You are on page 1of 35

13

BAB II
KAJIAN PUSTAKA, KERANGKA PEMIKIRAN, DAN HIPOTESIS

2.1 KAJIAN PUSTAKA

2.1.1 Osteoporosis

Osteoporosis merupakan suatu penyakit dengan karakteristik hilangnya

jaringan tulang secara progresif terutama pada area yang berperan menyokong tulang

rangka. Osteoporosis merupakan salah satu komplikasi umum yang terjadi dengan

bertambahnya usia dan merupakan salah satu masalah kesehatan publik yang penting

untuk ditangani karena setidaknya sekitar 33% wanita berusia 60-70 tahun dan 66%

wanita berusia 80 tahun atau lebih mengalami osteoporosis.3,37 Osteoporosis

merupakan penyakit kompleks, berbagai faktor lingkungan antara lain aktivitas fisik

dan asupan kalsium mengambil peran.21 Pada status postmenopause, peningkatan

kalsium di urin dan jatuhnya absorpsi kalsium merupakan kejadian primer.

Peningkatan resorpsi kalsium tulang merupakan respon terhadap peningkatan

keperluan kalsium yang diperburuk oleh kehilangan aksi estrogen di tulang.38

Mekanisme yang mendasari kasus osteoporosis adalah ketidakseimbangan

antara resorpsi dan formasi tulang. Proses tersebut dipengaruhi oleh hormon terutama

estrogen serta metabolisme kalsium. Berkurangnya kadar estrogen yang bersirkulasi

akibat dari menopause dapat menyebabkan peningkatan resorpsi tulang. Telah

menjadi pemahaman umum bahwa asupan kalsium dan vitamin D yang cukup

diperlukan untuk perkembangan optimum tulang rangka dan menjaga kesehatan


14

tulang. Asupan kalsium dan vitamin D yang kurang bukan saja dapat meningkatkan

risiko kelainan tulang rangka seperti osteomalacia dan osteoporosis, namun juga

berhubungan dengan patogenesis infeksi, inflamasi kronis, dan penyakit autoimun.25

Proses pembentukan tulang yang memelihara kesehatan tulang dapat

dikategorikan sebagai program pencegahan, secara kontinyu mengganti tulang

yang lama dan menggantikannya dengan tulang yang baru. Kehilangan massa

tulang terjadi saat keseimbangan proses pembentukan tulang terganggu sehingga

resorpsi tulang lebih banyak dari pembentukan tulang baru. Ketidakseimbangan

ini biasanya terjadi pada orang lanjut usia dan pada wanita yang mengalami

menopause. Kehilangan massa tulang dapat mengubah mikro-arsitek jaringan

tulang dan meningkatkan resiko fraktur tulang.39

Gambar 2.1 Mikrograf Tulang Normal Dikutip oleh Mundy 40

Untuk mendiagnosis osteoporosis dilakukan pengukuran bone mineral density

(BMD). BMD ditentukan oleh beberapa faktor antara lain puncak massa tulang,

faktor lingkungan, dan pengaruh genetik.21,40 Kejadian osteoporosis tidak dapat

dipisahkan dari faktor genetik.


15

Gambar 2.2 Mikrograf Tulang yang Mengalami Osteoporosis


Dikutip oleh Mundy, et al 40
2.1.2 Struktur Tulang

Struktur tulang terdiri dari atas sel, serat dan substansi dasar, namun komponen

ekstraselnya mengapur menjadi substansi keras yang cocok untuk fungsi

menyokong dan pelindung kerangka. Secara makroskopik, tulang dibedakan

menjadi dua bentuk tulang yaitu tulang kompak (substansia kompakta) dan

tulang spons (substansia spongiosa). Tulang kompak tampak sebagai massa utuh

padat dengan ruang-ruang kecil yang hanya tampak dengan menggunakan

mikroskop. Kedua bentuk tulang saling berhubungan tanpa batas jelas.41

Gambar 2.3 Fotomikrograph Potongan Sagital Ujung Proksimal


Humerus Sendi Bahu
Dikutip oleh Kanis,et al 41
16

Substansi interstisial tulang terdiri atas dua komponen utama yaitu

matriks organik sebanyak 35% dan garam-garam anorganik sejumlah 65%.

Matriks organik terdiri atas 90 % serat-serat kolagen yang terbenam dalam substansi

dasar kaya proteoglikan, terutama kolagen tipe I. Bahan anorganik tulang terdiri

atas endapan sejenis kalsium fosfat submikroskopik. Pada tulang yang aktif

bertumbuh, terdapat empat jenis sel yaitu sel osteoprogenitor, osteoblas, osteosit

dan osteoklas. Sel osteoprogenitor paling aktif selama pertumbuhan tulang dan

akan diaktifkan kembali semasa kehidupan dewasa saat pemulihan fraktur tulang

dan bentuk cerea lainnya. Osteoblas adalah sel pembentuk tulang yang

berkembang dan dewasa.41,42

Sel utama tulang dewasa adalah osteosit, yang terdapat dalam lacuna

didalam matriks yang mengapur. Osteoklas adalah sel yang memiliki peran

dalam resorpsi tulang dalam proses remodeling tulang. Osteoklas menempati

lekukan yang disebut lakuna Howship yang terjadi akibat kerja erosif osteoklas

pada tulang dibawahnya. Sel osteoblas dan osteoklas berperan dalam pengaturan

metabolisme tulang dan keduanya terlibat dalam perkembangan osteoporosis.

Ketidakseimbangan antara pembentukan tulang dan resorpsi tulang adalah kunci dari

patofisiologi dari penyakit tulang pada orang dewasa termasuk osteoporosis. 41,42

2.1.2.1 Osteoblas

Osteoblas adalah sel pembentuk tulang dari tulang yang berkembang dan

dewasa. Selama deposisi aktif dari matriks baru, mereka tersusun sebagai lapis

epiteloid sel-sel kuboid atau kolumnar pada permukaan tulang. Inti osteoblas
17

biasanya terletak pada ujung sel paling jauh dari permukaan tulang.

Sitoplasmanya sangat basofilik dan sebuah kompleks Golgi tampak mencolok

sebagai daerah lebih pucat antara inti dan dasar sel. Pada mikrograph elektrik,

osteoblas memiliki struktur yang diharapkan dari sel yang aktif menghasilkan

protein. 41,42

Retikulum endoplasmanya yang luas ditaburi ribosom dan banyak

ribosom bebas terdapat dalam sitoplasma. Meskipun osteoblas terpolarisasi

terhadap tulang dibawahnya, pembebasan produknya agaknya tidak terbatas pada

kutub basal karena ada sel diantaranya yang berangsur-angsur diselubungi oleh

sekretnya sendiri dan ditransformasi menjadi osteosit, terkurung dalam matriks

tulang yang baru dibentuk. Selain mensekresi berbagai unsur matriks seperti

kolagen tipe I, proteoglikan, osteokalsin, osteonektin, dan osteopoetin, osteoblas

juga menghasilkan faktor penumbuh yang memiliki efek autokrin dan parakrin

penting pada pertumbuhan tulang. Mereka juga memiliki reseptor permukaan

terhadap berbagai hormon, vitamin, dan sitokin yang mempengaruhi

aktivitasnya. 41,42

2.1.2.2 Osteoklas

Seumur hidup tulang tetap mengalami remodeling intern dan pembaruan

yang mencakup menghilangkan matriks tulang pada banyak tempat, diikuti

penggantiannya berupa deposisi tulang baru. Dalam proses ini, agen resorpsi tulang

adalah osteoklas, sel-sel besar sampai berdiameter 150 μm dan mengandung

sampai 50 inti sel. Sel-sel ini menempati Osteoklas adalah sel multinukleus
18

yang berperan dalam proses resorpsi tulang. Osteoklas merupakan satu-satunya sel
41,42,43
yang dikenal mampu meresorbsi tulang. Osteoklas yang teraktivasi berasal dari

sel-sel prekursor mononuklear dari monosit–makrofag. Sel prekursor monosit-

makrofag mononuklear telah diidentifikasi dalam berbagai jaringan, tetapi sel

prekursor monosit-makrofag mononuklear pada sumsum tulang diperkirakan

memiliki osteoklas paling banyak lekukan yang disebut lakuna Howship, terjadi

akibat kerja erosif osteoklas pada tulang dibawahnya Osteoklas menunjukkan

polaritas nyata, dengan intinya mengumpul dekat permukaan bebasnya yang licin,

sedangkan permukaan dekat tulang menunjukkan garis-garis radial yang dulu

ditafsirkan sebagai brush border.

Tetapi mikrograf elektron menunjukkan bahwa mereka tidak begitu teratur

dan terdiri atas lipatan-lipatan dalam dari membran yang membatasi sejumlah

besar cabang mirip daun, dipisahkan oleh celah-celah sempit. Berbeda dengan

brush border, yang merupakan kekhususan permukaan stabil, pada osteoklas

sangat aktif dan terus mengubah konfigurasinya. Studi sinematografik merekam

penjuluran dan penarikan kembali cabang-cabang bordernya dan perubahan

bentuknya. Istilah deskriptif ruffled border kini banyak dipakai untuk

membedakan kekhususan pada dasar osteoklas ini dari brush border pada

permukaan lumen epitel absorptif. 41,42,43

2.1.2.3 Densitas Tulang


19

Densitas tulang dipengaruhi oleh koordinasi aktivitas osteoblas dan

osteoklas. Proses remodeling tulang ini tidak hanya untuk mempertahankan

massa tulang, tetapi berfungsi juga untuk memperbaiki kerusakan mikro pada tulang,

untuk mencegah terlalu banyak tulang yang tua dan untuk fungsi homeostasis

mineral.44 Aktivitas osteoblas dan osteoklas dikontrol oleh berbagai macam

hormon dan sitokin. Yang terpenting adalah hormon seks untuk menjaga massa

tulang tetap seimbang dan jika kekurangan salah satu hormon seks baik

estrogen maupun testosteron dapat menurunkan massa tulang dan meningkatkan

resiko osteoporosis. Sifat mekanikal tulang sangat tergantung pada sifat material

tulang tersebut. Pada tulang kortikal kekuatan tulangnya sangat tergantung pada

kepadatan dan porositasnya.

Semakin bertambahnya umur, tulang semakin keras karena mineralisasi

sekunder semakin baik, tetapi juga tulang semakin getas, tidak mudah menerima

beban Pada tulang trabekular, kekuatan tulang juga tergantung pada kepadatan

tulang dan porositasnya. Penurunan densitas tulang trabekular sekitar 25%, sesuai

dengan peningkatan umur 15-20 tahun dan penurunan kekuatan tulang sekitar 44%.

Sifat mekanikal tulang trabekular ditentukan oleh mikroarsitekturnya, yaitu susunan

trabekulasi pada tulang tersebut, termasuk jumlah, ketebalan, jarak dan

interkoherensi antara satu trabekulasi dengan trabekula lainnya. Dengan

bertambahnya umur, jumlah dan ketebalan trabekula akan menurun, jarak antar

trabekula dengan trabekula lainnya bertambah jauh dan interkoneksi juga makin

buruk karena banyaknya trabekula yang putus.44


20

2.1.3 Kalsium

Konsentrasi kalsium di cairan ekstraseluler (atau plasma) dikendalikan sangat

ketat oleh mekanisme homeostatik komplek yang melibatkan aliran kalsium antara

cairan ekstraseluler, ginjal, tulang dan, usus. Aliran tersebut diatur oleh tiga senyawa,

yakni hormon paratiroid, kalsitonin, dan 1,25-dihidroksivitamin D. Fungsi seluler

yang penting bergantung pada kestabilan konsentrasi kalsium ekstraseluler pada

rentang tertentu. Gangguan yang terjadi pada sistem homeostatik ini, akan memicu

kondisi gangguan metabolisme kalsium.45

Dalam istilah fungsional, jaringan yang berpartisipasi dalam metabolisme

kalsium dan fosfat meliputi koordinasi respon hormonal (paratiroid, sel C tiroid, sel

tubulus proksimal renal, dan mungkin osteosit di tulang), transport ion kalsium dan

fosfat anorganik masuk dan keluar tubuh (usus halus dan ginal), respon terhadap ion

kalsium dan fosfat anorganik (sel tulang dan sel paratiroid), atau pemakaian ion

kalsium dan fosfat anorganik sebagai komponen struktural (tulang). Berbagai fungsi

ini akan diregulasi atau dimodulasi oleh mekanisme sensing kalsium atau fosfat,

misalnya reseptor sensing kalsium ekstraseluler.46 Selain itu, 15% kalsium skeletal

akan hilang sebagai buffer terhadap asidosis metabolik derajat sedang sebagai akibat

asupan diet. Sebaliknya, status alkali yang tinggi akibat asupan diet maupun agen

farmakologi mempunyai efek positif terhadap keseimbangan kalsium.47

Perkiraan rerata aliran kalsium ke dan dari cairan ekstraseluler yang terjadi

selama 24 jam diperlihatkan pada Gambar 2.4. Pada umumnya, pertambahan mineral
21

tulang sebanding dengan resorpsi mineral skeletal, dan kandungan kalsium di urin

diperkirakan mendekati absorpsi intestinal. Rerata diet Western menyediakan kalsium

1 gram kalsium elemental setiap hari. Secara khusus, 30% (300 gram) akan

diabsorpsi, terutama melalui usus halus dan dalam persentase yang kecil melalui

kolon. Akibat sekresi kalsium dari usus relatif konstan pada 150 mg per hari, absorpsi

kalsium net adalah 150 mg per hari untuk dewasa sehat dalam keseimbangan kalsium

normal. Kalsium yang diabsorbsi di usus akan memasuki darah dan disaring oleh

ginjal. Sebagian besar kalsium yang disaring akan diabsorbsi ulang di proksimal

tubulus renalis, sehingga hanya 200 mg per hari akan diekskresikan oleh individu

sehat.40

Gambar 2.4. Perubahan kadar kalsium normal pada dewasa muda


Dikutip oleh Felsenfeld & Levine48

Tulang rangka adalah simpanan utama dari kalsium. Dewasa sehat

mengandung 1-1,3 kg kalsium dan 99% dari berat tersebut membentuk kristal
22

hidroksiapatit di tulang rangka. Sisanya, sebesar 1% terkandung di dalam cairan

ekstraseluler dan jaringan lunak. Sebagai tambahan, 1% dari kandungan kalsium

tulang rangka berada di cairan tulang dan akan mengalami pertukaran secara bebas

dengan cairan ekstraseluler. Kadar ionik kalsium ekstraseluler (Ca2+) pada kondisi

osteoklas aktif yang meresorpsi dapat mencapai konsentrasi tinggi (8-40 mM).

2.1.4 Proses mineralisasi tulang

Tulang dibentuk dari kolagen dan kristal hidroksiapatit. Molekul-molekul

kolagen membentuk serabut-serabut elastik pada tulang. Pada tulang dewasa, kolagen

mengeras karena terisi bahan anorganik hidroksiapatit. Kristal-kristal mineral ini

dalam bentuk kalsium fosfat mengisi matriks kolagen. Kolagen memiliki karakteristik

yaitu kekuatan tensile yang baik namun memiliki kekuatan kompresi yang rendah.

Adapun kristal hidroksiapatit memiliki sifat yang kaku dengan kekuatan kompresi

yang baik. Kristal ini berperan sebagai material yang mampu menahan tekanan. Sifat-

sifat tersebut menjadikan tulang sebagai organ yang memiliki kompresi yang kuat,

lemah terhadap robekan, dan intermediet terhadap tegangan. Tulang merupakan

material yang dinamis. Hal tersebut dicirikan dengan kemampuannya untuk

memperbaiki diri, kondisi yang berubah sesuai dengan usia dan aktivitas

(imobilisasi).49

Tulang trabekular adalah salah satu dari dua jenis tulang yang membentuk

tulang rangka (Gambar 2.5). Tulang trabekular memiliki sifat lebih lembut, lebih

lemah, dan tidak kaku seperti tulang kompak. Tulang ini dapat dijumpai dibagian
23

ujung dari tulang panjang, persendian dan diantara interior tulang belakang. Di tulang

tersebut terjadi proses hematopoiesis.

Gambar 2.5. Komposisi tulang trabekular


Dikutip oleh Francis,et al 49

Sistem tulang rangka merupakan jaringan yang disusun oleh lebih dari 200

buah tulang. Susunan ini akan mendukung tubuh dan bertindak sebagai reservoir

mineral. Tulang merupakan jaringan yang sangat dinamis dan mengalami

remodelling secara konstan, sangat cepat di rahang dan lambat di tulang dada. Proses

remodelling ini merupakan aksi dari dua jenis sel yaitu osteoklas dan osteoblas.

Osteoklas akan mendegradasi matriks mineral sebagai respon terhadap berbagai

sinyal, sedangkan osteoblas akan menyimpan matriks baru setelah terjadi perekrutan

osteoklas ke lokasi resorpsi. Keseimbangan ini terjadi selama perkembangan tubuh.

Pada tahap awal, terjadi lebih banyak formasi tulang dibandingkan resorpsi, mencapai

puncak massa tulang pada akhir dewasa. Setelah dewasa, aktivitas ini berubah. Pada
24

akhir kehidupan, aktivitas dan jumlah osteoklas akan meningkat seiring dengan

penurunan osteoblas, sehingga mengarah kepada penyakit tulang terkait umur,

misalnya osteoporosis post-menopause.21

Gambar 2.6 Proses remodelling tulang


Dikutip oleh Sharan et al15
Siklus remodelling tulang melibatkan proses kompleks dari langkah-langkah

yang teratur dan teregulasi (Gambar 2.6). Fase aktivasi dari remodelling tersebut

bergantung dari efek lokal dan faktor sistemik dari sel-sel mesenkim pada osteoblas.

Sel-sel tadi berinteraksi dengan prekursor hematopoitik untuk membentuk osteoklas

pada fase resorpsi. Fase selanjutnya adalah fase “pembalikan” (reversal) yaitu ketika

sel-sel mononukleus terdapat pada permukaan tulang. Sel-sel tersebut dapat

menyelesaikan proses resorpsi dan menghasilkan sinyal untuk menginisiasi formasi.

Fase formasi adalah fase akhir ketika sel-sel mesenkim berdiferensiasi menjadi

osteoblas dan membentuk matriks. Matriks ini kemudian dimineralisasi untuk

selanjutnya menjadi tulang.15


25

Remodelling tulang merupakan proses yang diregulasi dengan baik oleh

hormon (1,25-dihidroksivitamin D3, hormon paratiroid (PTH), kalsitonin, estrogen,

dan glukokortikoid), sitokin (RANKL, OPG, dan IL-6) dan TGF-. Proses ini

mencakup komunikasi silang antara osteoklas dan osteoblas, sebagai perekrutan satu

sama lain ke lokasi resorpsi yang melibatkan sel stromal dan sel T. Berbagai faktor

mempengaruhi kecepatan dan luasnya remodelling tulang, termasuk stres mekanik,

mikrofraktur tulang dan ketidakseimbangan hormon. Kalsium ekstraseluler

merupakan faktor utama dalam pengaturan proses tersebut, dalam arti kaskade lintas

sinyal multi organ.21

Sebagai respon terhadap kalsium di sirkulasi yang rendah, sel paratiroid akan

mensekresikan PTH. Hal ini akan mengaktivasi resorpsi kalsium di renal dan

mendukung hidroksilasi 25-hidroksivitamin-D3 menjadi bentuk aktifnya 1,25-

dihidroksivitamin-D3. Bentuk vitamin D3 ini akan meningkatkan resorpsi intestinal

dari kalsium. PTH dan 1,25-dihidroksivitamin D3 menstimulasi resorpsi tulang

melalui dukungan terhadap diferensiasi osteoklas dari prekursor multinukelus, dengan

CaSRa demikian akan meningkatkan kalsium di sirkulasi. Ketika konsentrasi kalsium

meningkat di atas 1,3 mM, proses ini akan dibalik: resorpsi tulang akan berjalan

menurun pelan dan ekskresi kalsium akan diaktivasi. Kaskade sinyal kalsium

menginduksi pelepasan kalsium dari retikulum endoplasmik. Hal ini menghambat

sekresi PTH dan konsekuensinya hidroksilasi 25-hidroksivitamin-D3 dan resorpsi

tulang.21
26

Secara lokal, empat tipe sel berperan dalam proses ini (Gambar 2.7). Faktor

transkripsi antara lain PU1 dan macrophage colony stimulating factor (M-CSF)

terlibat pada tahap awal dari diferensiasi sel punca hematopoetik menjadi prekursor

monosit. Pada tahap ini, sistem sinyal yang terdiri atas OPG, RANK, RANKL

merupakan regulator utama dari diferensiasi osteoklas. RANKL merupakan molekul

yang diekspresikan pada permukaan osteoblas dan sel stroma, yang menginduksi

diferensiasi osteoklas dan resorpsi tulang melalui aktivasi RANK. Downstream

RANK, TRAF6 merupakan molekul adaptor yang mentranslasikan sinyal eksternal

ke Jun N-terminal kinase (JNK) dan kaskade sinyal NF-kB. Secara simultan,

osteoblas akan mensekresikan OPG, yang bertindak sebagai decoy bagi RANKL,

akan berikatan dengannya dan mencegah aktivasi osteoklas yang berlebihan. Sel T

juga mengekspresikan RANKL dan OPG sebagai link antara inflamasi dengan

resorpsi tulang. Sel T akan membatasi jumlah aktivasi osteoklas melalui sekresi IFN-

, yang mengaktifkan degradasi TRAF6 dan terkait dengan kaskade sinyal

RANK/RANKL.21
27

Gambar 2.7 Proses mineralisasi tulang


Dikutip oleh Purroy & Spurr 21
Metabolisme mineral secara normal memerlukan pengaturan dalam hal

pelepasan dan kelarutan kalsium dan fosfat dari makanan yang difasilitasi oleh asam

lambung dan enzim pencernaan, absorbsi kalsium dan fofast di intestinal, ekskresi

kalsium dan fofast di renal serta pembentukan serta turn over kalsium dan fofast yang

terkandung dalam kristal matriks tulang.46

Terdapat keterlibatan atom mineral lain yang berfungsi dalam substitusi atau

inkorporasi kristal tulang. Substitusi adalah penggantian satu atom dengan atom yang

lain. Hal ini didasari oleh kesamaan ukuran jari-jari atom. Inkorporasi adalah

penggabungan atom dalam susunan atom yang lain sehingga mengubah integritas

molekul secara keseluruhan. Kandungan atom mineral dalam diet lain tersebut

memberikan pengaruh terhadap homeostasis kalsium atau tanpa pengaruh terhadap

homeostasis kalsium.
28

Substitusi atau penggantian suatu atom dengan atom yang lain dalam satu

sistem komposit didasari oleh kesamaan sifat konfigurasi elektron terluar masing-

masing atom. Namun karena masing-masing atom tersebut memiliki efek Van der

Walls yang berbeda, maka ukuran jari-jari medan atomik mereka menjadi berbeda

satu dengan yang lainnya. Akibatnya, inkorporasi yang merupakan penggabungan

atom dalam susunan komposit, akan merubah struktur dan tekstur material komposit

akibat dari perubahan integritas molekul yang disusunnya.52,53

Dalam skala mikro dan nanometer, perubahan tekstur ini berarti terbentuknya

rongga-rongga yang berbeda dengan medan gaya magnetik yang juga berbeda.

Dengan demikian, substitusi dan inkorporasi ini akan sangat menentukan pola dan

derajat kualitas pertumbuhan matriks tulang yang pada akhirnya akan mempengaruhi

konfigurasi susunan atom dalam komplek hidroksiapatit dan interaksi kolagen dengan

hidroksiapatit. Secara keseluruhan hal ini akan mempengaruhi sifat tulang.

pembentukan tulang osteoporosis ditentukan oleh komposisi dan struktur

hidroksiapatit yang lebih sederhana dibanding tulang normal, diikuti dengan pola

distribusi kalsium yang cenderung mengalami hipermineralisasi lokal. Atom yang

mendukung pembentukan kristal hidroksiapatit tulang normal adalah kalsium,

tembaga, zinc, timbale, strontium, magnesium, kromium, mangan, selenium, dan

natrium. Sedangkan atom yang mendukung pembentukan kristal hidroksipatit amorf

meliputi alumunium, molybdenum, silicon, boron, vanadium, dan arsen. 52,53

2.1.5 Triad Molekular OPG/RANK/RANKL


29

Telah diketahui bahwa beberapa anggota superfamili tumor necrosis factor

(TNF) memiliki peran penting pada regulasi metabolisme tulang.36 Nuclear factor-kB

merupakan anggota dari superfamili TNF yang berperan sebagai regulator respon

imun, inflamasi, dan osteolitik. Delesi beberapa subunit NF-kB dapat menyebabkan

kelainan pada fungsi makrofag, sel B, dan sel T. Sebagai contoh, delesi sel-A dapat

mengarah pada apoptosis sel-sel hati, delesi p50 atau p52 dapat menyebabkan

kelainan sel-sel imun, sedangkan kombinasi delesi p50/p52 dapat menyebabkan

kelainan tulang belakang dan osteopetrosis. Adapun aktivasi berlebihan dari NF-kB

dapat mengarah pada poliartritis dan erosi tulang.35

Fakta bahwa Nf-kB dapat diaktivasi oleh beragam tipe sel oleh sinyal imun

dan inflamasi telah mengarah pada usaha untuk mengungkap perannya sebagai

modulator sistem imun dari penyakit osteolitik dan inflamasi. Sinyal sistem imun dan

inflamasi menyebabkan aktivasi sel-sel T (Gambar 2.8). Subset sel-sel T yang

teraktivasi (Th1, Th2, dan Th17) mengaktivasi makrofag dan mensekresikan populasi

sel osteoklastogenik, factor pro- dan anti-inflamasi seperti RANKL, TNF-a, IL-1, IL-

6, IL-17, IL-4 dan IFNg. Ikatan RANKL dengan reseptor di makrofag (MF) atau

prekusor osteoklas (OCP) mengaktivasi jalur NF-kB melalui pengikatan protein

adaptor (seperti TRAF6) dan kompleks kinase (terutama IKKs dan MAPK). Faktor

pro-inflamasi lainnya seperti IFNs dan IL-4 menghambat jalur NF-kB pada beragam

tahapan.35
30

Gambar 2.8 Regulasi respon osteolitik melalui sinyal imun/inflamasi


Dikutip oleh Abu-amer 35

Triad molekuler yang terdiri dari OPG/RANK/RANKL telah dideskripsikan

sebagai kunci dari sistem sitokin untuk mengendalikan diferensiasi dan fungsi

biologis osteoklas. Pada proses remodeling tulang, anggota dari triad

OPG/RANK/RANKL saling berikatan satu dan lainnya. RANKL disintesis dalam

bentuk membrane atau larutan terutama oleh sel-sel osteoblastik, sel-sel imun, dan

beberapa sel-sel kanker. Faktor ini penting untuk memediasi resorbsi tulang melalui

osteokastogenesis dan aktivasi pematangan osteoklas. RANKL menstimulasi

osteoklastogenesis dan aktivitas osteoklas dengan berikatan pada reseptor di

permukaan RANK yang terletak di osteoklas. Ikatan RANKL dengan RANK


31

mengarah pada aktivasi jalur sinyal spesifik yang terlibat dalam pembentukan dan

survival osteoklas. OPG disekresi oleh sel-sel stroma dan sel tipe lainnya seperti

osteoblas. Interaksi OPG dengan RANKL mampu menghambat ikatan RANKL dan

RANK sehingga mencegah aktivasi RANK dan menunda osteoklastogenesis serta

menghambat resorbsi tulang.36

Eksposur kronik TNF-α meningkatkan osteoklastogenesis melalui dua

mekanisme yang berbeda (Gambar 4). TNF-α pertama kali mempengaruhi

osteoklastogenesis pada prekusor-prekusor osteoklas di dalam sumsum tulang oleh

sel-sel dasar untuk berdifferensiasi menjadi c-Fms+/CD11b+/RANK+/-

progenitorprogenitor osteoklas melalui mekanisme independent RANKL/RANK.

Prekusorprekusor osteoklas ini kemudian masuk ke dalam pembuluh darah dan

jaringan perifer kemudian berdifferensiasi menjadi osteoklas yang matang

(mekanismedependent) berperan mempercepat proses resorpsi tulang.36,54

Gambar 2.9 Mekanisme RANK Dependen Dan Independen TNF-Α Mediator


Osteoklastogenesis
Dikutp oleh Grimaud Eva 36,54
32

TNF-α bisa menginduksi berbagai sel, termasuk sel-sel sinovial, sel-sel T,

dan osteoblas/sel-sel stroma, untuk meningkatkan ekspresi mereka terhadap RANKL,

yang mengikat RANK pada permukaan prekusor-prekusor osteoklas dan

menginduksi differensiasi prekusor-prekusor osteoklas. TNF-α juga bisa mengikat

reseptornya pada permukaan prekusor-prekusor osteoklas dan secara tidak langsung

menginduksi differensiasi mereka menjadi osteoklas-osteoklas matang, kemudian

meningkatkan aksi RANKL yang diinduksi secara tidak langsung. 36,54

Molekul-molekul stimulasi osteoklas lainnya, merangsang produksi RANKL

oleh sel-sel stroma, dan juga menginduksi sekresi RANKL oleh limfosit T, limfosit B,

dan sel-sel endotel untuk menginduksi formasi osteoklas secara tidak langsung. TNF-

α juga menstimulasi produksi M-CSF oleh sel-sel stroma. 44,54 Osteoclast

differentiation factor (ODF, disebut juga RANKL/TRANCE/OPGL) menstimulasi

progenitor-progenitor osteoklas pada monosit/makrofag menjadi osteoklas dengan

adanya macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). 44,54

Pada sistem imun, mekanisme molekular dan selular dari triad tersebut

penting untuk menjaga respon imun. Pada sistem ini, RANKL yang terekspresi oleh

sel-sel T teraktivasi berinteraksi dengan RANK yang terekspresi oleh sel-sel

dendritik. Ikatan RANKL dan RANK meregulasi fungsi dan survival dari sel-sel

dendritik. Di lain pihak, OPG yang di produksi oleh limfosit B serta sel-sel dendritik

menjaga keseimbangan sistem tersebut.36


33

Gambar 2.9 Mekanisme molekular dan selular OPG/RANK/RANKL


Dikutip oleh Tat 36

RANKL dan macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) merupakan

faktor-faktor utama yang terlibat dalam differensiasi osteoklas dan RANKL

diekspresikan dengan diaktifkannya limfosit T. 23 IFN-γ memicu aktivasi sel T

dan sel T mensekresi faktor-faktor osteoklastogenik RANKL dan TNF-α.18

Meskipun osteoklastogenesis (proses resorpsi tulang) bisa diinduksi oleh TNF-α

pada mekanisme dependent dan independent, IL-1 dan IL-6 berperan juga dalam

resorpsi tulang melalui induksi RANKL. RANKL, yang mengikat RANK, merupakan

salah satu penginduksi kuat terhadap pembentukan dan aktivitas osteoklas. Stimulasi

terhadap RANKL bisa dikurangi oleh OPG ( osteoprotegerin ), yang mengikat


34

RANKL dan menghambat interaksi antara RANKL dan RANK. Rasio ekspresi

RANKL dan OPG penting dalam inflamasi induksi resorpsi tulang.54,55

Gambar 2.10 Resorpsi tulang atau pembentukan tulang terjadi tergantung secara kritis
pada ratio RANKL/OPG, yang berfungsi terhadap kadar ekspresi
RANKL dan OPG.
Dikutip oleh Manolagas et al 55

Ketika konsentrasi OPG relatif meningkat daripada ekspresi RANKL, OPG

mengikat RANKL, menghambatnya untuk mengikat RANK. Pencegahan

berikatannya RANKL dengan RANK mengurangi pembentukan osteoklas dan

terhadap osteoklas yang telah ada sebelumnya. Ketika ekspresi RANKL relatif

bertambah daripada OPG, RANKL bersiap untuk mengikat RANK pada

prekusorprekusor osteoklas,mengaktifkan pembentukan osteoklas dan resorpsi

tulang.55,56 Berikatannya RANKL pada prekusor-prekusor osteoklas terjadi pada saat

selsel stem hematopoietik berdifferensiasi dari bentuk CFU-GM (colony forming unit

for granulacytes and macrophages) menjadi M-CSF (colony forming unit for

macrophages). Berikatannya RANKL dengan RANK pada CFU-M menghadirkan M-

CSF menginduksi differensiasi preosteoklas menjadi suatu sel multinukleat yang

kemudian menjadi osteoklas matang. 55,56


35

Gambar 2.11 Mekanisme aktifitas ekspresi RANKL oleh berbagai tipe sel dalam
menginduksiosteoklastogenesis yang diikuti dengan mengikat RANK pada prekusor
osteoklas(kiri). Sebaliknya OPG terhadap RANKL relatif menghambat pengikatan
RANKLdengan RANK, yang menyebabkan berkurangnya osteoklastogenesis dan
osteoklas yang telah ada sebelumnya (kanan).
Dikutip oleh Ann E. Kearns et al 56
Osteoklas matang merupakan sel yang mengalami perubahan struktural untuk

memudahkannya masuk ke daerah penghubung antara permukaan tulang dan

membran basal.

2.1.6 Timbal

Timbal merupakan salah satu unsur logam berat yang lebih tersebar luas

dibandingkan kebanyakan logam toksik lainnya. Kadarnya dalam lingkungan

meningkat karena penambangan, peleburan, dan berbagai penggunaan dalam industri.

Lebih dari 4 miliar ton timbal dihasilkan tiap tahun untuk memproduksi batu baterai,

amunisi (peluru), dan cat. Pada beberapa negara, timbal tetraethyl masih digunakan
36

sebagai zat adiktif pada bahan bakar yang dapat menimbulkan polusi udara. Timbal

dapat masuk kedalam tubuh manusia melalui pernafasan dan saluran pencernaan.

Sumber timbal di lingkungan adalah udara yang tercemar bahan bakar, tanah yang

tercemar cat berbahan dasar timbal, pasokan air yang dialirkan melalui pipa berbahan

dasar timbal, dan debu yang berasal dari cat serta alat-alat makan dari keramik.28

Timbal telah dipostulasikan akan tersimpan pada tiga bagian tubuh. Pertama,

yaitu di darah. Sebanyak 95% timbal berikatan dengan eritrosit dengan waktu paruh

25-30 hari. Kedua, yaitu di jaringan lunak dengan waktu paruh beberapa bulan.

Ketiga, yaitu di tulang dengan waktu paruh 30-40 tahun. Sebanyak 90% timbal yang

masuk ke tubuh akan terakumulasi di tulang. Timbal mengikuti jalur kalsium untuk

masuk ke dalam sel tubuh. Timbal berikatan dengan calbindin (CaBP9kD) di

duodenum.31

Percobaan dengan memberikan timbal secara oral pada anak tikus

menunjukan bahwa terdapat akumulasi timbal pada tulang tibia dibandingkan dengan

yang tidak diberikan timbal (Gambar 2.12). Dapat dikatakan bahwa paparan timbal

dapat menyebabkan penurunan pertumbuhan somatik, pertumbuhan tulang

longitudinal, serta kekuatan tulang pada saat pubertas. Efek-efek tersebut tidak dapat

diperbaiki oleh stimulasi dari hormon pertumbuhan (growth hormone;GH) atau dari

hormon seks. Pada akhirnya, paparan timbal dapat menghambat osteoblastogenesis

secara in vivo pada hewan dewasa.31


37

(A) .Kontrol (B).Percobaan


Gambar 2.12 Perbandingan hasil radiografik tulang tibia anak tikus kontrol dan
diberi timbal
Keterangan : e = tulang endostial baru
p = tulang periostial baru
Dikutip oleh Ronis et al.31
Penelitian pada hewan dengan diet rendah kalsium yang menyebutkan bahwa

terdapat risiko peningkatan kadar timbal dalam darah empat kali lipat. Adapun

penelitian yang lain menyebutkan bahwa jumlah timbal yang diabsorpsi tergantung

dari kadar kalsium diet. Bila dibandingkan dengan kisaran normal, maka kadar

kalsium rendah dapat menyebabkan peningkatan absorpsi timbal dan kadar kalsium

tinggi dapat menyebabkan penurunan absorpsi timbal. Lebih lanjut, peningkatan

kadar kalsium ini dapat berhubungan dengan gejala klinis atau patologis dari

keracunan timbal.32

Gambar 1 merupakan model dari jalur timbal masuk dan keluar dari dua

kompartemen tulang utama (kortikal dan trabekular). Terlihat bahwa 1/3 dari timbal

yang masuk ke sirkulasi berasal dari tulang trabekular.31


38

Gambar 2.13 Model aliran timbal dalam tubuh


Dikutip oleh Bilezikian31

Paparan timbal dalam waktu yang lama dapat menyebabkan deposit timbal di

tulang dengan konsentrasi yang tinggi (>20mg/g tulang). Akan tetapi, mengingat

tulang adalah organ yang dinamis maka deposit timbal tersebut akan dilepaskan

ketika kalsium dimobilisasi seperti pada saat kehamilan, menyusui, osteoporosis, dan

thyrotoxicosis.

Timbal berkompetisi dengan ion divalen saat absorpsi nutrisi begitu pula

dengan mekanisme fisiologis lainnya. Beberapa contoh ion divalen tersebut adalah

kalsium dan zinc. Timbal berkompetisi dengan kalsium, menghambat pelepasan

neurotransmiter, dan mengganggu regulasi metabolisme sel dengan cara berikatan

pada reseptor second-messenger calcium, menghalangi transpor kalsium pada kanal

kalsium dan pompa kalsium-natrium, serta berkompetisi di daerah calcium-binding

protein. Timbal menghalangi efluks kalsium dari sel dengan

mensubstitusi/menggantikan kalsium pada pompa ATP kalsium-natrium. Cara ini

merupakan salah satu dari mekanisme timbal berinteraksi dengan kalsium di intestin.

Cara yang lain adalah kompetisi di binding site pada calcium-binding protein.34
39

Sumber utama logam berat seperti timbal yang terdapat pada tanaman adalah

media pertumbuhan, nutrisi, input agro dan tanah. Sumber-sumber lain mungkin

termasuk pestisida dan pupuk. Tingkat logam berat yang tinggi menyebabkan

kerusakan pada tanaman seperti tertunda berbunga, kandungan klorofil yang lebih

rendah dan pengurangan jumlah dan kualitas tunas. Seperti terdapat nya kandungan

pb pada teh hijau, hal ini bisa di sebabkan oleh berbagai macam faktor. Tanah dari teh

hijau bersifat asam dan kondisi ini cocok untuk kelarutan logam berat. Selain itu,

letak perkebunan teh yang berdekatan dengan lalu lintas yang padat bisa mendapat

paparan Pb melalui dampak dari mobil knalpot dan debu. Kehadiran setiap variasi

kandungan Pb bisa terjadi akibat adanya metode penyimpanan, pengolahan daun teh

dan perbedaan konsentrasi logam tanah. Selain itu, aplikasi pupuk menyebabkan

peningkatan logam berat dalam tanah.58 Sehingga, konsumsi teh hijau yang

berlebihan karena kandungan pb yang dominan di dalam teh tersebut, di duga bisa

menjadi salah satu pencetus terjadi nya resiko osteoporosis yang meningkat.

2.1.7 Hewan Uji

Tikus yang akan dipergunakan dalam penelitian ini adalah tikus galur Wistar dengan

klasifikasi sebagai berikut:

Kingdom : Animalia

Kelas : Mamalia

Subkelas : Eutheria

Ordo : Rodentia
40

Subordo : Sciurognathi

Famili : Muridae

Subfamili : Murinae

Genus : Rattus

Spesies : norvegicus

 Anatomi Tikus

Tikus memiliki rambut pendek, ekor panjang, telinga bulat, mata exophthalmic,

memiliki lima jari pada kaki depan dan belakang.59 Tikus merupakan hewan

tetrapoda yang berjalan dengan menggunakan ujung jarinya. Tubuh tikus ditutupi

oleh rambut yang merupakan turunan dari epidermis kulit. Secara anatomi, tubuh

tikus dapat dibagi menjadi kepala, leher, badan, dan ekor.

1. Kepala dan leher

Tikus memiliki ukuran kepala yang besar dan dipisahkan dari badan dengan

leher yang mampu bergerak leluasa. Bagian ujung mulut di tutupi oleh bibir

bagian atas dan bawah. Bibir tikus bagian atas memiliki celah yang dalam

serta nampak sepasang gigi taring di bagian bawah dan atas mulut. Mata tikus

dilindungi oleh kelopak mata bagian atas dan bawah. Bagian kuping tikus

memiliki lipatan eksternal yang disebut pinna yang mampu mengarahkan

gelombang suara masuk ke saluran telinga tempat membran timpani berada.

Tikus juga memiliki sungut (vibrissae) pada hidung, pipi, dan dagu yang

berfungsi dalam sistem sensor.


41

2. Badan

Bagian badan tikus dibagi menjadi toraks (anterior) dan abdomen (posterior)

dengan tulang dada pada bagian toraks. Puting susu terletak dua baris pada

permukaan ventral badan. Setidaknya 12 buah puting susu terdapat di badan

tikus yang terbagi merata antara daerah toraks dan abdomen.

Tikus memiliki anus dan urogenital yang terpisah seperti kebanyakan mamalia

lainnya. Pada tikus betina, lubang uretra terletak di daerah anterior dan lubang

vaginal terletak di daerah posterior. Anus terdapat di dasar ekor, daerah

posterior dari lubang vagina. Pada tikus jantan, uretra merupakan saluran

urogenital yang terbuka pada ujungnya (penis). Pada bagian dasar ekor,

terdapat kantung skrotum berisi testis.

3. Ekor

Ekor tikus hanya memiliki sedikit rambut dan tersebar diantara sisik yang

berasal dari epidermis.

 Tulang rangka

Maturitas tulang terjadi secara perlahan dan osifikasi belum lengkap sampai

mendekati akhir tahun pertama.59

 Tampilan fisik

Tikus jantan dewasa memiliki berat 400-500 g, sedangkan tikus betina dewasa

lebih ringan ± 100 g dari jantan. Hewan dewasa akan terus tumbuh secara

bertahap sesuai dengan ukuran rangka selama hidupnya yang dimungkinkan


42

karena tulang epifise tikus masih dapat tumbuh (masih aktif). Tikus yang sehat

akan memiliki kisaran hidup dari 2,5-3 tahun tergantung dari galur (strain), jenis

kelamin, kondisi lingkungan dan variabel yang lain.60,61

 Reproduksi

Tikus akan mulai dapat bereproduksi saat berusia 50-60 hari. Tikus berkembang

biak setiap tahun dan tidak mengenal musim. Produktivitas tikus betina akan

mulai berkurang saat mendekati usia 1 tahun. Tikus merupakan hewan poliestrus

dengan masa penerimaan jantan dan ovulasi terjadi tiap hari ke-empat atau ke-

lima selama 12-14 hari.62 Bila terjadi perkawinan, dapat dipastikan dengan

mengobservasi adanya sumbat vagina pada tikus betina. Kebuntingan berlangsung

selama 21-23 hari.

 Perilaku

Secara umum tikus laboratorium bersifat agresif, namun jika ditangani dengan

baik dan teratur dapat menjadi jinak dan mudah dilatih. Tikus membesarkan

anakannya secara bersama-sama dalam kelompoknya. Tikus merupakan hewan

omnivora.

2.2 KERANGKA PEMIKIRAN

Osteoporosis menyebabkan penurunan densitas dan pengurangan aktivitas

mineralisasi tulang. Berkurangnya kekuatan tulang trabekular dan peningkatan risiko

patang tulang pada osteoporosis bergantung tidak hanya pada berkurangnya densitas
43

tulang trabekular, namun juga pada berkurangnya struktur elemen dan konektivitas

antar elemen tersebut. Mekanisme yang mendasari kasus osteoporosis adalah

ketidakseimbangan antara resorpsi dan formasi tulang. Proses tersebut dipengaruhi

oleh hormon terutama estrogen serta metabolisme kalsium.

Salah satu mineral penting dalam proses mineralisasi tulang adalah kalsium

(Ca2+). Kalsium merupakan molekul yang dapat berpartisipasi dalam berbagai proses

dalam tubuh. Kalsium ekstraseluler akan memodulasi aktivitas osteoklas melalui

perubahan konsentrasi kalsium internal. Proses mineralisasi pada tulang bisa saja

mengalami perubahan. Hal tersebut sangat dipengaruhi oleh sifat atom yang mampu

melakukan substitusi membentuk sebuah komposit. Sehingga dapat dikatakan bahwa

terdapat keterlibatan atom mineral lain yang berfungsi dalam substitusi atau

inkorporasi kristal tulang. Substitusi atau inkorporasi ini didasari oleh kesamaan

ukuran jari-jari atom. Beberapa atom mineral tersebut antara lain fosfor, magnesium,

florida, besi, natrium, zinc, alumunium, copper, dan strontium. Masing-masing atom

mineral mempunyai sifat spesifik di tulang.

Oleh karena itu, terdapat pemikiran bahwa terdapat atom mineral lain yang

dapat mensubstitusi kalsium dalam proses mineralisasi tulang. Beberapa penelitian

telah mengungkap komposisi atom pada tulang, akan tetapi tidak banyak yang

mengkaji pada osteoporosis. Pilihan atom mineral tersebut adalah timbal (Pb2+).

Timbal dipilih karena merupakan salah satu unsur logam berat yang lebih tersebar

luas dibandingkan kebanyakan logam toksik lainnya. Timbal dapat mempengaruhi


44

regulasi hormon pada absropsi kalsium dengan cara mengantikan peranan kalsium

sebagai mineral pada matriks tulang yang mampu mempengaruhi kualitas tulang.

Timbal berkompetisi dengan kalsium, menghambat pelepasan

neurotransmiter, dan mengganggu regulasi metabolisme sel dengan cara berikatan

pada reseptor second-messenger calcium, menghalangi transpor kalsium pada kanal

kalsium dan pompa kalsium-natrium, serta berkompetisi di daerah calcium-binding

protein. Menurut penelitian terdahulu dikemukakan bila ditemukan timbal pada

proses mineralisasi tulang akan menyebabkan densitas tulang meninggi dan

porositasnya menurun.

Diduga bahwa pemaparan timbal pada tubuh akan menimbulkan reaksi

inflamasi. Hal ini tentunya akan mempengaruhi Calcium Sensing Receptor dan

aktivitas triad molekular OPG/RANK/RANKL. Pada sistem imun, mekanisme

molekular dan selular dari triad tersebut penting untuk menjaga respon imun.

Sehingga diharapkan melalui proses substitusi kalsium dengan timbal, maka

akan didapatkan gambaran mikroarsitektur serta kekuatan tulang trabekular selain

melihat bagaimana reaksi inflamasi yang ditunjukkan oleh aktivitas triad molekular

OPG/RANK/RANKL. Pada akhirnya diharapkan akan mendapatkan informasi

terbaru mengenai mekanisme patogenesis timbal pada tulang tikus yang secara

langsung kontak pada timbal.

Secara singkat, kerangka pemikiran pada penelitian dapat dilihat pada bagan

2.13

Mineralisasi tulang
45

Ca2+ + Kristal hidroksiapatit


Mekanisme
inflamasi tulang S
U
B
S Osteoporosis
T
I
Triad molekular T
OPG/RANK/ U Penurunan densitas dan pengurangan
RANKL S aktivitas mineralisasi tulang
I

Inflamasi
Pb2+

Mampu berkompetisi
dengan kalsium
Normal
Tidak Normal
Dosis dan durasi
Dosis dan durasi
tertentu
tertentu

Gambaran mikroarsitektur tulang


trabekular

Bagan 2.1 Kerangka Pemikiran

2.3 PREMIS

Berdasarkan kerangka pemikiran di atas, dapat dirumuskan premis-premis

sebagai berikut:

Premis 1: Jaringan tulang mengalami remodelling dengan

mekanisme bone-resorbing oleh osteoklas dan


46

mekanisme bone-forming oleh osteoblas secara terus-

menerus.15
Premis 2: Osteoporosis merupakan penyakit kompleks, berbagai

faktor lingkungan antara lain aktivitas fisik dan asupan

kalsium mengambil peran.21


Premis 3: Pb2+ salah satu unsur logam berat yang terkandung pasir

timah dapat menyebabkan kristal tulang pada jaringan

lainnya.28
Premis 4: Interaksi OPG dengan RANKL yang teroksidasi oleh

timbal mampu menghambat ikatan RANKL dan RANK,

sehingga mencegah aktivasi RANK dan menghambat

resorbsi tulang.36

Premis 5:
Premis 6: Nf-kB (RANK) dapat diaktivasi oleh oleh sinyal imun

dan inflamasi.35

Premis 7: Massa tulang dapat mengubah mikro-arsitek jaringan

tulang dan meningkatkan resiko fraktur tulang jika

tertoksifikasi oleh timbal.39

Premis 8: Aktivitas osteoblas dan osteoklas yang tidak seimbang

dapat menurunkan massa tulang dan meningkatkan

risiko osteoporosis. 44

2.4 HIPOTESIS

Dari premis-premis tersebut dapat dideduksi hipotesis sebagai berikut:


47

Hipotesis 1: Terdapat perubahan mikroarsitektur tulang trabekular dan

bentuk kristal hidroksiapatit, dan yang diintervensi Pb2+

dengan dosis dan durasi tertentu. (Premis 1-6)


Hipotesis 2: Terdapat perubahan aktivitas OPG/RANKRANKL yang
diintervensi timbal pada dosis dan durasi tertentu (Premis
7,8,9)
Hipotesis 3: Terdapat perubahan kekuatan tulang yang telah

diintervensi oleh timbal pada dosis dan durasi tertentu

(Premis 10,11)