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PBL de

Microbiologia

Dr. Carles
Alonso
Noviembre del 2006

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PBL DE MICROBIOLOGIA

Miembros que participan en la resolución del caso.

GRUPO 1
. Erola Ainsua
. Arantxa Blasco
. Anna Civit

GRUPO 2
. Daniel Castillo
. Núria Sánchez

GRUPO 3
. Eva Feinblatt
. Carolina Núñez
. Mª Lourdes Sánchez-Cid

GRUPO 4
. Núria Monfort
. Marta Villarroel

GRUPO 5
. Teresita Masan Galleto
. Beatriz Souto

GRUPO 6
. Rosa Fernández
. Nira Suárez

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DOCUMENTO DE ACEPTACIÓN

Los miembros que a continuación firman este documento manifiestan que han participado en la
elaboración del trabajo, y que han leído y aceptado su contenido.

. Erola Ainsua

. Arantxa Blasco

. Daniel Castillo

. Anna Civit

. Eva Feinblatt

. Rosa Fernández

. Teresita Masan Galleto

. Núria Monfort

. Carolina Núñez

. Núria Sánchez

. Mª Lourdes Sánchez-Cid

. Beatriz Souto

. Nira Suárez

. Marta Villarroel

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CASO CLÍNICO DE MICROBIOLOGÍA

En la sesión de tutoría se nos plantea un caso clínico referente a un paciente seropositivo que presenta
un aumento de la carga viral pasados tres años desde el inicio del tratamiento con antirretrovirales.
Pensamos que el paciente puede haber desarrollado una resistencia a dicho tratamiento, pero es
necesario estudiar en profundidad el caso para confirmarlo y descartar otras causas.
El siguiente trabajo se ha estructurado en seis apartados que reunen los conocimientos necesarios
para la resolución del caso:

1. Historia natural de la infección por VIH.

2. Detección de anticuerpos en el diagnóstico microbiológico

3. Sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo. Pruebas de


confirmación.

4. Estudio de las cargas virales.

5. Estudios de resistencia a los antirretrovirales: fenotipado, genotipado y fenotipo virtual.

6. Técnicas de Biología Molecular en el diagnóstico microbiológico: PCR cualitativa y PCR


cuantitativa

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HISTORIA NATURAL DE LA INFECCCIÓN POR EL VIH-I

INTRODUCCIÓN Y DEFINICIÓN
El Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) es el agente infeccioso determinante del Síndrome de
Inmunodeficiencia Adquirida (sida). Las primeras cepas de VIH1 fueron descubiertas y aisladas en el año
1983. Más tarde, se identificó otra clase, el VIH2, endémico en ciertos países pero con menor virulencia
que el VIH1. Existen diferentes clasificaciones de la enfermedad. Una de ellas se basa en el recuento de
linfocitos T CD4+, y en su clínica; de manera que divide el VIH en 3 categorías: categoría A, engloba
aquellos pacientes asintomáticos con linfoadenopatías; categoría B, pacientes con infecciones no
englobadas entre las 23 infecciones oportunistas clasificadas por la OMS como complicaciones del VIH;
y categoría C, pacientes con alguna de las 23 infecciones oportunistas.
Ésta fue revisada en 1993:

Categorías clínicas
Categoría A (asintomática) B (sintomática, no C condiciones) C (indicador condiciones
SIDA Cel.TCD4+)

>500/µ L A1 B1 C1
200-499µ L A2 B2 C2
<200µ L A3 B3 C3

El VIH 1 también se divide en tres tipos: M, O y N. La M a la vez se subdivide en 9 subtipos siendo el


subtipo B el predominante en España y en el mundo occidental en general.

ESTRUCTURA
El VIH pertenece a la familia Retrovirae y al género Lentivirus. Es un virus esférico con envoltura de
doble membrana. En esta membrana se encuentran unas proteínas llamadas Gp41 y Gp120,
encargadas de reconocer a los receptores de la célula huésped, actúando como antígenos proteicos que
se acoplan específicamente a las células del huésped.
Dentro del virus se encuentra una cápside proteica que envuelve el genoma viral. El genoma está
formado por dos copias de ARN monocatenario. Dentro de esta envoltura también están presentes unas
enzimas (transcriptasa, integrasa y proteasa) que ayudan en la replicación del ARN viral.
El VIH1 tiene tres genes estructurales denominados gag (proteína de la nucleocápside), pol (proteasa,
transcriptasa y retrotranscriptasa) y env (glucoproteína de envoltura), además de seis genes reguladores
que condicionan la complejidad de la interacción virus-célula y su patogenia.

CICLO VIRAL
La primera etapa de la invasión del virus a la célula es la fijación. Consiste en un reconocimiento
mutuo, entre las proteínas de la envoltura del virión (Gp41 y Gp120) y los receptores de los LT CD4+,
macrófagos, células dendríticas y demás células huésped, con ayuda de unos correceptores de la célula
a invadir, CCR5 en el caso de macrófagos y CXCRA en LTCD4+, que son los que interactúan con las
proteínas de superficie del virión (Gp120).
Una vez reconocidos, la penetración es el segundo paso. La envoltura del virión se fusiona con la
membrana plasmática de la célula y se vacía en el citoplasma. Se eliminan las cubiertas proteicas y la
cápside de manera que el ARN vírico queda libre para ser procesado.
En la tercera etapa se desarrolla la transcripción inversa del ARN vírico para dar ADNc. Las dos
moléculas de ARN con ayuda de la enzima transcriptasa inversa forman dos moléculas de ADN que se
asocian para formar una molécula encargada de integrarse en el genoma de la célula huésped. El ADN
vírico penetra en el núcleo y se inserta en el ADN celular con ayuda de la integrasa procedente del virión.
La transcripción del ADN se lleva a cabo por los mecanismos normales de la célula. El resultado es un
ARNm que una vez procesado puede salir a través de los poros nucleares. De nuevo en el citoplasma, el
ARNm se dirige a los ribosomas para participar en la traducción generando poliproteínas. La proteasa
viral es la encargada de cortar estas poliproteínas y obtener proteínas constitutivas del virus. Estas
proteínas se ensamblan con ARN proviral y forman los compuestos internos de la estructura del virión.

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El último paso es la gemmación, cuando los nucleoides víricos se acercan a la membrana plasmática
de la célula, forman una verruga y se acaban desprendiendo formando un nuevo virión capaz de infectar
a otras células. En cada célula infectada se ensamblan miles de viriones, aunque muchos son
incompletos e incapaces de infectar.

TRANSMISIÓN
Existen diferentes vías de transmisión: sexual, parenteral y vertical.
La vía de transmisión sexual se produce a través del contacto de secreciones infectadas con la
mucosa genital, rectal u oral de la otra persona. Existe una alta relación entre transmisión y contacto
sexual por vía anal debido a la fragilidad de la mucosa de la membrana rectal. Cuando se presenta una
infección asociada a una inflamación, el número de linfocitos y monocitos se ve incrementado en las
secreciones de manera que aumentan las posibilidades de transmisión ya que están presentes un
número elevado de células diana. Esta transmisión puede llevarse a cabo por dos vías: directamente en
sangre si hay herida en la mucosa, o por la presencia de infección de células diana que facilitan la
transmisión. La transmisión sexual de hombre a mujer es ocho veces más probable que de mujer a
hombre debido a la morfología genital.
Puede producirse una transmisión por sexo oral, aunque las posibilidades son menores. La saliva
consta con una respuesta inmunitaria fuerte, pero la presencia de infecciones bucales con inflamaciones
aumenta las posibilidades al igual que los traumatismos o heridas en la cavidad oral. Aunque el virus se
encuentra en la saliva en menor cantidad, es una posible vía de transmisión si va acompañado de
inflamaciones bucales como la gingivitis al aumentar el número de linfocitos T CD4+. La recepción de
sexo oral no garantiza seguridad de no transmisión.
En la vía de transmisión parenteral se puede transmitir el virus por transfusiones sanguíneas o por
transplantes de tejidos u órganos, y es la vía común de transmisión entre toxicómanos al compartir
jeringuillas. No es necesaria una punción intravenosa; por vía subcutánea o intramuscular el VIH presenta
buena transmisión, siempre dependiendo de la cantidad de muestra y del periodo de exposición.
Los profesionales de laboratorio deben tener especial cuidado al estar expuesto a él. La transmisión
por punción con material contaminado se puede dar también dependiendo de la muestra, del tiempo de
exposición y de las características de la punción. Si no hay punción pero hay contacto con material
infectado la transmisión también depende de la presencia de heridas o mucosas en la piel.
La vía de transmisión vertical se trata de la transmisión madre-hijo a través de la placenta. Sin
embargo, el contacto más frecuente se da en el momento del parto por contacto de sangre o fluidos
vaginales de la madre, dependiendo de la carga viral presente. Por ello, es aconsejable la cesárea o el
tratamiento con antirretrovirales antes, durante y después del parto ya que se ha comprobado que
disminuye la probabilidad de transmisión. La lactancia materna es otra posible vía de transmisión de
madre a hijo.

PATOGENIA
El VIH-I prolifera en forma continua desde el momento en que infecta a un paciente. Cabe distinguir:

Fase precoz infección aguda o primoinfección. Va desde el ingreso del virus al organismo hasta
cuando el sujeto infectado comienza a producir anticuerpos contra el virus Los anticuerpos aparecen
entre las 6 y 12 semanas de la infección primaria, y su detección es la base del diagnóstico de la
enfermedad. Los primeros anticuerpos detectados son aquellos contra las proteínas estructurales o
proteínas Gag (p24 y p27), más tarde aparecen los anticuerpos contra el envoltorio (gp120, gp160, p88 y
gp41) y contra los productos del gen pol.
Estos anticuerpos se ha observado que pueden realizar una función protectora, bien neutralizando
directamente el virus o bien ayudando a los linfocitos NK en la destrucción de las células que expresan
antígenos virales, aunque también pueden estar implicados en la patogénesis del virus, ya que en
algunos casos los anticuerpos anti-gp120 pueden llegar a destruir linfocitos T CD4+ no infectados.
La respuesta inmunitaria celular es realizada principalmente por los linfocitos T: los linfocitos T CD4+,
que a pesar de ser los primeros en ser infectados y destruidos aún son capaces de sobrevivir y producir
una expansión clonal, y los linfocitos T CD8+, que pueden producir citocinas y destruir directamente las
células afectadas uniéndose a ellas por sus receptores de antígeno.
Independientemente del mecanismo de transmisión, los síntomas que aparecen tras el contagio del
VIH guardan relación con la dosis infectante, la virulencia de la cepa y la capacidad de respuesta del
sujeto infectado. En esta fase se puede ser asintomático o presentar síntomas "similares a los de la
gripe", que generalmente duran pocos días y pueden incluir fiebre, escalofríos, sudores nocturnos y
erupciones en la piel. Después, la persona infectada vuelve a verse y sentirse completamente bien.

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Aproximadamente un 30-40% de los casos cursan de forma asintomática. La presentación de fiebre alta
persistente durante un período de 10-14 días puede pronosticar un curso rápidamente progresivo. La
seroconversión, es decir, la aparición de los anticuerpos anti-VIH se produce entre 8 días y 14 semanas,
aunque a veces se retrasa hasta 6 meses. Durante este período ventana el sujeto permanece
seronegativo pero tiene capacidad infectante.
A partir de las primeras horas de infección el VIH-I invade el tejido linfático, donde alcanza
concentraciones muy elevadas. Durante la primoinfección en el plasma se pueden alcanzar niveles muy
altos de viriones circulantes cuya presencia puede demostrarse a través de la cuantificación de copias de
ARN-VIH-I (carga viral) (2-6 semanas). Posteriormente, con el tiempo aparecen los diferentes tipos de
anticuerpos (1-3 meses) y una drástica reducción de la concentración de virus circulante. A lo largo de
este proceso agudo puede haber una inmunodepresión transitoria.

Particularmente, la difusión del virus a los órganos linfoides es un factor importante en el


establecimiento de una infección crónica y persistente. Parece que el nivel inicial del viremia del plasma
en la infección del VIH primaria no determina necesariamente el índice de la progresión de la
enfermedad; sin embargo, el punto de ajuste del nivel de la viremia del estado estacionario del plasma
después de 1 año se puede correlacionar con la rapidez de la progresión de la enfermedad.

Fase intermedia o crónica. En esta fase, que generalmente dura varios años, persiste la actividad
proliferativa vírica. En casi todos los pacientes es posible detectar y cuantificar la concentración de ARN
vírico (carga viral). En el plasma se alcanza un nivel de equilibrio que depende de la tasa de producción
vírica y de la destrucción. Los pacientes suelen ser asintomáticos o sin adenopatías. La carga viral y en
menos medida la cifra de linfocitos CD4+ son los mejores marcadores de la progresión clínica.
A pesar de que una persona infectada puede parecer sana, el VIH está activo y durante esta etapa,
continúa debilitando el sistema inmunológico durante varios años. En la mayoría de las personas, sin
embargo, en algún momento se produce una depresión rápida del sistema inmunológico y el virus se
multiplica rápidamente. Este daño se puede observar en los análisis de sangre antes de que se
experimenten los síntomas.
El establecimiento de la cronicidad de la infección es debido a la capacidad del virus de evadir la
eliminación y el control por el sistema inmune mediante la mutación, variando la conformación del sitio de
unión del receptor, y de infectar células que se escapan del control inmunológico como las del sistema
nervioso central.

Fase sintomática. Cuando el sistema inmunológico se ve comprometido por la infección con VIH,
muchas personas comienzan a experimentar síntomas leves, como erupciones en la piel, fatiga, sudores
nocturnos, pérdida de peso, úlceras en la boca, infecciones por hongos en la piel y en la uñas. La
mayoría, pero no todos, experimentará síntomas leves de este tipo, antes de desarrollar enfermedad más
grave. Si bien el pronóstico varía mucho, dependiendo de varios factores, en general la aparición de los
primeros síntomas leves de enfermedad se da entre cinco y siete años después de la infección. Estos
síntomas marcan las etapas tempranas y media de la etapa sintomática de la enfermedad por VIH

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aunque no son necesariamente específicos del VIH o del desarrollo de sida. Sin embargo, deben ser
motivo de preocupación para los seropositivos. Generalmente, los síntomas aparecen cuando el virus ya
ha causado un daño considerable en el sistema inmunológico. Por eso, estos pacientes no deberían
esperar hasta que aparezcan síntomas para recibir tratamiento médico.

Fase final o crisis. En este momento ya hay una caída significativa de los linfocitos CD4+ (<200/mm3) y
el virus se reproduce muy activamente. El sujeto comienza a presentar una serie de problemas
relacionados con la infección por el VIH mismo y por la presencia de otras múltiples infecciones que
atacan dado el deterioro de la inmunidad, son las llamadas infecciones oportunistas, causadas por
organismos que generalmente no producen enfermedad en personas con un sistema inmunológico
normal, pero que emergen en las personas con un sistema inmunológico comprometido.
Durante esta etapa puede haber manifestaciones a nivel de todos los órganos, por ejemplo: neumonía
por Pneumocystis carinii, toxoplasmosis, citomegalovirus (afecta retina, esófago, colon y múltiples
órganos), candidiasis del esófago, diarreas por parásitos como Isospora o Cryptosporidium. Las
enfermedades dermatológicas, como linfomas o el sarcoma de Kaposi, son unas de las más relevantes a
la hora de dictaminar el inicio de esta etapa. También pueden aparecer problemas neurológicos y
demencia ocasionados por el daño del VIH al sistema nervioso central. Hay pérdida de memoria y
atención, capacidad de juicio y razonamiento. Se presentan cuadros con compromiso motor y de la
función de la vejiga. Estos problemas pueden ser causados también por otros tipos de infecciones o ser
debidos a problemas psiquiátricos.

PRUEBAS DE CRIBAJE EN DETECCIÓN DE ANTICUERPOS

INTRODUCCIÓN
Después de la infección el primer marcador serológico que se detecta en algunos pacientes es el
antígeno p24, algunas semanas después aparecen los anticuerpos que se dirigen frente al VIH y se
pueden detectar por las técnicas de cribado actuales en la mayoría de los pacientes infectados antes de
transcurridos tres meses de la exposición al virus.
En general las técnicas que son más sensibles para la detección de anticuerpos dirigidos frente al core
del VIH se pueden positivizar antes, al igual que las que detectan anticuerpos de la clase IgM, si bien
este tipo de anticuerpos no son específicos solamente de la primoinfección y pueden aparecer en etapas
ulteriores del desarrollo de la infección. De este modo los primeros anticuerpos que se suelen positivizar
son los anti-p24 y anti-gp160, mientras que el resto de los anticuerpos van apareciendo de modo
progresivo en las semanas siguientes.
Existen diferentes métodos para la realización de las pruebas de cribado para la detección de
anticuerpos específicos frente al VIH. Entre ellos las técnicas ELISA (enzyme-linked immunoabsorbent
assay), pruebas de aglutinación y análisis dot-blot son las más utilizadas, especialmente el ELISA que
también se denomina análisis inmunoenzimático (abreviado, EIA).

TÉCNICA ELISA
Se basa en la detección de un anticuerpo inmovilizado sobre una fase sólida mediante antígenos que
directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, por ejemplo un colorante, puede ser
medido espectrofotométricamente. El antígeno puede proceder del lisado viral de un cultivo (como en los
primeros EIA disponibles que se llamaron de 1ª generación) o bien de proteínas recombinantes o
péptidos sintéticos de 10-50 aminoácidos específicos del VIH (que se han calificado como EIA de 2ª. y
de 3ª. generación).
Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal
(luminiscentes, cascadas enzimáticas,...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la
obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.
Dispositivos empleados en ELISA: Se han ensayado numerosas fases sólidas, desde los tubos de cristal
de los orígenes a las actuales microplacas de 96 pocillos de plástico tratado para aumentar su capacidad
de adsorción de moléculas y con fondos de pocillo ópticamente claros para poder realizar las medidas de
densidad óptica en instrumentos específicos, espectrofotómetros de lectura de placas que han recibido el
nombre de lectores ELISA. Actualmente se están desarrollando dispositivos de mayor capacidad, por
ejemplo con 384 y 1536 pocillos, adecuados para los sistemas de 'screening' masivo de los sistemas
robotizados (HTS, 'High-throughput system')

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Los lectores ELISA son espectrofotómetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de los
pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotómetro convencional, con capacidad de leer
todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los lectores de ELISA
disponen de sistemas de filtros que sólo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda. Son la
que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad óptica de los cromógenos más
comúnmente utilizados.
Fases de un ensayo ELISA: La primera fase es la conjugación del anticuerpo o del antígeno con un
enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina,...). El anticuerpo conjugado al enzima se emplea en los ensayos
directos e indirectos, sandwich, etc.. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de
antígeno. En segundo lugar se da la unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. Se realiza con
facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas. Después se forma
una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar
mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-
antígeno y un secundario anti-primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la
amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario.
En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se
ensayan diferentes relaciones de antígeno frío frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el
ensayo de competición del antígeno. Finalmente se revela la reacción enzimática. Después de un lavado
para eliminar todas las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el
sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante
espectrofotometría.
Tipos de ensayos ELISA: Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten la
cuantificación de un antígeno o la detección de un anticuerpo en solución. A continuación se describen
los más comúnmente usados para la detección de anticuerpos:
ELISA competitivo directo: Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con los antígenos
específicos para los anticuerpos que buscamos. Añadimos el suero del paciente que contiene los
anticuerpos (no marcados) y también se añaden los mismos anticuerpos pero marcados
enzimáticamente. Estos dos tipos de anticuerpos (marcados y no marcados) van a competir para unirse
al antígeno de manera que la aparición de color al revelar, será inversamente proporcional a la
concentración de anticuerpos en la muestra. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras
del mismo tipo que las analizadas (sangre, orina,...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia
del anticuerpo buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el
anticuerpo buscado, o bien se le ha añadido).
ELISA indirecto: Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los controles
positivos y negativos son los mismos. Añadimos el suero del paciente que contiene los anticuerpos y
estos se unirán a los antígenos de la placa. Posteriormente se añaden anticuerpos secundarios
marcados enzimáticamente, que se unirán a los del paciente (primarios) y que detectaremos añadiendo
un sustrato análogo. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal
debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada anticuerpo del paciente. Es el ensayo
más popular, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permiten cuantificar
una gran cantidad de anticuerpos. Es el más utilizado en las pruebas de cribaje en pacientes de VIH.

LA SEROLOGÍA EN LOS RECIÉN NACIDOS


El diagnóstico de la infección por el VIH-1 en los recién nacidos y niños menores de dos años tiene
características propias determinadas en gran parte por la posibilidad de transmisión pasiva de los
anticuerpos maternos, que dificulta conocer con las pruebas de cribado rutinarias si realmente el niño
está infectado, y los potenciales efectos indeseables que acompañan a la terapia antirretroviral
Actualmente el diagnóstico de la infección por VIH en los niños comprende una combinación de
pruebas como las determinaciones seriadas de anticuerpos y detección de antígeno del VIH que son
asequibles a la mayoría de los laboratorios mientras que otras, como el cultivo del virus o detección de
ácido nucleicos, son realizadas en laboratorios más especializados o centros de referencia.
Otro de los hechos que van a caracterizar la positividad de las pruebas es el momento evolutivo del
embarazo en el que se ha adquirido la infección. Alrededor del 30% de los casos se producen
intrauterinamente en cualquier momento de la gestación (infección prenatal o intrauterina) pero la gran
mayoría, alrededor del 70%, se adquieren en el mismo momento del nacimiento en el parto y solo muy
pocos casos se adquieren después del nacimiento (lactancia, etc.). En el primer caso va a ser posible
detectar el VIH más precozmente que en el resto si bien no siempre es así por la posibilidad de
quiescencia del virus en las células infectadas. Reviste importancia pues, conocer que una sola
determinación negativa en niños recién nacidos o con pocos días de vida no tiene valor para descartar la

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infección y que una detección positiva en muestras tomadas en los primeros momentos de la vida puede
revertir a la negatividad por la presencia de un inóculo viral materno que no ha infectado al niño.
La detección de anticuerpos específicos por pruebas de EIA o WB aportan pocos datos sobre la
infección de los recién nacidos ya que las IgG maternas pasan a través de la placenta y se pueden
mantener en el niño hasta los 18 meses de vida. La persistencia, aumento de la intensidad o aparición de
nuevas bandas en el WB a través del análisis seriado en el tiempo de las muestras puede objetivar la
infección del hijo, sin embargo no es útil si el fin es establecer un diagnóstico precoz para instaurar la
terapia. Otros tipos a anticuerpos como la IgM o la IgA específicas al VIH no atraviesan la barrera
placentaria y su presencia se puede considerar diagnóstica; sin embargo la sensibilidad de las pruebas
EIA disponibles es escasa, en torno al 10% al nacer y al 50% hacia los seis meses de vida.
La detección de la antigenemia p24 reviste en los niños los mismos problemas que en los adultos:
poca sensibilidad de los EIA y presencia de antígeno solo en determinadas fases evolutivas
probablemente por su fijación en inmunocomplejos con su anticuerpo. Aunque realizada de forma
rutinaria en los neonatos su sensibilidad es menor del 20% al nacer y un poco más alta a partir de los 3
meses; sin embargo ya que refleja la detección directa del virus, su positividad, en ausencia de errores
técnicos, es un signo inequívoco de infección vertical.

INMUNOCROMATOGRAFÍA Y PRUEBAS DE AGLUTINACIÓN

Estas dos técnicas son una buena alternativa a la ELISA y la Radioinmunoenzimoanálisis. Son pruebas
alternativas a la ELISA de gran utilidad que se usan en países subdesarrollados, sobretodo en el
continente Africano, ya que su coste es muy inferior al de un ELISA a parte de las dificultades técnicas de
realizar estos ensayos en países del 3r mundo. En los países desarrollados también se utilizan ya que
son pruebas muy rápidas y sensibles.

Inmunocromatografía: consiste en una pequeña placa de un material cromatográfico donde en una zona
determinada tenemos hibridados los antígenos de interés (en este caso, p24 por ejemplo) y al final de la
placa tenemos otros antígenos universales que utilizamos como control, para determinar que la prueba
ha funcionado. Se deposita una gota de sangre al principio de la placa que por cromatografía irá
corriendo. Si en la muestra hay presencia de anticuerpos, en la lectura veremos que tanto la zona de
antígenos como la zona control nos dan un resultado colorimétrico, en caso contrario solo nos dará
resultado la zona de control. Se sobreentiende que si no aparece ninguna línea es que la prueba no ha
funcionado correctamente.
Pruebas de aglutinación: tienen un mecanismo muy parecido al anterior pero aun son más rápidas.
Consiste en hibridar los antígenos de interés a unes pequeñas bolitas de látex. En un portaobjetos
colocamos una gota con bolitas de látex y otra pequeña gota, a una cierta distancia, de muestra (sangre),
las mezclamos y esperamos unos segundos. Si hay presencia de anticuerpos veremos una reacción de
aglutinación, volviéndose turbia la mezcla y compacta. Por el contrario, si no hay anticuerpos veremos
bien diferenciados los dos medios. Prueba rápida y muy indicativa y de menor coste que los EIA.

ESTADÍSTICA DE PRUEBAS DIAGNÓSTICAS Y PRUEBAS DE CONFIRMACIÓN

ESTADÍSTICAS
Para elaborar un diagnóstico, hay que acumular información, que se divide en signos, clínicos y
complementarios. Aquí nos interesamos en los signos complementarios, que son dados por los
resultados de diferentes pruebas. Así, para una afección considerada, buscamos si un signo – “signo
con un interés diagnostico” – esta presente o ausente.
Para evaluar pruebas complementarias, utilizamos diferentes probabilidades: el valor predictivo
positivo1, el valor predictivo negativo2, la sensibilidad3 y la especificad4. En estadística, los signos son

1
VPP = Pr (M/S) ≈ VP / (VP + FP)
2
VPN = Pr (M’/S’) ≈ VN / (VN + FN)
3
Se = Pr (S/M) ≈ VP /(VP + FN)
4
Sp = Pr (S’/M’) ≈ VN / (VN+ FN)
VP : verdaderos positivos ; FP : falsos positivos ; VN : verdaderos negativos ; FN : falsos negativos

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representados por variables binarias, es decir, el signo esta presente (S) o no (S’). Después vemos si el
diagnóstico es verdadero (M) o no (M’), es decir, si el paciente tiene la enfermedad o no.
En realidad, cuando se reciben los resultados de un examen, hay que preguntarse cual es la
probabilidad de presencia de la enfermedad (M) en este paciente, si el resultado es positivo o negativo.
Esas probabilidades se llaman “valores predictivos”. El valor predictivo positivo de un signo para una
enfermedad es la probabilidad de que el paciente tenga la enfermedad si tiene el signo. El valor
predictivo negativo es la probabilidad de que el paciente no tenga la enfermedad si no tiene el signo.
Esos valores pueden exprimirse en función de la frecuencia de la enfermedad en la población. Como las
proporciones de enfermos y de no enfermos cambian, para una misma enfermedad, de un centro
hospitalario al otro, los valores predictivos no son los parámetros más usados para evaluar una prueba.
Los más usados son la sensibilidad y la especificad que son en función de la población enferma
(sensibilidad) o de la población sana (especificad).
La sensibilidad de un signo para una enfermedad es la probabilidad de que el signo esté presente (que
la prueba de un resultado positivo) si el paciente tiene la enfermedad. Por eso, las pruebas sensibles
son pruebas de cribaje. Tienen la capacidad de resultar positivas en casi todas las personas infectadas, y
no da falsos negativos (es decir, el signo está ausente pero el paciente tiene la enfermedad). Si el
resultado de la prueba de cribaje es positivo, se repite con la misma muestra de sangre. Y si también es
positivo, los resultados se confirman mediante pruebas de confirmación que pueden diferenciar, por
ejemplo en el caso del sida, los anticuerpos anti-VIH del resto de anticuerpos. La prueba de cribaje EIA
puede dar falsos positivos en personas no infectadas.

Por eso, la prueba de confirmación tiene que ser especifica. La especificad de un signo para una
enfermedad es la probabilidad de que el signo esté ausente si el paciente no tiene la enfermedad. Da un
resultado negativo para casi todos los pacientes no enfermos. Las pruebas de confirmación que existen
actualmente son el Western-Blot (el método más utilizado), la inmunofluorescencia indirecta, la
radioinmunoprecipitación y el inmunoensayo en línea.

PRUEBAS DE CONFIRMACIÓN
El Western Blot (WB) se basa en la separación de las proteínas (antígenos) obtenidas del VIH-1
procedentes del lisado del cultivo del virus y purificadas por centrifugación. La proteína viral se coloca en
un gel de poliacrilamida en forma de láminas delgadas y luego se efectúa una electroforesis con la que
las proteínas migran en función de su peso molecular. Después se transfieren a una tira de nitrocelulosa
y se cortan en tiras de unos 5 mm de ancho. Éstas son las tiras que se exponen al suero humano diluido,
después de una incubación se lavan y se vuelven a incubar con una IgG antihumana marcada con una
enzima que con la exposición a un revelador enzimático producirá una banda coloreada en las zonas
correspondientes a los anticuerpos específicos que contenga la muestra.
Las principales bandas del WB son las proteínas de la envuelta: gp160, gp 120 y gp 41, las proteínas del
core P55, 40, 24 y 17, las proteínas que codifican para la transcriptasa inversa, P66 y P51, y la
endonucleasa, la P31.

Los criterios para la interpretación de los resultados son los expuestos a continuación:

No bandas presentes NEGATIVO

Bandas en p31 o p24 Y


bandas presentes en gp 160 POSITIVO
o gp 120.

Hay bandas presentes pero


el patrón no cumple el INDETERMINADO
criterio de positividad.

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El mayor problema que probablemente presentan los WB es la reactividad indeterminada de bandas
p24, p55 o p66. Las principales causas de WB indeterminado suelen obedecer a una reactividad
inespecífica (ver falsos positivos), una infección por VIH-2 u otros retrovirus humanos, la seroconversión
al VIH-1, el estado avanzado de infección VIH-1, un hijo de madre seropositiva, divergencias genéticas
de la cepa del VIH-1 (africanos). Las ventajas son que confirma definitivamente la infección por HIV,
detecta al menos un 96% de las infecciones y que produce muy pocos falsos positivos. Éstos son
debidos principalmente a reacciones cruzadas con ribonucleoproteínas humanas, otros retrovirus,
anticuerpos frente a antígenos mitocondriales, nucleares, de células T y leucocitarios, anticuerpos frente
a antígenos HLA clases I y II y globulinas en una gammopatía monoclonal. El principal inconveniente es
su elevado precio, que lo hace inviable como prueba de confirmación en algunos países
subdesarrollados. Además, no puede detectar la infección hasta que los anticuerpos se desarrollan y
produce algunos resultados indeterminados.
La Inmunofluorescencia indirecta permite detectar anticuerpos anti VIH-1 en suero o plasma.
Fluorognos IFA TM en concreto, aprobado en 1992 por la FDA, utiliza células T humanas inmortalizadas e
infectadas que expresan antígenos del VIH-1. Como control se utilizan células T no infectadas. Si existen
anticuerpos anti VIH-1 en suero o plasma, se unirán a las células infectadas pero no a las control. Los
anticuerpos unidos son detectados con inmunoglobulinas anti-humanas conjugadas a isocianato de
fluoresceína, que emitirá fluorescencia al ser expuesto a luz UV. Se observa con un microscopio de
florescencia y se evalúa la intensidad de fluorescencia y el porcentaje entre células infectadas y no
infectadas. La ventaja es que requiere menos experiencia técnica, menos tiempo y dinero que el WB,
además, presenta una sensibilidad y especificidad similar. La principal ventaja es que el resultado, sea
positivo o negativo, es más fácil de leer en comparación con los resultados indeterminados que aparecen
en el WB.
La Radioinmunoprecipitación usa antígenos marcados radioactivamente para detectar anticuerpos
específicos en el suero. Los antígenos pueden reaccionar con el suero y precipitarse utilizando un
reactivo especial la proteína A sefarosa. El inmunoprecipitado unido, marcado radioactivamente, se
analiza generalmente mediante electroforesis en gel que es revelado por autorradiografía. El
inconveniente es que es una técnica limitada a laboratorios capaces de lograr la propagación del VIH-1
en cultivos celulares, pero ofrece más sensibilidad que el WB frente a las proteínas de alto peso
molecular, a excepción de la p24.
El Análisis inmunoenzimático de tipo lineal (LIA) es equivalente al WB pero incorpora en un
soporte plano, equivalente a la tira, varias proteínas recombinantes o péptidos sintéticos
correspondientes a diferentes proteínas del VIH-1 y en algunos casos del VIH-2. En algunos sitios
reemplazan al WB pero la presencia de péptidos sintéticos puede ocasionar resultados falsos negativos
en la infección VIH aguda y en niños.

CUANTIFICACIÓN DE LA CARGA VIRAL EN ENFERMOS DE VIH

El test de cuantificación de la carga viral o PVL (Plasma Viral Load) consiste en la medida de los
niveles de ARN del VIH en plasma para cuantificar el número de partículas virales circulantes. Es un
marcador de la actividad del VIH.

USO CLÍNICO
Este test se usa rutinariamente desde 1997 debido a la estrecha correlación de la carga viral con la
evolución a sida en individuos VIH positivos, a la relación con un mayor riesgo de transmisión y
progresión del virus y a la utilidad para evaluar nuevos fármacos. También se usa para monitorizar el
tratamiento con antirretrovirales, es decir, para decidir el momento de inicio del tratamiento, su
efectividad y la necesidad de un cambio si se perdieran los efectos beneficiosos de éste.

CURSO NATURAL DE LA INFECCIÓN POR VIH


El número de partículas virales en personas infectadas por VIH es elevado aunque existe gran
variabilidad entre individuos, por este motivo se debe estudiar la evolución del paciente en el tiempo. La
determinación de linfocitos CD4+ también puede ser de gran ayuda porque es un indicador del sistema
inmune del individuo.

12
Es importante cuantificar la carga viral en los 6
meses posteriores a la seroconversión para poder
predecir la progresión de la enfermedad. Los
individuos que presentan ≥ 105 copias/ml
experimentan una rápida caída de linfocitos CD4+
que condiciona la rápida progresión a sida en los
siguientes 5 años; mientras que si la carga viral es
menor, la progresión a sida se dará después de
muchos años de infección.

En la fase asintomática los niveles de ARN en


plasma varían entre los pacientes ya que depende
de la eficacia del sistema inmune que es el que
atenúa la replicación del virus.

En la fase sintomática el paciente padece


infecciones oportunistas y se observa un aumento
de la carga viral debido a la muerte de los linfocitos
CD4+.

USO DE LA PVL EN EL TRATAMIENTO CON ANTIRRETROVIRALES


Se recomienda iniciar el tratamiento cuando la carga viral está entre 10.000-30.000 copias/ml y si el
recuento de CD4+ es menor de 350 a 500 por mm3. Después de 4 a 6 semanas desde el inicio del
tratamiento se espera una reducción de 1 o 2 log (la reducción de la carga viral se expresa en log10). En
caso que después de conseguir una importante reducción del PVL la carga viral vuelva a aumentar, hay
que considerar la aparición de mutantes y la necesidad de cambiar el tratamiento antirretroviral.
Se debe tener en cuenta que todas las determinaciones de un mismo paciente se tienen que hacer
por el mismo método que se usó para medir la carga viral basal, no hay que realizar ninguna medida
hasta pasado un mes de haberse vacunado o sufrir una infección oportunista y se considerarán
significativas las variaciones de carga viral superiores a 0.5log para descartar la variabilidad biológica
individual.

MEDIDA DE LA CARGA VIRAL EN PLASMA


Existen tres tipos de técnicas:

Amplificación del ARN por RT-PCR: Amplicor HIV-1 monitor test


Es la técnica más usada para cuantificar la caga viral en enfermos de VIH-1 y es el único test
aprobado por la FDA para estimar el pronóstico de individuos afectados por esta enfermedad.
En primer lugar se aísla el ARN y se añade un control interno para detectar posibles problemas en el
aislamiento y amplificación. Gracias a la ADN-polimerasa termoestable se lleva a cabo la transcripción
inversa del gen gag y se obtiene ADNc a partir del ARN. A continuación se amplifica el ADNc por una
PCR convencional (reacción en cadena de la polimerasa) y una vez finalizada, se desnaturalizan las
copias obtenidas de ADN bicatenario para pasar a la hibridación con sondas oligonucleotídicas
específicas para el VIH-1 y el control interno. Finalmente se añade el conjugado (HRP: avidin-
horseradish peroxidase), se detecta con TMB que es un sustrato colorimétrico y se lee a 450 nm.

Amplificación isotérmica de ARN : NASBA HIV-1 RNA QT


La técnica NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) consta de una amplificación basada
en la transcripción y una detección basada en un método de electroquimioluminiscencia. La técnica
amplifica selectiva y directamente el ARN del VIH-1 (gen gag) en un solo paso del procedimiento de
hibridación isotérmica (41ºC) utilizando 2 oligonucleótidos como primers, 3 enzimas (AMV-RT, ARNasa
H, T7 ARN polimerasa), nucleósidos trifosfato y los tampones adecuados.

13
El mecanismo de amplificación se divide en 2 fases, una
cíclica y una no cíclica. En la no cíclica se extrae y purifica el
ARN. Al ARN se le une el primer1 a partir del cual una
transcriptasa reversa generará un híbrido ADNc-ARN. La
cadena de ARN se degrada por la ARNasa y a la cadena ADNc
sobrante se le une un primer2 creándose así una doble cadena
de ADN. A partir de la doble cadena la T7 ARN polimerasa va
sintetizando ARN que reinician el ciclo conocido como etapa
cíclica.

La cantidad de ARN se determina por


electroquimioluminiscencia, es decir, la detección se basa en la
emisión de luz por parte de átomos de rutenio que se unen al
ARN. Para dicha cuantificación se necesitan calibradores
internos.

Amplificación de la señal por hibridación molecular: b-ADN, quantiplex HIV RNA v2

La técnica b-DNA (branched DNA o ADN ramificado)


permite cuantificar las moléculas de ARN del VIH-1 en el
plasma partiendo de los viriones. Esta técnica consigue
más sensibilidad en métodos b-DNA de segunda y
tercera generación.

Los pasos a seguir son: Se concentran los viriones


por centrifugación, a continuación se libera el ARN
(digestión proteica) y se captura en placas gracias a los
oligonucleótidos complementarios que contienen.
Posteriormente se añaden sondas ramificadas que
hibridarán con el gen pol del VIH-1 y finalmente, unas
nuevas sondas marcadas (con fosfatasa alcalina) nos
proporcionarán la luminiscencia al añadir el sustrato
(dioxietano). La quimioluminiscencia generada será
proporcional a la cantidad de VIH-1 y será cuantificada
en un espectrofotómetro. Para esta cuantificación
también serán necesarios calibradores internos.

14
RESISTENCIAS DEL VIH AL TRATAMIENTO ANTIRRETROVIRAL

Para el tratamiento de la infección por el VIH-1 se han aprobado 16 medicamentos antirretrovirales: 7


son análogos de nucleótidos/nucleósidos (NRTI) como el Zidovudine, Tenofovir, AZT, que son
inhibidores de la transcriptasa reversa (RT); 6 son inhibidores de la proteasa (PI) como el Saquinavir y 3
inhibidores no nucleósidos de la RT como el Nevirapine (NNRTI), que son los más selectivos. Las pautas
terapéuticas empleadas generalmente consisten en la combinación de al menos tres fármacos, de los
cuales dos son inhibidores de la RT análogos de nucleósido y el tercero es un no nucleósido o bien un
inhibidor de la proteasa. Las distintas combinaciones posibles de estos regímenes terapéuticos se
engloban dentro de la denominación terapia de alto rendimiento o HAART (highly active antiretroviral
therapy) y han demostrado producir un beneficio virológico e inmunológico profundo y mantenido en
aproximadamente dos tercios de los pacientes.

El VIH presenta una gran capacidad de adaptación a los cambios introducidos en su medio natural, y
fundamenta esta cualidad en diversos mecanismos, entre los que cabe destacar dos: la RT carece de
actividad exonucleasa 3’5’, que actúa como correctora de errores y que el virus presenta una alta tasa
de replicación (1010 nuevos viriones cada día). Estos procesos darán lugar a una alta tasa de mutación,
que dará paso a la selección de cuasiespecies en virtud de su capacidad de supervivencia en un
ambiente “hostil” (presencia de antirretrovirales) y se producirá por tanto una selección de aquellas que
presenten características de supervivencia más favorables en estas circunstancias. La detección de
variantes resistentes nos puede permitir correlacionar dicho fracaso con los distintos fármacos
administrados y optimizar la terapia.

TIPOS DE TÉCNICAS PARA LA DETECCIÓN DE RESISTENCIAS


Las técnicas para la determinación de las resistencias del VIH a los distintos antirretrovirales se
pueden clasificar en dos grandes grupos: genotípicas, que detectan mutaciones en el genoma del virus, y
fenotípicas, que determinan la sensibilidad del virus a distintos fármacos.

Las técnicas genotípicas se basan en el análisis del genoma y por tanto detectar la presencia de
mutaciones, utilizando la amplificación por PCR de aquellas regiones implicadas en el desarrollo de
resistencias, habitualmente el gen de la RT y el de la proteasa (PR), para el posterior análisis de su
secuencia de nucleótidos. Entre las distintas técnicas genotípicas actualmente en uso destacaríamos las
siguientes: secuenciación de ácidos nucleicos, ensayos LiPATM y GeneChipTM.

La secuenciación es el método genotípico de referencia que proporciona información de todos los


nucleótidos de la región en estudio. Para secuenciar el VIH de la muestra problema se pueden adoptar
dos estrategias: la secuenciación del genoma proviral integrado en los linfocitos, que ya está como ADN,
o la realización de una retrotranscripción previa de ARN plasmático. Actualmente la técnica más
empleada es la secuenciación cíclica (basada en la aplicación de la tecnología PCR al método de
Sanger) a partir de productos de PCR obtenidos de la amplificación de los genes de la RT y de PR del
virus del paciente. Los productos secuenciados mediante el uso de dideoxinucleótidos marcados se
detectan en el curso de una electroforesis en equipos automáticos, obteniendo así la secuencia del VIH
de la muestra problema en forma de electroferograma y ésta se compara con la secuencia de una cepa
salvaje de VIH mediante un programa informático acoplado al secuenciador.

Los ensayos LiPATM y GeneChipTM son técnicas basadas en la hibridación. La LiPATM nos da
directamente información sobre la presencia de mutaciones conocidas que confieren resistencias a
fármacos antirretrovirales. En el GeneChipTM, el resultado final es una secuencia del material amplificado
del VIH problema.

En principio las técnicas genotípicas se caracterizan por su sensibilidad, son menos laboriosas, más
rápidas y de coste inferior a las fenotípicas. La existencia de cuasiespecies virales no detectadas, el
desconocimiento del efecto de algunas mutaciones y sus resistencias cruzadas, la compleja
interpretación, la variable respuesta de los pacientes a los fármacos y el hecho de tratarse de un
marcador indirecto (la presencia de mutaciones no siempre implica su expresión), avalan la precaución
de la comunidad científica a su uso.

Un nuevo sistema de interpretación del genotipo, introducido por el grupo Virco, es el fenotipo virtual,
que busca emparejamientos entre las mutaciones de un determinado genotipo y una amplia base de

15
datos de muestras, de las que se conoce el genotipo y fenotipo. La respuesta del sistema es una
sensibilidad fenotípica para un determinado fármaco, que es la media de los fenotipos individuales de
todas las muestras de la base de datos que presentan el genotipo de la muestra problema. Presenta la
ventaja de reducir la interpretación compleja del genotipo a un fenotipo sencillo. Permite realizar el
genotipo en los laboratorios de los hospitales, con independencia del sistema elegido y enviar luego los
ficheros de las secuencias obtenidas por Internet de una forma rápida y segura, recibiendo en 24 o 48
horas el posible fenotipo derivado de ellas. En cuanto a la limitación principal, encontramos que la
fiabilidad del resultado dependerá del número de emparejamientos que puedan producirse entre los
codones de la muestra real y los de la bases de datos, por lo tanto podemos decir que este método
proporciona información menos real.

Las técnicas fenotípicas permiten conocer si una determinada cepa del VIH es sensible o resistente a
un fármaco, teniendo en cuenta su capacidad de replicación ante concentraciones decrecientes del
fármaco in vitro. El resultado que se obtiene se conoce como concentración inhibitoria del 50% (CI50) o
del 90% (CI90), lo que indica la concentración de fármaco necesaria para reducir la capacidad de
replicación del VIH en un 50% o en un 90%, respectivamente. Estas técnicas requieren el aislamiento y
la cuantificación del virus en sangre periférica. Los aislamientos son cultivados con células
mononucleares de sangre periférica (CMSP) que se obtienen de donantes sanos y que son estimuladas
en presencia de diluciones seriadas de un determinado fármaco o de una combinación de ellos. La
sensibilidad relativa del virus a un fármaco se obtiene en función de la menor concentración de fármaco
capaz de suprimir la replicación viral determinada por la cuantificación del antígeno p24, lisis celular o
inducción de sincitios, según sea el sistema de cultivo celular utilizado.

Estos estudios tienen la ventaja de valorar con mayor fidelidad la sensibilidad del virus frente a cada
fármaco, ya que son un marcador directo de la resistencia, y según este grado de sensibilidad se podría
valorar en un futuro la posibilidad de sobrepasar la resistencia aumentando los niveles plasmáticos del
fármaco. Además informan de resistencia cruzadas y son de interpretación más fácil. Sin embargo, estos
estudios deben considerarse por el momento como poco viables, principalmente por la complejidad,
laboriosidad de la técnica, los altos costes y el tiempo necesario para la emisión de resultados.

INDICACIONES DE LAS PRUEBAS DE RESISTENCIA A FÁRMACOS ANTIRRETROVIRALES EN LA


PRÁCTICA CLÍNICA
Las recomendaciones para el uso de los estudios de resistencia en la elección del tratamiento
antirretroviral, están sujetas a variadas opiniones. En España, las recomendaciones realizadas por el
Grupo de Estudio de sida y el Plan Nacional sobre el sida, contemplan su uso en pacientes sin
tratamiento previo en tres supuestos específicos (infección aguda, embarazo y profilaxis postexposición)
y en pacientes pretratados en fracaso terapéutico.

LIMITACIONES DE LAS PRUEBAS DE DETECCIÓN DE RESISTENCIAS


Una precaución importante a tener en cuenta a la hora de tomar las muestras para estas
determinaciones es asegurar que en ese momento el paciente continúa con el tratamiento que
supuestamente ha fracasado, pues el rápido recambio de la población viral conduciría a un predominio
de subpoblaciones salvajes que daría lugar a falsos negativos en la determinación de resistencias.
Otra limitación de estas técnicas es la proporción mínima que debe representar una subpoblación
determinada respecto al global de la muestra, necesitándose una proporción de un 20% para que esa
subpoblación esté representada en el conjunto, y por tanto ser detectable. Además, se requiere un
umbral de carga viral mínimo para garantizar la obtención de resultados fiables, que generalmente se
establece en 500 o 1000 copias de ARN/ml, dependiendo de la técnica utilizada.

16
PCR Y PRUEBAS DE DETECCIÓN DE ANTIGENOS VIH
Los virus se pueden evidenciar de forma indirecta (contacto del huésped con el agente viral mediante
la detección de anticuerpos específicos contra el virus) y de forma directa (evidencian al virus o a alguno
de los antígenos virales que se pueden encontrar presentes en los tejidos o fluidos humanos).

TÉCNICAS DIRECTAS PARA LA DEMOSTRACIÓN VIRAL


Las pruebas para la demostración de Ag virales son inmunoensayos (RIA, ELISA, IFA) y pruebas de
látex. Las que visualizan la partícula viral o su efecto celular específico son tinciones para microscopía de
luz y electrónica, cultivos o aislamiento viral. Y las que evidencian la presencia de material genético viral
son ensayos de amplificación genética PCR, e hibridación (sondas, ADN ramificado).

Demostración de agentes virales: Mediante esta técnica se pueden descubrir Ag virales circulantes y
que se encuentran en los tejidos del huésped. La sensibilidad de estas pruebas depende de la cantidad
de Ag presente y su especificidad depende de la cantidad de los antisueros disponibles a tal efecto. Las
técnicas más utilizadas son:
Aglutinación con látex: las partículas de látex son esferas de poliestireno que se unen fácilmente al
fragmento cristalizable (Fc) de la molécula de IgG o IgM. Los fragmentos de unión al Ac (Fab) quedan
expuestos y son capaces de unirse al Ag que se encuentra en la muestra cuando los Ag tienen varios
epítopos. Los Ac multivalentes acoplados a múltiples partículas de látex se unen al Ag y se produce un
entramado de las partículas de látex que dan como resultado una aglutinación visible. Es una técnica
rápida pero pueden darse reacciones cruzadas con otros Ag de la muestra.
Inmunofluorescencia directa (IFA): utilización de un Ac específico para el Ag que se quiere descubrir
marcado con un fluorocromo (conjugado). Se extiende la muestra en la placa, se fija, se coloca el
conjugado con la fluorescencia y después de una incubación y lavado, la placa se observa en el
microscopio de fluorescencia.
Inmunoensayos: son inmunoensayos en fase sólida donde se fijan los Ac específicos para el virus en
la superficie de una matriz, tubo o microplaca y luego se pone el suero o muestra que contiene el Ag que
se quiere detectar; una vez ocurre la reacción Ag-Ac, se hace un lavado y se agrega un Ac marcado.
Radioinmunoensayo (RIA) o inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA O EIA), dependiendo del
trazador que se utilice para evidenciar la reacción. En el RIA (Ac marcado con un isótopo radiactivo), el
Ac que reacciona modo de sandwich se pega a los epítopos del Ag que han quedado expuestos;
después de varios lavados, se mide o cuantifica la radioactividad mediante un contador de centelleo; el
número de destellos por minuto es proporcional a la concentración de Ag que reacciona y de acuerdo
con una serie de estándares de concentración conocida se realiza una curva y se extrapolan los valores
de la muestra. En ELISA, el Ac se marca con una enzima (fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano) y
para revelar la reacción se coloca el sustrato específico para la enzima que es modificada por ésta y
produce un compuesto coloreado. Para la cuantificación se mide la absorbancia en una longitud de onda
determinada en un espectrofotómetro. La absorbancia será directamente proporcional a la cantidad de
Ag descubierto.

Visualización de la partícula viral o su efecto celular específico: aislamiento de cultivos


Los virus son microorganismos intracelulares y para evidenciarlos se deben utilizar sistemas basados
en líneas celulares que permitan su desarrollo. La invasión viral se evidencia a través del cambio celular
o efecto citopático y mediante técnicas complementarias. Los sistemas más utilizados son cultivos
primarios, cepas celulares diploides derivadas de tejidos normales y líneas celulares.
Para los cultivos virales se utilizan monocapas celulares adheridas al lecho de un tubo que contiene
una solución amortiguadora, pH adecuado y suero bovino que favorece el crecimiento celular.
El inconveniente de esta técnica está en su eficacia, que depende del momento de toma de la
muestra, transporte, y tipo de células que son escogidas para que sean permisivas. Cuando no se
detecte el efecto citopático es posible identificarlo mediante técnicas que ayuden a identificar las
propiedades virales como la hemadsorción.

Presencia del material genético viral: Son técnicas de diagnóstico molecular. Evidencian el material
genético específico viral conservado y replicable, en fluido, células o tejidos, activo o latente, son:
Ensayos de hibridación: El conocimiento de los virus que causan infecciones importantes en la
comunidad, han hecho que se disponga de fragmentos de ADN del material genético específico y
altamente conservado de un determinado virus que se utiliza como sonda. Ésta, frente a sus secuencias

17
complementarias se hibrida para formar una molécula dúplex. Se utiliza para la confirmación de un virus
en un cultivo y para descubrirlo directamente en una muestra. Se pueden utilizar células o tejidos fijados
con sustancias que conserven la morfología celular y la integridad del ADN o ARN. Para estudios de
ARN se requieren tejidos frescos congelados rápidamente con nitrógeno líquido y para estudios de ADN
se pueden emplear tanto tejidos fijados como congelados.
Las sondas (tanto ADN como ARN) se someten a un análisis de hibridación. Se pueden marcar con
radioisótopos, enzimas, avidita o moléculas quimioluminiscentes para la revelación. Las sondas
radioactivas requieren empleo de autorradiografía y las sondas con enzimas se demuestran por métodos
colorimétricos. La sensibilidad de las sondas depende de la cantidad de material genético para la
hibridación, y su especificidad depende de la calidad de la sonda.
Técnicas de ampliación del ácido nucleico:
 PCR CUALITATIVA. La detección de material genético del antígeno ofrece información funcional. Este
material genético puede recuperarse de células, tejidos o líquidos acelulares con partículas víricas
circulantes. En la PCR tiene lugar una multiplicación exponencial. En el caso del VIH, la detección de
ARN requiere un paso previo de ARN a ADN mediante la transcripción inversa llevada a cabo por la
enzima retrotranscriptasa. En condiciones determinadas, la presencia de un ADN molde permite la
síntesis de una hebra complementaria a ésta: la doble cadena se abre por el calor del termociclador y la
polimerasa empieza a sintetizar la cadena complementaria usando unos cebadores de ADN y los
oligonucleótidos que se encuentran libres en disolución. Se necesita controlar otras condiciones como la
temperatura y la concentración de iones magnesio, que ayudan a estabilizar el proceso. Para esto, el
termociclador debe producir una serie de ciclos donde ocurran tres hechos diferentes a temperaturas
también diferentes: desnaturalización del ADN molde (92-96º), hibridación de los oligonucleótidos a un
lugar complementario (45-72º) y extensión de la cadena complementaria (72º). Una vez amplificado, el
material genético debe detectarse, y para ello también existen diferentes técnicas, como la electroforesis
en gel y la visualización con luz ultravioleta una vez teñido el material genético con bromuro de etidio
(agente intercalante), autorradiografía tras la hibridación de una sonda marcada radioactivamente y
técnicas de quimioluminiscencia, similares a EIA.
 PCR CUANTITATIVA: aquí los procesos de amplificación y detección se producen de manera
simultánea. Además mediante la detección por fluorescencia se puede medir durante la amplificación la
cantidad de ADN sintetizado en cada momento. Puesto que los fragmentos amplificados se detectan al
final de la PCR, cuando la mayoría de reacciones han alcanzado ya la fase de saturación, la cantidad de
ADN obtenido no suele guardar mucha relación con la concentración inicial en la muestra.
La PCR tiene un crecimiento exponencial. Para evitar oscilaciones en la eficacia de la amplificación se
ha hecho que el ADN diana compita durante la amplificación con una cantidad conocida de control
interno añadida antes de iniciar el proceso ( PCR-COMPETITIVA). Los termocicladores para llevar a
cabo la PCR a tiempo real incorporan un lector de fluorescencia y están diseñados para poder medir en
el tiempo, la fluorescencia emitida en cada uno de los viales donde se realice la amplificación.
Los sistemas de detección por fluorescencia empleados en la PCR pueden ser agentes intercalantes y
sondas específicas marcadas con fluorocromos. Los agentes intercalantes son fluorocromos que
aumentan notablemente la emisión de fluorescencia cuando se unen a ADNds. El más empleado es el
SYBR green 1.
Las sondas de hibridación específicas son sondas marcadas con dos tipos de fluorocromos. Un
donador y un aceptor. El proceso se basa en la transferencia de energía fluorescente mediante
resonancia (FRET) entre dos moléculas. Las más utilizadas son las sondas de hidrólisis, molecular
beacons y sondas FRET.
Las ventajas de la RT-PCR con respecto a la convencional se basan en la rapidez con la que tiene
lugar, ya que no necesita ningún proceso adicional de detección; utiliza sistemas cerrados con lo que se
reduce el riesgo de contaminación; permite cuantificar la concentración inicial de ácido nucleico presente
en las muestras de manera mucho más sencilla y precisa; y determina de forma más sencilla las
mutaciones puntuales que pueden estar relacionadas con resistencias a medicamentos antimicrobianos
o con factores de virulencia.

18
RESOLUCIÓN DEL CASO

El caso que se nos presenta es el de un paciente VIH positivo que desde el momento de la infección
ha sido seguido y tratado con antirretrovirales. Desde el inicio del tratamiento las cargas virales siempre
han sido indetectables pero la tendencia de las últimas determinaciones muestra un incremento
significativo de las copias de ARN viral y un descenso de los linfocitos CD4+ en sangre. El médico
descarta la posibilidad de una mala administración del fármaco por parte del paciente.

Con toda la información recopilada podemos considerar diferentes hipótesis que podrían explicar el
aumento de la carga viral del paciente. Una posibilidad sería una progresión más rápida hacia la fase
final de la enfermedad, mientras que una segunda explicación sería la aparición de resistencias al
tratamiento administrado debida a una o varias mutaciones.

El rápido avance de la enfermedad puede verse condicionado por el tipo de vía de infección, la carga
viral adquirida en el momento de la infección y la eficacia del sistema inmunitario de cada paciente. En
caso que en el momento de la infección hubiese recibido una cantidad elevada de carga viral y existiera
un deterioro o ineficacia del sistema inmunitario, aunque el tratamiento fuera el adecuado, la enfermedad
evolucionaría más rápidamente hacia la etapa de sida. Nuestro paciente podría estar en una fase donde
se detectan elevadas cargas virales pero aún no presenta sintomatología.

Con la historia clínica de Pere Cavaller, la hipótesis más probable sería que hubiese desarrollado una
resistencia a los antirretrovirales administrados. Para detectar esta resistencia podemos buscar
mutaciones en el genoma del virus mediante PCR (genotipo) o la resistencia a diferentes fármacos
(fenotipo). También, mediante el fenotipo virtual, podemos comparar el genoma del virus con las
mutaciones y las resistencias ya estudiadas disponibles en una base de datos, para saber el tipo de
mutación. Así pues, si se comprobara que existe una mutación que hace que el virus sea resistente al
fármaco, el médico debería valorar la posibilidad de cambiar el tratamiento.

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