compoziţia mediilor pentru cultura de întreţinere În urma testării celor doua medii menţionate în capitolul 4 s-a constatat că mediul cu extract de malţ oferă cele mai bune condiţii pentru obţinerea culturilor de întreţinere pentru toate tulpinile testate. bacilolizin (proteaze) (E.Capitolul 5. alb pufos şi un miceliu aerian purtător de conidiofori coloraţi în negru intens.12 .4).2. produsul KEMZYME®VP DRY.1. Acesta permite obţinerea unor performanţe deosebite chiar în condiţiile excluderii din alimentaţie a surselor proteice de origine animală. Miceliul este uniform. ca termen de comparaţie. sporulat pe toată suprafata. pe pe suprafata acestui mediu.3-beta-glucanaze (E.2 Analiza comparativă a biosintezei enzimelor hidrolitice cu tulpini Aspergillus niger şi Trichoderma viride pe diferite medii Pentru a evalua nivelul de biosinteză a enzimelor componente ale complexului studiat s-a utilizat.2. 5.6). se formează un miceliu bogat.1.2.

= 40 UDNS/ml). cele mai bune rezultate obtinându-se pe mediul de cultură M3.E. 1. care s-a caracterizat din punct de vedere al activităţii enzimatice.18 UC1-Cx/ml) şi la 72 de ore (activitatea amilolitică A. rezultate bune oţinându-se la 48 de ore pe mediul de cultură M4 (activitatea celulozolitică A. Mediul de cultură final de fermentaţie s-a prelucrat integral prin absorbţie pe carbonat de calciu tehnic. activitatea celulozolitică fiind considerată satisfăcătoare. Din tabelul 13 se observă că tulpina Trichoderma viridae prezintă cea mai bună activitate amilolitică (cuprinsă între 30-46 UDNS/ml). De asemenea s-a constatat ca maximum de activitate amilolitică şi proteolitică s-a obţinut la 48 ore : 12. se observă că tulpina Aspergillus niger CMGB-401 aflată în colecţia Facultăţii de Biologie.Din tabelul 11 se observă că tulpina de Aspergillus niger CBM-1 are activitate proteolitică şi amilolitică. dar activitatea celulozolitică este de aproximativ de 10 ori mai mică. Întrucât se urmăreşte obţinerea unui produs cu activitate amilolitică şi celulozolitică s-a ajuns la concluzia ca cea mai potrivită tulpină pentru scopurile noastre este tulpina de Aspergillus niger CMGB-401 pe mediul de cultură M4.= 1.11 Variaţia activităţii enzimatice hidrolitice pe parcursul biosintezei enzimelor cu tulpina de Aspergillus niger CBM-1 per As Me 24 ore 48 ore 72 ore . Tabelul nr.3 UDNS/ml.E. Universitatea Bucureşti este producătoare de enzime amilolitice şi celulozolitice. s-a uscat în curent de aer timp de 2 ore la 40ºC şi s-au obţinut 10g produs. această tulpină a fost luată în considerare în experimentele ulterioare fără a fi considerată cea mai bună. Produsul enzimatic solid obţinut cu tulpina de Aspergillus niger CBM-1 prezintă următoarele activităţi enzimatice: Din tabelul 12. În tabelul 14 sunt redate valorile activităţii xilanazice pe probe obţinute prin cultivarea timp de 72 de ore a tulpinilor de Aspergillus niger şi Trichoderma viridae pe două variante de mediu: M1 (Aspergillus niger CBM-1 şi Trichoderma viridae CMGB401 uscate pe pat de carbonat de calciu) şi M4 (Aspergillus niger CMGB-401-cultura finală lichidă).44 UP/ml.

02 0.E proteolitică UP/ml pH A.01 6 7 11 5 0.E proteolitică UP/ml 1 2 3 4 6.0 6.39 0.52 1.15 31.4 46.5 0.6 28 16 13 1.E celulozolitic ă (C1-Cx) U/ml A.5 6.E celulozolitică (C1-Cx) U/ml A.07 8.7 5.8 0.12 0.E celulozolitică (C1-Cx) U/ml A.12 0.E amilolitică UDNS/ml A.49 0.4 6.E celulozoliti că (C1-Cx) U/ml 48 ore A.0 5.1 9.15 0.49 0.5 5.01 0.5 0.2 0.0 5.8 0.80 0.90 2 3.44 5.5 0.10 0.9 0.5 3. 12 Variaţia activităţii enzimatice hidrolitice pe parcursul biosintezei enzimelor cu tulpina de Aspergillus niger CMGB-401 Mediul Aspergillus niger CMGB-401 24 ore pH A.75 40.0375 0.02 0.07 0.5 0.08 0.16 0.E amilolitică UDNS/ml A.E proteolitică UP/ml pH A.14 6.0 6.0 0.4 5.5 5.8 34.E amilolitică UDNS/ml A.0 6.19 0.5 5.28 0.7 5.04 0.2 4.E celulozolitică (C1-Cx) U/ml A.28 0.01 0.5 5.13 Variaţia activităţii enzimatice hidrolitice pe parcursul biosintezei enzimelor cu tuplina de Trichoderma viride CMGB-405 Mediul 24 ore 48 ore 72 ore pH A.11 0.26 0.02 0.0 0.32 1.5 5.93 0.E celulozolitică (C1-Cx) U/ml A.E amilolitică UDNS/ml A.2 8.0 9.E celulozolitică (C1-Cx) U/ml A.0 5.40 0.5 5.6 3.4 18.2 0.15 0.E proteolitică UP/ml pH A.0 0.095 0.30 0.20 7.02 0.E proteolitică UP/ml pH A.E celulozolitică (C1-Cx) U/ml A.E proteolitică UP/ml 1 2 3 4 6.1 16 26 36 40 0.E celulozolitică (C1-Cx) U/ml 72 ore A.gillus niger CBM-1 diul pH A.09 0.14 0.50 0.22 0.025 8 9.5 0.5 0.03 0.4 5.17 .18 0.0 6.0 5.8 0.5 5.25 0.0 5.1 6.4 6.30 Trichoderma viride CMGB-405 Tabelul nr.20 0.4 12.E proteolitică UP/ml pH A.84 Tabelul nr.057 0.187 0.4 0.0 6.7 13.0 6.E amilolitică UDNS/ml A.21 6.67 0.E amilolitică UDNS/ml A.4 0.E amilolitică UDNS/ml A.2 0.0 5.E amilolitică UDNS/ml A.10 0.18 13.5 5.15 0.E proteolitică UP/ml pH A.14 0.5 5.E proteolitică UP/ml 1 2 3 4 6.95 0.3 5.3 6.5 5.12 0.6 25.11 6.44 0.44 0.5 0.4 1.E amilolitică UDNS/ml A.74 1.

84 UC1-Cx/g). totuşi cele mai bune rezultate s-au obţinut prin cultivarea tulpinii Aspergillus niger CMGB-401 la temperatura de 28°C (activitatea amilolitică 124. Variaţia activităţilor enzimatice în funcţie de temperatura de cultivare pe mediul de cultură M4 dupa 48 ore şi dupa condiţionare Temp.Tabelul nr.2168 0.31 (U/g) 2.0957/0.29 (U/g) 1. 122.03 (U/ml) 1. 28°C 32°C 37°C 28°C 32°C 37°C Activitatea amilolitică Activitatea Proteolitică Activitatea celulozolitică (C1-Cx) 124.69 (U/ml) 82. Temperatura optimă de cultivare Temperatura optimă de cultivare a tulpinii de Aspergillus niger CMGB-401 pe mediul de cultură (M4-făină de soia) s-a urmărit determinând activitatea enzimatică la diferite temperaturi (28°C.43 (U/ml) 1.1275/0. 32°C.64 (U/g) 84.0512 0. .82 (U/ml) 104.84 (U/ml) PRODUS CONDIŢIONAT-prin adsorbţie pe CaCO3.71 (U/g) 99.1445/0. activitatea celulozolitică 1. activitatea proteolitică 2. Rezultatele obţinute sunt prezentate în tabelul 15.0485 0.98 (U/g) 1. Tabel 15. 1 2 3 4 Proba Cantitate (g) 0.0635 Activitate xilanazica(U/g) 106 390 280 580 85 330 U/ml PH Timp (ore) Varianta mediu KEMZYME®VP DRY Aspergillus niger CBM-1 Trichoderma viride CMGB-405 Aspergillus niger CMGB-401 6.72 (U/g) 1. activitatea celulozolitică 2.8 UDNS/g.4 (U/g) 2.7 5. activitatea proteolitică 1. 14 Determinarea activităţii xilanazice Nr.3.27 (U/ml) 2.0714 0.5 72 72 72 M1 M1 M4 5.5061/0.0590 0.8 (U/ml) 1.08 (U/ml) 2.37 (U/g) Din tabelul 15 şi figura 7 se observă că deşi cultura are activităţi enzimatice şi la 37°C (activitatea amilolitică 82.1259 1 ml ml tampon 5 5 3 1 X4 diluţia X 10 Extincţia 540 nm 0.08 UDNS/g.43 UP/g.6 (U/g) 1.0 5.88 (U/ml) 2.27 UP/g. 37°C). crt.82 UC1-Cx/g).

Tabelul 16.33 1269.08 104.69 1.84 28°C 32°C 37°C Temperatura Figura 7.4749/0. iar la 370C activitatea scade de cca 4 ori.66 Concluzia este că varianta optimă de cultivare a tulpinii Aspergillus niger CMGB401 este cea realizată la temperatura de 28°C. că şi activitatea xilanazică este optimă la 22 -280C.0941 0.Din tabelul 16 se observă.03 1.88 82. dupa 48 ore . Efectul temperaturii de cultivare a tulpinii Aspergillus niger CMGB-401 pe mediul de cultura (M4-faina de soia) asupra activitatii enzimatice.82 2.27 2.1978/0.43 1.4749/0.0941 0. tampon (ml) 2 2 2 Diluţia X5 X5 X5 Extincţia (540 nm) 0. de asemenea. Activitate a enzimatică (U/ml) Activitatea amilolitică(UDNS/ml) 140 120 100 80 60 40 20 0 124.33 345. Variaţia activităţii xilanazice în funcţie de temperatura de cultivare a mediului de cultură (M4-făină de soia) dupa 48 de ore Temperatura 220C 280C 370C Cantitate probă (ml) 2 2 2 Sol.8 Activitatea proteolitică(U/g) Activitatea celulozolitică(UDNS/g) 2.0941 Activitate xilanazică (U/ml) 1269.

Culturile au fost agitate cu ajutorul unui agitator rotativ la 220 rpm timp de 48 de ore.6 (U/ml) 1. mediile de cultură au fost condiţionate integral.5.15 (U/ml) 76.36 (U/g) 1.7 (U/g) 1.28 (U/g) 77.5 5. Ulterior.5 7. pH-ul mediului de cultură – sarja 2 (M4-mediu de cultura cu făină de soia) a variat astfel: Varianta 1: pH mediului de cultură=5. pe când pentru celelalte variante (2 şi 3) pH-ul mediilor de cultură a scazut de la 6. Varianta 2: pH mediului de cultură =6.5.01 (U/g) 1. s-a constatat că pH-ul mediului de cultură în cazul primei variante a rămas constant 5-5.15 (U/ml) 1.3 Alegerea pH-ului optim de cultivare Experimentele s-au realizat în pahare Erlenmayer cu capacitatea de 250 ml şi 500 ml care conţin 100 ml mediu cu făină de soia respectiv. 250 ml mediu cu tărâţe de grâu.66 (U/ml) PRODUS CONDIŢIONAT-prin adsorbţie pe CaCO3.4 (U/g) 0. Variaţia activităţilor enzimatice în funcţie de pH-ul mediului de cultură (M4) după 48 ore de fermentaţie şi după condţionare pH 5.8 (U/ml) 1.95 (U/ml) 2.29 (U/ml) 2. 105.5.08 (U/g) 1.91 (U/ml) 108 (U/ml) 1.0 Tabelul 17. .5.31 (U/g) După 48 ore.5-7.5 Activitatea amilolitică Activitatea proteolitică Activitatea celulozolitică (C1-Cx) 141. Varianta 3: pH mediului de cultură =7.5.35 (U/g) 96 (U/g) 1.5 la 5-5.5 6.5 6.5 7.

5 7. dupa 48 ore Din datele prezentate în tabelul 17 şi figura 8 s-a poate observa că tulpina de Aspergillus niger CMGB-401 prezintă cele mai bune activităţi enzimatice la pH-ul mediului de cultură de 5.5 pH Figura 8.91 1.29 2. În urma procesului de condiţionare prin adsorbţie pe CaCO3 sa observat o scădere a activităţilor enzimatice aşa cum rezultă din figura 9.95 2.6 Activitatea amilolitică(UDNS/ml Activitatea proteolitică(U/g) 108 Activitatea celulozolitică(UDNS/g) 76. Activitatea enzimatică (U/ml) 160 140 120 100 80 60 40 20 0 141. .5 6.15 1.5.8 1. . Variatia activitatii enzimatice a complexului enzimatic obtinut cu tulpina Aspergillus niger CMGB-401 in functie de pH-ul mediului de cultura (M4 faina de soia).66 5. prin adsorbţie pe CaCO3.15 1.înainte de sporulare.

5 7. 0.5 ca optim. funcţie de pH.67 U/mg 5.5 6.0941 2 2 X5 0.5 6.5 2 2 X5 0.6 108 96 76.0742 2 0.5 pH Figura 9.5757/0. dar scăderea nu este dramatică la valoarea de pH = 6.5 7.5. iar pentru produsul condiţionat activitatea xilanazică este mai ridicată la pH = 5. .36 3. Variaţia activităţii xilanazice în funcţie de pH-ul mediului de cultură după 48 ore şi după condiţionare PH Probă (ml sau g) Soluţie tampon (ml) diluţia Extincţia 540 nm Activitate xilanazică (U/ml) 1366.5 6.0696 0.5-7. se observă că aceasta este optimă la un pH 6.3635/0.0941 2 2 X5 0.5. ceea ce permite a se considera pH-ul 5.8 77.5963/0.160 Activitate 140 enzimatică 120 100 80 60 40 20 0 141.95 U/mg 2.0624 În ceea ce priveşte activitatea xilanazică a culturii de Aspergillus niger după 48 de ore.5181/0.33 1674 1595.5 5.0759 2 0. Variaţia activitătii amilolitice după 48 de ore şi după condiţionare pe carbonat de calciu Tabelul 18.4 după 48 de ore după condiţionare 105.5040/0.36 5.0941 PRODUS CONDIŢIONAT-prin adsorbţie pe CaCO3.

.5 7.5 6.36 167.5 Valoare pH Figura 10. Activitatea xinalazică (U/ml) 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 1366. Rezultatele obţinute după 48 ore şi după condiţionarea cu carbonat de calciu sunt prezentate în tabelul de mai jos. Variaţia activităţii xilanazice în funcţie de pH S-a urmărit variaţia pH-ului mediului de cultură şi în cazul cultivării tulpinii Aspergillus niger CMGB-401 pe mediu semisolid (tărâţe de grâu).33 1595.4 5.ţinând cont de faptul că la această valoare şi activitatea celorlalte enzime din complex este mai ridicată.

4.88 (U/g) 50.48 (U/g) 0.45 UC1-Cx/g).98 (U/ml) 1. Mediul lichid este mai avantajos din punct de vedere economic ceea ce îl recomandă pentru folosirea în condiţii de micropilot şi pilot.22 (U/g) 0.5 5.12 UDNS/g.74 Examinand comparativ rezultatele prezentate în tabelele 17 -19 care redau variaţia activităţilor enzimatice în funcţie de pH pe mediul M4 (stabilit în prima fază ca fiind mediul optim de dezvoltare) şi un mediu semisolid cu tărâţe de grâu ca sursă de carbon (activitatea amilolitică 75.22 (U/g) 8.55(U/ml) Activitatea celulozolitică (C1-Cx) 1.5 6. 5. celulaza) ca şi a xilanazei este favorizată în mediul lichid (M4-făină de soia) la pH=5. degradarea sau schimbarea fibrei[26].98 UP/g.98 (U/g) 58. activitatea celulozolitică 1.88 (U/g) 1. proteaza. schimbările în polizaharurile fără amidon.5 52. producţiile endogene.4 (U/g) 1.5 7.45 (U/ml) 1.32 (U/g) 1. activitatea proteolitică 1.12 (U/ml) 66. 76.32 (U/ml) 1.05).Tabelul 19.5 7. Testarea complexului enzimatic ca aditiv furajer Greutatea medie iniţială a animalelor supuse testării a fost de 8 kg.96 (U/ml) Activitatea proteolitică 1.29 (U/ml) 1. .5 6.05 (U/ml) Activitate xilanazică (U/mg) 5. Variaţia activităţilor enzimatice în funcţie de pH-ul mediului semisolid (cu tărâţe de grâu) după 48 ore şi după condiţionare PH Activitatea amilolitică 75. Performanţele au fost îmbunătăţite în cazul loturilor la care a fost inclusă enzima în structura reţetei de nutreţ combinat dar nu s-au semnalat diferenţe semnificative în ceea ce priveşte greutatea corporală şi sporul mediu zilnic (P>0.27 (U/ml) PRODUS CONDIŢIONAT-prin adsorbţie pe CaCO3.5. O posibilă explicaţie a îmbunătăţirii performanţelor la purcei prin adăugarea de enzimă ar fi efectul asupra unor factori ca: timpul de tranzit intestinal al hranei.81 (U/g) 1. s-a constatat că biosinteza enzimelor hidrolitice (amilaza. figura 8). După 18 zile de la începutul experimentului s-a efectuat cântărirea individuală finală iar rezultatele obţinute au fost prelucrate statistic (tabelul 18.

23 a ± 2.446 1. finala M E1 E2 8.75 8 6 4 2 0 G.83 G.% faţă de martor 100. se constată de asemenea. 0.09 Consum mediu zilnic de NC (kg) 0.23 Figura 10.450 1.222 kg la lotul martor).96 14 12 10 12.90 95. fără ca diferenţele să fie semnificative.229a ± 0.96 12. respectiv. figura 11).94 Spor mediu zilnic (kg) 0.75 a ± 1.75 Greutate corporala finală (kg)* 12.95 98. Performanţe bioproductive M Greutate corporala iniţiala (kg) 8. o uşoară îmbunătăţire în cazul loturilor experimentale (0.08 0. .90 0.229 kg la lotul E2.86 0. Dinamica greutăţii corporale În ceea ce priveşte sporul mediu zilnic (tabelul 20.71 8.98 .Tabelul 20.83 a ± 1.96 13.71 12. initiala 13.237a ± 0.00 *aceeaşi literă diferenţe nesemnificative între loturi (P>0.237 kg la lotul E1.05) Specificaţie LOT E1 8.222a ± 0. faţă de 0.48 E2 8.75 8.12 0. Se apreciază că enzima ameliorează efectul antinutritiv şi eficientizează producţia [26].439 Consum specific -kg NC /Kg spor 1.

237 0.90 M E1 E2 Figura 12 .z NC 0. S-a constatat o reducere a consumului specific în cazul loturilor cu adaos de preparat enzimatic (1. 2.98 kg NC/kg spor la lotul M). figura 12).9 0.2 0.0.222 0.95 kg NC/kg spor la lotul E1 respectiv.6 0.95 1.1 1.3 0 M E1 E2 c.229 M E1 E2 0.24 0.98 1.23 0.90 kg NC/kg spor în cazul lotului E2 comparativ cu 1.8 1. Consumul mediu zilnic (kg) şi consumul specific (kg NC/Kg spor) 0.5 1.450 Consum specific 1.439 0.22 .446 0. 1. Sporul mediu zilnic Consumul mediu zilnic de nutreţ combinat a fost asemănător la cele trei loturi (tabelul 20.21 smz Figura 11.m.

CaCl2-0. au fost cercetaţi o serie de parametrii care au o importanţă semnificativă pentru acest tip de bioprocese şi anume: compoziţia mediul de cultură. Cele trei tulpini de fungi au fost cultivate în sistem submers. cele mai bune rezultate s-au obţinut cu mediul lichid M 4. în urma . MgSO4x7H2O-0. În scopul determinării condiţiilor optime de cultivare a tulpinii de Aspergillus niger CMGB-401 pentru biosinteza enzimelor hidrolitice (amilaze. s-a observat că tulpina de Aspergillus niger CMGB-401 conduce cele mai bune activităţi enzimatice. Rezultatele obţinute au evidenţiat capacitatea bioproductivă superioară a tulpinii Aspergillus niger CMGB-401 în ceea ce priveşte complexul enzimatic studiat. celulaze.CONCLUZII În cadrul cercetărilor experimentale prezentate în proiectul de faţă s-au testat două tulpini de Aspergillus niger şi o tulpină Trichoderma viridae din colecţia Centrului de Biotehnologii Microbiene şi respectiv a Facultăţii de Biologie. proteaze. xilanaze). pH-ul mediului de cultură şi gradul de agitare şi aerare al culturii. xilanaze) utilizabil ca aditiv furajer. Universitatea Bucureşti. concentrare şi adsorbţie pe CaCO3 tehnic) s-a evaluat comparativ cu preparatul KEMZYME®VP DRY (Belgia). pe 4 medii de cultură preluate din literatura de specialitate. în ceea ce priveşte capacitatea acestora de a produce un complex de enzime hidrolitice (proteaze.1% În cazul diferitelor variante de pH şi temperatură folosite.5%. având următoarea compoziţie (g%): Făină de porumb-2%. activitatea polienzimatica a mediilor de fermentaţie şi a produselor finite (obţinute prin filtrarea mediului de fermentaţie. (NH4)2HPO4-0. amilaze. temperatura. În ceea ce priveşte compoziţia mediului de cultură. Făină de soia-3%. dintre cele cinci medii testate (patru medii lichide şi un mediu semisolid pe bază de tărâţe de grâu).05%. celulaze.

33 U/ml). tratarea cu CaCO3 a concentratului şi uscarea sub vid a amestecului rezultat.95 UP/g. posibil din cauza faptului că nutreţul combinat a fost optimizat în principii nutritivi specifici acestei categorii de porcine. Condiţionarea produsului polienzimatic s-a realizat prin concentrarea mediului integral din finalul fermentaţiei.27 UC1-Cx/g. . in funcţie de cantitatea de produs introdusă în raţia zilnică. activitatea xilanazică 1366.6 UDNS/g.52% . Rezultatele obţinute sugerează eficienţa utilizării preparatelor enzimatice în recepturi de nutreţ combinat deficitare în principii nutritivi.5 şi la temperatura de 280C (activitatea amilolitică 141. activitatea celulozolitică 2.cultivării la pH = 5.04% mai mic faţă de martor. activitatea proteolitică 1. Testarea ca aditiv furajer a produsului polienzimatic condiţionat a evidenţiat faptul că utilizarea acestuia nu a influenţat semnificativ greutatea corporală şi sporul mediu zilnic a purceilor în perioada crizei de înţărcare. Consumul specific la loturile de purcei la care s-a utilizat preparat enzimatic este cu 1.4.

Bielecki Stainslaw. Institute of Technical Biochemistry.. vol. Rita Pyc. S. Process Biochemistry 34... Betts W...1985.. Applied Microbiology and Biotechnology.S. Lee. David Cowan. 511. 761-766.. pag. Hemicellulose and Hemicellulases. 12.K. Pederson S.B. J. Rosgaard I.Y. pag. Biotehnologii*Fundamente*Bioreactoare*Enzime. Biores. 6.2000 11. Kelinpeter E. N. 7. Technol... 62. 4.L. Peilin Cen. 308-318. 2006 . Kang.. Schuseil J. 2. 1999. Pedlar S.. Schmidt M. Meyer AS. Demain.87. International Journal for Food Chemistry.. Cheng J. Journal of Applied Microbiology. 5. 83: 1-11. 10.R. Sarke I. Hong. Z. Gawande and M. 3. 22(2):493-498. issue 4. Biotechnol Prog. Sun Y. Biodegradation: Natural and Synthetic 6. Stefana Jurcoane. 8.. A. Liming Xia.. Park. S. Biology of Industrial Microorganisms. Kamm B. S.A. 909-912. Puls J. Chemosphere.. Editura Tehnica Bucuresti. Harris P. pag. 9. 2002.. Cherry J. Kamm M.BIBLIOGRAFIE 1. 1999.nr.L.. pag. 153-157. 58. Kim. pag.. Kamat. Poland. Portland Press.. 2006. 1992. Technical University of Eoodz. 1993. 2002. vol. Solomon. MP Coughlan and GP Hazlewood (Eds). P. Ball A. 97-105. V. 32-38. Dart R.

. 24.A. Portugalia. J. 2004 26.F. 2004 20. Levine J. Press. J. Miller G. 106: 147-150. 111-116. Enzyme applications in corn/soia diets fed pigs.... Costa-Fereira M.A. 113:509-523. L. Anal.1-5. Biotechnol.. Moldovan I. Biomass burning and global change. 426-428. and J.. 5-10. Procedeengs of Bioenergy-I: From concept to Commercial Processes. 1974. vol. Supplementary enzymes to improve utilization of pig diets. Lyons& K. 15.S. Dierick. International Sugar Journal. Cloete T.13.. 23. Luiza Jecu. Eustace A. 1. Chem.151. 1996. Biochimie practica. Cambridge.. Biochem.2004. Biochem. Biotechnol. T. African Journal of Biotechnology vol. Editura Cartea Universitara. D. Biotechnol.E.. Kanuf M. Petterson and Porath. pp 35. 186-188.. 17.Kitchen. 23. 14. N. vol.. .. Rczey K. 1994. Environ. 22.. Edinburgh... The MIT Press. Biely P.2006.. in Biotechology in the Feed Industry. Iyayi. 8. 18. Appl. Decuypere.1959. 2003 19. Dumitru I. 1977. 16. 257-270. J.3.A. sp. Industrial Crops and Products. Eur. 31. Levine J. Varga E. Jacques (Ed). 2000. Malherbe S. USA. Sci. Massachusetts. Ciurescu Georgeta. 21. Proceedings of Alltech’s 13th Annual Symposium Nottingham Univ.. 11. 2005.I.1959. 1:105-114. Matos de Sousa J.. 1980. 25.03. Iordachescu D.pag.S (ed).. Monirussaman M.. Baylei M.. Vasile Anca. Tomar. Zacchi G. Proceedingsa 45th Annual Meeting of EAAP.P.

Powered by http://www.referat.ro/ cel mai tare site cu referate .

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful