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ENZIMA INVERTASA DE LEVADURAS Saccharomyces cerevisiae

INTRODUCCIÓN

En esta práctica vamos a ver la acción de la invertasa y demostraremos entre
otras cosas la velocidad de la reacción que cataliza.

La invertasa se conseguirá de células de levadura del Saccharomyces cerevisiae
que se rompen por autólisis cuando se le agrega el cloroformo, trabajando
posteriormente con el sobrenadante.

Luego de “romper” las células de levadura desecadas por autolisis se determinará
la actividad específica y total del autolisado bruto una vez eliminado el debris
celular. La enzima bruta se purifica luego por eliminación del material
contaminante (proteínas y otras moléculas). Finalmente se determinara la
presencia de la enzima con la ayuda del reactivo de Benedict.

La actividad enzimática se pone de manifiesto incubando el sustrato de sacarosa
juntamente con la enzima y posteriormente paramos la reacción y medimos
colorimétricamente la reducción del ión cúprico (sulfato cúprico presente en el
reactivo de Benedict) a ión cuproso. Se basa en que la sacarosa no contiene
átomo de carbono anomérico libre y por lo tanto no es un azúcar reductor.

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también es susceptible de efectuar la reacción en sentido inverso: invertasa Sacarosa Fructosa + Glucosa En base a la reacción anterior. Bertheelot. en razón de la inversión (de + a -) de la rotación óptica durante la hidrólisis de la sacarosa. Más recientemente se han usado los nombres de invertasa. sucrasa. le llamó "ferment inversif". Las enzimas del tipo de la invertasa se encuentran presenten en el organismo de las abejas y en algunas levaduras. la sacarasa o invertasa es utilizada para hidrolizar la sacarosa y polisacáridos que presenten el mismo tipo de enlace (b-d- fructofuranosil). la cual desdobla la sacarosa en fructosa y glucosa. como todas las enzimas. En 1860. que se hallaba trabajando en la purificación de un enzima procedente de la levadura que hidrolizaba la sacarosa. ENZIMA INVERTASA DE LEVADURAS Saccharomyces cerevisiae MARCO TEÓRICO La invertasa es también conocida como sacarasa. Biotecnologíía Página 2 .

5] a una rotación negativa que es promedio de la rotación de la glucosa [+52. A la mezcla resultante de Fructosa y Glucosa se le denomina “Azúcar invertido” debido a la inversión de sus propiedades ópticas de una rotación positiva [ + 66. es una mezcla sobresaturada de glucosa y fructosa. cuando el ser humano consume azúcar común o sacarosa. ENZIMA INVERTASA DE LEVADURAS Saccharomyces cerevisiae sacarosa y β -fructofuranidasa para denominar la enzima hidrolizante de la sacarosa. En el caso de la sacarosa. incluyendo la industria del chocolate. la invertasa presente en la saliva y en tracto digestivo. estas moléculas quedan libres recuperando así su poder reductor. Muchos fructofuranósidos son susceptibles de hidrólisis por esta enzima. Biotecnologíía Página 3 . la cual. En algunos jarabes se utiliza también para aumentar sus propiedades edulcorantes.7] y de la fructosa [-92. pero la sacarosa es el mejor sustrato. Aparte de cambiar sus propiedades ópticas. poniendo asimismo su nombre de invertasa a la enzima fue Berthelot en 1860.4]. también cambian las propiedades químicas de las soluciones que son tratadas mediante invertasa. Fisiológicamente. La forma más común de este azúcar invertido la miel de abeja. El primero en describir esta propiedad. Normalmente se obtiene a partir de la levadura Saccharomyces cerevisiae y se utiliza en la confección de fórmulas que prevengan la cristalización de determinados preparados dulces. cataliza la reacción de rompimiento del enlace glucosídico haciendo que el procesamiento y asimilación de esta por su organismo sea bastante rápido. el tipo de enlace que subsiste entre sus moléculas enlazadas de fructosa y glucosa (que es a para la glucosa y b para la fructosa) impide que dicha molécula contenga terminales reductores (aldehídos o cetónicos). Otra aplicación es su utilización para la fabricación de rellenos blandos de caramelos. Al hidrolizarse. La reacción hidrolítica se mide observando el cambio de la rotación óptica o de poder reductor al incubar sacarosa con la enzima.

ENZIMA INVERTASA DE LEVADURAS Saccharomyces cerevisiae PARTE EXPERIMENTAL OBJETIVO  Determinar la actividad de la enzima invertasa de las levaduras Saccharomyces cerevisiae. mezclar hasta formar una pasta fina. Biotecnologíía Página 4 . Dejar en reposo durante 20 minutos. REACTIVOS  Reactivo de Benedict  Cloroformo  Solución de sacarosa 2% estéril MATERIALES Y EQUIPOS  Pipetas  Tubos de ensayo  Mortero y pilón  Papel de filtro  Cepa: Saccharomyces cerevisiae  Estufa Técnica operatoria a) Colocar en un mortero 10g de levadura Saccharomyces cerevisiae y 5ml de cloroformo (lisa la levadura para dejar libre a la enzima invertasa). b) Colocar en tubo A 4ml de solución de sacarosa 2% estéril y adicionar 1ml del filtrado. Agregar 10ml de agua destilada y mezclar. transcurrido el tiempo proceder a filtrar utilizando un papel de filtro.

d) Colocar en tubo C 4ml de agua destilada estéril y adicionar 1ml del filtrado. ENZIMA INVERTASA DE LEVADURAS Saccharomyces cerevisiae c) Colocar en tubo B 4ml de solución de sacarosa 2% estéril y adicionar 1ml de agua destilada. Biotecnologíía Página 5 .

calentar ligeramente los tubos en la llama del mechero y observar el cambio de coloración. TUBO A TUBO B Biotecnologíía Página 6 . f) Tomar 1ml de cada tubo y agregar el reactivo de Benedict. ENZIMA INVERTASA DE LEVADURAS Saccharomyces cerevisiae e) Incubar en una estufa los tres tubos a 37C durante 2 horas.

ENZIMA INVERTASA DE LEVADURAS Saccharomyces cerevisiae TUBO C RESULTADOS Biotecnologíía Página 7 .

puesto que el azúcar en solución forma un anillo de piranósico o furanósico. Biotecnologíía Página 8 . ENZIMA INVERTASA DE LEVADURAS Saccharomyces cerevisiae Tubo Nº1 Observó una coloración marrón. Una vez que el azúcar está lineal. Este nuevo ion se observa como un precipitado rojo ladrillo correspondiente al óxido cuproso (Cu2O). el ion cúprico (otorgado por el sulfato cúprico) es capaz de reducirse por efecto del grupo aldehído del azúcar (CHO) a su forma de Cu+. (+ + + +) El fundamento de esta reacción radica en que en un medio alcalino. El medio alcalino otorgado por el NaOH presente en el reactivo de Benedict facilita que el azúcar esté de forma lineal. Esto ocurre por las condiciones en que se realiza la prueba: en un medio alcalino caliente esta cetohexosa se tautomeriza (pasando por un intermediario enólico) a glucosa (que es capaz de reducir al ion cúprico). su grupo aldehído puede reaccionar con el ion cúprico en solución. En estos ensayos es posible observar que la fructosa (una cetopentosa) es capaz de dar positivo.

(-) DISCUSIÓN DE RESULTADOS Biotecnologíía Página 9 . ENZIMA INVERTASA DE LEVADURAS Saccharomyces cerevisiae Tubo Nº2 Observó una coloración Verde (+) Los disacáridos como la sacarosa (enlace α(1 → 2)O) y la trehalosa (enlace α(1→1)O). no dan positivo puesto que sus OH anoméricos están siendo utilizados en el enlace glucosídico Tubo Nº3 Observó una coloración azul.

 El azúcar sacarosa es hidrolizado en glucosa y fructosa. porque la enzima hidroliza la sacarosa que van a dar la glucosa y fructosa.  En el tercer tubo da una coloración verde. observándose el cambio color desde azul hasta marrón.  La glucosa es un agente reductor y el sulfato de cobre (SO 4Cu) es una agente oxidante. porque el reactivo Benedict no reacciona con ningún sustrato. estos reccionan con el reactivo de Benedict. porque no se da una reacción. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Biotecnologíía Página 10 .  En el segundo reactivo da una coloración azul. Como aspectos importantes a recordar de la práctica son:  El cloroformo permite la extracción de las enzimas de la levadura Saccharomyces cerevisiae que van actuar sobre el azúcar sacarosa. CONCLUSIONES  El primer tubo dió una coloración marrón.  La reacción química se potencia con el calentamiento y con el carbonato de sodio (CO3Na). ENZIMA INVERTASA DE LEVADURAS Saccharomyces cerevisiae La práctica tiene como finalidad la estimación de la actividad invertasa y específica del extracto de levadura de Saccharomyces cerevisiae.

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