Resumen

Antecedentes: las células madre mesenquimales (estromales) (MSC) median sus funciones
inmunorreguladoras y de reparación tisular
segregando factores paracrinos, incluyendo vesículas extracelulares (EVs). En varios modelos animales de
enfermedades humanas,
Los MSC-EV imitan los efectos beneficiosos de las MSC. Los virus de la influenza causan brotes anuales de
enfermedades respiratorias agudas
resultando en mortalidad y morbilidad significativas. Los virus de la influenza evolucionan constantemente,
generando medicamentos resistentes a los medicamentos.
y haciendo que las vacunas actuales sean menos efectivas contra las cepas recién generadas. Por lo tanto,
nuevas terapias.
Eso puede controlar la replicación del virus y se necesita la respuesta inflamatoria del huésped. El objetivo de
este estudio.
fue examinar si el tratamiento con MSC-EV puede atenuar la lesión pulmonar aguda inducida por el virus de
la gripe en un modelo preclínico.
Métodos: Aislamos EV de cerdos derivados de la médula ósea porcina. La morfología de MSC-EVs fue
determinada por
La microscopía electrónica y la expresión de marcadores mesenquimales se examinaron mediante citometría
de flujo. A continuación, examinamos
La actividad anti-influenza de MSC-EVs in vitro en células epiteliales de pulmón y antiviral e
inmunomoduladora.
Propiedades in vivo en un modelo porcino de virus de influenza.
Resultados: Se aislaron MSC-EV de medio condicionado con MSC mediante ultracentrifugación. MSC-EVs eran
de forma redonda
y, de manera similar a las MSC, expresaron marcadores mesenquimales y carecían de la expresión de
antígenos de leucocitos de cerdo I y II.
La incubación de EV marcados con PKH-26 con células epiteliales de pulmón reveló que los MSC-EV se
incorporaron a las células epiteliales.
A continuación, examinamos las propiedades anti-influenza y antiinflamatorias de los MSC-EV. MSC-EVs
inhibió la
Actividad de hemaglutinación de los virus de la influenza aviar, porcina y humana en concentraciones de 1,25-
5 μg / ml.
Los MSC-EV inhibieron la replicación del virus de la influenza y la apoptosis inducida por el virus en células
epiteliales de pulmón. La antiinfluenza
La actividad de los MSC-EV se debió a la transferencia de ARN de EV a células epiteliales desde la preincubación
de
Los MSC-EV con la enzima ARNasa anularon la actividad anti-influenza de los MSC-EV. En un modelo de cerdo
del virus de la gripe,
La administración intratraqueal de MSC-EV 12 h después de la infección por el virus de la influenza redujo
significativamente la propagación del virus en el
frotis nasales, replicación del virus de la influenza en los pulmones y producción inducida por virus de
citoquinas proinflamatorias en el
Pulmones de cerdos infectados de influenza. Los hallazgos histopatológicos revelaron que los MSC-EV
aliviaron el virus de la gripe inducido
Lesiones pulmonares en cerdos.

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Fondo
Los virus de la influenza A (IAV) causan una enfermedad respiratoria aguda
Enfermedades en humanos y animales. Brotes anuales y
pandemias ocasionales de influenza resultan en millones de
Muertes, sufrimientos y pérdidas económicas. Solo en los Estados Unidos,
desde 2010 los virus de la influenza han causado 140,000–710,000
hospitalizaciones que resultan en 12,000–56,000 muertes anuales
(https://www.cdc.gov/flu/about/disease/burden.htm).
Ancianos, lactantes y personas con afecciones subyacentes.
Están en alto riesgo de mortalidad asociada a la influenza. En
Además de virus estacionales y pandémicos, altamente patógenos.
El virus de la influenza aviar (HPAI) H5N1 ha sido repetidamente
Se transmite directamente de las especies aviares a los humanos. En
Humanos, el virus H5N1 está asociado con una enfermedad grave.
resultando en fallo multiorgánico y altas tasas de mortalidad
[1, 2]. A 30 de octubre de 2017, los virus HPAI H5N1 tienen
causó 860 infecciones humanas que resultaron en 454 muertes desde
2003 (http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/
2017_10_30_tableH5N1.pdf? Ua = 1) Casos graves de influenza
causar una mortalidad significativa debido a su capacidad para
inducir patología inmune pulmonar mediada por citocinas con características
del síndrome de dificultad respiratoria aguda moderada a grave
(ARDS) [3].
Las infecciones por el virus de la influenza generalmente son controladas por
Vacunación anual. Sin embargo, estas vacunas proporcionan
Protección limitada contra nuevos reordenes que son
Genéticamente diferente del virus de la vacuna. En el caso
de una pandemia, generación de una nueva vacuna que contiene
Los virus circulantes llevan aproximadamente 6 meses. Además,
Los virus de la gripe sufren continuamente mutaciones.
resultando en la generación de nuevas cepas virales que pueden
volverse resistente a los medicamentos antivirales actualmente disponibles.
Así, terapias alternativas capaces de inhibir la gripe.
Replicación del virus y atenuación de la inflamatoria.
Se necesita la respuesta del anfitrión.
Las células madre mesenquimales (estromales) (MSC) son multipotentes
Células que fueron identificadas por primera vez en la médula ósea.
(BM) como células adherentes de plástico similares a fibroblastos.
Las MSC poseen diferenciación multilinaje e inmunomoduladora.
y propiedades de reparación tisular [4]. Debido a
Estas propiedades de MSC son atractivas como terapia celular.
para enfermedades inflamatorias y autoinmunes, y
medicina regenerativa. Varios estudios de SDRA en
Los modelos animales han mostrado efectos beneficiosos de MSC.
administración, y los ensayos clínicos han demostrado la
viabilidad de la administración de MSC en pacientes con
SDRA [5-7]. Se están realizando estudios terapéuticos. similar
a SDRA, infecciones graves por virus de influenza en
Los humanos y modelos animales muestran una inflamación aguda.
Respuesta y daño pulmonar [8]. Como MSC suprimen
Inflamación y reparación tisular y regenerativa.
habilidad, SDRA e influenza son objetivos apropiados
para la terapia de MSC. Sin embargo, la terapia de MSC en ratones.
los modelos de influenza muestran resultados inconsistentes [9-12].
Además, nosotros y otros hemos demostrado que el virus de la gripe
infecta MSCs y que la infección puede alterar la
Inmunorregulador y propiedades de diferenciación de
MSC [13-15].
Varios estudios indicaron que las acciones benéficas
de MSCs se deben a la liberación de factores paracrinos ya que
solo unos pocos MSC trasplantados se injertan en el sitio de
lesión [16]. Recientemente, las vesículas extracelulares (EV) que
incluyen exosomas (Exo) que son liberados de
Cuerpos multivesiculares y microvesículas (MV) que
Se desprenden de la superficie celular, y los cuerpos apoptóticos.
Se identificaron en las secreciones de MSC [17]. en este papel
Los EV, Exo y MV se denominarán colectivamente como
EVs. Los EV derivados de MSC tienen una expresión similar de
moléculas de superficie y contienen proteínas específicas de MSC,
mRNAs, microRNAs (miRNAs), orgánulos y lípidos
[18-20]. En tejido enfermo, los MSC-EV interactúan con
Células lesionadas y proteínas de transferencia, ARNm, y bioactivas.
lípidos de MSCs a células lesionadas resultando en
Reparación de tejidos [21, 22]. En modelos de roedores, estos EVs.
fueron tan terapéuticamente eficaces como las MSC en E. coli
lesión pulmonar aguda inducida por endotoxina (ALI) y E.
neumonía grave inducida por coli en ratones [20, 23].
Debido a su estrecha similitud en anatomía, fisiología,
e inmunología para los humanos, los cerdos se utilizan como una gran
Modelo preclínico animal para diversas enfermedades humanas,
Incluyendo enfermedades respiratorias y medicina regenerativa.
[24, 25]. Además, los cerdos están infectados naturalmente.
con virus de la gripe como el epitelio respiratorio de
Los cerdos expresan receptores utilizados por aviares y mamíferos.
virus de la gripe [26]. Patogénesis del virus de la gripe
y los signos clínicos en cerdos también son similares a
Los observados en humanos. Así, los cerdos son un adecuado
Modelo animal grande para estudiar el virus de la influenza humana.
Patogenia y para probar la eficacia de la terapéutica.
Incluyendo MSCs o sus derivados para la influenza.
Khatri et al. Investigación y terapia con células madre (2018) 9:17 Página 2 de 13
Métodos
Aislamiento de MSC y EV derivados de MSC
MSC de huesos de fémur de un comercial de 2 a 6 semanas de edad.
Los cerdos fueron aislados como se describió anteriormente [27, 28].
Brevemente, la punta de cada hueso fue removida y la
la médula se recogió insertando una aguja de jeringa en
un extremo del hueso y la gripe
scussion
En este estudio, aislamos EVs porcinos derivados de BM-MSC
y examinaron sus propiedades antivirales e inmunomoduladoras.
Propiedades en un modelo porcino del virus de la influenza. MSC-EVs
tenían forma redonda y, de manera similar a BM-MSC,
expresaron marcadores mesenquimales pero, a diferencia de MSC, los EV
Carecía de la expresión tanto de SLA-I como de II, mientras que
MSC expresados SLA-I. Es importante destacar que los MSC-EVs inhibidos

La actividad HA de los virus de influenza, suprimió la

replicación del virus de la influenza en células epiteliales de pulmón, y
replicación del virus de la gripe inhibida y proinflamatoria
Producción de citocinas en los pulmones de virus infectados.
cerdos
Aislamos y caracterizamos EVs de BMMSCs porcinos.
utilizando protocolos como se describe para humanos MSCderived
EVs [23, 29, 30]. En cuanto a los MSC-EV humanos, nosotros
También se utilizó TEM para determinar el tamaño y la morfología de
MSC-EVs. Distribución de tamaño de MSC-EV humanos también fue
determinado por nanotraqueo pero esta técnica no fue
Utilizado en este estudio. EVs derivados de MSC humanos expresados
Marcadores mesenquimales y carecía de la expresión de
Moléculas MHC [36]. En nuestro estudio, cerdos derivados de MSC.
Los VE también expresaron marcadores mesenquimales y la
expresión de ambos SLA-I y II no se detectó en
EV, sugiriendo que los MSC-EV de cerdo son similares a los humanos
MSC-EVs y serán útiles para entender los mecanismos
de los efectos terapéuticos mediados por MSC-EV en un cerdo
Modelo de enfermedades humanas.
Una serie de estudios han demostrado el beneficio
Efectos de los MSC-EV in vitro y en modelos animales de
Enfermedades pulmonares, renales y hepáticas [37, 38]. Además,
Varios estudios han demostrado que los EV ejercen su función terapéutica.
Efectos por la transferencia de su ARNm a enfermos
Células [20, 29, 39, 40]. En este estudio, la lucha contra la gripe.
La actividad del virus de MSC-EV en células epiteliales de pulmón fue
mediada por su contenido de ARNm como tratamiento previo de
EVs con la enzima RNase anuló la lucha contra la gripe
Actividad vírica de los EV. En un estudio reciente, Qian y
colegas [41] demostraron que los exosomas (Exo)
Aisladas de MSC derivadas de cordón umbilical inhibidas
replicación del virus de la hepatitis C (VHC) en la dermis humana
Fibroblasto de 7 células. Estos autores identificaron además cuatro
MiRNAs específicos de MSC-Exo con actividad anti-HCV.
Los miRNAs específicos de MSC-EV también se han implicado en
La regulación de la supervivencia celular, diferenciación e inmunomodulación.
[42, 43]. Los estudios futuros se centrarán en
identificando el ARNm y los miARN específicos de MSC-EV que
Puede jugar un papel en la regulación de las actividades contra la gripe
de MSC-EVs.
Uno de los mecanismos por los cuales los virus de la influenza.
causar daño pulmonar extenso y la mortalidad se debe a la
inducción de respuesta inflamatoria no regulada [44,
45]. De manera similar a los MSC, los EV derivados de MSC también poseen
Actividad inmunomoduladora [46–52]. En este estudio,
Los cerdos inoculados con MSC-EV mostraron significativamente menos pulmón
Inflamación y disminución de los niveles de proinflamatorios.
Producción de citoquinas y quimioquinas. Adicionalmente,
aumento de los niveles de citoquinas antiinflamatorias IL-10
Se observaron en cerdos administrados con MSC-EV. Estos datos
sugieren que, además de la actividad anti-influenza, los MSCEV
También ejercen sus actividades inmunomoduladoras y
Suprimir la respuesta inflamatoria en la gripe. Similar
según nuestros hallazgos, los MSC-EV causaron una disminución en la producción
de citoquinas inflamatorias y aumento de la producción de
IL-10 en un modelo de ratón de SDRA [20]. Monsel y
colegas [23] demostraron que MSC-EVs expresan
mRNA de la ciclooxigenasa (COX) -2, la enzima que induce
Síntesis de prostaglandina E2 (PGE2). PGE2 secretado
por MSC ha demostrado reprogramar proinflamatorio
Monocitos-macrófagos (M1) al antiinflamatorio.
(M2) tipo que produce altos niveles de IL-10 [53]. Adicionalmente,
Los MSC-EV interactúan con las células inmunes y causan
La producción de factor de crecimiento transformante (TGF) β

Conclusiones
En resumen, los EVs derivados de BM-MSC porcinos
Marcadores mesenquimales expresados, influenza inhibida.
Replicación del virus in vitro e in vivo, y atenuado.
ALI inducida por el virus de la gripe en un preclínico relevante
Modelo animal grande. Nuestros hallazgos sugieren que los MSCEVs
Puede ser una potencial terapia sin células para la aguda.
enfermedades inflamatorias incluyendo la gripe.