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Norma oficial mexicana NOM-112-SSA1-1994, Bienes y servicios.

Determinación de
bacterias coliformes. Técnica del número más probable.
OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIÓN.
Esta Norma Oficial Mexicana establece el método microbiológico para estimar el
número de coliformes presentes en productos alimenticios, por medio del cálculo
del número más probable (NMP) después de la incubación a 35 °C de la muestra
diluida en un medio líquido. Este procedimiento puede aplicarse a agua potable,
agua purificada, hielo y alimentos procesados térmicamente, así como a muestras
destinadas a evaluar la eficiencia de prácticas sanitarias en la industria alimentaria.
Este procedimiento debe seleccionarse cuando la densidad esperada es como
mínimo de una bacteria en 10 ml de producto líquido o una bacteria por gramo de
alimento sólido. Cuando la densidad bacteriana sea menor que la aquí citada y si la
naturaleza del alimento lo permite, utilizar el método de filtrado en membrana. Si la
densidad microbiana se espera sea mayor a 100 por mililitro o gramo de muestra,
ampliar el intervalo de diluciones o utilizar el método en placa.
Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el territorio nacional
para las personas físicas o morales que requieran efectuar este método en
productos nacionales o de importación, para fines oficiales.
Fundamento
El método se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas
a 35 ± 1°C durante 24 a 48 horas, resultando una producción de ácidos y gas el cual
se manifiesta en las campanas de fermentación.
Esta norma se complementa con lo siguiente: NOM-109-SSA1-1994
Procedimientos para la Toma, Manejo y Transporte de Muestras de Alimentos para
su Análisis Microbiológico. NOM-110-SSA1-1994 Preparación y Dilución de
Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico.
Para fines de esta norma se entiende por: Coliformes, bacilos Gram negativos, no
esporulados, aerobios o anaerobios facultativos, que a 35 °C fermentan la lactosa
con la producción de gas bajo las condiciones especificadas en esta norma.
Símbolos y abreviaturas.
Cuando en esta norma se haga referencia a los siguientes símbolos y abreviaturas
se entiende por: g gramo, ml mililitro, l litro, mm milímetro, °C grado Celsius, % por
ciento, pH potencial de hidrógeno, N normal y NMP número más probable.
Aparatos e instrumentos

 Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C.


 Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de
máximas y mínimas.
 Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista
con termómetro calibrado con divisiones de 0,1° C y que mantenga la
temperatura a 45 ± 1,0°C.
 Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien un
homogeneizador peristáltico (Stomacher).
 Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para
homogeneizador peristáltico.
 Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1,0° C,
provista con termómetro calibrado.
 Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal
cuadriculada y lente amplificador.
 Registrador mecánico o electrónico.
 Microscopio óptico.
 Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25 °C.

Medio de cultivo

Agar-rojo- violeta-bilis-lactosa (RVBA)

Reactivos

Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada)


La preparación de la muestra
Norma oficial mexicana debe ser de acuerdo a lo
NOM-112-SSA1-1994, establecido en la NOM-110-
Bienes y servicios SSA1-1994 "Preparación y
(preparacion de la Dilución de Muestras de
muestra) Alimentos para su Análisis
Microbiológico".

Repetir el procedimiento Colocar en cajas Petri por


tantas veces como duplicado 1 ml de la muestra
diluciones decimales se líquida directa o de la
requiera sembrar, utilizando dilución primaria, utilizando
una pipeta estéril diferente para tal propósito una pipeta
para cada dilución. estéril.

Vertir de 15 a 20 ml del
medio RVBA fundido y Mezclar el inóculo con el medio
mantenido a 45 ± 1,0°C en con seis movimientos de derecha
baño de agua. En el caso de a izquierda, sentido de las
utilizar cajas de Petri de manecillas del reloj, sentido
plástico se vierte de 10 a 15 contrario al de las manecillas del
ml del medio. La preparación reloj y de atrás para adelante
de la dilución primaria y el sobre una superficie lisa. solidifcar
momento en que se vierte el dejando las cjas Petri sobre una
medio de cultivo, no debe superficie horizontal fría.
exceder de 20 minutos.

Después de que está el


medio completamente
solidificado en la caja, verter
Preparar una caja control
aproximadamente 4 ml del
con 15 ml de medio para
medio RVBA a 45 ± 1,0°C en
verificar la esterilidad.
la superficie del medio
inoculado. Dejar que
solidifique.

Invertir las placas y


colocarlas en la incubadora a Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150
35°C, durante 24 ± 2 horas. colonias. Las colonias típicas son de color rojo oscuro,
Después del periodo generalmente se encuentran rodeadas de un halo de
especificado para la precipitación debido a las sales biliares, el cual es de color
incubación, contar las rojo claro o rosa, la morfología colonial es semejante a
colonias con el contador de lentes biconvexos con un diámetro de 0,5 a 2,0 mm.
colonias.
Norma oficial
mexicana NOM-112- Placas que contienen
SSA1-1994, Bienes y Cálculo del método entre 15 y 150 colonias
servicios (Expresion características.
de los resultados)

Calcular el número de
Placas que contienen coliformes por mililitro o por
menos de 15 colonias gramo de producto, Separar las placas que
características. multiplicando el número de contienen el número
Si cada una de las placas colonias por el inverso de antes mencionado de
tiene menos de 15 la dilución correspondiente, colonias características
colonias características, tomando los criterios de la en dos diluciones
reportar el número NOM-092-SSA1-1994. consecutivas. Contar las
obtenido seguido de la Método para la Cuenta de colonias presentes.
dilución correspondiente. Bacterias Aerobias en
Placa.

Si en las placas no hay


Si cada una de las placas
colonias características,
tiene menos de 15
reportar el resultado
colonias características, Placas con colonias no
como: menos de un
reportar el número características.
coliforme por 1/d por
obtenido seguido de la
gramo, en donde d es el
dilución correspondiente.
factor de dilución.