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Escuela de Medicina Humana

Biología Celular y Molecular

ENZIMAS

OBJETIVO:

 Detectar la presencia o ausencia de actividad enzimática en saliva ( actividad amilolitica


 Determinar el valor de la actividad variando algunos parámetros que regulan su actividad
(pH, temperatura, etc.)
INTRODUCCION
En todo ser vivo se producen constantemente innumerables reacciones químicas.
Muchas de ellas tienden a trasformar las sustancias introducidas con los alimentos a fin de
obtener energía y materia prima para la síntesis de nuevas estructuras moleculares. Un
catalizador es un agente capaz de acelerar una reacción química, sin formar parte de los
productos finales, ni desgastarse en el proceso. En los medios biológicos se desempeñan
como catalizadores macromoléculas denominadas Enzimas. La mayoría de las enzimas son
de naturaleza proteica, pero además de las proteínas, ciertas moléculas de ARN, llamadas
Ribozimas tienen también actividad catalítica. Como todo catalizador las enzimas actúan
disminuyendo la energía de activación (Ea) de una reacción, acelerando la velocidad de
reacción. Las sustancias sobre sobre las cuales actúa una enzima reciben el nombre de
sustrato. La especificidad de una enzima le permite distinguir con gran selectividad entre
diferentes sustancias y aun entre isómeros ópticos.

Estructura de las enzimas


Según su composición pueden ser de dos tipos:
• Enzimas: Formadas por una o varias cadenas proteínicas,
• Holoenzimas: Poseen una parte proteica llamada apoenzima y otra no proteica denominada
cofactor
HOLOENZIMA = APOENZIMA + COFACTOR
El cofactor puede ser una molécula inorgánica, (iones metálicos como Fe, Cu, Zn, Mn, Mg,…)
o puede ser una molécula orgánica. En este caso, si la unión al apoenzima es covalente se
denomina grupo prostético y si no es covalente coenzima.
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Propiedades de las enzimas

 Especificidad: Como consecuencia de la estructura del sitio activo las enzimas presentan
un alto grado de especificidad por el sustrato, puesto de manifiesto por su habilidad para
discriminar entre moléculas muy similares.
 Reversibilidad: Reversibilidad: Una enzima actúa igual sobre una reacción química sea
cual sea el sentido de la reacción. No modifican el sentido de la reacción.
Sacarosa + H2O glucosa + fructosa

 Eficacia: Se necesitan en muy poca cantidad. Una sola molécula de enzima puede
catalizar la reacción de miles de moléculas de sustrato ya que la enzima no se consume
en el proceso sino que se recupera al final.
 Gran poder catalítico: Multiplican la velocidad de las reacciones por un millón de veces o
más.
 No se consumen en las reacciones.
Actividad o acción enzimática
En toda reacción enzimática el sustrato es transformado en producto para lo cual la
enzima se une al sustrato formando un complejo enzima-sustrato. Luego la enzima
permanece inalterado y el sustrato transformado en producto.
E+S [E + S] E+P
Enzima sustrato complejo enzima-sustrato enzima producto
Sitio activo:
Cada enzima independientemente de la reacción que catalice o de su estructura
particular contiene dentro de alguna parte de su estructura terciaria un grupo característico de
aminoácidos que forman el sitio activo donde ocurre el evento catalítico del cual esa enzima
es responsable. El sitio activo es un surco o bolsillo real con propiedades químicas y
estructurales que le permiten la acomodación adecuada y especifica al sustrato.
Inhibidores:
Son moléculas que impiden el normal funcionamiento de las enzimas o las inutilizan,
ya que disminuyen o anulan la actividad enzimática. Constituyen un mecanismo de control de
las reacciones metabólicas. La inhibición puede ser:
a) Inhibición irreversible: Envenenamiento del enzima. El inhibidor se une al centro activo
de la enzima de forma permanente mediante un enlace covalente, con lo que la enzima queda
inutilizada. Ej: fármacos y tóxicos. El ión cianuro se une a la citocromo-oxidasa que es clave
en la respiración.
b) Inhibición reversible: No se inutiliza el centro activo sino que impide temporalmente su
normal funcionamiento. No se une mediante enlaces covalentes. Puede ser de dos tipos:

 Inhibición reversible competitiva: El inhibidor es una sustancia semejante al sustrato y


compite con él para unirse al centro activo. Sin embargo la enzima no puede romperlo y no
podrá actuar hasta que se libere de él. Disminuye la velocidad de reacción. Se puede anular
su inhibición aumentando la concentración de sustrato.
 Inhibición reversible no competitiva: El inhibidor se une a la enzima en un lugar distinto
al centro activo, pero lo modifica e impide el acoplamiento del sustrato o bien hace fijo al
complejo enzima-sustrato.
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MATERIALES
Amilasa salival, tubos de ensayo, vaso de precipitado, pipetas, baño maria, mechero de
alcohol almidón al 1%, sacarosa al 20 %, reactivo de Fehling, soluciones amortiguadoras con
pH 3, 6.8 y 9.8, lugol,. Muestra biológica: saliva
PROCEDIMIENTO
El método se basa en la hidrolisis del almidón (sustrato) en condiciones de pH y
temperatura fisiológicos, por acción de la amilasa presente en la saliva .Cuando se hidroliza
el almidón se rompen las uniones glucosídicas dando lugar a oligosacáridos de diferente
longitud (dextrinas). Las de mayor tamaño amilodextrinas dan azul con lugol, las siguientes
eritrodextrinas, dan coloración rojiza, y las acodextrinas, de menor tamaño, dan negativa a la
reacción de lugol. Si la hidrolisis prosigue, se forman maltotriosas, isomaltosas y maltosas,
productos de degradación no evidénciales con el reactivo de lugol (pero si con el Fehling).
A. RECOLECCION DE LA MUESTRA DE SALIVA Y PREPARACION DE LA SOLUCION
DE ENZIMA
Primero se tiene que recolectar la muestra de saliva para obtener una solución de
enzima. Para ello el alumno debe enjuagarse la boca varias veces con agua corriente y
proceda a recoger en un vaso de precipitado limpio aproximadamente 2 ml de saliva. Luego
adiciónele a la muestra recogida 10 ml de agua destilada y mezclar.
1. Especificidad enzimática
Los enzimas, además de ser unos catalizadores muy eficaces, presentan un alto grado
de especificidad química, es decir, son capaces de inducir la transformación de un sólo tipo
de moléculas y no de otros que también se encuentran presentes en el medio de reacción. Un
enzima es capaz de discriminar entre dos sustancias que potencialmente podrían actuar como
sustratos.
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Prepare la siguiente gradilla

1 2
Solución de almidón 3 ml
Solución de sacarosa 3 ml
Amilasa salival 2 ml 2 ml
Cloruro de sodio 0.5 ml 0.5 ml
Mezclar e incubar durante 20 min. En baño maría ( 37°C)
Lugol 5 gotas
Reactivo de Fehling 2 ml

2. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática:

Fundamento: Cada enzima tiene una temperatura óptima en la cual la velocidad de reacción
es máxima. Suele ser 40ºC. Si aumenta mucho, la enzima se desnaturaliza. El calor aumenta
la energía cinética con lo que aumenta la movilidad de las moléculas facilitando su encuentro.

Prepare la siguiente gradilla:

1 2 3
Buffer 6.8 2 ml 2 ml 2 ml
Cloruro de sodio 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
Amilasa salival 1 ml 1 ml 1 ml
Colocar c/ tubo durante 10 min. en sus diferentes baños: 1. Baño de hielo
2. baño maría 37°C
3. llevar a ebullición
Solución de almidón 3 ml 3 ml 3 ml
Incubar 20 min. mas en sus respectivos baños
lugol 3 gotas 3 gotas 3 gotas

Los tubos deben estar en sus respectivos baños por un laxo de 30 minutos en total
3. Sensibilidad al pH
Fundamento: Cada enzima presenta unos valores de pH entre los que son efectivos. Entre
ambos existe un pH óptimo en el que la velocidad de la reacción es máxima. Fuera de los
límites la enzima se desnaturaliza. Este efecto se debe a que, al ser los enzimas de naturaleza
proteica, al igual que otras proteínas, se desnaturalizan y pierden su actividad si el pH varía
más allá de unos límites estrechos.
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Prepare la siguiente gradilla:

1 2 3
Buffer pH 3.8 2 ml
Buffer pH 6.8 2ml
Buffer pH 8.9 2 ml
Cloruro de sodio 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
Solución de almidón 3 ml 3 ml 3 ml
Amilasa salival 1 ml 1 ml 1 ml
Mezclar e incubar durante 20´ en baño maria a 37° C
Lugol 3 gotas 3 gotas 3 gotas

4. Identificación del Cofactor e Inhibidor de la Amilasa Salival


Fundamento: La enzima α amilasa salival requiere como cofactor de la presencia de los iones
cloruros, sin embargo los metales pesados como sulfato de cobre y nitrato de plata causan
precipitación de la enzima inhibiendo su actividad catalítica.

Prepare la siguiente gradilla:


1 2 3
Cloruro de sodio 2 ml
Sulfato de cobre 2 ml
Nitrato de plata 2 ml
Buffer pH 6.8 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
Solución de almidón 3 ml 3ml 3ml
Amilasa salival 1 ml 1 ml 1 ml
Mezclar e incubar durante 20 minutos en baño maria ( 37°C)
lugol 3 gotas 3 gotas 3 gotas

Observe, esquematice y analice sus resultados


Cuestionario
1. Observe la siguiente reacción enzimática de la hidrólisis de la sacarosa, catalizada por la
enzima sacarasa.
Sacarosa + H2O → Glucosa + Fructosa
a. Represente la acción enzimática según el modelo de llave-cerradura.
b. A que grupo de la clasificación enzimática pertenece y donde actúa?
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2. La biosíntesis de purinas y pirimidinas utilizadas en la síntesis de ADN necesita ácido fólico.


El metotrexato es un análogo del ácido fólico utilizado en el tratamiento de algunos
cánceres.

a. Por qué este fármaco se utiliza para el tratamiento del cáncer?


b. Qué efectos secundarios tiene el fármaco?
c. Defina la inhibición y que tipos de inhibición existen.

3. Con relación a las siguientes enzimas describa:

Tejido donde se
Enzima Reacción que cataliza Aplicación clínica
localizan

Amilasa

Creatina quinasa

Alanina aminotransferasa
Lactato deshidrogenasa

4. Complete el cuadro sobre aplicaciones terapéuticas de inhibidores enzimáticos.

Agente terapéutico Enzima inhibida Modo de inhibición Uso clínico

Captopril

Lovastatin

Paracetamol

Ciprofloxacina

Cafalosporina

5. Explique mediante un cuadro comparativo la clasificación de las enzimas.