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com

农 业 生 物 技 术 学 报  J
our
nal
 of
 Agr
icu
ltu
ral
 B[
ote
chn
olo
gy 

3;;
一 
新城疫北京 强毒株融合糖 蛋 白( F)
基 因的 
克 隆及 序 列 分 析 

墅  

中 国农业大学生物学 院生物化学与生物分子学 系 ,
北京 1
000
94)
 

摘 要:
  NDV 北 京强 毒株 F48
E9经 SPF鸡 胚增 殖 。
超逮 离心纯 化 ,
异硫氰 酸胍 法提 取病毒 RNA 
后,
用 RT—
PCR扩增 。
得 到其融合糖蛋 白(
F)基因  将扩增 产物与  EM@ T载体相连接 转化 。
经过 Amp
— 

PTG—
xEa
I(AI
X)平 板筛选 、
Hin
d l酶切及 PCR鉴定,
初步获得 了含 F基因 的阳性克隆 。用渐近法 (
Primer
 
wa
lki
ng)
对克隆 片段进 行全序列分析 ,
证 明得到了全长 1
 744十核 苷酸 的 NDVF蛋白基因 :
所 获得 F基 因 
与 国外 已报道的 6个 强毒 株序列进行 比较 ,
可知 F4
8E9与 其它毒株均 有一定差异 (
氪基酸 差异在 26
/553 ̄ 
44
/55
3),
但较接近 于 Aus
tra
li
a—Vi
cto
ra毒株 (
氪基酸 差异为 26
/55
3) 
关蕾词 新城疰病毒 ;融合糖蛋白 ;RT—
’— — — —
PCR;基因克隆 ;序 列分析 
一 — — — — 一
、 — — 一 — — —
~  

新 城疫 病毒 (
Newca
stl
e di
seas
e Vi
rus:
NDV)
是 有 囊 膜的单 股 负 链 RNA 病 毒 ,
共 有 Np、
P、M 、F、
 
HN 和 L 6种蛋 白 ,
其 中位 于囊 膜表 面 的 HN 和 F为糖 蛋白 ,与新城 疫的 发生发 展 密切 相关 。
HN 蛋白 
具 有血 凝 素和 神经 氨酸 酶两 种 活性 ,
主要 与病 毒 的 吸 附过 程 有关  。F蛋 白具 有融 合 功能 ,
主要 参 与 
病 毒囊 膜 与宿 主细 胞膜 的融 合 及细 胞膜 之间 的融合 ,
使病 毒侵 入宿 主 细胞 或在 细胞 问扩散 。]
。同 时 ,
 
F蛋 白还是 诱 导机体 产生 中和性 抗 体 的主 要病 毒蛋 白 ,在机体 抗感 染 免疫 中 起着 重要作 用 ]
。 

 986年 Cha
mbe
rs[
 。和 MeGi
nnes
[ 等 人采 用 亚 克 隆 方 法 分 别 测 定 了 Be
aude
tte
 c和 Aus
tra
li
a— 
Vi
ctor
ia 毒 株 的 F 基 因 全 序 列 。 日 本 的 Toyoda(1987、1989)
  、美 国 的 Sc
hape
r(1
 988)
 J,S
eal
 
(1995)_
10
 和英 国 的 Mi
nar(1988)
l1
 ,Coli
ns(1996)
[t2
3等 人相 继测 定 了不 同毒 株的 F基 因  基于 F蛋 
白具 有 的 良好免疫 原 性 ,
近 年 来 国外学 者 又用 F基 因作 为 目的基 因构 建一 系列 重组 病 毒  ]
,以期 
用于 新城疫 的免疫 防治 。
 
我 国早在 4o年代 就 分离 到 了 NDV 中国毒 株 ,
并 对其 生 物学 特性 进行 了大 量研究 。但 有关 其分 
子 生物 学方 面 的研 究报 道 较 少 ,尤其是 对 F基 因的全 序列 分析 尚未 见到 报道  本研 究 采用 RT—
PCR 
方 法获 得 了 NDV北 京 强 毒株 的 F基 因 ,
并对 其进 行 了克 隆及 全 序列 分 析 ,为进 一 步研 究 NDV 的致 
病 机理 ,
毒株 间差 异 的分子 基础 提 供依据 。
 
I 材 料和 方 法 
I.I 毒株 NDV北 京 强毒 株 毒号 AV1
 611代次 F48E9,由中国兽 医药 品检 察所提 供 。本研 究 进行 
序 列 比较时 ,
参 比了以 下 6个 NDV 强 毒株 的 F基 囡序 列 ,
分 别 为 Be
aude
tteC/45(
BEA/45)
口一,
Texas
 
G.B/48(
TEX/48)
[ ,
Aust
ral
ia—
Vic
tor
ia/32(
AUS/32)[
 ,Mi
yade
ru/51(MI
Y/51):
 ,He
rts
/33 (
HER/
 
33)[
 ,ha
lien/45(I
TA/45)
[ 。
 
I,2 载体 及 毒拣 pGEM ̄-
T 载体 购 自 pr
ome
ga公 司,
pUC18载体 及 DH52菌 株 由本 实验 室提 供 。
 
1.3
  SPF种 蛋 购 自中国兽 医药 品检 察所 ,
本 实验 室 自行孵 育 。
 
I.4
  酶及 试 剂  M—
MLV 反 转录 酶 购 自 GI
BCO 公 司 ,
Sequenc
e Ver
sion 2.0
 DNA 
Sequen
cing 
Kit购 
自 USB,
Taq
 DNA 聚合 酶 由中国 农业 大学农 业生 物技 术 国家 重点 实验 室提供 。
 

龙 飞 :男 .
1969—
01生 ,
主 要 从 事 薛扁 病 毒 分 子 生 物 学 方 面 的研 究 
* 眭 系 凡 
收 稿 日期 :
i99
8 02
 27
 
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农 业 生 物 技 术 学 撤 

1.5 ;J物设 计 据文献[


8]报道 资料 .用 OLI
G05
.0软 件设 计 5个 引物 ,
其 序列 、
位置 和 用途 如下 
弓}
物名张 序 列  位 置  作 用 
Pl
  5’GCAAGCTT 
AGATTCTGGATCCCGGTTGG 3’(一 )
  1~ 21
  RT PCR 

P2
  5’
TACACACAAATTGCTAT3’(一 )
  1
 728~ 1744
 RT PCR 

P3
  5’
GGGAATTC 
GCAAGATGGGCTCCAGA3’
(+ )
  34~49
  PCR 鉴 定 
P4  5’
cGGAGCTc GcATTcAcATTTTTGTAGTGG3’()
  1
 683~1703
 PCR 鉴 定 

P5
  5’
CCACAAATCACTTCCCCTGcCT3’(+ )
  7l3~ 734  I
则序 

其 中 P1、P3、
P4的 5端 分别 引入 Hi
ndⅢ、
EcoR I和 Sac
 I酶 切 位点及 两 个保 护碱 基 。以上 引物均 
由赛 百盛 生 物工 程公司 合成 。
 
1.6 塥 毒 增 殖 及 基 因 组 RNA 的提 取 
将 毒种 100倍 稀释 后 ,
接 种于 10日龄 SPF鸡 胚尿 囊腔 (
O.2
 mL/胚 )。
收 集 36 ̄48
 h死 亡鸡 胚的 
尿囊 液 。然后 按 文献 [16]所述 方法纯 化病 毒 。NDV 基 因组 RNA 的提 取 参 照文 献 [1
 7]进 行 ,
即取 200
 
L尿囊液 ,
加 5
  蛋 白酶 K,37
 C 10 r
ain.
加 400  I
 异 硫氰 酸 胍变 性液 [25
 g异硫 氰 酸胍 .
33 mI
 
CSB(0.83
  N一十二烷 基 肌 氨酸 ,
42 mmol
/L柠 檬 酸钠 ,
0.2
 mmol
/L  巯 基 乙醇 )],冰浴 1j
 rai
n.加 

O  2  mo l
/L pH4.0乙酸钠 , 冰浴 5~10 r
ain,
加等体积酚 ( 水饱和): 氯仿 :异戊醇( 25:24:1 )
冰 
浴1 
5 r
ain。12 000 r
/r
ain室温 离心 10
 rai
n.取 上清重 复 上述 操 作一 次 。其上 清再 用 等体 积氯 仿 :异戊 
醇(
24:1)抽提 一 次 。而 后取 上清 加等 体 积 异丙 醇 置 一20 
C 2
 h。13
 000 r/r
ain室温 离 心 1
 5 r
ain.
 
7O
  乙醇 (
DEPC水 处理 )洗沉 淀一 次 ,
凉干 后溶 于 1
 0
  L DEPC水 中 。
 
1.7  RT —PCR 

取 RNA 9
  L,加 RNas
in 1
  .DTT 2
  L,5× 反 转 录 酶 缓 冲 液 4
  .dNTPs
 1.5
  L 

10 mmol
/L),
引物 P 1.5
 I ,M—
MI 
V 反 转录 酶 1
  L,
37C温育 1.5
 h。
 
取上 述 反转录 产 物 5止 加 入 dNTPs
 2  (10 r
et
ool
/L)引物 P1、
P2各 2
  L,1
 0×PCR 缓 冲液 

  L,
最 后 用 灭 菌 双 蒸水 定 容 至 5O pL。95
 C变 性 5
 rai
n后 ,
加 入 0.5
  Ta
q DNA 聚 合 酶 (5
 u/
 
),
按 94
 C 35
 s、5
2 C 56
 s、72
 C 110 s的条件 完成 3O个循 环反 应 ,
最后 72
 C延伸 10
 rai
n。反应 结 
束 后取 5
  进 行 0.9
  琼 脂糖 凝胶 电泳观 察 。
 
1.8
  PCR 产 物 的兑 隆及 鉴定 
将 PCR 产物 用 0.5
  低 溶 点琼 脂糖 回收 纯 化 后 .
按 pGEM ̄-
T载 体操 作手 册 进 行连 接 和转 化 。
 
37
 C过 夜培 养后 ,
挑取 白色菌 落转接 到 2
 mL 
LB培 养液 中  碱裂 解 法提 取 质粒 ,先后用 Hi
nd R
I酶切 
鉴 定和 用 P1、
P2及 内侧 引物 P3、
P4进 行 PCR 鉴 定 。
 

.9 酶 切 图谱 分 析 
将 筛 选 到 的 阳性 克 隆 用 H觚iⅡ和 Sac
 I双 酶 消 化 并 回收切 下 片段 。据 文 献[7,
8]选 用 PvuⅡ、
 
Ba
mH 
I、Ps
t I、
Sma 
I、Ec
oR 
I、Kpn
 I、
H  I等酶分别消化回收的克隆片段 。而后取样进行琼脂糖 
凝胶 电泳观 察酶 切谱带 
1.10 序 列 分 析 
选 取一 株经 Hi
ndⅢ酶 切及 PCR 鉴定后 的阳性 克 隆进 行 序列分 析 。为确 保 测序 的准 确性 和 有效 
性,
先进 行 人工 部分 测序 ,
再 用 AB1
377自动测 序仪 测 定全基 因 。
 
人工 测序 时 ,为 了一次 能读 取 更 长 的 目的基 因序 列 ,
将 插 入 T载 体 中 的外 源 片段 用 Hi
ndⅢ、Sac
 
I双 酶 切下 ,回收纯 化并连接 到同 一酶 切后纯 化的 pUC18中 .
构 建 成 pUC18
 2,
再 以此 作 为测 序模板 
进 行 人工部 分测 序 。自动 测序 时采 用渐近 法 (
Pri
mer
 wal
king),
即5 
端 和 3’端分 别先 用通 用 引物 进 行 
反应 ,
而 后 依据 两端测 出序 列 ,另外设 计 中 间段 测序 引物 (
P5),
再 进 行 测序 反应  用三 段 测序结 果 拼 
接 出 F基 因全 序列 。
 
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第 4期  霍龙 E等 :新城 痤北京强 毒株融合糖蛋 白(


F)基因的克隆l
及序列分析  33
5 

删 序时模 板的 制 各采用 PEG 法 。


 
2 结果 
I)
应 用 引物 Pl、P2对 NDV 基 因组 RNA 进 行 RT 
PCR.反 应 产物 经 0.9
  琼脂 糖 凝 腔 电 泳 检 
测,
得 到 约 1.8
 kb的扩 增 片段 ,
与预 期 的 NDV 
F基 因片段 大 小一致 (见图 1)。
 
2)
PCR 产物 经 回收纯 化 与 T载 体连 接 后 ,
通过 AI
X平 板 筛选 ,
HindⅢ酶 切及 PCR 鉴 定 ,
得 到 阳 
性 克 隆质 粒 pGFS1
8(见 图 2),用 原引物 对 Pl、
P2及 内侧 引物对 P3、
P4分 别扩 增此 克 隆质 粒 ,
均 获得 
约 1.7
 kb左右 扩增 片段 .
说 明所克 隆 片段是 完整 的 PCR产物 (见 图 3)。
 
3)
bg用 7种 限制 性 内切 酶对 克 隆 片段 进 行 酶 切分 析 ,电泳 检 测 结 果显 示 ,已克 隆 片段 存 在 Hae
 
Ⅱ、
P “I、
Pst
 I等酶 位 点 ,
而 无 Ec
oR 
I、Kpn
 I、Sma 
I等酶 位 点 (见 图 4)。此 结果 除 Sma I外 ,
均与 
文 献 [7.8]中 报道 的 NDV F基 因相 符  Toyoda等 人  的 资 料 显 示 ,
Sma I在 NDV F基 因 上 的约 

 200核 苷 酸 处 有 相 当 保守 的识 别 序 列 .而 本 实 验 的 结 果 表 明 可 能 由于 点 突 变 造 成 此 毒 株 F基 因 
Sma 
I位 点 的丧 失  本 实验 的测 序结 果也 证实 了这 一推 测 
4)人工 测 序时 ,
采用 二抗 上样 技 术  自动 测 序时 引物 P5的 测序结 果 与 5
 端 正 向及 3
 端 反 向测序 
结 果分 别重 叠 90余 个和 180余个 核苷 酸 。3次 反应 结果 拼读 出 了克 隆 的 F基 因全 片段 ,
共 1
 744个 
核 苷酸 (见 图 5)
 由此 F基 固 编码 区推 导 出的 F蛋 白为 553个氨 基 酸(见图 6)
 将此 中国毒 株 F蛋 自 
的 基围 序列及 氡 基酸 序 列与 国外 毒 株进 行 比较 ,
发 现其 棱苷酸 差 异在 1
 02.

'1707(5.9
8% )至 186/1
 707
 
(10.9
 )之间 .
而 氯基酸 蔗异在 26
 j53(4.7
  )至 44/553(7.95
 )之 间 (见表 1)
 

  Ⅵ
  表 1
 F4
8E9与其它 NDV强毒株 F蛋 白基 因序列 殛 
氨基酸序 q
差异性比较 
TabJ
e l
  T he
 di
ffer
ences
 compar
ison of
 nuel
eot
ide 


equence
 and deduced
 ami
no aci
d se
qunce
 of
 F 
prme
ins
 

bet
ween F48
E9 and
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her
 NDV 
vir
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 str
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株  !
竺! 


 ns
  璧
 荒 个
  芎
  十
 
圈l
  NDV 
F48E9
F摹固的 RT—
PCR扩增 
Fi
g.1
  Ampl
i{i
cadon of
 F gene
 of
 NDV 


trai
n F48E9 
by RT 
PCR 

M.M)NA 
EcoR 1,
  d Ⅲ标 准分 子 量 
M.
  DNA EroR 1-
  Ⅲ ma*ker
 

A  RT 
PcR 严 物 
R 
r PC R p*odu ̄‘
 

A  B  C 


 pGF51
8的 Hi
ndⅢ、
SacI酶切鉴定 

一 
Fi
g.2  Rest
rict
ion enzyme di
gest
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 l 

A  I
弱性 质 粒 pGEM@ T载悼 Ne
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pLs
mid
  [M@ T  。
r 
阳性质粒 pGFS1
 
8 Pas
ti
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plm
.mi
d  W51
8 

、 P
GF51
 
8 HmdⅢ 、
岛 f【酶 切 结 枭 P ̄s
mid
 pGF51
8 di
ges
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农 业 生 物 技 术 学 报 

t 

Fi

A.引物 P1、
图 3 阳 性 克 隆 pG'
g.3  I
ndent
ifi
eat

P2扩 增 产 物
ion 
of
F518的 PCR 鉴 定 
 0pos

Pr
oduc

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 of
 
 cl
one

PCR 
us
 by PCR 


ng 
pri
mer
s 
图4
 p
Fi
g.4
 

ment
 i
一 
GF5
18克 隆片段的限制性 内切酶 电泳 图 

nse
Agros

rte
d i
e gel

n pL
as
 el

mi

ectr
ophor
esi

 pGF518 di
 of

ge
 t

st
he
 f

ed wi

l ag—

h 
 

P1
 ao
d  PZ  t
he f
oRowi
ng e
nzymes
 

3- 引物 P3、P4扩 增 产物 Pr
d uc
o t o
/PCR us
ing 
pri
mer
s  . K卸 I
  B.EcoR I
  C  Sma1  D.D  Ps打 I
 
P3 ar
m P4  E .B 删 H I
  F. P  Ⅱ
  G  1 

C 阴性 对 照 Ne
gati
ve 
eont
r ̄  M .XDNA 
EeoR 【/Hi
ndI标 准分 子 量 
M.2
 ̄DNA EmRI/Hi
ndI标准分子  M   DNA EcoR 【/  dI 眦 ker 
XDNA £coR I/  Ⅲ m arker
 

3 讨 论 
本 实验 采用 人工 部分 测序 与 自动 测序 相 结 台 ,
保 证 了被 测 样 品 的准确 性 。同时 测 序时 未 做 亚 克 
隆 ,而 用渐近 法 (
Pri
mer
 wal
king)直接 对 约 1.75
 kb的 F基 因进 行 测 序 。此法 省 去 了进 行 亚 克隆 ,
酶 
切 、筛选 等 繁琐工 作 ,
而显得 省时 、省力 。
正 因 为渐近 法 测序的 高效 性 ,目前 已被 广 为采 用 ,尤其 被用 于 
酶 切 图谱 不 清或 酶切位 点不 适 的长 片段 基 因的 序列 分析 
通过 PT—
PCR和 序列 分析 ,
获 得 了 F48E9毒 株 的 F基因 序列 共 1
 744个 核 苷酸 ,
该序 列包 含 了 启 
始密码 子 和终 止 密码子 在 内的 1
 662个 碱基 的 F蛋 白编码 序 列  启始 密码 子上 游 尚有 37个 核 苷酸 ,
 
终 止 密码子 下游 亦有 45个核 苷酸 ,因此本 实验 已获得 了完 整 的 F基 因 。由此 F基 因推 导 出的 F蛋 白 
长 553个 氨 基酸 ,与 已报 道 的 12株 NDV 
F蛋 白长 度 一致 口’
 ]。本 实验 所 测 的 F蛋 白基 因序 列 已被 
Ge
neBa
nk接 受 ,
序号 为 Banki
t 159737。
 
NDV 的 F 蛋 白首 先 以无 活性 的前 体蛋 白(
  )形式 合成 .
经 蛋 白酶裂 解 为二硫 键相 连 的 F2一F1两 
个多肽 后 ,
才表 现 出生 物学 活性 。根据 Toyoda(1987)
口一,
Gli
ekl
man(1988)7
埘和 Gorman(1990)
[” 等 人 
的报 道 ,
NDV 强 弱毒 株 的 F。蛋 白 在裂 解 位 点 (】1
2~ 117位氨 基 酸残 基 )处 存在 明显 不 同 的保 守 序 

 
列 。弱 毒株 多为 GR/K 
QS/G 
RI ,
而强 毒 株则 为 RRQR/KF。由本 实验 获得 的 F基 固推 导出 的 F。蛋 
白,
其 112~ 11
 7位的氨 基酸 残基 与 已报 道 的强 毒 株裂 解位 点 处 的保 守序 列 完全 相 同 ,
这 与 F48E9毒 
株在 临床上 表 现出 强致 病性 是一 致 的 
通 过 核 苷酸 序 列 和 氨 基酸 序 列 的 比 较 ,可 以看 出 ,
F48E9与 澳 大 利亚 毒株 AUS/32的差 异 最 小 
(分别 为 102/1707、26/553),
而 与 TEX/48(
美 国 株)的 差异 最 大 (
St别 为 186/1707
 44/553)。此结 果 
表明 ,
北京 强毒珠 F48E9与 AUS/32的亲 缘关 系较 近 .而 与 TEX/48的关 系较 远 。
 
由 核 苷 酸 序 列 推 导 出 的 F48E9
 F。蛋 白氨 基 酸 序 列 中 有 13个 位 点 (25、76、199、338、347、362、
 
370、
394、
399、
401、
424、514、523)出现 半胱 氨 酸残 基 。其 中有 12个 位点 的半肮 氨 酸残 基与 报道 的其 它 
 
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霍 龙 飞 等 :新 城 疫 北 京 强 毒 株 融 合 糖 蛋 白(
F)基 因 的 克隆 及 序 列分 析  33
7 


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338  农 业 生 物 技 术 学 报  1998笠 

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7个 NDV 毒 株 F基 因 的 核 苷 酸 序 列 
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neBank接受 ,
序号为 Banki
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de sequence of the NDV strai
n F48E9 has been accepted by Genebank,t
he num ber
 is Banki
t 159737 
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第 1期  霍龙飞等 :新城 疰北 京强 毒株融合糖蛋 白(


F)基因的克隆及序列分析 


 




 


 三

  



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图中全部列 出F48E9FO蛋白的氨基酸序列 ,
其 它毒株只列出 与F48E9不 同的氪基酸 。
框 内标 出了 N一末端信号序 
列,
F1的 N一
末端 融合诱 导序列及 c_
末端跨膜区。阴影部分代表半胱氨酸残基及潜在椿基化位点 
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6个 强毒 株 完全 一致 ,
只有 第 514位 的半肮 氨酸 残 基略有 变化 。据 Toyoda
  等人报 道的 资料 ,
NDV 
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蛋 白中第 27位 氨基 酸在 弱毒 株 多为半 胱 氨酸 ,
在 强毒 株则 多 为荷正 电的精 氨酸 或组 氨酸 。本 实验 所 
得 F。蛋 白氨基酸 序 列在 27位 亦为精 氨酸 ,
这进 一 步佐证 了 Toyoda等 人的 资料 。从本 实验 的结果 可 
看 出 ,NDV 
F蛋 白中的 半胱 氨 酸残 基是 高 度保 守 的 ,
这 些半 胱 氨 酸可 能在 维 持 F蛋 白高级 结 构 及 
功能 方 面起着 重要 作用 。另外 ,
F48E9
 F蛋 白中 的 5个 潜在 糖基 化位 点 ,与其 它 6个强 毒株 一样 亦 具 
高度 保守性 。Mc
ginne
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。  等人最近 报道 ,
NDV 
HN 蛋 白中 的半肮 氨酸 残基 能直 接 影 响邻近 潜 在糖 基 
化位点的糖基化作用。在本研究列举的七株 NDV 
F蛋白的氨基酸序列中,
可以看出半肮氨酸残基位 
点及 潜在 糖基 化位 点在 F蛋 白中均 具有高 度 保守性 ,
这 一点似 乎 说 明二者 亦有 某种联 系 。不 过 ,
对 于 
NDV 的 F蛋 白 ,
是 否真 的存在 如 Mcgi
nnes所述 的影 响关 系,尚有 待研 究证 明 。
 
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340
  农 业 生 物 技 术 学 报  1998正 

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