You are on page 1of 12

UNIVERZITET U TRAVNIKU

FARMACEUTSKO-ZDRAVSTVENI FAKULTET
ODSJEK/SMJER: SESTRINSTVO

MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA VIRUSNIH
OBOLJENJA

Mentor Student

doc.dr. Sabaheta Bektaš

Travnik, novembar 2018. godine
Sadržaj

1. Uvod .................................................................................................................................... 3

2. Mikrobiološka dijagnostika virusnih oboljenja................................................................... 4

2.1 Uzimanje i transport uzoraka za virološku dijagnostiku .................................................. 4

2.2 Izolacija virusa u ćelijskoj kulturi .................................................................................... 5

2.3 Detekcija virusnih antigena .............................................................................................. 6

2.4 Serološke metode .............................................................................................................. 7

2.5 Molekularne metode u dijagnostici virusnih oboljenja .................................................... 9

3. Zaključak ........................................................................................................................... 11

4. Literatura ........................................................................................................................... 12

2
1. Uvod

Pošto su virusi striktini intracelularni paraziti, oni se ne mogu izolovati na vještačkim
hranjivim podlogama, već samo u živim ćelijama domaćina. Kulture ćelija su veoma
osjetljive, pa se najčešće koriste za otkrivanje i kultivisanje virusa. Pored kultivisanja u
ćelijskim kulturama, animalni virusi se kultivišu i u eksperimentalnim životinjama (rjeđe se
koristi) i u embrionisanom kokošijem jajetu (za proizvodnju virusnih antigena i vakcina).

Kod animalnih virusa, kulture ćelija su zapravo razmnožene životinjske ćelije u vještačkoj
podlozi. Kada se u ćelijsku kulturu unese materijal koji sadrži virus, virus će inficirati ćelije i
formirati plake – vidljiva mjesta, prozirne zone, unutar ćelijske kulture gde je virus lizirao
(razorio) ćeliju. Virusna infekcija može dovesti i do drugih morfoloških promjena (oblika i
građe) kao što su gigantske ćelije, nakupine ćelija u gomilice itd. Ove promjene ćelijske
kulture nazivaju se – citopatogeni efekat (CPE). CPE se može posmatrati primjenom običnog
svjetlosnog mikroskopa.

Za brzu, jednostavnu i pouzdanu dijagnostiku virusnih infekcija najčešće se primjenjuju razni
imunološki testovi. Primjenom ovih testova mogu se dokazati specifična antitijela u serumu
(serološki testovi) i virusni antigeni. Neki od imunoloških testova su: test neutralizacije
virusa, reakcija vezivanja komplemenata, imunoenzimski (ELISA) test i dr. U zadnje vrijeme,
napretkom molekularnih metoda, sve više se dokazuju i identificiraju virusi odnosno njihove
nukelinske kiseline u uzorcima. Ovim metodama se može odrediti i broj kopija u krvi što je
važno za prognozu i praćenje uspješnosti terapije.

3
2. Mikrobiološka dijagnostika virusnih oboljenja

Posljednjih 30 godina na području laboratorijske dijagnostike virusnih oboljenja
dogodio se veliki napredak. Dugotrajne i zahtjevne postupke izolacije virusa na ćelijskoj
kulturi u velikoj mjeri su zamijenile savremene dijagnostičke metode koje iskorištavaju kako
specifičnost monoklonksih antitijela kod testa direktne ili indirektne imunofluorescencije,
tako i izuzetnu osjetljivost novih molekularnih metoda kao što je PCR. (1)

Uvođenjem imunoenzimksih testova i metoda direktne i indirektne imunofluorescencije danas
je moguće dobiti rezultate u istom danu ili čak za nekoliko sati. Najviše vremena od uzimanja
uzorka do rezultata testa danas se još ubijek gubi zbog slabo organizovanog i koordiniranog
transporta. (1)

Za razliku od bakteriološkog laboratorija u kojem je krajnji cilj analize određivanje
osjetljivosti izoliranog bakterijskog soja na antibiotike, dijagnostika virusa izvodi se rjeđe i to
kada na raspolaganju postoji djelotvoran lijek. Za izolirane viruse određuje se osjetljivost na
antivirusne lijekove i to genotipski, a ne fenotipski što je u slučaju kod bakteriologije. (1)

2.1 Uzimanje i transport uzoraka za virološku dijagnostiku

Da bi virološka dijakgnostika bila uspješna i kvalitetna glavni preduslov je pravilan
način uzimanja uzorka. Uzorak mora biti uzet sa odgovarajućeg anatomskog mjesta, u pravo
vrijeme u toku bolesti i mora biti što je moguće brže prenesen u laboratoriju. Kod uzimanja
uzorka za virološku dijagnostiku važno je imati na umu da su virusi obavezni intraćelijski
paraziti, te je cilj uzimanja uzorka sa nekog oboljelog mjesta uzeti što veći broj inficiranih
ćelija. (1)

Uzorke materijala pacijenta, za izravnu detekciju i izolaciju virusa kao i serume akutne faze
bolesti treba uzeti prvih nekoliko dana od početka bolesti. Većina se uzoraka može pohraniti
nekoliko dana na temperaturi od 4 od 8 C. zamrzavanjem uzoraka na temperaturi od -70 C i
nižoj je očuvana infektivnost virusa. Ako se očekuju virusi koji su osjetljivi na zamrzavanje,
uzorak je potrebno skaldištiti dodatkog stabilizirajućeg agensa. (2)

Najčešći uzorci za dijagnostiku virusnih infekcija su:

- krv (plazma/serum)
- bris (sa kože, farinksa i dr)

4
- aspirat nazofarinksa
- tekućina iz kožnih mjehurića
- feces
- likvor

2.2 Izolacija virusa u ćelijskoj kulturi

Kao što je već navedeno, virusi su obavezni intraćelijski paraziti te za svoje
umnožavanje treba žive ćelije. U laboratoriji takav sistem se može obezbijediti pomoću
ćelijskih kultura, pokusnih životinja ili oplođenih kokošijih jaja. U kliničkoj dijagnsotici
upotrebljiv je samo sistem sa ćelijskim kulturama. Laboratorijske životinje se zbog strogih
etičkih propisa upotrebljavaju još samo u iznimnim slulajevima, a oplođena jaja još uvijek se
dosta upotrebljavaju u industriji i u istraživačkim laboratorijama za izradu vakcina. (1)

Ćelijska kultura je biološki sistem in vitro, u kojem ćelije su stavljene u vještački okoliš te
zadržavaju sposbnost razmnožavanja. Razlikujemo tri vrste ćelijskoh sistema: primarne,
diploidne i trajne ćelijske kulture. Ove ćelijske kulture se razlikuju po građi, obliku,
hromosomima i porijeklu. (2)

Prisutnost virusa u ćelijskoj kulturi može se otkriti citopatološkim promjenama koje su
posljedica umnožavanja virusa. Takve se promjene nazivaju citopateogenim efektom prikazan
na slici 1 (CPE). Biološke osobine virusa određuju brzinu umnožavanja, a time i vrijeme
pojave CPE. (2)

Slika 1. CPE (A – ćelije bez infekcije; B – inficirane ćelije)

5
CPE nekad nije specifičan za određeni virus ili se uantoč repliakciji virusa uopće ne izrazi.
Zato je za izolaciju virusa uvijek neophodna još specifičnija identifikacija virusa.
Identifikacija se izvodi upotrebom metoda direktne imunofluorescencije monoklinskim
antitijelima iznačenih sa bojom FITC, jednostavnija metoda koja se koristi je hemadsorpcija
kod koje se na jednoslojne inokulirane ćelije kojima je odstgranjeno hranilište nalije
suspenzija eritrocita. Pritom se gleda moguća pojava agregacije eritrocita na površinu ćelija.
Njihovo grupisanje na ćelije znači da te ćelije na svojoj površini izražavaju virusne
hemaglutinine što uzrokuje prisutnost virusa kao što su virusi influence, parainfluence,
aprotitisa i togavirusa. (1)(2)

2.3 Detekcija virusnih antigena

Tokom ciklusa umnožavanja virusa u napadnutoj ćeliji prisutni su brojni virusni
proteini i enzimi. Te virusne dijelove moguće je otkirti različitim metodama koji se
pirmjenjuju u biohemiji, imunologiji i molekularnoj biologiji. (2)

Danas za dokazivanje antigena koriste se metode sa monoklonalnim antitijelima i metode
direktne imunofluorescencije kao i imunoenzimske metode. Rjeđe se koriste i metode
aglutinacije, hemaglutinacije, hemadsorpcije i brzi testovi koji se temelje na principu
imunodifuzije. Za svaku od metoda osnova je korištenje antitijela specifičnih za određen
virusni antigen. Ova monoklonalna antitijela su komercijalno dostupna. Sve metode su
uglavnom kratkotrajne od 30 minuta do 3 sata. (1)

Metode za dokazivanje virusnih antigena najčešće se koriste kod dokazivanja virusnih
infekcija dišnih puteva (respiratorini sincicijski virus, adenovirus, virus parainfluence i
influence). Virusni antigen obično se dokazuje i kod dijagnsotike hepatitis B i infekcija HIV
virusom. (1)

Imunoenzimske metode su veoma osjetljive metode u kojima se i 1 mL uzorka može
odrediti prisutnost količine virusa od 1 ng. Postoji više različitih metoda, a najčešće se koristi
tzv. sendvič-ELISA. Prva antitijela koja su fiksirana za cvrstu podlogu vežu Ag koji želimo
dokazati. Na ove komplekse se dalje vežu druga antitijela označena sa enzimom. Na kraju se
doda supstrat, koji poslije djelovanja enzima promjeni boju. Nakon toga vrši se mjerenje
intenziteta boje i preračunava u koncentraciju antigena. Primjenjuje se kod dijagnostike virusa
akutnog gastroenteritisa (norovirus, rotavirus, entericni ademovirus, astrovirus i dr.) (1)(3)

6
Metoda direktne imunofluorescencije koriste monoklonsko antitijelo označeno
fluorokromom (bojakoja obasjana svjetlošću nižih talasnih dužina emitira svjetlost vidljivog
spektra) i usmjereno protiv najizloženijih antigena određenog virusa. Uzorak sa inficiranim
ćelijama se centrifugira i nakon toga talog se nanese na specijalna stakla. Kada se osuše,
fiksiraju se u hladnom acetonu, a potom se nanesu specifična monoklonska antitijela. Nakon
inkubacije od pola sata vrši se ispiranje te mikroskopiranje sa flurescentnim mikroskopom.
Virusnu infekciju potvrđuje nalaz specifičnih nakupina virusnih antigena koji se vide u formi
zelene flurescencije u unutrašnjosti inficiranih ćelija (slika 2). (1)(3)

Slika 2. Nakupine fluorescencije odnosno antigena respiratornog sincicijskog virusa (RSV) u inficiranim
ćelijama.

Kod metode aglutinacije, odgovarajući dijelovi virusa aglutiniraju polistirenske dijelove koji
su prekriveni specifičnim antitijelima. Metoda nije tehnički zahtjevna, a rezultat se očitava
golim okom. Osjetljivost metode je niska i najviše se upotrebljava za dokazivanje antigena
rotairusa u stolici gdje je osjetljivost od 69% do 96%.

2.4 Serološke metode

Mjerenje specifičnih antitijela usmerenih protiv virusa danas je jedna od najvažnijih
metoda dijagnostičke virusologije. Jedino je serološkim metodama moguće opredijeliti
postojeću imunost na neke virusne infekcije. Odnosno, serološki postupci primjenjuju se u
dijagnostici virusnih infekcija, evaluaciji toka ifnekcije te određivanju primarne, akutne,
hronične i rekurentne infekcije tj. reinfekcije. U aktunoj fazi bolesti moguće je dokazati IgM
antitijela, a u rekonvalescenciji IgG i IgM antitijela. Od uzoraka mogu se koristiti serum,
plazma i likvor. Rezultat testa se može izraziti titrom antitijela (najveće razrjeđenje seruma
koje daje pozitivnu reakciju) ili u internacionalnimjedinicama. Zbog automaticacije često se

7
koristi u dijagnostici HIV-a, hepatitisa, krpeljnog encefalitisa i dr. Najčešće metode koje se
kroiste su indirektna imunofluorescencija, indirektna ELISA, reakcija vezanja komplementa i
inhibicija hemaglutinacije. (1)(2)

Kod indirektne ELISA metode, na čvrsu podlogu je vezan virusni antigen za koje se vežu
antitijela iz uzorka ukoliko ih ima. Nakon toga tom kompleksu se dodaje monoklonsko
antitijelo koje se veže za Fc kraj antitjela iz seruma. Dodatno monklonkso antitijelo je
označeno sa nekim enzimom, najčešće hren peroksidazom. Nakon inkubacije dodaje se
supsrat za enzim i indikatorska boja te se mjeri intenzitet boje. Što je intezitet boje veći više je
antitijela prisutno u uzorku.

Hemaglutinacija i inhibicija hemaglutinacije: Virusi sa glikoproteinom hemaglutininom u
ovojnici (ortomiksovirusi, paramiksovirusi,mumps), lijepe eritrocite. U tom slučaju se
eritrociti održavaju u difuznom obliku unutar epruvete, ne dolazi do njihovog taloženja na
dnu. Sa specifičnim antitijelima se može inhibirati hemaglutinacija i dokazati virus.

U rekaciji vezanja komplementa iskorištena je sposobnost komplementa da hemolizira
eritrocite i da se veže na imunološke komplekse. Odvija se u dvije faze:

- I faza seroloska reakcija formiranja kompleksa Ag-Ab-komplement
- II faza: vizualizacija kompleksa uz dodatak hemolitičkog sistema (hemolizin kunića i
eritrociti ovna).

Pozitivan nalaz imamo kada izostaje hemoliza jer je komplement iskorišten u prvoj fazi
odnosno postoje specifčna antitijela iz uzorka koja su stvorila kompleks sa antigenom.
Negativan nalaz je onaj u kome je došlo do vidljive hemolize jer je komplement neiskorišten i
hemolizirao je eritrocite.

Western blot je visoko specifična tehnika. Koristi se za istraživačke svrhe al i kao potvrdni
(konfirmatorni) test za pozitivne uzorke. Izvedba: Proteini mikroorganizama se prvo
separiraju u poliakrilamid gelu elektroforezom (PAGE) baziranom na molekulskoj masi.
Lakši protein putuju dalje kroz gel, a teži su tromiji i putuju sporije. Proteini se prezentuju
(blotiranje) na nitroceluloznu membranu, koji se osuši i izreže u stripove. Na stripove se
nanosi uzorak i inkubira.

Rezultat se pokaže u obliku obojenih prugastih područja, a ukazuju na reakciju sa tačno
određenim antigenom (slika 3). Što je veći broj obojenih prugastih područja, veća je

8
mgoućnost da je potvrđena infekcija s određenim virusom. Ova metoda se koristi za potvrdu
kod HIV infekcija, hepatitisa C i ponekad infekcija Epstein-Barrovim virusom. (1)(3)

Slika 3. Western blot stripovi za detekciju antitijela na proteine HIV-a.

2.5 Molekularne metode u dijagnostici virusnih oboljenja

Zadnjih godina metode umnožavanja nukelinskih kiselina dovele su do značajnih
promjena u virusološkoj dijagnostici. Molekularne metode su doesgle najveći napredak i
upotrebljivost na pdoručju dijagnostike i praćenje liječenja infkecije virusom HIV-a,
hepatitisa C i B, kao i CMV te dijagnsotike virusnih meningitisa i encefalitisa. Najviše
korištena metoda je PCR odnosno Lančana reakcija polimerazom. Njena varijana Real-Time
PCR je najkorištenija u mikrobiologiji.

PCR je in vitro amplifikacija definisane DNA sekvence i predstavlja imitaciju procesa DNA
replikacije. Reakcija koristi dva oligonukleotida (prajmera) koji su komplementarni krajevima
sekvence koja se umnožava i koji su međusobno suprotno orjentisani. Sinteza DNA je
katalizovana termostabilnom DNA polimerazom. Ponavljanje ciklusa, od kojih se svaki
sastoji od denaturacije DNA, hibridizacije prajmera i ekstenzije hibridizovanih prajmera od
strane termostabilne DNA polimeraze, za rezultat ima eksponencijalnu amplifikaciju
specifičnog DNA fragmenta. Krajevi amplifikovanog fragmenta su definisani 5’ krajevima

9
prajmera, a njihova veličina određena je rastojanjem između sekvenci koje prajmeri
„prepoznaju“.(3)

Rezultati klasičnog PCR-a se detektuju agaroznom gel elektroforezom i bojenjem. Ovo
omogućava da se umnožena DNA vizualizuje kao trake različite veličine. Veličina traka se
može odrediti upoređenjem sa markerima standardne molekulske mase. Prisustvo trake ili
traka očekivane veličine označava pozitivan rezultata. Ovo je ujedno i nedostatak ove metode,
jer nakon amplifikacije prisustvo amplikona mora da se detektuje. Najčešće korištena tehnika
je gel elektroforeza koja pokazuje PCR produkte kao trake na gelu. Ovo ne pokazuje
specifičnost PCR produkta već demonstrira da li su dobijene trake očekivane veličine ili ne.
Traka može poticati i od produkta nespecifične reakcije koji može biti iste veličine kao i
očekivani produkt. Potrebno je uraditi hibridizaciju sa dijagnostičkim probama ili
sekvenciranje da bi se dokazalo da je dobijen očekivan amplikon. (3)

Real-time PCR (PCR u stvarnom vremenu) omogućava detekciju i kvantifikaciju
nukleotidnog signala kontinualnim merenjem fluorescentnog reportera za vrijeme PCR
reakcije. Najjednostavniji tip reportera je fluorescentna boja koja se vezuje specifično za
dvolančanu DNA (na pr. Etidijum bromid, SYBR Green, Molekularne probe). Kada je vezana
boja, emituje se svjetlo nakon ekscitacije, tako da se fluorescencija povećava proporcionalno
akumulaciji PCR produkta. Boje se vezuju za bilo koju dvospiralnu DNA u reakciji, kao što
su dimeri prajmera i nespecifični produkti reakcije, tako da su oni najpogodniji za dobro
karakterisane i visoko specifične reakcije. (3)

10
3. Zaključak

Mikrobiološka dijagnostika virusnih oboljenja se radi zbog određivanja specifičnih
antivirusnih lijekova, sprečavanja bolničkih infekcija, smanjivanja upotrebe antibiotika u
dokazanim virusnim infektima i zbog određivanja antitijela i posljedičnog imuniteta virusnih
oboljenja.

Koriste se direktne metode kao što su izolacija virusa na ćelijskoj kulturi, detekcija virusnih
antigena eimunoenzimskim metodama i metodom direktne imunofluorescenije, detekcija
virusnih nukelinskih kiselina, a može se koristiti i elektronska mikroskopija. Što se tiče
indirektnih metoda to su serološke metode kojima se dokazuju antitijela pacijenta
imunoenzimksim metodama i imunofluorescencijom. Akutna infekcija potvrđuje se dokazom
IgM antitijela ili četverostrukim porastom ukupnih antitijela u parnom serumu.

11
4. Literatura

1. Uzunović, S. (2009). Medicinska mikrobiologija. Zenica
2. Kalenić, S. i saradnici (2013). Medicinska mikrobiologija. Medicinska naklada,
Zagreb
3. Lojo-Kadrić, N., Pojskić, N i Pojskić, L. (2018). Laboratorijske tehnologije u
molekularnoj biologiji. Univerzitet u Sarajevu – Institut za genetičko inženjerstvo i
biotehnologiju

12