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“Año del Diálogo y la Reconciliación Nacional”

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

TRABAJO DE INVESTIGACIÓN:

“TÉCNICA DE BIOLOGÍA MOLECULAR: PCR CONVENCIONAL Y
PCR EN TIEMPO REAL”
AUTORES:

ABADIE GALECIO, JOHN MARIO
CRUZ ORDINOLA, ANTHONELA LISBETH
GUERRERO LÓPEZ, YOMIRA
MERINO CORNEJO, BETSY
NEVADO PALACIOS, BRUNO
POZO FERRER, PAUL
RAMIREZ VERA, BRYAN
RAMOS CHUQUIMARCA, TOMAS
SILVA MOSCOL, SAIRA
VALDIVIEZO VASQUEZ, EDUARDO
DOCENTES:

DR. REYES CHAVEZ, DANIEL

DRA. CRUZ OJEDA, ROSA

DRA. SILUPU GARCIA, CARMEN

CURSO:

MICROBIOLOGÍA
-2018-
1

INDICE

I. INTRODUCCION A LA BIOLOGIA MOLECULAR…………………………………………….....4
II. BASES MOLECUALES DEL ADN……………………………………………………………………….4
III. BASES MOLECULARES DEL ARN…………………………………………………………………...15
IV. INTRODUCCION DEL PCR……………………………………………………………………………..15
V. PCR CONVENCIONAL……………………………………………………………………………………16
 DEFINICION………………………………………………………………………………………………… 17
 ELEMENTOS QUE SE UTILIZAN …………………………………………………………………….17
 ETAPAS………………………………………………………………………………………………………..21
 APLICACIÓN CLINICA……………………………………………………………………………………22
 VENTAJAS Y DESVENTAJAS………………………………………………………………………….25
VI. PCR EN TIEMPO REAL………………………………………………………………………………….27
 DEFINICION………………………………………………………………………………………………...27
 FUNDAMENTO……………………………………………………………………………………………28
 PROCEDIMIENTO………………………………………………………………………………………..29
 APLICACIÓN………………………………………………………………………………………………..31
 VENTAJAS Y DESVENTAJAS………………………………………………………………………….32
VII. CONCLUSIONES…………………………………………………………………………………………..36
VIII. BIBLIOGRAFIA……………………………………………………………………………………………..37

2

OBJETIVOS

 La técnica PCR se fundamenta en la propiedad natural de las polimerasas para replicar
hebras de ADN y tiene como objetivo obtener un gran número de copias de un
fragmento de ADN, por lo que es posible partir de muy pequeñas cantidades de un
agente infeccioso y realizar una detección fiable del mismo.

 El objetivo de la PCR es producir suficiente ADN de la región blanco para que pueda
analizarse o usarse de alguna otra manera.

 Describir el proceso de la reacción en cadena de la polimerasa o PCR.

 Detallar los componentes necesarios para llevar a cabo una PCR.

 Predecir cómo afecta al resultado de la PCR la modificación de factores como la
temperatura o la concentración de alguno de los componentes de la reacción.

3

existe la posibilidad de entender todo acerca de esta disciplina desde sus bases.coli solo tiene 4. los seres humanos tendríamos una cantidad mayor de ADN que los organismos vegetales.  ESTRUCTURA DEL ADN El ADN Ácido desoxirribonucleico. BASES MOLECULARES DE ADN El ADN se encuentra en múltiples seres vivos. que servirán para que cada pequeño segmento de cada hélice del ADN se enrolle alrededor. siendo que cuando más complejo es el organismo. Si desenrolláramos la molécula única contenida dentro de un cromosoma. por lo general. la célula humana posee 46 cromosomas organizados en 23 pares (22 pares somáticos y 1 par sexual). Sin embargo. la cual será necesaria para la producción de sus proteínas que. para así tener la oportunidad de advertir claramente los aspectos relacionados al diagnóstico. En los eucariotas. serán las responsables de determinar la función biológica del gen o la patología de la enfermedad. finalmente. Por otro lado. los seres humanos tenemos 3200 millones de pares de bases en nuestros genomas. denominadas histonas. 1. a todas las pruebas o procedimientos que se usan para aislar ácidos nucleicos. INTRODUCCION DE BIOLOGIA MOLECULAR Al hablar de Biología Molecular estamos entrando en un campo amplio que. mientras que la bacteria E. en muchos casos.6 millones de pares de bases. en la cual deberá empaquetarse gran cantidad de información genética en un pequeño espacio dentro de la célula. el cual no solo permitió conocer la estructura tridimensional del ADN. podría llegar a medir varios centímetros de largo. Así también. El ADN es una molécula bastante larga. a pesar de su gran tamaño. quizás. extrayéndolos con alta pureza para poder estudiarlos en diversas aplicaciones que. por lo que es considerada una macromolécula. las hélices de ADN se enrollan dentro del núcleo conformando los cromosomas. posee una estructura relativamente simple. El inicio de la Biología Molecular se puede resumir en el descubrimiento de la doble hebra de ADN por James Watson y Francis Crick en el año 1953. puede ocasionar confusión o creer que se trata de un tema complicado. la azucena tiene 30 veces más ADN que nosotros (aproximadamente 90 000 millones de pares de bases). sino que marcó el comienzo de la nueva era del estudio de la genética y la herencia Se conocen como técnicas de Biología Molecular. Sin embargo. es aquel que contiene toda la información genética del organismo en la mayoría de seres vivos. Por ejemplo. este tendrá mayor cantidad de información genética. incluye el diagnóstico de enfermedades. se debería concluir que. El gen será una secuencia de ADN que codificará una molécula compleja. 2. sin embargo. 4 . existe una gran cantidad de proteínas.

una base nitrogenada y un fosfato. Se debe recordar que cada azúcar posee 5´ átomos de carbono se puede explicar más fácilmente en que el grupo fosfato que se une siempre al átomo de carbono 5 del azúcar del nucleótido. que es común en ambos ácidos nucleicos ADN y ARN y el uracilo que sólo se encuentra en el ARN. Siendo que la base de una cadena que se une por los puentes de hidrógeno con la base de otra cadena formando un par de bases. ya que diferentes enzimas celulares reconocerán esas diferencias para poder interactuar con el ácido nucleico respectivamente. es decir. Otros componentes del nucleótido del ADN Serán las bases nitrogenadas. Para el primer grupo. Estás bases se van unir mediante puentes de hidrógeno. El nucleótido puede estar conformado por uno dos tres grupos de fosfato a los que se les designa: alfa. 5 .  UNIDAD PRINCIPAL DEL ADN: NUCLEOTIDO El ADN es un polímero. que es una gran molécula formada por moléculas más pequeñas unidas entre sí que son los monómeros. La pentosa y la base nitrogenada serán los que hagan diferencia con él ARN. El último componente será el grupo fosfato. Recordar que este puente de hidrógeno es termosensible y su unión es reversible aspectos bioquímicos esenciales para comprender los primeros pasos de la reacción en cadena polimerasa (PCR) principal técnica utilizada para el diagnóstico molecular. Estos están compuestos principalmente por unidades llamadas nucleótidos y estos a su vez están formados por azúcares como: la pentosa. de las cuales tenemos dos tipos: las purinas (la adenosina y la guanina) y las pirimidinas (la tiamina y la citosina). beta y Gamma. el segundo grupo y tercer grupo respectivamente. el cual está formado por un átomo de fósforo unido a cuatro átomos de oxígeno y son los que portaran la carga negativa al nucleótido convirtiendo el ADN en una molécula ácida.

en tanto que la parte externa de los grupos fosfatos y los azúcares que es hidrofilica. El conjunto de enlaces covalentes los cuales se unen a una serie de nucleótidos se le conoce como cadena polinucleotídica. 34 nm. Esta polaridad le dará a ambos extremos de los nucleótidos o cadenas nucleótidos propiedades químicas y biológicamente diferentes. guanosina. De este modo una purina se encontrará enfrentada y unida a una pirimidina de la otra cadena. conocido como el término 3 y 5 enlace fosfodiester. Ese tipo de enlace covalente se formará por acción de la enzima ADN polimerasa durante el proceso de replicación y síntesis del nuevo ADN. de todos los posibles cambios o modificaciones químicas que podrían ocurrir debido al ambiente. por otro lado está conformado por una base y un azúcar. Las dos hebras o cadenas existen como una molécula helicoidal dextrógira. este se diferencia del nucleótido por no contar con el grupo fosfato en su estructura. Su tipo de estructura va a proteger a todos los átomos importantes que componen las bases. El diámetro de la hélice es de 2 nm y la distancia entre cada par de base es de 0. esta brindada por sus dos cadenas o hebras que giran hacia la derecha como un tornillo. se encuentran en posición antiparalela y orientada de 5 a 3 en direcciones opuestas. timidina y citidina. Este espiral de sentido de las agujas del reloj y posee alrededor de 10 pares de bases por cada giro de 360 grados de doble hélice. Son finalmente un tipo de enlace covalente. En la parte interna de la doble hélice encontramos a las bases nitrogenadas. los cuales están conectados mediante enlaces fosfodiester. que es el lado hidrófobico. Unidos a través de un enlace covalente. Dentro de los nucleosidos tenemos: adenosina. Esto quiere decir el extremo 5 de una hebra se encontrará mirando puesta mente al extremo 3 de la otra cadena. estos se unen al carbono 3´ del azúcar de un nucleótido a través del grupo fosfato Y al carbono 5´ del azúcar del nucleótido siguiente. Todas las cadenas finalmente tienen una polaridad con un extremo que será 3´ y 5´. siendo el número de purinas igual al número de pirimidinas los cuales estarán unidas por puentes de hidrógeno. 6 .  ADN TRIDIMENCIONAL La forma tridimensional del ADN. enrollándose alrededor de un eje formando una doble hélice.El ADN está formado por muchos nucleótidos. El nucleosido. La gran longitud de la molécula de ADN hace que sea susceptible rotura debido a las fuerzas de cizallamiento hidrodinámica.

LA ESTRUCTURA SECUNDARIA Está constituida por el modelo de doble hélice. observándose un proceso de transcripción lento o nulo en las secuencias metiladas. la metilación es mucho más compleja y diferente. que podría corresponder al de un virus. mediante la acción de diferentes enzimas. existen otras estructuras secundarias la más común y estable es aquella que encontramos fisiológicamente y que se conoce como B-ADN o ADN tipo B. Watson y Crick en 1953. En los organismos eucariotas.  ESTRUCTURA PRIMARIA. el metilar se pueden diferenciarse en un ADN no metilado o extraño. TERCIARIA Y CUATERNARIA ESTRUCTURA PRIMARIA Está conformada por cadenas polinucleotídicas. 7 . Algunos microorganismos como las bacterias pueden modificar su estructura primaria en diversas ocasiones. Este proceso conocido como metilación de ADN. SECUNDARIA. desencadenando que las propias bacterias corten cualquier ADN extraño no metilado que encuentren. Esta forma fue descubierta por la utilización del análisis de difracción de las fibras del ADN y con ayuda de los datos proporcionados por Rosalind Franklin. Aparte de la estructura tridimensional típica. por ejemplo. esto es importante debido a que la diferencia de la información genética entre unos y otros radica en la distinta secuencia de bases nitrogenadas. descubierto y descrito por Watson y Crick. mientras que en las áreas no metiladas se realiza activa y regularmente. es una modificación en el cual añade grupos de metilo (-CH3) a ciertas posiciones de las bases nucleotidicas. la modificación afecta el proceso de transcripción.

El enrollamiento final que sufren los nucleosomas forma el solenoide. ESTRUCTURA CUATERNARIA Normalmente. siendo cada hebra una plantilla de replicación para las moléculas hijas. y es formada previa a la replicación del ADN. la cromatina en el núcleo celular tiene un grosor de 300 A. y para esto pueda ocurrir. En los procariotas el ADN es de forma circular y asociado a las proteínas. ya que sus componentes son azúcar-fosfato se encuentran zigzagueando de adelante hacia atrás. más ancha y con sus bases inclinadas alejándose al eje principal. Este tipo de estructura varía y es diferente según el tipo de organismo del que se hable. la cual deberá súper enrollarse y empaquetarse para poder ocupar un pequeño espacio dentro de las células. 8 .Aparte existe formas A-ADN y Z-ADN. la cromatina de 100 A tiene que empaquetar. y está formada por 11 pares de base por cada giro de 360 de hélice. y se va a formar cuando una molécula de ADN es colocada en una solución de alta concentración Salina. en las eucariotas el ADN es una macromolécula y el empaquetamiento es mucho más complejo y Compacto. se junta y pliega como una súper elise al igual que en las mitocondrias. ESTRUCTURA TERCIARIA Comprende el tipo de almacenamiento de ADN o forma que adquiere dentro de un espacio pequeño para finalmente formar los cromosomas. la segunda recibe el nombre ziczac-Z. que posee 6 nucleosomas por vuelta. siendo más corta. La primera se presenta cuando no existen grandes cantidades de agua. ya que está presente en las cadenas simples de los nucleótidos. una horquilla está compuesta por un tallo región de bases apareadas y algunas ocasiones por un bucle región de bases no apareadas. los solenoides son aquellas que se enrollan formando la cromatina característica del núcleo de las células eucariotas. Otro tipo de estructura secundaria viene dado por la formación de la horquilla. Recordamos que el ADN es una macromolécula llena de grandes cantidades de información.

Toda la información dispuesta de El ADN de un organismo se le denomina genoma. se conoce como horquilla de replicación. así como de varios pasos. y que actuará como molde para la síntesis de la nueva hebra hija complementaria. es importante recordar que cada hebra de ADN contiene una secuencia de nucleótidos complementaria. de tal forma que las dos moléculas de ADN hijas resultantes tengan la misma información genética que el progenitor original. Al dividirse cada célula. Un error de esta replicación Podría tener consecuencias catastróficas. Finalmente. La unión entre ambas cadenas de la plantilla que acaban de ser separadas. y el ADN doble no duplicado. En los organismos procariotas la replicación celular comenzará en un solo sitio. y en los eucariotas inicia en varios puntos a lo largo de la cadena. es copiar una molécula de ADN. cuando la helicasa va rompiendo la doble cadena viaja y se va separando en dos simples. aquí. cada una servirá de molde o plantilla para la síntesis de una nueva cadena.  REPLICACIÓN DEL ADN El propósito de la replicación del ADN. Y contiene la información para la síntesis de todas las proteínas que el organismo sintetizara. cada nueva cadena hija recién formada se mantiene unida a la cadena original de ADN que usó como plantilla mediante un enlace de hidrógeno. el genoma debe ser copiado para ser traspasado a sus células hijas. en el proceso de transcripción y traducción. 9 . Este proceso necesita de la aparición de diferentes proteínas y enzimas. cada nueva doble hélice formada contiene una cadena de ADN original y una hebra sintetizada Di Novo que será la complementaria de la hebra madre. ya que estos errores suelen convertirse permanentes en el genoma del individuo y se transmitirán a las generaciones posteriores. quiere decir que al separarse las dos cadenas complementarias de ADN original. Así la horquilla de replicación es la Y que se observa al microscopio. La replicación es un proceso complejo y semiconservador.

La estructura de ADN tridimensional está compuesta por numerosos enlaces covalentes. que se une a una cadena de ADN y comienza a recorrerla a lo largo. Existe un solo punto de crecimiento que se moverá alrededor del ADN circular hasta que la replicación se completa. este proceso puede ser unidireccional o bidireccional. pero en direcciones opuestas hasta el lado opuesto del círculo. por lo cual. los organismos procariotas son unidireccionales ya que existe un único cromosoma circular con un único origen de replicación. haciendo el ADN sea inaccesible o imposible de ser copiado. se moverán al mismo tiempo. proteínas ligantes de ADN monocatenario o SSB necesarias para prevenir que el ADN monocatenario por acción de las helicasas se hidroliza por nucleasas o se vuelva a pegar. En el caso de la replicación unidireccional. Sin embargo. como explicamos. lo que da como resultado dos moléculas de ADN circulares. la polimerasa del ADN. además. la síntesis de las dos horquillas de replicación se producen en direcciones opuestas a partir de un mismo inició. 10 . requieren energía necesaria para poder desarrollar la doble hélice. Por esta razón se necesitan diferentes enzimas. para que la enzima de ADN ligasa comience la unión de los nucleótidos sucesivos de ADN usando los enlaces fosfato como fuente de energía para lograr uniones. Dentro de las enzimas tenemos las helicasas que. y su longitud hace que deba plegarse y empaquetar se para poder ocupar un pequeño espacio en la célula. En la bidireccional habrá dos puntos de inicio para el comienzo de la replicación que.Según el tipo de microorganismo que replicará su ADN. Existen evidencia que las bacterias y las células eucariotas tiene un proceso bidireccional. fuerzas y energía que participen en diversos procesos de la replicación y la transcripción.

conocido como primer o cebador. ahora monocatenario. todo ese proceso se divide en tres fases iniciación. y está caracterizado por la síntesis de las nuevas cadenas de ADN. Serán las encargadas de mantener el ADN. la hebra complementaria se denominará retrasada. de forma estable.así también es importante recalcar la función de la topoisomerasa. que serán las enzimas encargadas de eliminar los superenrollamiento es que pueden formarse en la doble cadena de ADN por delante de la horquilla. Estos segmentos que van sintetizando de a pocos en la cadena retrasada. una sola hebra se formará y copiar a de modo continuo y mucho más rápido en esa dirección. debido a que el extremo 5 recién estará disponible luego de que la enzima ADN helicasa haya realizado su función de separar ambas hebras. las proteínas SSB van uniéndose rápidamente a la hebra y así mantienen la hebra estable . Estos cebadores también son utilizados en el laboratorio para poder reconocer. comienzan con la acción de las enzimas de ADN helicasa. En las células procariotas es más sencillo el proceso. ya que realizará la replicación por secciones. y así impedir que por acción de las helicasas se hidroliza o se forme nuevamente una doble hélice al plegarse. de novia no sé hebra conductora o adelantada. Cuando la molécula superenrollada del ADN empieza a aflojarse y a soltarse.Recordemos que sobre cada una de las cadenas separadas se ensambla una secuencia complementaria de nucleótidos en dirección contraria a la 35 de la cadena de ADN. mientras que las helicasas van avanzando realizando su función. El siguiente grupo de enzimas llamadas proteínas SSB. específicamente el blanco molecular que uno pretende amplificar o reconocer Esto dependerá del diseño que se haga de estos cebadores los cuales se desarrollan según las diferentes bases de datos de los diferentes genomas tales como pubmed esos cebadores son la clave principal de la especificidad de la detección. se necesita de un iniciador del proceso de secuencia de inicio. y la horquilla de replicación irá en dirección de 53 en la hebra rezagada y de 35 en hebra adelantada. Una para cada futura hija de ADN. Ya que la síntesis del nuevo material genético corren dirección de 5 a 3. se conoce con el nombre de fragmentos de okazaki. LA ELONGACIÓN Será el siguiente paso del proceso de replicación. permitiendo que la horquilla de replicación puede avanzar. ya que si uno de ellos es complementario con una porción de un virus o bacteria diferente a lo que pretendemos encontrar Podrían haber falsos positivos. gracias a la acción de la enzima ADN polimerasa III. En las células eucariotas. elongación y terminación. esas enzimas catalizan la separación de las dos cadenas del ADN dúplex como serruchando los peldaños de la escalera por la mitad. la porción más lineal de la doble hélice se separa en dos hebras componentes. LA INICIACIÓN Tanto en organismos procariotas como eucariotas. los cuales van desarrollando la doble hélice al romper los puentes de hidrógeno que las mantienen unidas. para que el proceso inicia. va añadiendo 11 . En esta fase se necesitará de energía en forma de ATP. Por su parte. en la cual el ADN polimerasa reconocer el sitio donde debe unirse y comenzar la replicación. el cual es un segmento corto de ADN que se va a adherir al extremo 3 de las cadenas de ADN. Luego.

se observará que existe un espacio entre el extremo 3 (OH) libre y el fosfato 5 de la nueva cadena sintetizada. 12 . el primer está encargado de eliminar el ARN en dirección de 5  3 que. y significará que todo el cromosoma sido replicado. Se dará sólo una vez ya que sólo existe un cebador para que pueda eliminarse el cebador es necesaria la participación de 2 enzimas el ADN polimerasa I y ADN ligasa. llegará un momento en el cual se encuentre. con dos horquillas de replicación que van avanzando una en sentido opuesto de la otra conforme Avanza en ambas horquillas.nucleótidos uno por uno sobre el ADN en crecimiento. Una parte del ADN polimerasa III sintetiza la hebra adelantada y la otra parte la hebra retardada. En el caso de la hebra adelantada. se fusionen ambas Burbujas de replicación. va rellenando con ADN en dirección de 5  3. al mismo tiempo. contacto con el extremo del fragmento okazaki contiguo. y es aquí donde la segunda encima de ADN ligasas. LA TERMINACIÓN Es la última fase de la replicación deberá cuando la enzima ADN polimerasa 3 se encuentre con la secuencia de terminación desacoplando se todo el replicoma y dando fin al proceso de replicación. se encargará de Eliminar esta rotura mediante la condensación entre el grupo fosfato de una cadena y el grupo hidroxilo (OH) de la desoxirribosa del nucleótido siguiente es decir mediante un enlace fosfodiester. es de proceso de eliminación de cebador. podrán ser Unidos y completar la formación de la doble hélice del ADN. al final. su cebador ser eliminado Y ambos fragmentos de okazaki recién formados. finalmente. Cuando el ADN polimerasa III haga. esta formación de la nueva cadena se va a dar en dos direcciones desde cada punto de inicio.

Se clasifican en: pequeñas inserciones. isocromosomas). y sustituciones dentro de las sustituciones. cromosomas dicentricos. ocurriendo una mutación genómica cada 25 a 50 divisiones meióticas. microdeleciones. Su frecuencia es de 6 por 10 4 /división celular. Existen las transiciones (cambio de una pirimidina a otra o cambios de una purina otra) y las transversiones (cambio de purina- pirimidina o viceversa).  DAÑO DEL ADN Y MUTACIONES MUTACIONES GÉNICAS También denominada mutaciones moleculares o puntuales. duplicación. MUTACIONES GENOMICAS Suceden cuando ocurre la ganancia o la pérdida de todo un cromosoma entero (o varios). Cuando el número de cromosomas es múltiplo Exacto del número haploide se utilizará el sufijo “ploidia” como triploide. Su frecuencia es de aproximadamente 102/ división celular. Ese tipo de mutaciones ocurre por la no disyunción o la meiosis. Daño por rotura de doble cadena o cadena simple del ADN 13 . afectan a una sola base o un número pequeño de bases y se denominan moleculares porque necesitan de técnicas de análisis genético molecular para poder ser detectadas. clasificándose en: reordenamiento desequilibrados (delección. Suceden debido a la recombinación no homologa entre los cromosomas. tetraploide y por lo contrario si el número de cromosomas no es múltiplo Exacto el número haploide se llamará aneuploide como la trisomía o monosomía. MUTACIONES CROMOSOMICAS Pueden afectar una parte de uno o varios cromosomas. sin conocer la causa exacta de esto. OTROS . o funciones como reordenamiento o translocación. reordenamientos equilibrados (inversiones para céntricas o pericéntricas) y translocaciones (reciprocas o robertsonianas). cromosomas en anillo.

a través de la respuesta transcripcional que cambiará el perfil de los genes o activando el proceso de muerte celular programada (apoptosis) y así eliminar las células con mutaciones como son potencialmente severas y catastróficas. Es una ventaja que ayudará a mantener y replicar las mutaciones favorables. LA UNION DE ESTREMOS NO HOMOLOGOS Puede realizarse fuera del ciclo celular sin la necesidad de una plantilla de ADN. Las células tienen dos mecanismos o formas principales de reparar el daño por roturas de doble cadena LA RECOMBINACIÓN HOMOLOGA Requiere de la presencia de su plantilla homologa para poder ser reparada. REPARACION POR ESCISIÓN DE NUCLEÓTIDOS La enzima ABC escinucleasa es capaz de reconocer lesiones y realizar los cortes hidroliticos a nivel de la cadena dañada. Los cuáles podrían ser causa de lesiones oxidativas en el ADN. LA ELIMINACIÓN DE LOS AGENTES MUTAGENOS Otra forma de reparación. y así la enzima ADN ligasa pueda generar una cadena continua. liberando así el fragmento que contiene las bases dañadas o alteradas. activando los puntos de control del daño del ADN. Errores de replicación  MECANISMO DE REPARACION DEL ADN Cuando ocurre algún tipo de daño en el ADN. la superóxido dismutasa evitará la acumulación de radicales superóxido. en el mecanismo de reparación más común está regulado por la unión directa de los extremos de la cadena de ADN rota. Sustituciones de nucleótidos o análogos de bases . también elimina las mutaciones desfavorables. 14 . el organismo desencadena diferentes respuestas para controlarla y corregirlo: eliminando el daño y. a la vez. En eucariotas. restaurando la continuidad de la doble cadena. Se encarga de neutralizar compuestos mutagenos. que más que todo previene que se produzcan lesiones. . la cual formarán complejo junto con el cofactor XRCC4. y los cuales van a detener el ciclo celular y reparar el daño antes de que se transmita. y causar mutaciones. Es aquí cuando el ADN polimerasa I formará un nuevo fragmento de ADN que sustituye al eliminado. en la fase S y G2 del ciclo celular: es el intercambio qué ocurre entre dos moléculas homólogas de ADN y así poder reestructurar la información genética. lo que le permite reparar el de DSBs luego de su replicación. Como por ejemplo. aquí principalmente actúa el ADN ligasa IV. dándole a cada individuo un juego único de información genética. ya que provoca dé lecciones o inserciones que serán inducidas en los sitios de reparación. un yendo directamente ambos extremos.

en la 2´ un grupo hidroxilo y por último. también conocida como estructura en horquilla y bucle o tallo y bucle. En ciertas ocasiones la adenina puede aparearse con el uracilo. lo que da lugar a un plegamiento sobre sí y la posterior formación de estructuras complejas. Esta estructura se expresa tanto en eucariotas como en procariotas.  Estructura terciaria: Hace referencia a la manera como se acomodan tridimensionalmente los nucleótidos en la molécula del ARN. El ARN es importante para el proceso de transcripción. Estructura del ARN: En el año 1950 se puso en marcha la investigación y el estudio del ARN. Al haber un apareamiento. Entonces. Los ribonucleótidos están formados por ribosa y se enumera del 1´ al 5´. un grupo fosfato que une a la ribosa de la posición 3´ a la 5´. El ácido ribonucleico es un polímero que posee una longitud que puede variar entre 65 y 200 000 nucleótidos (llamados ribonucleótidos o ribonucleótido 5´ monofosfato. el tallo y el bucle respectivamente. conformada por un gran número de enlaces de puente de hidrógeno. Los brazos y bucles plegados entre sí se mantienen unidos no solo por emparejamiento de bases. El ARN es lineal y generalmente de hebra sencilla. siendo el ribosoma el primer claro ejemplo de la complejidad que presentaba el ARN. sino también por 15 . Muchos científicos afirman que con el plegamiento del ARN se da lugar a una estructura adicional. Se pueden identificar hasta 3 estructuras del ARN.BASES MOLECULARES DEL ARN E INTRODUCCIÓN DEL PCR Bases moleculares del ARN El ácido ribonucleico (ARN) es un ácido nucleico formado por una cadena de ribonucleótidos. claro en excepciones como en los virus donde el genoma puede ser de doble hebra. para la síntesis de proteínas. Dicha estructura. en el carbono 1´ se posiciona la base nitrogenada.  Estructura secundaria: La estructura secundaria. Tan solo una molécula de ARN puede contar con innumerables horquillas. las cadenas serán antiparalelas. para la lectura y el mantenimiento de la información en el genoma y. La horquilla tendrá una región de bases apareadas como de no apareadas. es aquella donde Existen regiones con secuencias complementarias capaces de aparearse. Cuando se forman puentes de hidrógeno complementarios se da origen a la segunda estructura. además de otros enlaces que son más débiles. además.  Estructura primaria: Esta estructura básica sigue una dirección de 5´ a 3´ y se refiere a la secuencia de ribonucleótidos que al formar los codones finalmente codifican el orden de los aminoácidos de las proteínas que generarán con la traducción. siendo de vital importancia para microorganismos como los ARN virus. la terciaria. El grupo hidroxilo libre en el carbono 2´ da la posibilidad de que esta molécula sea degradada de manera rápida en un ambiente alcalino. dicha ribosa se une a un grupo OH en el átomo de carbono 2´. mientras que la base nitrogenada es reemplazada por uracilo. por lo que la citosina se aparea con la guanina y la adenina con el uracilo.

para la síntesis proteica. definiéndose como monocistrónicos.Coli y nucleótidos trifosfatados. permitiendo a los investigadores producir cantidades ilimitadas de ADN específico y asimismo estudiarlas y manipularlas de una mejor manera. el ARN ribosómico se combina con las proteínas para formar ribosomas. mediante su secuencia nuleotídica. Sin duda alguna la invención de la reacción en cadena de la polimerasa produjo un salto tecnológico. 16 . llamándose policistrónicas Introducción del PCR La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una de las herramientas tecnológicas más importantes e innovadoras que han sido creadas en los laboratorios de genética molecular para el estudio de ácidos nucleicos y un posterior diagnóstico eficaz. El ARNm eucariótico contiene la información genética específica para una sola cadena polipeptídica.  ARN mensajero: Este ARN codifica las diferentes proteínas. la subunidad 30S del ribosoma contiene un ARNr 16S que mide aprox. una subunidad 50S con un ARN grande 23S de 2904 bases y un ARN pequeño 5S de 120 bases. En los eucariotas la subunidad 40S posee un ARN 18S de 1800 bases y en la subunidad 60S un ARN de 28S de 4500 bases y otro 5S de 120.  ARN de transferencia: Su función principal es fijar y transportar los aminoácidos libres hacia los ribosomas. 1541 bases. se logró una revolución en los protocolos experimentales en la biología molecular. desarrollando nuevas aplicaciones y variantes. Años después la técnica fue evolucionando y progresando. con estructura secundaria y terciaria y Participan en la traducción del ARNm. en esos tiempos. ya que. quién. probaron y realizaron algo distinto. La historia del PCR se remonta a la década de los 80 donde el Dr. gracias a su talento posteriormente obtendría un Premio Nobel. la cantidad limitada de ADN que se obtenía era una barrera para los investigadores. por lo que se dio como resultado el proceso de replicación exponencial del fragmento de ADN que fue flanqueado por los cebadores. interacciones entre bases que implican a más de dos nucleótidos. simplificando más las cosas para los científicos. Así pues. Consta de una cadena de diferente tamaño. el cambio de temperaturas cíclicas. Clasificación del ARN:  ARN ribosómico: Va a formar parte de los ribosomas y es el más abundante en las células. como parte de los ribosomas. asegurando el ordenamiento de aminoácidos recién incorporados. Por otro lado. el ARNm procariótico pueden codificar más de una proteína. utilizaron dos cebadores los cuales se alineaban con cada una de las hebras del ADN. junto a otros investigadores. En el año 193 fue cuando el Dra Mullis. Esta característica contribuye a que la molécula de ARN se mantenga plegada. A esto se le añadió un factor. El grupo OH ubicado en la posición 2´ de la ribosa funciona tanto como dador y aceptor de hidrógenos. En conclusión. al definir el orden en el que se van a unir los aminoácidos. Cabe mencionar que existe un ARNt específico para cada uno de los 20 aminoácidos que conforman las proteínas. al cual se le agregó ADN polimerasa I de la bacteria E. Kary Mullis (quién trabajó en la síntesis de oligonucleótidos y desarrolló el concepto de la PCR) fue el que tuvo el papel protagónico en este descubrimiento de una nueva técnica. En los procariotas.

Al final de la reacción. timina. si usamos como sustrato ADN genómico. Todos estos elementos interactúan en tres etapas principales de las que se compone la PCR: desnaturalización. Esta conversión se logra mediante una reacción conocida como transcripción reversa y controlada por la enzima transcriptasa reversa. ¿Qué elementos químicos se necesitan? Para conseguir una buena amplificación del fragmento de interés. para corroborar si se amplificó la secuencia blanco de interés. una solución amortiguadora o buffer y H2 O.Fundamentos ¿Qué es la PCR? La reacción en cadena de la polimerasa es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia blanco es copiada fielmente. los productos de la PCR o también llamados amplicones son analizados en geles de agarosa para confirmar si la reacción fue exitosa. la reacción aprovecha la actividad de la enzima ADN polimerasa que tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las células. los desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs: adenina. Este método fue copiado de los retro virus que usan una transcriptasa reversa para convertir su genoma de ARN en ADN duplicarse en millones de partículas virales. A continuación se explicarán cada uno de los puntos mencionados. y preparar una master mix con las cantidades exactas. También se puede conseguir los reactivos por separado. Los elementos importantes en la reacción son el templado o molde (ADN o ADNc). la ventaja es que el costo por cada reacción disminuye considerablemente. capaz de convertir el ARNm en una molécula de ADNc. los cuales están diseñados para establecer un sistema homogéneo en donde las condiciones de temperatura y tiempo necesarios no se modifiquen en cada uno de los ciclos. los oligonucleótidos o primers. por sus siglas en inglés). vienen en concentraciones estándar y necesitamos llevarlos a las concentraciones necesarias para nuestro protocolo. Para ello. el ión magnesio (Mg +). 17 . lo que nos brinda la ventaja de la facilidad de manipulación. pues traen las cantidades en las proporciones exactas. al igual que la calidad y cantidad de la muestra. entonces típicamente hablamos de una PCR. En la reacción. El ADNc se utiliza cuando analizamos la expresión del ARNm de algún gen de interés. Todos los reactivos necesarios para la PCR ahora vienen en Kits comerciales de Amplificación. Los equipos en donde se realiza la reacción son llamados termocicladores. la enzima. pero si usamos ADN complementario (ADNc) proveniente del ARNm (ácido ribonucleico mensajero) se le conoce como RT-PCR (Reverse Transcription-PCR. contar con todos los elementos de la PCR y en sus cantidades correctas es de vital importancia. citosina y guanina). hibridación y extensión.

actúan como cofactores de la polimerasa La concentración correcta de MgCl2 está alrededor de 1. Sin embargo. por lo que 24 concentraciones elevadas de dNTPs inhibirían la reacción al no tener la Taq polimerasa suficiente Mg como para incorporar los dNTPs. d. también es esencial experimentar con distintas cantidades de Mg ya que si se excede se puede dar una acumulación de productos inespecíficos debido a que aumenta la fuerza de atracción entre las cadenas. b) La temperatura de fusión de los primers (forward y reverse) deben ser similares. Tris (hidroximetil aminometano) y MgCl2. d) Se debe constatar que no existan secuencias complementarias entre los primes para evitar la formación de dímeros de primers DESOXINUCLEÓTIDOS TRIFOSFATOS (DNTPS.5 mM. y menor de 24 bases debido a que primers más largos (30-35 bases) disminuyen su rendimiento y los primers cortos son menos específicos. PRIMERS Debido a que la ADN polimerasa no puede colocar el primer nucleótido necesita de un una secuencia pequeña de nucleótidos (alrededor de 18-24 denominada primer o cebador de ADN) que sirve como punto de partida para el trabajo de la enzima por lo tanto para la elongación o elaboración de la nueva cadena. c) Entre las bases púricas y las bases pirimídícas debe haber una relación 1:1 o no mayor a 40:60%. Consta de un grupo de nucleótidos complementarios al inicio de la región de interés de la hebra molde y actúa como punto de inicio para que la ADN polimerasa inicie la adición de nucleótidos en su extremo 3’ del primer o cebador. cuando se utiliza concentraciones de 200 mM de cada uno de los dNTPs. En un volumen de reacción de 25 µl con esta concentración de dNTPs se sintetizarían entre 6-6. En esta mezcla el componente que más ayuda a la especificidad y rendimiento de la reacción es el MgCl2 debido a que los iones Mg2+ son fundamentales para la actividad de la Taq polimerasa. es decir tener una diferencia máxima 5 ° C para lograr una hibridación correcta.5 µg de ADN. Para una concentración de 200 µM de cada dNTP se suele añadir MgCl2 a una concentración de 1. es decir. La secuencia de los primers debe iniciar y terminar con 1 o 2 bases púricas como mínimo. por el contrario una disminución de la concentración ocasionará un menor rendimiento de la amplificación por la pobre hibridación de los fragmentos. Se debe tomar en cuenta las siguientes reglas al momento de elegir los primers a utilizar para la amplificación: a) La longitud de los primers debe ser mayor a 18.Entre los reactantes que no pueden faltar en un tubo de reacción para PCR tenemos: BUFFER DE AMPLIFICACIÓN Los buffer o tampones de PCR están formados por KCl.5 mM. Las concentraciones de desoxinucleotidos trifosfatos estarán alrededor de 200 µM para cada uno de ellos y necesariamente están relacionadas con las concentraciones de MgCl2. 18 . La concentración de dNTPs y de MgCl2 va relacionadas ya que el Mg es utilizado por la polimerasa para incorporar los dNTPs en la nueva cadena.

 De la cantidad del ADN: La reacción de secuencia es muy sensible a la concentración del ADN molde. Las cantidades esenciales de la Taq polimerasa para la síntesis de ADN están alrededor de 2 unidades en 25 µl de volumen final de reacción. es por esto que se utiliza la polimerasa extraída del Termus aquaticus. Su actividad está influenciada por la concentración de: dNTPs.  Calidad del ADN: Se debe utilizar un ADN de óptima calidad para evitar problemas en la amplificación y cantidades del mismo por encima o por debajo de los 5 ng. un pez cuya ADN polimerasa puede soportar dichas condiciones por ser termoestable. o tiene mejores condiciones de amplificación que otros. obteniendo secuencias truncadas) y las pequeñas cantidades producen intensidades de luz pequeñas que se pueden confundir con el ruido de fondo. Ciertos reactivos que se utilizan antes de la amplificación pueden modifican la actividad de la enzima como la urea 1M que la estimula y el SDS (sodio dodecilsulfato) o el etanol que a bajas concentraciones la inhiben. de Mg2+ y de ciertos iones monovalentes. El éxito o fracaso de la amplificación del ADN mediante la PCR depende de varios factores como:  Del marcador que se va a amplificar: Existen marcadores que poseen primers más específicos que otros. no amplifique todos los marcadores.TAQ-POLIMERASA La ADN polimerasa utilizada en la PCR es una enzima con características especiales necesarias para soportar los cambios de temperatura sin degradarse ni disminuir su rendimiento. es utilizado como molde por la Taq polimerasa para sintetizar nuevas cadenas polinucleotídicas por complementariedad de bases. cantidades altas disminuyen la reacción (los reactivos se consumen rápidamente. 19 . debido a la degradación o a una serie de contaminantes que pueden inhibir la actividad de la polimerasa. ADN MOLDE O “TEMPLATE" El ADN molde o template. Bajas concentraciones de KCl activan la síntesis de la Taq polimerasa en un 50-60% cuando la concentración es de 50 mM. en Genética Forense la cantidad óptima que asegura un rendimiento adecuado está en torno a 5 ng. a pesar de que altas cantidades no afectan su proceso pero si el costo final de cada reacción. Cuando el ADN se encuentra degradado debido a la acción de enzimas de restricción el que se obtenga o no como resultado en la amplificación dependerá del daño o no del fragmento a amplificar. por lo cual concentraciones elevadas de los mismos inhiben dicha actividad. Cuando se tiene un ADN no degradado pero ligado a distintos factores de contaminación se procede a diluir a la muestra para disminuir los contaminantes. es el ADN del cual se va a amplificar un determinado fragmento. teniendo en cuenta que el ADN se encuentre por encima del rango óptimo de sensibilidad de la PCR. Por lo que puede ocurrir que una cantidad determinada de ADN especialmente cuando se trata de cantidades pequeñas. Cuando el ADN obtenido no es de buena calidad se da resultados no deseados. Se debe hacer un estudio de validación y de sensibilidad al momento de utilizar un nuevo marcador para obtener una idea precisa con respecto a la mínima cantidad de ADN que se necesita para la amplificación del marcador en condiciones estándar.

ADYUVANTES DE LA PCR Estos mejoran el rendimiento y la especificidad de la PCR. 20 . por lo que no se dará una correcta hibridación de los primers y una posterior extensión. BSA: Es el adyuvante más utilizado a concentraciones por encima de 0. Desnaturalización: En esta etapa. manteniendo por unos minutos esta temperatura. Esta condición va estrechamente ligada con un apropiado protocolo de termociclaje que optimice la reacción. Cuando el ADN se desnaturaliza parcialmente éste regresa a su estado natural rápidamente.8 µg/µl aumenta la eficiencia de la PCR actuando como una proteína captadora de iones que pueden ser inhibidores de la Taq polimerasa. Se recomienda el uso del DMSO (dimetilsulfóxido). ¿Cómo funciona la reacción? Esta reacción se lleva a cabo en una serie 26 a 30 ciclos cada uno de los cuales incluye tres etapas principales: desnaturalización. produciéndose la rotura de los puentes de hidrógeno intercatenarios para separar las cadenas.  Termocicladores adecuados: Estos permiten facilitar las variaciones de temperatura y prevenir la pérdida o la contaminación cruzada de muestras al evaporarlas. del glicerol o BSA. hibridación y extensión. las cadenas de ADN son calentadas y separadas a una temperatura de 95 °C durante 20-30 segundos.

Se eleva la temperatura de 90 a 95ºC produciéndose la rotura de los puentes de hidrógeno intercatenarios para separar las cadenas. Si el diseño de los primers es el correcto y la temperatura es la adecuada. No obstante. HIBRIDACIÓN: “Esta fase se denomina también fase de “annealing” o de emparejamiento. cada primer exige una serie de estudios experimentales para determinar su temperatura de annealing específica ya que si la temperatura es muy baja la unión se hará de forma inespecífica y si es muy alta no se producirá una unión completa” 21 . por lo que no se dará una correcta hibridación de los primers y una posterior extensión. ETAPAS DEL PCR Esta reacción se lleva a cabo en una serie 26 a 30 ciclos cada uno de los cuales incluye tres fases o pasos: 1. DESNATURALIZACIÓN: El ADN molde se debe encontrar en forma de cadena sencilla. manteniendo por unos minutos esta temperatura. los primers se alinean al extremo 3’ del templado previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria. 2. Cuando el ADN se desnaturaliza parcialmente éste regresa a su estado natural rápidamente. ésta generalmente oscila entre 50-60 °C. es importante que la temperatura de hibridación o temperatura melting (Tm) sea la óptima. Un tiempo de 20 segundos es adecuado para fragmentos inferiores a 500 pb. “melting temperature”) depende de varios factores y es relativamente específica para cada primer.2Kb. Extensión: En esta fase los primers sirven de punto de inicio para que la Taq polimerasa sintetice ADN desde el extremo 5´ hacia el extremo 3' utilizando nucleótidos libres a una temperatura óptima de 72ºC ya que a esta temperatura la Taq polimerasa alcanza su máxima actividad. Para que se forme el complejo templado primers. Una vez que el ADN está desnaturalizado se disminuye la temperatura hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60ºC para que se pueda producir la unión de los primers a las secuencias flanqueantes del fragmento que se va a amplificar. La temperatura de fusión o annealing (Tm. mientras que 40 segundos es adecuado para fragmentos superiores a 1.Hibridación-Apareamiento ó “anneling”: En esta etapa. la estabilidad y especificidad del complejo será eficiente.

 HEPATITIS B : La técnica de PCR es la más sensible de las técnicas de biología molecular para la detección de DNA del virus de la hepatitis B. este hecho proporciona a la técnica de PCR una gran ESPECIFICIDAD. Un tiempo de 20 segundos es adecuado para fragmentos inferiores a 500 pb. El laboratorio Immunogen tiene actualmente montadas técnicas de PCR aplicables al diagnóstico y valoración de diversas enfermedades infecciosas. 3. EXTENSIÓN: En esta fase los primers sirven de punto de inicio para que la Taq polimerasa sintetice ADN desde el extremo 5´ hacia el extremo 3' utilizando nucleótidos libres a una temperatura óptima de 72ºC ya que a esta temperatura la Taq polimerasa alcanza su máxima actividad.2Kb. y al tipaje del sistema mayor de histocompatibilidad. a continuación se describen brevemente las ventajas potenciales de estas técnicas en cada una de las aplicaciones. mientras que 40 segundos es adecuado para fragmentos superiores a 1. La importancia del diagnóstico molecular de la hepatitis por VHB radica en los siguientes hechos: 22 . que la hace aplicable al diagnóstico de enfermedades infecciosas. Aplicaciones diagnósticas de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa disponibles en el laboratorio immunogen. neoplásicas y genéticas. APLICACIONES CLINICAS: La utilidad clínica de la técnica de PCR se basa en la existencia de secuencias de DNA que son específicas de distintos microorganismos y de distintos genes humanos normales y patológicos.

b) puede contribuir a la distinción entre hepatitis crónica persistente y hepatitis crónica activa. el diagnóstico serológico convencional de la infección VIH tiene el problema de que los anticuerpos anti-VIH de clase IgG pueden ser de origen materno. a) La determinación de DNA de VHB 94 en suero permite una estimación de la replicación viral más fiable que los métodos serológicos convencionales. la técnica de PCR destinada a la búsqueda de DNA provírico en las células mononucleares de sangre periférica es muy útil para hacer el diagnóstico precoz de infección VIH . d) La determinación de DNA de VHB en suero puede ser útil para la monitorización de la respuesta a tratamientos antivíricos. tales como la determinación de HBeAg y de anticuerpos anti-HBeAg . Tras la infección por VIH existe un periodo generalmente de 3 a 6 semanas de duración. En estos casos. durante el cual no hay anticuerpos anti-VIH detectables. b) Diagnóstico de la infección VIH durante el periodo de seroconversión. b) La pérdida de DNA de VHB indica ausencia ó reducción de la replicación viral. ya que los niveles séricos de RNA de VHC son menores en la primera de las formas de hepatitis. En estas circunstancias. ya que se ha observado una correlación inversa entre dicho nivel y la respuesta al tratamiento anti-vírico. y pueden persistir en el niño hasta durante 18 meses. c) Diagnóstico de la infección VIH en casos en los que la determinación de anticuerpos anti-VIH por "Western-blot" da resultados indeterminados. ya que la presencia de RNA de VHC precede a la aparición de dichos anticuerpos. En estos casos. c) El nivel de RNA de VHC circulante puede servir para la selección de pacientes para tratamiento con interferón. y frecuentemente predice la resolución de la enfermedad. c) La cantidad de DNA de VHB circulante puede servir para la selección de pacientes con hepatitis crónica B para tratamiento con interferón. En los niños recién nacidos.  HEPATITIS C: La importancia de la determinación del RNA del virus de la hepatitis C (VHC) en suero mediante RT. la búsqueda por PCR de DNA 23 . transmitidos a través de la placenta.PCR se basa en los siguientes hechos: a) Permite hacer un diagnóstico de la infección más precoz que la determinación de anticuerpos anti-VHC. d) El nivel de RNA de VHC circulante puede ser útil para la monitorización de la respuesta a tratamientos anti-víricos  INFECCIÓN POR EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VIH) En la infección por VIH las técnicas de PCR tienen las siguientes aplicaciones: a) Diagnóstico de la infección VIH en niños nacidos de madres infectadas. pero que puede ser bastante más largo. la PCR destinada a la búsqueda de DNA provírico en las células mononucleares de sangre periférica del niño es la técnica de elección para hacer el diagnóstico de infección VIH .

debido a la existencia de reacciones cruzadas.  INFECCIÓN POR CITOMEGALOVIRUS En la neumonitis por CMV. sin embargo. La técnica de PCR permite hacer el diagnóstico diferencial. una PCR negativa no excluye en estos casos la existencia de infección. la técnica de PCR tiene una sensibilidad del 83-87 %.  INFECCIÓN POR PAPILOMAVIRUS HUMANO (PVH) Puesto que el PVH no se ha podido cultivar.  INFECCIÓN POR CHLAMYDIA TRACHOMATIS La técnica de PCR ofrece niveles de sensibilidad y de especificidad similares a los de la técnica convencional de cultivo celular para el diagnóstico de infección por C. teniendo sobre la metodología de cultivo las ventajas de una mayor rapidez y de una menor complejidad técnica. para el diagnóstico de infección por CMV.provírico en las células mononucleares de sangre periférica es esencial para descartar que el resultado indeterminado del "Western-blot" sea debido a que el paciente se encuentra en una fase precoz de la infección VIH. la técnica de PCR es muy útil para descartar el diagnóstico de infección por CMV con un alto grado de certeza y con mayor rapidez que el cultivo viral. ya que es un procedimiento mucho más rápido que el cultivo. la técnica de PCR como procedimiento aislado tiene. trachomatis. Mediante la técnica de PCR se obtiene una prevalencia de infección por PVH mayor que la que se observa con otras técnicas 24 . la técnica de PCR tiene las siguientes aplicaciones: a) Diagnóstico de la infección. las técnicas de biología molecular son las únicas disponibles para la detección y el tipaje del virus. una especificidad relativamente baja pero una sensibilidad de 100% . Por tanto. Utilizando muestras de lavado broncoalveolar (BAL). Tomando como referencia el diagnóstico por cultivo. aunque también se pueden observar recidivas en pacientes en los que llega a desaparecer el DNA de CMV. Esta distinción puede no ser posible mediante la determinación de anticuerpos anti-VIH.Así. mediante el uso de pares de iniciadores y de sondas específicos para cada tipo de VIH .  TUBERCULOSIS El papel de las técnicas de PCR en el diagnóstico de tuberculosis pulmonar se ha evaluado en dos situaciones distintas: a) Diagnóstico de tuberculosis en los casos con baciloscopia negativa. la técnica del PCR puede ser muy útil para hacer el diagnóstico de tuberculosis en casos con baciloscopia negativa. un problema frecuente en pacientes ¡nmunodeprimidos. La combinación de la técnica de PCR con la tinción por inmunofluorescencia de macrófagos alveolares da una especificidad también del 100%. b) Monitorización de la eficacia del tratamiento anti-vírico. d) Distinción entre la infección por VIH1 y la infección por VIH-2. La persistencia de DNA de CMV en sangre tras el tratamiento anti-vírico puede predecir la recidiva de la enfermedad con un alto grado de certeza. pero una especificidad del 98-99% .

y nos serán útiles para mediante la electroforesis crear perfiles genéticos tanto de los presuntos progenitores como de los presuntos hijos. síntesis y reasociacion • Cada ciclo dura típicamente entre 3 a 5 min y se utiliza un termociclador que lleva un microprocesador para programar los cambios de temperaturas y el número de ciclos deseados 25 . mediante la técnica de PCR puede hacerse el tipado del virus. utilizando equipos relativamente poco sofisticados. • Una reacción de PCR típica consiste en 30 ciclos de desnaturalización. hace de la PCR la técnica de elección para el diagnóstico de infección por PVH. Además. tales como la hibridación "in situ" en biopsias (77% vs 68%) y la hibridación en medio líquido en frotis y en muestras de 96 orina (50% vs 22%) (21). y luego separándolos por medio de electroforesis. por lo que es una metodología válida para el estudio epidemiológico de los distintos tipos de PVH en la población Es de gran utilidad para el mapeo cromosómico y para el análisis de cambios en la estructura cromosómica. Esto.  TEST DE PATERNIDAD En la actualidad. unido a su mayor rapidez y a su mayor sencillez. • Crear sondas de hibridación específicas para una secuencia de interés. lo que se conoce como DNA fingerprint o huella digital de ADN. mediante la PCR conseguimos amplificar fragmentos polimórficos específicos de ADN (STR’s) que varían según el kit comercial. y comparar para obtener el porcentaje de posibilidad de que un acusado sea el verdadero progenitor biológico. mediante la obtención de multiples copias del DNA al amplificar ciertos segmentos polimórficos (variables en la población). • Investigar el desarrollo de las secuencias de un gen y las alteraciones de la secuencia en la función del cromosoma. • Amplificar y reconocer las secuencias blanco in situ  HUELLA DIGITAL GENÉTICA Esta técnica forense identifica a una persona comparando su perfil genético con el de una muestra obtenida. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL PCR VENTAJAS • RAPIDEZ Y SENCILLEZ DEL USO • La PCR permite clonar ADN en pocas horas. Con la PCR se ha logrado: • Identificar secuencias repetidas del genoma y utilizarlos como marcadores genéticos.moleculares. El mapeo cromosómico hace referencia a cualquier método empleado para determinar la localización y distancias relativas entre los genes en un cromosoma.

La aparición de numerosas aplicaciones (ciencia forense. • El método se ha empleado con éxito también para la amplificación de ADN de muestras de tejidos fijadas con formol. tendiendo hacia el extremo inferior • Los fragmentos pequeños se amplifican muy fácilmente. • Tamaño corto de los productos de la PCR • La información de que se dispones sobre la mayor parte de secuencias de donadas por PCR situa el tamaño de los fragmentos clonados entre 0 y 5kb. estudios de paleontología molecular. el hecho de que el método tenga una sensibilidad tan elevada significa también que se deben extremar las precauciones para evitar la contaminación de la muestra con ADN extraño • ROBUSTEZ • La PCR permite la amplificación de secuencias especificas de material que contiene ADN muy degradado o incluido en un medio que haces problemática su purificación convencional • Esto hace que el método resulte muy adecuado para estudios de antropología y paleontología molecular. incluso a partir de ADN contenido en una sola célula. DESVENTAJAS • Necesidad de disponer de información sobre la secuencia del ADN diana • Para poder construir oligonucleótidos específicos que actúen como cebadores para la amplificación selectiva de una secuencia de ADN se necesita: • Disponer de alguna información previa sobre la propia secuencia a amplificar. • Por supuesto el diseño y síntesis de los oligonucleótidos cebadores también leva tiempo. pero este proceso ha sido simplicado gracias a la apricion de programas informáticos para el diseño de los cebadores • Una vez que se pone a punto la reacción puede ser repetida de forma sencilla • SENSIBILIDAD • La PCR puede amplificar secuencias a partir de cantidades ínfimas de ADN diana. • La elevada sensibilidad ha permitido: • . pero conforme aumenta de tamaño es difícil obtener una amplificación diferente • INFEDILIDAD EN REPLICACION DEL ADN 26 . lo cual ha tenido importantes aplicaciones en patología molecular. etc.Desarrollo de nuevos métodos para el estudio de la patogénesis molecular • .) • Sin embargo. diagnostico.

27 . Los ensayos de la PCR en tiempo real son entre 10. Posee características importantes como alta especificidad. el vapor alcanza el ambiente del laboratorio.000 veces más sensibles que las pruebas de protección por ARNasa. evidenciado por un incremento en la fluorescencia producto de la adición de Bromuro de Etidio en la reacción. al utilizar la fase exponencial de la curva de amplificación. presentes inicialmente en la reacción. La cuantificación es muy utilizada en lo que refiere al análisis de expresión génica. PELIGRO DE CONTAMINACION • La facilidad con que se amplifica el ADN exige evitar el peligro de contaminación inherente al poder multiplicador de la reacción • En un tubo en el que se ha realizado una reacción de PCR hay que tal cantidad de ADN. La PCR en tiempo real es hoy una de las variantes más utilizadas. • Sin embargo. A menor número de copias presentes inicialmente.000 y 100. menor el número de ciclos necesarios para detectar fluorescencia. amplio rango de detección y rapidez en la visualización del producto ya que no es necesario realizar una electroforesis posterior. de mecanismos de lectura y corrección de errores. Además. utilizando una cámara para monitorear reacciones de PCR durante el curso del termociclado.000 veces más sensibles que la hibridación por Dot blot y pueden detectar diferencias de una sola copia del ADN. La PCR en tiempo real fue reportada por primera vez en un artículo de Higuchi y colaboradores. Mediante esta variación de la PCR es posible seguir la cinética de cada reacción en tiempo real. al correlacionar el producto de la PCR de cada uno de los ciclos con una señal de intensidad de fluorescencia. proceso asociado a una gran fidelidad de copiado debido a la existencia en la celula. Estos autores. por lo que permite una cuantificación sensible y específica del blanco que se desea analizar. cuando el ADN se replica in vitro la tasa de errores cometidos durante el copiado se dispara. que al salir caliente del termociclador y abrir este. esta técnica presenta un amplio rango dinámico de cuantificación. PCR EN TIEMPO REAL DEFINICIÓN: La PCR en tiempo real es una técnica que combina la amplificación y la detección en un mismo paso. El aumento de fluorescencia se relaciona directamente con el número de copias de la molécula que está siendo amplificada. detectaron la acumulación de ADN doble cadena en cada ciclo de PCR. • La clonación del ADN en células pasa por la replicación del ADN in vivo. 1. • Hay peligro de contaminarse con otro ADN incluso puede ser del mismo investigador o de otro.

en torno a los 95 °C. por ejemplo 80 °C. a 68 . nos referimos a una RT-qPCR. sólo que la forma en cómo se detectan y analizan los productos de la amplificación es diferente. tales como la enzima usada para la síntesis de ADN. Dado el pequeño tamaño de los fragmentos amplificados usualmente en este tipo de PCR puede omitirse el último paso. La nomenclatura que se usa también es diferente. El término en tiempo real se refiere a que la detección de los productos amplificados sucede en cada ciclo de la reacción. La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador con capacidad de hacer incidir sobre cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado. por lo general. llamados ciclos. Además. consiste en una serie de cambios de temperatura que se repiten 25 . Mg +. dNTP’s. son los mismos utilizados en la PCR punto final. algunos termocicladores añaden a cada ciclo unos segundos a otra temperatura. la segunda. Por su parte. pues la enzima es capaz de amplificar durante la rampa entre la temperatura de alineamiento y la de desnaturalización. a diferencia de la PCR punto final en donde no es posible detectar en tiempo real ni cuantificar la secuencia blanco. estas últimas dos características representan grandes ventajas de la PCR en tiempo real.72 °C. la tercera. si por lo contrario. Los ingredientes químicos en la PCR en tiempo real.9 Una de sus aplicaciones más usadas es para cuantificar cambios muy pequeños en la expresión génica mediante la detección de los niveles del ARNm procedente de células o tejidos. punto final que necesita una mayor concentración. ya que el producto de amplificación es monitoreado conforme transcurre la reacción sin que haya la necesidad de que sea manipulado en un gel de agarosa para conocer si la reacción fue exitosa como sucede en la PCR punto final. La cantidad de ARNm que puede detectar la reacción puede ser a partir de concentraciones bajas a diferencia de la PCR. Precisamente. permite la separación de los ácidos nucleicos de doble cadena. cada uno con un mínimo de tres etapas: la primero. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parámetros. el buffer y el sistema reportero de 28 .PCR EN TIEMPO REAL: FUNDAMENTOS: El principio de la técnica se basa en la PCR punto final. el término cuantitativo hace referencia a que es posible cuantificar la cantidad de ADN en la muestra. la concentración de iones divalentes y desoxirribonucleótidos (dNTPs) en la reacción o la temperatura de unión de los cebadores. si utilizamos ADN genómico entonces hablamos de una qPCR (quantitative PCR). facilita la polimerización por parte de la ADN polimerasa. a fin de reducir el ruido por la presencia de dímeros de cebadores cuando se emplea un colorante inespecífico. permite el alineamiento de los cebadores al ADN molde. a una temperatura en torno a los 50-60 °C. primero obtenemos ADNc y luego hacemos la PCR. sólo que generalmente la enzima. Este termociclador es un aparato con capacidad para calentar y enfriar rápidamente las muestras. El proceso de PCR.40 veces. de modo que se aprovechen las cualidades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos y las enzimáticas de la ADN polimerasa.

quienes garantizan resultados altamente eficientes y satisfactorios para los usuarios. El equipo y el software deben estar conectados a un no break para evitar que se interrumpa el ensayo o se pierdan datos por falla o por cambios repentinos en el suministro eléctrico. Es muy importante trabajar con guantes sin polvo. El equipo debe estar calibrado. Los primers deben ser diseñados especialmente para garantizar una alta especificidad y para que generen amplicones de un tamaño que oscile entre 100-150 pb. la eficiencia de la reacción disminuye considerablemente. el agua es proporcionada por separado y también es libre de nucleasas. o comprarlos ya validados de las compañías de biología molecular.fluorescencia para detectar los productos amplificados se venden juntos en una solución conocida como «Master mix». PROCEDIMIENTO DE PCR EN TIEMPO REAL Antes de empezar Verificar que el fluoróforo para el ensayo sea el apropiado de acuerdo con el equipo que se usará. si éstos son más grandes. en caso necesario realizar las calibraciones pertinentes. Las superficies de trabajo deben estar limpias para evitar la contaminación. Para evitar estos problemas. una alternativa es diseñar los primers. utilizando programas informáticos disponibles. limpiar las superficies con papel sin pelusa y detergentes que degraden el ADN o bien con una solución de hipoclorito de sodio al 10%. 29 .

3. Preparar el equipo y programar las condiciones para la amplificación (Tabla 2). 1. Preparar una curva de calibración (ADN) con estándares certificados a diferentes concentraciones. Procesar cada muestra por duplicado. centrifugar los tubos para eliminar burbujas que pudieran interferir con la lectura de la fluorescencia y la solución quede en el fondo de los tubos. 6. Se emplean los puntos 10%. Ejecutar el programa. el gen endógeno. 9. Localizar la línea umbral en el área donde las curvas sean paralelas. 8. Ver la 30 . una para el marcador endógeno y otra para p35s. cuidadosamente.1.1% y 0% de concentración por cuadruplicado. Las muestras del ADN que van a ser analizadas deben mantenerse en hielo hasta que se coloquen en la placa o en los tubos PCR. Primero. 4. Colocar 23 µL de la mezcla de reacción en cada tubo. Analizar los datos. En el software del equipo desplegar las curvas de amplificación en escala logarítmica. Agregar 2. 5. Obtención de datos. 0. Una vez preparadas las mezclas. Mantenerse sobre hielo y tapados para evitar que reciban la luz directa.1. 7. de acuerdo a las cantidades de la Tabla 1. Establecer el umbral. Preparar por duplicado la mezcla de reacción. después p35s.0 µL del ADN problema a cada tubo. Todos los reactivos para la PCR deberán descongelarse y homogeneizarse. Reacciones de amplificación.1. 1%. 2. 10. 10.

APLICACIONES DE LA PCR EN TIEMPO REAL La PCR en tiempo real tiene amplias aplicaciones en investigación científica y como herramienta de diagnóstico. 2005). Bajo los principios revisados anteriormente también se puede acceder a la cuantificación de OGM.. el comportamiento de células cancerosas (Edwards et al. recurriendo a 31 . La caracterización de pequeñas cantidades de material genético procedente de tales organismos hace posible conocer su procedencia e identificar su dinámica (Johnson et al. por ejemplo. Una ventaja adicional de esta técnica es que para implementarla es suficiente contar con una cantidad pequeña de muestra.3.2. el programa generará de manera automática la curva de calibración y realizará una regresión lineal con los puntos de la curva. También es ampliamente utilizada en identificar mutaciones o polimorfismos genéticos valiéndose de sondas específicas y sus resultados en el análisis de los cambios de la curva de fusión (Valasek & Repa. agentes infecciosos.. presencia de fármacos. Aquí. De acuerdo al equipo y Software empleado.. lo anterior puede hacerse de manera automática o manual. Después de seleccionar el umbral y la línea base. Vale la pena resaltar que se han hecho grandes logros en el estudio de virus que afectan al hombre y a los animales (Bustin. permitiendo asociar dichos cambios a estados fisiológicos celulares. Johnson et al. 2005). Otro campo en el que se utiliza la PCR en tiempo real es el de la seguridad alimentaria.. A partir de la regresión calculará los valores de ciclo umbral o Ct (véase más adelante) para las muestras problema y de estos últimos se calcula la concentración en porcentaje. Sin embargo uno de los campos de mayor aplicación de esta técnica es la investigación de cambios en la expresión genética de células a través de la cuantificación de su ARNm. 1993). Establecer la línea base. En estos casos las investigaciones se basan en la identificación con una alta sensibilidad y especificidad de organismos patógenos o saprófitos difundidos en el medio ambiente. (Bustin et al. 2005). Analizar los datos y exportarlos a una hoja de cálculo. 2005). Esto la hace ideal cuando se usa conjuntamente con microcirugía laser para hacer biopsias de tejidos o células específicas y estudiar. la identificación de organismos genéticamente modificados (OGM) en alimentos o aditivos alimentarios es una necesidad que se puede cubrir utilizando esta tecnología. Asimismo la PCR en tiempo real se utiliza para acceder a datos relevantes a la biodinámica de los organismos que producen enfermedades (Clementi et al. algunos programas permiten hacer todo el análisis sin necesidad de exportar a una hoja de cálculo.. curva en modo lineal y verificar que el umbral seleccionado quede dentro de la fase geométrica de ésta. etc. La PCR en tiempo real también se está usando en otros campos como la investigación forense y la bioseguridad. pues esta prueba ofrece una gran sensibilidad y especificidad en menor tiempo y a un menor costo. 2005a) así como en la investigación de bacterias y hongos patogénicos. 2004. Determinar el número de ciclo en el que la primera curva de amplificación cruza el umbral y establecer la línea base tres ciclos antes de este punto. 10. 10.

Caracterización de productos de PCR . 2005a). diagnóstico de tumores y la detección de polimorfismos). Permite reconocer organismos cultivables facilitando su detección inmediata de algún tipo de bacterias.genes de referencia para normalizar la cantidad de ADNc ingresado en los ensayos (Bustin. Garantiza un correcto proceso de amplificación ya que los datos de la muestra son tomados en la fase exponencial. Detección de la presencia o ausencia de secuencias de ácidos nucleicos específicas y de particular interés (Plus/Minus Assays) . por medio de PCR en tiempo real. Validación de resultados de experimentos con arrays . Genotipado .  APLICACIONES DE LA PCR A TIEMPO REAL EN LA MICROBIOLOGÍA CLÍNICA: La PCR en tiempo real juega un papel muy importante en la actualidad gracias a sus innumerables beneficios es por esto que grandes empresas de diagnóstico disponen de kits para diagnóstico de agentes infecciosos como VIH. Determinación de mutaciones .  Tiene mayor rapidez y disminuye falsos positivos. Discriminación alélica o detección de variantes genéticas . Estudio de la expresión genética (RQ o RT-PCRrt) . Determinación agentes patógenos o Amplificación de genes .  Es de gran utilidad en el campo de la medicina (cuantificación viral. Cuantificación de ácidos nucleicos (AQ) . 32 . Detección de SNPs. la cuantificación de la expresión genética. Diagnóstico clínico de tumores o respuesta a tratamientos . bacterias. control correcto de fármacos. Brinda métodos fáciles y rápidos para identificar mutaciones asociadas con la resistencia de fármacos antimicrobianos.  Posee mayor sensibilidad evitando factores de contaminación que puedan alterar las muestras. . VHB. VHC. determinación de agentes infecciosos. Facilita el avance de varias pruebas moleculares logrando identificar y cuantificar agentes infecciosos ya sea en virus. Metilación de DNA y estudio de apoptosis o Monitorización de patrones de expresión de citoquinas. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL PCR EN TIEMPO REAL VENTAJAS SOBRE LOS OTROS TIPOS DE PCR  La ventaja principal de la PCR en relación a otros tipos de PCR es su rapidez ya que no requiere de procesos adicionales de detección. haplotipo. micosis invasivas o infecciones parasitarias.  OTRAS APLICACIONES: . citomegalovirus.

PCR  Sus ciclos de amplificación son más rápidos <2x DESVENTAJAS  Se puede puede reproducir solamente partes del genoma en donde se conoce por lo menos una mínima secuencia de 20-40 pb.  Permite medir la cantidad de ADN sintetizado mientras se amplifica ya que la emisión de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN formado.  La polimerización puede tener errores al sintetizar el ADN  Puede contaminarse con otro ADN DISCUSIÓN ENTRE PCR CONVENCIONAL Y PCR EN TIEMPO REAL PCR (reacción de cadena de polimerasa). PCR convencional Aunque la PCR convencional es una herramienta muy útil para el diagnóstico molecular. es una técnica que tiene como objetivo replicar millones de veces pequeños fragmentos de ADN blanco u objetivo. al igual que también se 33 . es decir obtener numerosas copias de fragmentos específicos de ADN partiendo de un molde o fragmento original que generalmente es más grande que el fragmento diana. una desventaja de la PCR convencional es que se necesitan varios pasos.  Se necesita “Primers” específicos que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar.  Brinda una amplificación especifica  Automatiza y disminuye el tiempo de análisis  Posee una reacción monitorizada a tiempo real  No requiere de un procesamiento post.

La PCR en tiempo real tiene una característica muy importante que es la de poseer mayor sensibilidad mientras que la PCR convencional posee menor sensibilidad. además tiene un amplio rango dinámico de detección mientras que PCR convencional posee un estrecho rango dinámico de detección. 34 . esta PCR hay una aplicación de sondas marcadas con fluorocromos. por ejemplo. también es elevado como se puede apreciar en la siguiente imagen: Todo esto hace que hoy esta técnica se encuentre en desuso en laboratorios clínicos de biología molecular. y a la vez también un termociclador con sensores especiales los cuales miden la fluorescencia que emiten las sondas al ser hidridadas y luego de estimular el fluorocromo a una longitud de onda óptima. y estos son susceptibles de errores y contaminación. además del tiempo que requiere la PCR. en los pasos y reactivos necesarios para reacción de PCR para IS6110 del complejo Mycobacterium tuberculosis son los siguientes: al igual que el tiempo que requiere. Esta tiene una gran importancia ya que es capaz de en tiempo real amplificar y detectar productos en una misma etapa mientras que la PCR convencional amplifica y detecta productos en dos etapas.utilizan varios reactivos. PCR en tiempo real En la PCR en tiempo real además de la utilización de los mismos reactivos de la PCR convencional. aunque por todo lo demás aún sigue utilizándose para comprobar la presencia de amplicones (es un pedazo de DNA o RNA es la fuente o el producto de eventos naturales o artificiales de amplificación o replicación) generados por PCR en tiempo real.

mientras que la PCR convencional es más económica en estos puntos. Tabla comparativa entre PCR convencional y la PCR de tiempo real 35 . esta es más costosa en cuanto a equipamiento al igual que los reactivos.Hay una contra de la PCR en tiempo real y es que.

En PCR convencional:  Detecta segmentos específicos  Menor sensibilidad y especificidad  Costo mucho más barato que PCR en tiempo real  Una desventaja de la PCR convencional es que se necesitan varios pasos. se llegó a la conclusión:  La reacción en cadena de la polimerasa es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia específica de ADN  La reacción en cadena de polimerasa necesita de varios elementos entre los cuales se recalca: los reactivos .  Para poder construir oligonucleótidos específicos que actúen como cebadores para la amplificación selectiva de una secuencia de ADN se necesitan de información necesaria para amplificar  La facilidad con que el ADN exige evitar el peligro de contaminación inherente al poder multiplicador de la reacción En base a PCR en tiempo real tenemos:  La PCR en tiempo real es una técnica que combina la amplificación y la detección en un mismo paso  La cuantificación es muy utilizada en lo que refiere al análisis de expresión génica.  El aumento de fluorescencia se relaciona con el número de copias de la molécula que está siendo amplificada. primers. Tuberculosis y PVH. anneling y extensión. A menor número de copias presentes .  Recientes fuentes de información se basan en que las aplicaciones clínicas mas frecuentes se dan dentro de : Hepatitis B-C.  EL PCR se compone básicamente de3 fases: Desnaturalización. ADN molde y el termociclador. Citomegalovirus. taq polimerasa. DNTPS. al igual que también se utilizan varios reactivos 36 . .  Basándonos en nuestra información concordamos:  que La PCR permite clonar ADN en pocas horas. CONCLUSIONES De acuerdo con la información recauda. VIH. siendo un método rápido y sencillo.  Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parámetros dentro de PCR en tiempo Real  También es ampliamente utilizada en identificar mutaciones o polimorfismos genéticos valiéndose de sondas específicas  Tiene mayor rapidez y disminuye falsos positivos. menor el número de ciclos necesarios para detectar fluorescencia.

inecc.ec/bitstream/reducacue/6538/1/Estudio%20bibliogtráfico% 20de%20PCR%20en%20tiempo%20real.pdf 37 .redalyc.html http://www2.pdf https://dcmq.edu.mx/publicaciones2/libros/710/pcrtiempo.gob. BIBLIOGRAFÍA http://www.mx/380-reacción-en-cadena-de-la-polimerasa-pcr-y-sus- aplicaciones-en-dermatología.org/html/636/63617114013/ http://dspace.ucacue.com.