You are on page 1of 9

Penilaian Keselamatan Nano-Hydroxyapatite sebagai Bahan Perawatan Mulut menurut Peraturan Kosmetik

Uni Eropa

Abstract

Nanopartikel hidroksyapatit (HAP-NP) dimasukkan dalam produk perawatan mulut seperti pasta gigi dan
obat kumur untuk mengobati sensitivitas gigi atau untuk mempromosikan remineralisasi email.
Meskipun kinerja HAP-NP yang baik dalam aplikasi ini, penting untuk memastikan keamanannya bagi
konsumen. Oleh karena itu, Komite Ilmiah tentang Keamanan Konsumen (SCCS) mengevaluasi
keamanan HAP-NP sebagai bahan perawatan mulut, tetapi pendapat yang dikeluarkan tidak sepenuhnya
konklusif dan SCCS merekomendasikan bahwa tes tambahan harus dilakukan. Di sini, kami
menggunakan epitel gingiva manusia yang tersedia secara komersial (HGE) sebagai alternatif non-hewan
dan viabilitas sel MTT, aktivitas LDH, dan produksi IL-1alpha dievaluasi setelah 3,1% pengobatan HAP-NP
selama 10 menit,

1 jam, dan 3 jam. Selain itu, penyerapan HAP-NP di jaringan gingiva dinilai dengan transmisi elektron
mikroskop (TEM) analisis. Akhirnya, perilaku disolusi HAP-NP dalam cairan lambung simulasi juga
diselidiki. Tidak ada efek merusak yang diamati untuk jaringan HGE diinkubasi dengan HAP-NP untuk
semua titik waktu dan parameter dievaluasi. Selain itu, pembubaran lengkap 3,1% HAP-NP dalam cairan
lambung simulasi diamati setelah 7,5 menit pada 37 ◦ C. Kesimpulannya, hasil kami membuktikan
keamanan HAP-NP untuk produk perawatan mulut dengan penggunaan alternatif pengganti in vitro.
untuk epitel gingiva manusia dan uji cairan lambung simulasi.

1. Perkenalan

Hydroxyapatite adalah kalsium fosfat yang banyak digunakan untuk aplikasi regeneratif tulang di
ortopedi dan kedokteran gigi [1]. Nanopartikel hidroksyapatit (HAP-NP) sangat mirip dengan
hidroksiapatit alami dalam hal ukuran dan struktur kristal, yang berkontribusi terhadap penggunaannya
dalam perawatan perawatan mulut [2]. Dalam beberapa tahun terakhir, HAP-NP telah dimasukkan
dalam produk perawatan mulut seperti pasta gigi dan obat kumur dengan tujuan mengobati sensitivitas
gigi dengan menyumbat tubulus dentinal yang dibuka ke permukaan dentin dan terhubung ke pulpa;
atau dengan tujuan mempromosikan remineralisasi email dengan mengganti ion kalsium dan fosfat ke
area di mana mineral telah larut, memulihkan integritasnya dan mengkilap [2–7].

Keamanan bahan baku kosmetik harus dibuktikan agar disetujui, namun Direktif Kosmetik menetapkan
larangan untuk menguji produk kosmetik dan bahan kosmetik yang sudah jadi pada hewan [8]. Dengan
mengingat hal ini dan untuk menilai keamanan bahan pasta gigi, harus diperhitungkan bahwa pasta gigi
akan bersentuhan dengan jaringan gingiva hanya untuk waktu yang singkat (~ 2 menit per 3 kali sehari);
Namun, periode ini bisa berpotensi cukup untuk penyerapan selular mulut. Selain itu, bahan dapat
ditelan dan diserap melalui jalur gastrointestinal dan berpotensi menjadi tersedia secara sistemik [9].

Untuk mempelajari biokompatibilitas HAP-NP pada gingiva oral manusia, kultur histotipik 3D in vitro
yang sangat menyerupai histologi jaringan asli dapat digunakan sebagai alternatif hewan untuk
pengujian bahan kosmetik [10,11]. Bahkan, penggunaan alternatif pengganti in vitro untuk korosi kulit
dan pengujian iritasi kulit menggunakan model kulit manusia komersial telah divalidasi oleh Komite
Ilmiah tentang Keamanan Konsumen (SCCS) [12].

Pada tahun-tahun terakhir, SCCS telah menarik perhatian pada kemungkinan munculnya masalah
kesehatan masyarakat seperti penggabungan nanomaterial dalam produk kosmetik. Dalam situasi ini,
kelompok ahli sCCS menyelidiki dan mengeluarkan pendapat resmi yang menentukan untuk
mendefinisikan undang-undang UE [13]. Khusus untuk nanopartikel hidroksiapatit, penilaian keamanan
telah dilakukan oleh SCCS pada tahun 2016, yang berisi analisis bibliografi lengkap mengenai efek
toksikologi nanomaterial ini sebagai bahan kosmetik. Namun, pendapat SCCS tentang nanopartikel
hidroksiapatit tidak sepenuhnya konklusif, karena efek toksikologi nanopartikel mungkin tergantung
pada aspek fisik seperti ukuran dan morfologi. Untuk alasan itu, SCCS menuntut bahwa penilaian
toksikologi harus dilakukan untuk setiap jenis nanomaterial secara individual untuk membuktikan
keamanannya bagi konsumen [14]. Oleh karena itu, tujuan dari penelitian ini adalah untuk menilai
biokompatibilitas HAP-NP spesifik untuk memperjelas keamanan bahan ini untuk aplikasi perawatan
mulut. Untuk tujuan itu, epitel gingiva manusia yang tersedia secara komersial direkonstruksi dari sel
primer [15] digunakan, dan parameter seperti viabilitas sel MTT, aktivitas LDH, dan produksi IL-1alpha
dievaluasi. Selain itu, untuk mempelajari kemungkinan bahwa HAP-NP dapat menjadi tersedia secara
sistemik melalui penyerapan di jaringan gingiva, gambar mikroskop elektron transmisi (TEM) dari
jaringan setelah waktu paparan yang berbeda dievaluasi. Akhirnya, perilaku disolusi dalam cairan
lambung simulasi diselidiki, sehingga untuk menilai kemungkinan penyerapan melalui sel-sel usus
setelah menelan yang tidak disengaja.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Bahan dan Karakterisasi Fisik-Kimia

2.1.1. Nanopartikel Hidroksyapatit

HAP-NP (CAS 12167-74-7, juga disebut sebagai 1306-06-5) yang digunakan dalam penelitian ini
diperoleh dari formulasi komersial (nanoXIM®) yang dipasok oleh FLUIDINOVA, SA Formulasi ini terdiri
dari 15,5% suspensi hidroksiapatit nanopartikel dalam air. Tergantung pada tes yang dilakukan,
nanopartikel diproses sesuai.

2.1.2. Transmisi Elektron Mikroskopi

Ukuran HAP-NP dan morfologi dievaluasi menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM). Untuk
melakukan analisis, nanopartikel diencerkan dalam etanol dan ditempatkan dalam bak ultrasonik untuk

30 menit untuk membubarkan partikel. Setelah itu, sampel dipasang pada grid tembaga dilapisi dengan
film karbon dan dikeringkan di dalam desikator. Akhirnya, nanopartikel divisualisasikan menggunakan
peralatan Hitachi HD2700 (Hitachi, Tokyo, Jepang).
2.1.3. Difraksi sinar-X

Kemurnian fase HAP-NP dinilai dengan menggunakan standar internasional “ISO 13779-3: Implan untuk
pembedahan - Hidroksyapatit – Bagian 3: Analisis kimia dan karakterisasi kristalinitas dan kemurnian
fase”. Untuk tujuan itu, suspensi HAP-NP dikeringkan semalam pada 105 ◦ C untuk menghilangkan air
dan digiling untuk mendapatkan bubuk halus. Difraksi sinar-X (XRD) analisis dilakukan dengan
menggunakan difraktometer PANalytical Empyrean (Malvern PANalytical, Royston, Inggris Raya) dengan
berikut mengatur: Langkah waktu scan dari 198,6450 s, ukuran langkah 2θ dari 0.0130◦, dan berbagai 2θ
antara 27 dan 39◦.

2.1.4. Luas permukaan

Luas permukaan spesifik dari HAP-NP dianalisis menggunakan Brunauer-Emmett-Teller (BET)

metode. Untuk tujuan itu, suspensi nanopartikel ditempatkan semalam dalam oven pengeringan di

105 ◦ C untuk menghilangkan air dan konten padat digiling untuk mendapatkan bubuk halus. Luas
permukaan ditentukan menggunakan peralatan Quantachrome NOVA 2000e (Instrumen Quantachrome,
Boynton Beach, FL, USA) dengan degasification sampel dilakukan pada 300 ◦ C selama 2 jam.

2.2. Biokompatibilitas In Vitro

2.2.1. Epitelium Gingiva Manusia yang direkonstruksi

Model jaringan human gingival (Gephine Gitival epithelium) buatan Heredine ™ (EpiSkin, Lyon, Perancis)
digunakan sebagai model in vitro untuk melakukan uji biokompatibilitas dan iritasi. Model HGE terdiri
dari sel gingiva manusia normal yang dibudidayakan pada filter polikarbonat inert pada antarmuka
cairan udara dalam media yang ditentukan secara kimia. Model ini secara histologis mirip dengan
lapisan sel luar gusi manusia.

Setelah tiba, jaringan diproses mengikuti protokol pabrik. Secara singkat, jaringan dihilangkan dari
larutan nutrisi agarose yang tertanam ketika dikirim dan ditempatkan di piring yang sebelumnya diisi
dengan SkinEthic ™ Maintenance Medium (EpiSkin, Lyon, Prancis) pada suhu kamar. Jaringan diinkubasi
dalam inkubator sel pada 37 ◦ C, 5% CO2, dan kelembaban jenuh selama 48 jam.

2.2.2. Perawatan dengan Nanopartikel Hydroxyapatite

Penggabungan maksimum suspensi air HAP-NP (nanoXIM®, 15,5 ± 0,5% hidroksiapatit nanopartikel
suspensi berair-FLUIDINOVA, S.A., Maia, Portugal) dalam pasta gigi adalah 20%. Mempertimbangkan hal
ini, diputuskan untuk menyiapkan pengenceran 40% dari suspensi berair HAP-NP dalam air ultra miliQ
(sistem Millipore, Billerica, MA, USA) dan kemudian diencerkan 1: 1 dalam PBS (fosfat buffered saline),
menghasilkan suatu konsentrasi akhir pengenceran 20% dari suspensi berair HAP-NP, yang sesuai
dengan 3,1% HAP-NP. Sebagai kontrol negatif, pengenceran air 1: 1 milliQ di PBS digunakan dan sebagai
kontrol positif, 1% SDS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) solusi disiapkan dalam air dan diencerkan 1: 1
di PBS dengan konsentrasi akhir 0,5% SDS. Volume 40 µL setiap sampel atau kontrol dimasukkan di atas
sampel HGE yang direkonstruksi dan diinkubasi pada 37 ◦ C untuk waktu paparan yang berbeda (10
menit, 1 jam, dan 3 jam).

2.2.3. Aktivitas LDH

Aktivitas laktat dehidrogenase (LDH) dalam media kultur pada akhir periode inkubasi digunakan sebagai
indeks kematian sel. Aktivitas LDH ditentukan secara spektrofotometri setelah 30 menit inkubasi pada
25 ◦C 50 µL kultur dan 50 µL campuran reaksi dengan mengukur oksidasi NADH pada 490 nm dengan
adanya piruvat, sesuai dengan instruksi kit pabrikan (Roche). Diagnostik, Mannheim, Jerman). Hasil
disajikan sebagai persentase aktivitas LDH dibandingkan dengan kontrol negatif untuk setiap titik waktu.

2.2.4. Tes MTT

Untuk setiap produk atau kontrol yang diuji, pada akhir periode inkubasi, jaringan dibilas dengan PBS
dan ditempatkan pada 300 µL 0,5 mg / ml MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -

2,5-diphenyltetrazolium bromide, ThermoFisher Scientific, Waltham MA, USA). Setelah 3 jam inkubasi
pada 37 ◦ C dan 5% CO2, kultur ditempatkan dalam 2 ml isopropanol. Ekstraksi dilakukan semalam pada
suhu kamar. Densitas optik diukur pada 200 µL ekstrak pada 570 nm (filter referensi:

690 nm). Hasilnya dinyatakan sebagai persentase viabilitas dibandingkan dengan kontrol negatif untuk
setiap titik waktu.

2.2.5. Penentuan IL-1alpha

Pada akhir periode inkubasi, media dikumpulkan untuk penentuan IL-1alpha yang dilepas ke media.
ELISA Kit IL-1 alpha yang tersedia secara komersial (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)
dijalankan sesuai dengan instruksi pemasok. Hasil dinyatakan dalam pg IL-1alpha per ml media kultur
untuk masing-masing kelompok pada titik waktu yang berbeda.

2.2.6. Histologi

Setelah masa inkubasi, jaringan diperbaiki dalam larutan formalin 10% yang seimbang dan kemudian
ditanam dalam parafin. Empat bagian vertikal mikron diwarnai dengan hematoxylin / eosin dan difoto
dengan mikroskop. Hematoxylin / eosin hasil yang diperoleh dengan sampel uji dibandingkan dengan
positif (jaringan rusak) dan kontrol negatif (jaringan biasa) dan dinilai sesuai dengan skala yang
ditunjukkan pada Tabel 1 [10].

2.2.7. Observasi dengan TEM

Untuk masing-masing produk atau kontrol yang diuji, pada akhir periode inkubasi satu kultur ditetapkan
dalam larutan glutaraldehid seimbang 2,5% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), didehidrasi, dan
kemudian ditanam dalam resin. Bagian vertikal 0,3 μm difoto di bawah Hitachi H600

TEM mikroskop (Hitachi, Tokyo, Jepang).


2.3. HAP-NP Dissolution dalam Simulasi Gastric Fluid

2.3.1. Komposisi Cairan Lambung Simulasi (SGF)

SGF disiapkan sesuai dengan Amerika Serikat Pharmacopeia XXII, mengandung 0,2% (b / v) NaCl
(Extrapure, Ph USP grade, Scharlau, Barcelona, Spanyol) dan 0,7% (v / v) HCl 38% (Biologi Molekuler
diuji, Sigma -Aldrich, St. Louis, MO, USA) dalam air ultra miliQ (Millipore system, Billerica, MA, USA). PH
larutan SGF adalah 1,2. SGF tidak mengandung pepsin karena tidak memainkan peran aktif dalam
solubilisasi HAP-NP. Solusi SGF disaring melalui membran syringe pori 0,2 μm sebelum inkubasi dengan
nanopartikel hidroksiapatit (HAP-NP).

2.3.2. Kandungan Kalsium dalam Media Digestion

Menurut Catatan SCCS [12], paparan harian maksimum untuk obat kumur adalah 2,16 g per hari dan
paparan harian maksimum untuk pasta gigi adalah 0,138 g per hari. Jadi, stabilitasnya

di SGF dievaluasi mempertimbangkan paparan maksimum, yang sesuai dengan obat kumur. Selain itu,
penggabungan maksimum suspensi air HAP-NP dalam obat kumur adalah 10% menurut pemasok. Untuk
secara signifikan meningkatkan margin aman dari tes ini, diasumsikan dua kali konsentrasi, yaitu 20%
pengenceran HAP-NP suspensi berair (3,1% HAP-NP). Oleh karena itu, larutan 2,16 g mengandung 3,1%
HAP-NP dalam air murni ditambahkan ke 250 ml SGF, mengikuti rekomendasi dari FDA untuk Pengujian
Pembubaran dari Rilis Padatan Mulut Padat Rilis Langsung [16].

Pencernaan dilakukan dalam botol tertutup dengan pengaduk magnet pada 100 rpm pada pelat
pemanas dengan kontrol suhu pada 37 ◦ C, menggunakan pengukur suhu Sensoterm II dalam mandi
termostatik (JP Selecta, Barcelona, Spanyol). Sampel diinkubasi selama 7,5, 15, atau 30 menit. Setelah
inkubasi, tiga aliquot dari 2 mL diambil dan segera disentrifugasi pada 20.000 × g selama 30 menit pada
25 ◦ C dalam sentrifus Eppendorf 5804R (Eppendorf, Hamburg, Jerman). Volume 1 mL supernatan
diencerkan hingga volume akhir 5 ml dalam HNO3 2% (v / v).

Konsentrasi Ca2 + dalam media pencernaan ditentukan oleh Inductively Coupled

Plasma-Atomic Emission Spectroscopy (ICP-AES) (Optima 5300 DV, PerkinElmer, MA, USA). Kurva
standar diperoleh dari larutan standar Ca2 + di HNO3 2%. Sampel kosong yang mengandung SGF juga
dianalisis dan intensitas rata-rata mereka dikurangi dari nilai sampel.

2.4. Statistik

Semua data disajikan sebagai nilai rata-rata ± SEM. Uji Kolmogorov-Smirnov dilakukan untuk
mengasumsikan distribusi parametrik atau non-parametrik untuk tes normalitas. Perbedaan antara
kelompok dinilai oleh Student t-test dalam kasus distribusi normal atau tes Mann-Whitney dalam kasus
distribusi non-normal. Hasil dianggap signifikan secara statistik pada p-nilai <0,05. Program SPSS® untuk
Windows (SPSS Inc, versi 17.0, Chicago, IL, USA) digunakan.
3. Hasil

3.1. Hydroxyapatite Nanopartikel Karakterisasi Fisik-Kimia

Ukuran dan morfologi nanopartikel hidroksiapatit diselidiki menggunakan TEM (Gambar 1A). Seperti
yang dapat diamati, nanopartikel hidroksiapatit yang digunakan dalam penelitian ini memiliki morfologi
mirip batang dan ukuran partikel <100 nm. Khususnya, morfologi HAP-NP menunjukkan lebar antara 5–
20 nm (biasanya mendekati 10 nm) dan panjang dibawah 50 nm (biasanya antara 20 hingga 40 nm).

XRD dilakukan untuk mengevaluasi komposisi fase nanopartikel hidroksiapatit. Seperti yang dapat
diamati pada Gambar 1B, hidroksyapatit adalah fase murni karena spektrum yang diperoleh tidak
menunjukkan fase yang tidak terduga. Yakni, posisi puncak sesuai dengan standar ISO

13779-3 persyaratan, karena hidroksiapatit dapat dibedakan dengan puncak 202, 210, dan 211 yang
dicocokkan dengan JCPDS 9-432 fi le. Akhirnya, luas permukaan spesifik nanopartikel hidroksiapatit
dievaluasi dengan BET

3.2. Biokompatibilitas Nanopartikel Hidroksyapatit

Tes LDH digunakan sebagai indikator sitotoksisitas, karena enzim ini bocor melalui membran plasma sel
yang rusak. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2A, 3,1% HAP-NPdid tidak menginduksi sitotoksisitas
dalam jaringan HGE pada setiap waktu inkubasi yang dievaluasi. Itu juga mengamati bahwa kontrol
positif hanya menunjukkan sitotoksisitas setelah 3 jam inkubasi.

Uji MTT digunakan sebagai penanda viabilitas sel, karena mengukur reduksi MTT oleh enzim
mitokondria reduktase. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2B, 3,1% HAP-NP menunjukkan tidak
berpengaruh pada viabilitas sel pada salah satu waktu inkubasi yang diuji. Mirip dengan hasil
sitotoksisitas, tidak ada efek merusak yang signifikan diamati kontrol positif pada HGEtissue. Uji MTT
digunakan sebagai penanda viabilitas sel, karena mengukur reduksi MTT oleh enzim mitokondria
reduktase. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2B, 3,1% HAP-NP menunjukkan tidak berpengaruh
pada viabilitas sel pada salah satu waktu inkubasi yang diuji. Serupa dengan hasil sitotoksisitas, tidak ada
efek merusak yang signifikan yang diamati pada kontrol positif pada jaringan HGE.

Pelepasan IL-1alpha diukur sebagai indikator iritasi akut pada epidermis manusia yang direkonstruksi
[17]. Seperti yang dapat diamati pada Figure2C, tes ini menunjukkan nilai yang lebih tinggi untuk kontrol
positif yang meningkat seiring waktu. Perbedaan yang signifikan membandingkan kontrol positif ke
seluruh kelompok diamati setelah 3 jam. Konsentrasi 3,1% HAP-NP menunjukkan nilai yang mirip
dengan kontrol negatif menunjukkan tidak adanya iritasi akut. Pelepasan IL-1alpha diukur sebagai
epidermis manusia yang direkonstruksi [17]. Seperti yang dapat diamati pada Gambar 2C, tes ini
menunjukkan nilai yang lebih tinggi untuk kontrol positif yang meningkat seiring waktu. Perbedaan
signifikan membandingkan kontrol positif terhadap sisa kelompok diamati setelah 3 jam. Konsentrasi
3,1% HAP-NP menunjukkan kesamaan nilai-nilai ke kontrol negatif menunjukkan tidak adanya iritasi
akut.
3.3. Hasil histologi dan TEMObservation

Sesuai dengan tingkat sitotoksisitas dan IL-1alpha, tidak ada tanda-tanda jaringan

3.3. Hasil Histologi dan Observasi TEM

Sesuai dengan sitotoksisitas dan hasil tingkat IL-1alpha, tidak ada tanda-tanda perubahan jaringan
(Gambar 3 dan Tabel 2) setelah inkubasi dengan kontrol negatif dan 3,1% solusi HAP-NP. Perubahan
jaringan hanya diamati setelah pengobatan dengan kontrol positif SDS 0,5% setelah 1 dan 3 jam
paparan.

TEManalisis (Gambar 4) memverifikasi tidak adanya nanopartikel HAP-NP yang diinternalisasi ke dalam
sel setelah perawatan di salah satu lapisan sel (hanya lapisan superfisial yang ditunjukkan pada Gambar
4). Tak satu pun dari bagian dianalisis mengandung sel-sel dengan nanopartikel diinternalisasi. Beberapa
nanopartikel diamati di luar lapisan sel paling superfisial dalam sampel HGE yang diobati dengan 3,1%
HAP-NP setelah 1 jam paparan, yang lebih mungkin terkait dengan pencucian yang tidak memadai
setelah pengobatan untuk titik waktu ini, karena hal yang sama tidak terjadi pada waktu pemaparan
lebih lama 3 jam.

3.4. Kandungan Kalsium dalam Media Digestion

Tabel3 menunjukkan konsentrasi kalsium yang ditentukan oleh ICP-AES dalam media pencernaan untuk
3,1%

3.4. Kandungan Kalsium dalam Media Digestion

Tabel 3 menunjukkan konsentrasi kalsium yang ditentukan oleh ICP-AES dalam media pencernaan untuk

3,1% HAP-NP setelah 7,5, 15, dan 30 menit pada 37 ° C. Ca maksimum HAP-NP setelah 7,5, 15, dan 30
menit pada 37 konsentrasi dalam pencernaan cairan dihitung untuk mengevaluasi hasil yang diperoleh.
Jadi, jika jumlah total nanopartikel hidroksiapatit dilarutkan selama pencernaan, konsentrasi Ca

2+ ion dalam media pencernaan akan menjadi 103 mg Ca / L untuk konsentrasi awal 3,1%

Seperti yang ditunjukkan Tabel 3 dan Gambar 5, konsentrasi Ca2 + dalam cairan pencernaan sama
dengan konsentrasi Ca2 + maksimum yang diperkirakan pada semua titik waktu. Dengan demikian,
totalitas HAP-NP dilarutkan dalam SGF pada 7,5 menit inkubasi pada 37 ◦ C. Selain itu, harus disorot
bahwa ketika menipiskan suspensi HAP-NP ke SGF pada 37 ◦ C, semua solusinya segera jelas dan tidak
ada partikel yang bisa diamati. Selain itu, setelah sentrifugasi, tidak ada sedimen yang diamati, yang
memperkuat bahwa 3,1% HAP-NP dilarutkan sepenuhnya dalam SGF untuk semua titik waktu yang diuji.
4. Diskusi

Penelitian ini membuktikan keamanan nanopartikel suspensi HAP-NP berair yang diuji untuk produk
perawatan mulut, menunjukkan tidak ada efek merusak pada jaringan HGE dan pembubaran lengkap
dalam cairan lambung simulasi. Semua tes yang dilakukan dirancang untuk mematuhi kebijakan Eropa
pengujian non-hewan untuk penilaian keamanan kosmetik. Alternatif pengganti in vitro tiga dimensi
yang menyerupai epitel gingiva manusia digunakan untuk menunjukkan keamanan HAP-NP ini untuk
digunakan dalam produk perawatan mulut. Viabilitas sel (MTT), toksisitas sel (aktivitas LDH), dan respon
pro-inflamasi (IL-1alpha) yang diinduksi oleh HAP-NP 3,1% pada titik waktu yang berbeda dinilai.

Nanopartikel hidroksyapatit telah dimasukkan dalam berbagai produk perawatan mulut komersial
[4,18,19] dan menurut pabrikan, penggabungan maksimum dari 15,5% HAP-NP bahan perawatan mulut
suspensi berair ini dalam pasta gigi adalah 20% dan dalam obat kumur adalah 10%. Mempertimbangkan
ini, diputuskan untuk menguji konsentrasi akhir pengenceran 20% dari suspensi berair HAP-NP, yang
sesuai dengan 3,1% HAP-NP. Mengenai waktu paparan, dengan mempertimbangkan bahwa waktu yang
disarankan serta waktu rata-rata yang digunakan untuk menyikat gigi adalah 2 menit [20,21], waktu
pemaparan yang cukup lama dievaluasi, yaitu 10 menit, 1 jam, dan 3 jam untuk memastikan bahwa HAP-
NP akan aman pada aplikasi ini bahkan dengan waktu kontak yang lebih lama dari yang diharapkan.

Baik viabilitas sel dan uji sitotoksisitas menunjukkan bahwa paparan HAP-NP 3,1% hingga 3 jam aman.
Sepengetahuan kami, ini adalah studi pertama yang mengevaluasi keamanan HAP-NP di HGE. Penilaian
keamanan menggunakan model jaringan epitel kornea manusia yang mirip mukosa (menggunakan HCE)
dengan menggunakan keratinosit kornea manusia - juga menunjukkan hasil yang sama, dengan
kurangnya sitotoksisitas dan tidak ada perubahan dalam rilis IL-1 alpha [22]. Biasanya, studi keselamatan
dilakukan menggunakan model kultur sel 2D, seperti sel epitel bukal manusia [23], 3T3 fibroblast [22]
pada sel mirip osteoblas [24] menggunakan sifat kristalografi yang berbeda dari HAP-NP, yang dapat
menginduksi sel yang berbeda. tanggapan, seperti yang diulas oleh Epple [25].

Kurangnya efek dalam viabilitas sel yang disebabkan oleh kontrol positif dapat dijelaskan oleh
konsentrasi SDS yang relatif rendah yang digunakan dalam pengujian ini, yang membuktikan rendahnya
sensitivitas jaringan HGE terutama untuk tes MTT, seperti yang dilaporkan oleh orang lain [10]. Ini
mungkin terjadi karena lapisan eksternal keratinisasi jaringan ini dan / atau konsentrasi SDS yang relatif
rendah (0,5%) yang digunakan dalam pengujian ini. Konsentrasi ini dipilih karena secara rutin digunakan
dalam tes semacam ini dalam model 3D in vitro dan bekerja dengan baik untuk epitel mulut [10], yang
tidak memiliki perlindungan terhadap deterjen yang diberikan oleh lapisan eksternal berkeratin. Namun,
meskipun tidak ada efek merusak yang disebabkan oleh kontrol positif dapat diamati dengan tes MTT,
sitotoksisitas yang lebih tinggi ditentukan oleh aktivitas LDH dan tingkat IL-1alpha yang lebih tinggi
ditemukan. IL-1 cytokines adalah salah satu inisiator utama dari respon pro-inflamasi dermal dan
merupakan indikator terkenal dari iritasi akut pada epidermis manusia yang direkonstruksi [17]. Bahkan,
IL-1alpha telah diusulkan oleh SCCS [12] sebagai titik akhir kedua untuk mendapatkan sensitivitas yang
lebih baik. Dengan demikian, setelah 3 jam paparan, 0,5% perawatan SDS menginduksi pelepasan IL-
1alpha secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol negatif (peningkatan 10 kali lipat) dan
ke solusi tes HAP-NP. Hasil ini sesuai dengan pengamatan sebelumnya [26], menunjukkan bahwa
peningkatan kadar IL-1alpha dapat dideteksi tanpa penurunan yang dapat dideteksi dalam viabilitas sel
dalam menanggapi stres retikulum endoplasma.

Untuk menguji kemungkinan serapan seluler HAP-NP, dua tes yang berbeda dilakukan. Tes pertama
mengevaluasi ada tidaknya HAP-NP di mukosa gingiva dengan observasi dengan TEM. Hasil kami
menegaskan bahwa pada konsentrasi dievaluasi dan selama waktu pemaparan diuji

tidak ada serapan seluler oleh HGE. Tes kedua dilakukan dalam kasus menelan secara tidak sengaja dan
pengambilan konsekuen di zona lain pada saluran pencernaan. Untuk tujuan itu, 3,1% suspensi HAP-NP
ditambahkan ke SGF untuk mengevaluasi pembubaran lambung mengikuti rekomendasi dari FDA [16]
dan dosis paparan yang disebut dalam Catatan SCCS [12].

Menurut pedoman FDA, kesimpulan konservatif adalah bahwa produk yang mengalami pembubaran
85% dalam 15 menit di bawah kondisi pembubaran ringan dalam 0,1 N HCl berperilaku seperti solusi dan
umumnya seharusnya tidak memiliki masalah ketersediaanhayati [16]. Dalam karya ini, terbukti bahwa

3.1% HAP-NP suspensi sepenuhnya dilarutkan dalam setengah waktu ini (Tabel 3 dan Gambar 5). Tes ini
dilakukan dengan mempertimbangkan dua kali lipat konsentrasi harian HAP-NP maksimum yang
digunakan dalam obat kumur dalam satu kali konsumsi, yang merupakan skenario terpapar dan
konsumsi terburuk jika dibandingkan dengan pasta gigi [12]. Selain itu, harus disorot bahwa setelah
suspensi HAP-NP 3.1% (suspensi opaque) ditambahkan ke SGF, pelarutan hampir seketika mengarah ke
solusi yang jelas tanpa pengamatan opasitas yang disebabkan oleh suspensi partikel HAP-NP . Hal ini
memperkuat kesimpulan tentang keamanan HAP-NP dalam kasus penyerapan, karena akan larut secara
instan dalam ion Ca2 + dan PO4 2−, sesuai dengan pernyataan Epple yang mengesampingkan

efek kesehatan yang merugikan dengan eksposisi oral ke kalsium fosfat [25]. Karena itu, kemungkinan

Penyerapan HAP-NP oleh sel-sel usus setelah tertelan secara tidak sengaja juga dibuang.

5. Kesimpulan

Dalam penelitian ini, karakterisasi dan penilaian keamanan dilakukan dengan mempertimbangkan
pendapat SCCS pada nanomaterial hidroksiapatit. Hasil kami membuktikan keamanan suspensi air HAP-
NP untuk produk perawatan mulut dengan penggunaan alternatif pengganti in vitro untuk epitel gingiva
manusia dan uji cairan lambung terstimulasi.