You are on page 1of 3

OXIDATIVE PHOSPHORYLATION

THEORY
Agar terjadi fosforilasi oksidatif, maka harus tercapai 2 kondisi, yaitu:
• Inner membrane mitokondria harus sempurna sehingga proton hanya dapat masuk
melalui proses ATP sintesis (pada kompleks 5)
• Pada luar inner membrane mitokondria, konsentrasi proton harus tinggi.
Energi dari gradient proton dikenal dengan nama potensial chemiosmotic. Potensial ini
merupakan jumlah dari (perbedaan konsentrasi proton antar membran) & (perbedaan
tegangan listrik antar membran).
• 2 elektron dari NADH membentuk 6-gradien proton.
ATP synthase mengandung 3 fragmen, yaitu:
• F0: pada membran
• F1: menonjol dari dalam inner membrane ke matriks
• OSCP: menyambungkan F0 dengan F1
FOSFORILASI OKSIDATIF:
• Kompleks 1: NADH  NAD+ (H+  2H+)
• Kompleks 2: Suksinat  Fumarate
• Kompleks 3: (2H+  4H+)
• Kompleks 4: ½ O2  H2O (2H+  2H+)
• Kompleks 5: ADP + Pi  ATP + H2O (3H+  3H+)

EXPERIMENT
APA YANG HARUS KITA KERJAKAN DULU?
1. Siapkan 5 tabung inkubasi. (Tabung 1&2 sebagai tabung didih, tabung 3,4&5
sebagai tabung reaksi)
2. + Incubation medium
3. + Sodium hydrogen glutamate (0,2 M)
4. + 2,4-Dinitrophenol (5mM)
5. + Methylene blue (25mg/dl)
6. + Potassium sianida (50mM)
7. + Water
8. + Sukrosa
9. + Suspensi mitokondria yang telah dicuci dengan sukrosa 2x.

EKSPERIMEN APA YANG DAPAT DILAKUKAN SELANJUTNYA?
• Penentuan Fosfat
• Penentuan respirasi seluler

UJI PENENTUAN FOSFAT!
1. Seimbangkan tabung 1&2 pada suhu 37oC
2. Pada 0 menit masukkan mitokondria, campurkan!

yudaherdantoproduction 06/195395/KU/11829
3. Ambil 0,2ml sample  deproteinasi dengan mencampurkan TCA 10%
4. Sentrifugasi untuk menghilangkan endapan.
5. Tentukan kandungan Pi (Fosfat inorganic) dari larutan supernatant.
6. Tutup tabung dan letakkan dalam waterbath goyang pada suhu 37oC
7. Buang larutan tiap 5 menit, tentukan Pi dalam medium.

UJI PENENTUAN RESPIRASI SELULER!
1. Siapkan tabung 3,4&5
2. Tambahkan 2ml paraffin cair.
3. Inkubasi pada suhu 37oC tanpa dikocok.
4. Amati perubahan warnanya,

THEORY OF EXPERIMENT
EXPERIMENT
FUNGSI MATERIAL!!!
• Inkubasi medium
o Glukosa: substrat proses glikolisis
o KHZPO4: penyedia fosfat inorganik
o EDTA: mengeliminasi logam berat (kontaminan)
o ATP: sumber energi (lebih murah dari ADP)
o NAD: suplemen koenzim proses fosforilasi oksidatif, agar NAD tidak
hilang dari mitokondria.
o Bovine serum albumin: menghilangkan uncoupling agent
o Crude hexokinase: memulai proses glikolisis.
Hexokinase: Glukosa  Glukosa 6 Phosphat. (pada glikolisis)
• Sodium hydrogen glutamate: substrat dalam fosforilasi oksidatif
• 2,4-Dinitrophenol: sebagai uncoupling agent. Menangkap proton dan membawa
masuknya kedalam mitokondria tanpa melalui ATP sintase.
• Methylene blue: mereduksi ekuivalen/menangkap H+. bersaing dengan ubiquinon.
• KCN: menghambat aliran electron (cytochrom oxidase) sehingga tidak terbentuk
H2O dan tidak terbentuk cukup energi.
• H2O: sebagai pelarut
• Sukrosa
• Suspensi mitokondria: pabrik fosforilasi oksidatif.
• TCA: deproteinasi protein.
• Parafin: mencegah pertukaran O2 dengan udara bebas.

PENENTUAN FOSFAT!
• Tes Newmann  untuk mengetahui ada tidaknya fosfat inorganic (Pi). Sebelum
terbentuk ammonium fosfomolibdat berwarna kuning. Dilakukan penambahan:
o + HNO3  Mengubah Po menjadi Pi
o + H2SO4  Katalisator
o + Ammonium molibdat  Indikator Pi.
• Hasil:
o Tabung 1: Warna jernih.
o Tabung 2: Warna kuning.

yudaherdantoproduction 06/195395/KU/11829
• Fakta yang terjadi pada Tabung 1!
o Gak dikasih 2,4-Dinitrophenol jadinya reaksinya berjalan NORMAL!!!
o Karena normal tentu saja terjadi reaksi! Reaksi apa itu? Fosforilasi….
ADP + Pi  ATP
o Karena semua Pi bereaksi dengan ADP, jadi tidak ada Pi berlebih….
Maka ammonium fosfomolibdat tidak terbentuk…. Makanya tetep bening.
• Fakta yang terjadi pada Tabung 2!
o Dikasih 2,4-Dinitrophenol (Uncoupler Agent)!
o Kerja Uncoupler Agent sebagai asam lemah lipofilik  dia akan
mengikat proton pada luar inner membrane mitokondria  masuk
bersama melalui inner membrane  melepas proton dalam mitokondria.
o Makanya gara-gara 2,4-DNP ini…. Proton masuk kedalam mitokondria
tanpa melewati ATP synthase sehingga tidak terbentuk ATP.
o Tetapi anehnya…. Terjadi respirasi maksimum! Karena 2,4-DNP akan
memisahkan antara reaksi respirasi dengan fosforilasi oksidatif.
o Karena ATP tidak terbentuk maka akan menumpuk Pi. Dan ketika uji
newmann akan terbentuk ammonium fosfomolibdat berwarna kuning….

PENENTUAN RESPIRASI SELULER!
• Hasil:
o Tabung 3: warna biru memudar/jernih
o Tabung 4: warna hijau memudar/jernih
o Tabung 5: warna biru memudar/jernih
• Fakta yang terjadi pada Tabung 3:
o Penambahan KCN, untuk menghambat aliran electron dengan
menghambat sitokrom oksidase. Sehingga aliran electron berjalan ke
jalur metylene karena jalur ubiquinon terhambat.
o Gara-gara aliran electron itu maka…… Warna MB (metilen biru) akan
memudar karena tereduksi oleh H+.
o Namun karena dalam matriks terdapat O2, maka O2 akan mengoksidasi
MB sehingga warnanya menjadi biru kembali.
o Perubahan warna yang bolak-balik ini akan terus terjadi hingga O2 habis.
o Hal ini dapat singkat ditulis dalam reaksi:
MB + 2H+  MBH2 (jernih) + O2  MB (biru)
• Fakta yang terjadi pada Tabung 4:
o Penambahan 2,4-DNP, untuk menghambat rantai transport electron 
untuk mengatasinya maka terjadi respirasi maksimum dengan pompa H+
 karena permeabilitas membrane yang tinggi  H+ tidak mampu
menembus  ATP tidak terbentuk  O2 menurun  H+ menumpuk 
mereduksi MB menjadi MBH2  warna larutan memudar.
• Fakta yang terjadi pada Tabung 5:
o Tidak ditambahkan inhibitor ataupun uncoupler agent sehingga reaksi
berjalan normal.
o Walaupun berjalan normal, O2 akan habis karena digunakan dalam
respirasi, dan H+ akan mereduksi MB membentuk MBH2 berwarna pudar.

yudaherdantoproduction 06/195395/KU/11829