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PRODUCCION DE ENZIMA AMILASA MICROBIANA

MEDIANTE FERMENTACION EN SUSTRATO LÍQUIDO

FACULTAD DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

UNIVERSIDAD PONTIFICIA BOLIVARIANA


CENTRO DE INVESTIGACIONES
MONTERIA – CORDOBA
2008

1
A. INFORMACION GENERAL

Título del proyecto Producción de enzimas amilasa microbiana, mediante


fermentación en estado líquido

Líder principal
responsable del Eder Durango Ballesteros
proyecto

Miembros e integrantes Alfonso Batista Jiménez


Ibeth Cepeda Jiménez
Héctor Alberto Tobón Guzmán
Unidad académica Facultad de Ingeniería Agroindustrial
Empresa donde Universidad Pontificia Bolivariana
realizará el proyecto
Fecha de inicio Junio de 2008
Fecha de finalización Junio de 2009
Costo total del proyecto
(incluyendo descargas – $ 21.826.281
pago de personal -).
Montos de contrapartida
(Entidad o dependencia $ 9.427.881
que cofinancia).
Línea de trabajo o área
del conocimiento en la Desarrollo de nuevos materiales y nuevas
cual se inscribe el aplicaciones
proyecto.

2
B. RESUMEN

El surgimiento de plantas de alcohol carburante de primera generación a partir de


almidón, en la región Caribe, implica la transformación de la materia prima por
procesos de hidrólisis mediante la acción de un complejo de amilasas capaces de
degradarlo en azucares. La implementación de hidrólisis enzimática conlleva
generar altos costos de producción, factor que genera una problemática en las
empresas de este género y a su vez en buscar soluciones para dicha temática.
Este proyecto tiene el principio de desarrollar e implementar aplicaciones
microbiológicas y biotecnológicas para la producción de un complejo de amilasa
microbial a partir de fermentación en un estado liquido, con el objeto de buscar
soluciones factibles en cuanto a la problemática planteada del proceso de
hidrólisis del almidón.

C. DESCRIPCION DEL PROYECTO:

1. Planteamiento del problema:

La tendencia actual y las altas exigencias ambientales han impulsado el desarrollo


de nuevas técnicas agroindustriales. Actualmente, en Colombia se plantea un
déficit general en torno a la agroindustria enzimática a causa de la carencia de
investigación, infraestructura y poca motivación para desarrollar empresas que
basen sus fundamentos en el progreso de este campo de la biotecnología. Su
desarrollo, así como el de otras áreas de la biotecnología, está afectado por
problemas como la creciente brecha científica y tecnológica con respecto a los
países industrializados. Según la firma internacional, Frost & Sullivan, analistas
dedicados al estudio de mercados mundiales, el comercio de enzimas esta
seccionado en distintos segmentos dependiendo la industria y la aplicabilidad de
estas. Según el estudio, para el año 2003 se generó cerca de 142 millones de
dólares solo en la industria alimenticia siendo el sector más innovador el de la
ingeniería genética a partir de organismos modificados, OGM. Con un 47.3%, las

3
enzimas destinadas al procesamiento del almidón (amilasas) y los azucares
componen el sector mas amplio en la industria.1

Esta crisis remarcada en el ficticio mercado enzimático colombiano afecta gran


diversidad de industrias incluso las que están en vía de desarrollo como las de
alcohol carburante de primera generación cuya materia prima para producción es
el almidón, ya que para la transformación de ésta se hace necesario catalizar el
polisacárido por medio de un complejo de enzimas amilasas capaces de desdoblar
este compuesto; el uso de este complejo representa el 12% del valor total de
producción de alcohol a base de esta materia prima. En la costa Caribe el empleo
de estas enzimas esta concretamente en el Ingenio Sicarare (Codazzi-Cesar) y
en la planta piloto de CORPOICA-TURIPANA en Córdoba, lo que les incrementa el
valor por litro de producto dado la necesidad de importación de este complejo.

Las plantas de alcohol carburante de primera generación con base en almidón se


ven obligadas a importar complejos de amilasas para la hidrólisis del polisacárido,
lo que implica un aumento significativo en los costos de producción de las
compañías por el hecho de incurrir en gastos de importación, aranceles y demás
impuestos. Las enzimas a escala industrial, son importadas de diversos países de
Europa, Japón, Estados Unidos, Canadá y México.2

En conclusión, la creciente agroindustria de los biocombustibles de primera


generación a partir de almidón ha establecido un hecho que evidencia la
necesidad de producir complejos de amilasas para reducir costos de operación.
Por lo que se plantea esta investigación para buscar alternativas de producción de
enzimas amilolíticas y su aplicación en las plantas de alcohol carburante en base
de almidón.
2. Impacto esperado

1
Consultado en: < www.agrobio.org/bioboletines.php?id=34>. boletín 34 publicado en junio de 2004 [en
línea]; consultado el 09 de febrero de 2008.
2
CARRERA, Jorge; producción y aplicación de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de
biotecnología en el sector agropecuario y agroindustrial. p 10.

4
Con este proyecto se busca incorporar soluciones biotecnológicas para establecer
un protocolo de producción de un complejo de enzimas amilasas para catálisis de
almidón. Bajo esta temática se permitirá lograr avances en términos de
investigación en el área enzimática.

La profundidad de esta investigación radica en buscar fuentes orgánicas capaces


de producir complejos amilolíticos para hidrólisis del almidón con el fin de mejorar
el desarrollo de este proceso.

3. Marco teórico y estado del arte:

3.1 Antecedentes

Mundialmente, la producción de enzimas esta desarrollándose aun más, bajo el


principio de optimizar procesos y convertirlos en bioprocesos. La aplicación de
esta industria gira en torno a países industrializados que tienen la capacidad de
investigar y producir a gran escala estas proteínas, lo cual margina a países
menos desarrollados a causa de carencia de recursos, infraestructura y desarrollo
en el campo biotecnológico. Sin embargo, esta afirmación no ha sido un
impedimento para que en diversos lugares del mundo se investigue en el área de
la enzimología y el impacto que estas ocasionan en los procesos y reacciones
químicas.

Enzimas amilasas son las mas estudiantes en este campo debido a su influencia
directa en la degradación del almidón, uno de los productos alimentarios mas
explotados a nivel mundial.

Obtención de amilasas fúngicas a partir de Aspergillus sp., aislado de


semillas de lentejas3. Este proyecto se llevo a cabo en Bogotá - Colombia y su
objetivo fue aislar microorganismos productores de amilasas para producir
enzimas hidrolíticas del almidón. El agente productor detectado fue una cepa del
3
CASTRO C.; NAVAS C.; CARO O; PIÑEROS Y. Obtención de amilasas fúngicas a partir de Aspergillus
sp. aislado de semillas de lentejas. Consultado en pagina oficial de Universidad Jorge Tadeo Lozano, Bogotá
– Colombia. www.utadeo.edu.co. Fecha de consulta:02 de marzo de 2008.

5
genero Aspergillus sp. Quien fue aislado de granos de lentejas. Este
microorganismo fue llevado a medio de cultivo en agar YPD bajo parámetros
específicos de incubación. Luego de 18 días se realizo cambio de sustrato a
salvado de trigo y se llevo a cabo pruebas de Lugol, medición de actividad
enzimática y extracción del complejo enzimático. Los resultados indican que las
amilasas presentes en el complejo enzimático obtenido del cultivo de Aspergillus
sp., sobre salvado de trigo, fueron activas en el desdoblamiento de la molécula de
almidón a pH 5.0 y temperatura de 37ºC demostrando su carácter débilmente
ácido y su proveniencia mesófila. El equivalente de dextrosa como medida
cuantitativa de la hidrólisis del polisacárido fue de 6.5, evidenciando la capacidad
enzimática amilolítica del complejo enzimático obtenido. En este trabajo se
confirmó teoría antes mencionada y la capacidad de hongos del género
Aspergillus sp., para la producción de amilasas.

Producción de amilasas por medio de Aspergillus niger sumergidos en


cultivos de aguas de lavado de dos empresas alimentarias 4. El objeto de este
proyecto fue de analizar la producción de enzimas amilasas por cepas de
Aspergillus niger en aguas de lavado de industrias cerveceras y cárnicas para
determinar la capacidad de producción de proteasas, amilasa y de depuración de
medio donde crecen. La metodología aplicada se baso en la creación de un medio
de cultivo de aguas de lavado con aplicación de nutrientes que mejoren la
adaptación del agente. Se implementó pruebas de azucares, niveles de nitrógeno
y fosforo y demanda química de oxigeno (DQO). Se analizaron los parámetros de
producción de enzima, pH, temperatura y concentración de iones. Los resultaron
indican que los niveles de amilasa y proteasa obtenidos son marcadamente
dependientes de la concentración inicial de almidón en el medio de cultivo. Las
fuentes de nitrógeno (peptona, aminoácidos y extracto de levadura) fueron

4
SALAS H, Mabel; RODRIGUEZ R, Marilu; PEREZ G., Manuel; PEREZ R, Renato. Amylase production by
Aspergillus niger in submerged cultivation on two wastes from food industries. 05 de marzo de 2005. Journal of
Food Engineering.

6
totalmente influyentes en la producción de enzimas. El pH óptimo encontrado fue
de 4.95 en las amilasas y la temperatura fue de 50ºC.

Producción de amilasas de levaduras floculantes 5. Este proyecto desarrollado


en Pakistán se destino en la consecución de seis especies de levaduras
productoras de amilasas. Para analizar sus niveles de producción bajo el medio de
cultivo agar almidón y como fuente de carbono se agrego extracto de levadura,
almidón y una muestra se suplemento con amilasa salival. El medio estuvo
contenido de los nutrientes ideales para el crecimiento y adaptación del
microorganismo incubado a una temperatura de 25ºC., se realizaron pruebas de
producción de enzima, degradación de sustrato, turbidimetría y velocidad de
crecimiento. Del la metodología ejecutada se aislaron 3 cepas de levadura
correctamente. El mejor resultado se obtuvo en la cepa que trabajó con saliva
humana, produciendo 28 U/ml, la cual presentó una estabilidad en el rango de 25-
60ºC. Los niveles de las demás cepas fueron muy inferiores al registrado
anteriormente.

Detergente con formulación enzimática de amilasa obtenida de Aspergillus


niger. Un estudio comparativo en detergentes comerciales 6. El proyecto
manifiesta una problemática de la necesidad de compuestos naturales y eficaces
para la industria de detergentes. El presente articulo describe la producción,
purificación y parcial caracterización de un complejo de amilasa producido por A.
niger y uso potencial en formulación de detergentes. Se diseño un cultivo con
distintos microorganismos a la espera de conocer el agente que mejor resultados
otorgará en cuanto a producción de amilasa se refiere. Se trabajo con medio APM
usando residuos industriales de proteína de soy y almidón como fuente de
carbono además de minerales. Se realizaron ensayos analíticos con pruebas de
5
NAHVI, Iraj; EMTIAZI, Giti . Production of " Amylase by Flocculant Yeast. Pakistan Journal of Biological
Sciences. 2003
6
MITIDIERI, Sydnei; SOUZA, Anne; SCHRANK, Augusto, HENNING, Marilene. Enzymatic detergent
formulation containing amylase from Aspergillus niger: A comparative study with commercial detergent
formulations. Bioresource technology. 19 de agosto de 2005.

7
DNS, iodometría y control de los parámetros de pH y temperatura. El extracto
obtenido del complejo enzimático fue comparado en tres formulaciones
comerciales de detergentes para determinar su actividad de limpieza en
equipos de hospitales, cirugía y endoscopia. Los resultados indicaron
que el microorganismos con mejor performance en la producción de
amilasa fue el Aspergillus niger con una producción de 3.9 U/ml en
medio sumergido y una actividad excelente de degradación de en el
rango de 50-55ºC y un pH de 4.0.

3.2 Enzima amilasa: Acción y clasificación

Las amilasas son enzimas las cuales hidrolizan moléculas de almidón dando como
productos dextrinas y polímeros compuestos progresivamente por unidades de
glucosa7 Esta familia de enzimas hidrolíticas esta compuesta por a proteínas
catalíticas: alfa-amilasa, beta-amilasa; glucoamilasa; isoamilasa. Se encuentran
ampliamente distribuidas en tejidos vegetales, donde juegan un rol muy
importante en la degradación del almidón en la germinación de las semillas; en
tejidos animales, cumpliendo una misión digestiva; y en diversas especies de
microorganismos como hongos y bacterias8.

Como bien es conocido las cadenas de almidón están compuestas por dos
grandes sub-cadenas, amilosa y amilopectina. La alfa-amilasa se caracteriza por
atacar los enlaces 1,4-alfa-glicosídicos en el centro de la cadena de los
polisacáridos, por lo que se la conoce como endoamilasa, produciendo glucosa,
maltosa y oligosacáridos.

7
ASGHER M.; JAVAID M.; RAHMAN S.U; LEGGE R.L.; A thermostable a-amylase from a moderately
thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing. 29 de marzo de 2006. Journal of Food Enginnering. P
950

8
TRIPATHI Pallavi; LEGGIO, Leila; MANSFELD, Johanna; ULBRICH-HOFMANN, Renate; Kayastha, Arvind.
apha- amylase of mung bean (vigna radiata) correlation of biochemical properties and terciary structureby
homology modelling. 23 de mayo de 2007. Phytochemistry. p. 1623.

8
La enzima alfa-amilasa en su accionar degrada la amilosa en maltosa y
pequeños compuestos de glucosa. Sin embargo, esta enzima solo es capaz de
degradar parcialmente la amilopectina y el glucógeno debido a que no es capaz de
desdoblar los enlaces glicosidicos1-6 encontrados en los puntos de ramificación
de la cadena del polisacárido. Por otro lado, La beta-amilasa, presente en plantas
y bacterias, también cumple la función de degradar los enlaces 1,4-a-glucosídicos
pero comienza su acción por el extremo libre no reductor del almidón, liberando
maltosa al igual que la enzima alfa-amilasa. La hidrólisis se detiene en los puntos
de ramificación de la amilopectina y el residuo se conoce como dextrina límite. La
pululanasa o isoamilasa, también perteneciente a la esta familia, hidroliza los
enlaces 1,6-alfa-glicosídicos quitando las ramas de la amilopectina o las dextrinas.
Si existe un acompañamiento general del complejo de las amilasas se puede
9
lograr efectiva una degradación total del almidón.

En cuanto a la nomenclatura de las enzimas de la familia amilasa, mundialmente


se reconoce a la comisión enzimologica (E.C.) quien es el encargado de identificar
a todas y cada una de las enzimas existentes. Este instituto reconoce la enzima
alfa-Amilasa como E.C. 3.2.1.1. Su nombre sistemático es alfa-1,4-glucan-4-
glucanohidrolasa. Otros nombres comunes en el comercio y el ámbito científico
son glucogenasa y endoamilasa. Estas se caracterizan en llevar a cabo la reacción
de endohidrólisis que se sitúa de los enlaces 1,4-alfa-D-glucosidicos en
polisacáridos que contienen 3 o más enlaces 1,4-alfa-D-glucosidicos. Los grupos
reducidos son liberados en una configuración alfa. Este termino alfa, esta
relacionado con la configuración anomérica inicial de los grupos de azucares
liberados10.

9
CARRILLO Leonor. Microbiología Agrícola. 2003.Universidad Nacional de Salta. ISBN 987-9381-16-5
10
IUBMB, Enzyme Nomenclature. [en línea]. <http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/2.html>.
[consultado el 10 de febrero de 2008]

9
α-amilasa bacteriana (EC 3.2.1.1). La α-amilasa hidroliza el enlace glucosídicos
interno dando lugar a productos de bajo peso molecular, solubles y menos
viscosos, cuya ruptura está limitada por la presencia de los enlaces glucosídicos
a-1-6 en los puntos de ramificación de la molécula del almidón nativo
(amilopectina). Los productos de hidrólisis tienen configuración a en la glucosa del
extremo reductor. Se piensa que la enzima actúa por la acción combinada de los
grupos carboxilo e histidina del centro activo. Las a-amilasas obtenidas de Bacillus
subtilis var amyioliqítedaciens tienen un ion calcio fuertemente ligado por
molécula, que es necesario para la actividad de! enzima y que lo estabiliza en gran
medida frente a! calentamiento. Se utiliza como enzima soluble en tratamientos de
dos horas a 85 °C y pH 5,5-7 como una alternativa a la utilización de ácido
clorhídrico que produce excesivos compuestos coloreados y la formación de
productos de reversión. Debido a que los almidones de patata y de cereales
cerosos no pueden tratarse por gelatinización, se les somete a un proceso en dos
etapas, en el que se añade una segunda dosis de enzima y se continúa et
tratamiento hasta lograr el contenido deseado de glucosa 11.

La enzima Beta-amilasa es reconocida en la comisión enzimológica como E.C.


3.2.1.2., su nombre sistemático corresponde al de 1,4-alfa-D-glucan
maltohidrolasa. Su función es actuar en la reacción de hidrólisis de los enlaces
alfa-1,4-glucosidicos del almidón con inversión en la configuración del carbono 1
pasándolo de la configuración alfa a la beta; así como de remover las unidades de
maltosa continuas presentes en los terminales no-reductores de la cadena
polisacárida. Los grupos sulfihidrilos son esenciales para la actividad, por lo que la
12
enzima se inactiva por oxidación, por los metales pesados y sus sales. . Su
producto es beta-maltosa.

11
WISEMAN, Alan. Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza - España. 1985. p.319

12
CARRERA, Jorge; producción y aplicación de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de
biotecnología en el sector agropecuario y agroindustrial. p 11.

10
Beta-amilasa ha sido descrita como una proteína abundante la cual se puede
encontrar en grandes cantidades tanto en tejidos de almacenamiento de almidón y
órganos de plantas13. Muchos Cereales contienen también la enzima beta-amilasa
y alfa-amilasa aunque esta ultima en concentraciones menores, tan solo ocupa
aproximadamente 30% de contenido total de proteínas sintetizadas durante la
germinación. Estas dos amilasas pueden ser distinguidas una de otra, mediante el
punto de inactivación que presentan a un pH determinado. La enzima alfa-amilasa
es inactivada a un pH en el rango de 4.8 - 5.0. Mientras que a este mismo rango la
beta-amilasa es estable. La enzima E.C. 3.2.1.2., es inactivada en un pH alrededor
de 6.0-7.0, y en caso reciproco las alfa-amilasa son estables bajo estas
condiciones14.

Otra enzima perteneciente a esta peculiar familia es la Glucoamilasa también


reconocida como amiloglucosidasa. En la nomenclatura internacional esta
identificada como E.C.3.2.1.3., y su nombre sistemático es 1,4-alfa-D-glucano
glucohidrolasa. Su función es actuar en la reacción de hidrólisis en cadenas de
polisacáridos operando en los enlaces 1,4-alfa-D-glucosa que están de manera
residual después de haberse expuesto la cadena a la acción de alfa y beta
amilasa15. El principal producto final de la acción de la glucoamilasa sobre el
almidón es glucosa, lo que la diferencia claramente de la alfa y beta amilasas. La
enzima también produce pequeñas cantidades de oligosacáridos. La sacarificación
del almidón puede alcanzar hasta 96% de dextrosa. La acción de la enzima causa
inversión de la configuración, produciendo beta-glucosa. Las glucoamilasas son
inactivas sobre almidón nativo. Su actividad es máxima entre pH 4 y 5.5, y
13
OLIVEIRA Joao R; VIEIRA Adair; ZACZUK B. Priscila; CORDENUNSI Beatriz; MAINARDI Jana´ına A.;
PURGATTO Eduardo; LAJOLO Franco. Beta-amylase expression and starch degradation during banana
ripening. 10 de noviembre de 2005. Posthaverst Biology and Technology. p 41
14
OLUSANJO A. Isaac; NGACHI A. Edith; IHUOMA O. Florence. Comparative studies on a-amylases from
malted maize (Zea mays),millet (Eleusine coracana) and Sorghum (Sorghum. 5 de mayo de 2006.
Carbohyfrates Polymers. P 72.

15
IUBMB, Enzyme Nomenclature. [en línea]. <http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/2.html>.
[consultado el 10 de febrero de 2008]

11
temperatura alrededor de 55-65 0C. La rata de reacción cae rápidamente a
medida que disminuye el tamaño de la molécula de sustrato, siendo máxima sobre
almidones previamente sometidos a licuefacción 16.

Amiloglucosidasa (EC 3.2.1.3). Las amiloglucosidasas (glucoamilasa, a-amilasa o


a-1-4 glucohidrolasa) catalizan la etapa de hidrólisis de los enlaces α-1-4 del
almidón y los oligosacáridos, liberando moléculas de β-glucosa a partir del
extremo no reductor de la cadena. Los enlaces ramificados α-1-4 también se
hidrolizan, pero mucho mas lentamente, formándose un jarabe de glucosa, un
contenido de glucosa del 95 al 97 % en peso y de un 30 a un 5 % de oligosacá-
ridos grandes. El enzima es capaz de hidrolizar también, aunque lentamente, los
enlaces a-1-3. La glucosa formada se utiliza como jarabe o se cristaliza para
obtener glucosa pura sólida. La amiloglucosidasa se usa a gran escala en la in-
dustria de procesado del almidón en tanques discontinuos a 55-60 °C y pH de 4,5
y con períodos de incubación de 48-92 horas, para transformar las dextrinas
formadas por la a-amilasa en glucosa. El calcio la estabiliza frente a la desna-
turalización por el calor o los álcalis, y la hidrólisis puede llevarse a cabo fácil-
mente añadiendo el enzima soluble al almidón una vez que la a-amilasa ha rea-
lizado del 15 al 30 % de la hidrólisis posible 17.

Una ventaja particular en el uso de enzimas en lugar de HCl para la hidrólisis del
almidón es que puede utilizarse una materia prima menos pura, ya que las
proteínas contaminantes no se hidrolizan hasta aminoácidos, que podrían dar
lugar a reacciones de pardeamiento. Después de la sacarificación con
amiloglucosidasa, el jarabe resultante se filtra para eliminar proteínas y grasas y
se purifica con columnas de carbón activo seguido de otras con resinas de
intercambio iónico.

16
CARRERA, Jorge; producción y aplicación de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de
biotecnología en el sector agropecuario y agroindustrial. p 11

17
WISEMAN, Alan. Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza - España. 1985. p.320

12
La glucoamilasa es un enzima extracelular producido por diversas especies de
Aspergillus o Rhizopus. La amilogluosidasa de Rhizopus puede separarse en
isoenzimas con propiedades semejantes a los isoenzimas de A. niger. El enzima
es una glicoproteína que contiene mañosa, glucosa, galactosa y ácido urónico, y
tiene un pH óptimo de 4,3-4,5. Una de sus desventajas es su relativa falta de
actividad frente a los enlaces α-1-6, lo que hace necesario el uso de grandes dosis
o de grandes períodos de incubación para lograr el grado de hidrólisis deseado.
Por tanto, se ha propuesto el uso combinado de amiloglucosidasa y la enzima
desramificante pululanasa, logrando aumentos del contenido de dextrosa del 1 al 2
%, a pesar de llevar a cabo la reacción a pH 5,5-6,0, en el que la amiloglucosidasa
es menos activa18.

El resto de la cadena del polisacárido es atacado por la enzima isoamilasa o


pululasa, reconocida oficialmente como E.C. 3.2.1.68. Participa en la reacción de
hidrólisis de polisacáridos específicamente en los enlaces 1,6-alfa-D-glucosidicos;
su nombre sistemático es glucógeno alfa-1,6-glucoanohidrolasa. Su actuar es
directamente sobre la amilopectina, glucógeno y dextrinas, pero es incapaz de
hidrolizar el pululano y las alfa-dextrinas limite. Su misión en participar en la
reacción de hidrólisis de ramificación que contengan enlaces 1,6-alfa-glucosidicos
por lo que también se le conoce como enzimas desramificadora. Su nombre
sistemático es glucógeno 1,6-alfa-D-glucanohidrolasa 19. El único producto de
reacción es maltosa. La temperatura óptima está alrededor de 45 0C y el pH entre
4y5

3.3 Usos y aplicación de las enzimas

18
WISEMAN, Alan. Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza - España. 1985. p.320
19
IUBMB, Enzyme Nomenclature. [en línea]. <http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/2.html>.
[consultado el 10 de febrero de 2008]

13
Las enzimas vuelven los procesos eficientes y menos costosos, en muchos casos,
a que tienen un alto grado de especificidad y adaptabilidad (suaves condiciones de
trabajo). Además, lograr más material procesado con el mismo equipo y menos
consumo de energía también ahorra costos. Al utilizar enzimas en la industria
alimentaria nos ofrece la ventaja de:
 Reducir viscosidad (hidrólisis).
 Mejorar extracciones (degradación de pectina).
 Hacer bioconversiones (glucosa a fructosa).
 Causar separaciones (separación del suero en queso).
 Sustitución de ingredientes y coadyuvantes en procesos.
 Ahorro con procesos más eficientes obteniendo menos subproductos
indeseados y mayor capacidad de planta con un incremento de rendimiento de
producto.
 Ganancia: mejora propiedades deseables obteniendo un producto único
(jarabe de alta concentración de fructosa).20

Las enzimas amilasas por su capacidad hidrolítica han tenido gran significancia en
las últimas décadas en diversas industrias que han visto una mejor manera de
optimizar sus procesos aplicando técnicas biotecnológica extensivas basadas en
enzimas. Industrias como la panadería, repostería, alimentaria, textilera,
cervecera, papel, azucarera entre muchas más han visto en estas proteínas una
gran oportunidad de comercio. Las amilasas ocupan cerca de un 25% en el
mercado enzimático llegando a sustituir completamente procesos de hidrolisis
química en la industria del almidón. Esto se debe a una característica esencial
dentro de esta familia de proteínas. La termoestabilidad de esta enzima,
industrialmente, ha hecho que las amilasas tengan gran aplicabilidad en diversos
procesos.21

20
MUNDO ALIMENTARIO. Aplicación de las enzimas en la producción industrial. Consultado en:
http://www.alimentariaonline.com/apadmin/img/upload/MA002_enzimas4WSF.pdf. [consultado:10 de febrero
de 2008]
21
ASGHER M.; JAVAID M.; RAHMAN S.U; LEGGE R.L.; A thermostable a-amylase from a moderately
thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing. 29 de marzo de 2006. Journal of Food Enginnering. P
950.

14
3.4 Procesos industriales que aplican enzimas22

3.4.1 Industria del almidón y del azúcar. Dependiendo de las enzimas


utilizadas, a partir del almidón se pueden obtener jarabes de diferente composición
y propiedades físicas. Los jarabes se utilizan en una variedad de alimentos tales
como gaseosas, dulces, productos horneados, helados, salsas, alimentos para
bebés, frutas enlatadas, conservas. Hay tres etapas básicas en la conversión
enzimática del almidón: licuefacción, sacarificación e isomerización.

3.4.2 Productos Lácteos. La aplicación de enzimas en el procesamiento de


leche está bien establecida, por el uso del cuajo (quimosina) en la producción de
queso, que tal vez representa el empleo más antiguo de enzimas en alimentos.
Otras enzimas que participan en la producción de quesos son las lipasas
presentes en la leche, las cuales hidrolizan el componente graso, proporcionando
cambios característicos en el sabor. Para algunos quesos se pueden aumentar las
lipasas naturales, añadiendo enzima extra. Por otra parte, también se recomienda
agregar enzimas exógenas de tipo proteolítico para acelerar el proceso de
maduración de algunos quesos.
3.4.3 Molineros y Panadería. El uso de enzimas en estas industrias se debe
principalmente a la deficiencia en el trigo y en la harina, de las enzimas
naturalmente presentes. El contenido de a amilasa de la harina depende de las
condiciones de crecimiento y de cosecha. En climas húmedos la tendencia será a
tener alta actividad de a amilasa debido a germinación de los granos, en tanto que
en climas secos el nivel de a amilasa será bajo debido a escasa germinación. Esto
conlleva a grandes diferencias en el contenido de amilasa de diferentes lotes de
harina.

3.4.4 Transformación del almidón. 23Los procesos encaminados a la producción


de edulcorantes están basados en la degradación del almidón y han sido
22
CARRERA, Jorge; producción y aplicación de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de
biotecnología en el sector agropecuario y agroindustrial. p 13
23
GACESA, Peter; HUBBLE, John. Tecnologia de las enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza-España. 1990. p.111

15
empleados durante muchos años, aunque originalmente se llevaba a cabo
mediante hidrólisis catalizada por ácidos. Durante el curso del desarrollo y la
expansión de la transformación industrial del almidón, se ha producido un cambio
de la catálisis acida por el uso de enzimas. La elevada especificidad de estas
reacciones enzimáticas, acopladas con la gran actividad de las preparaciones
disponibles, ha permitido directamente el que pueda ser incrementada y además
la formación de derivados indeseables se ha minimizado.

De todas las aplicaciones a escala industrial, la más afortunada es la producción


de jarabe de maíz con fructosa elevada (HFCS). El propósito de este proceso es
obtener un material de poder edulcorante semejante a la sacarosa a partir de una
materia prima de bajo precio (almidón de maíz). Esta conversión requiere el uso
secuencial de tres enzimas. En primer lugar, el almidón (un polímero de la D-
glucosa) se degrada parcialmente, empleando alfa-amilasa microbial. Este
material es degradado posteriormente para rendir una solución donde el
carbohidrato presente está en forma de D-glucosa en una concentración del 94-96
%. La glucosa tiene algunas aplicaciones en las industrias de alimentación y
farmacéuticas, pero su uso está restringido debido a su solubilidad limitada a
concentraciones elevadas y a su bajo poder edulcorante comparado al de la
sacarosa. Por estas razones, la glucosa total obtenida se transforma en una
mezcla de glucosa y fructosa mediante el empleo de la enzima glucosa
isómerasasa.

3.4.5 Productoras de Jugos de Frutas.24 Las primeras enzimas empleadas en


las industrias de jugos de frutas fueron las enzimas pécticas para la clarificación
del jugo de manzana. Actualmente las enzimas pécticas se usan en el
procesamiento de muchas otras frutas, junto con amilasas y celulasas. Durante el
procesamiento de los jugos cuando se desintegran los tejidos vegetales, parte de

24
CARRERA, Jorge; producción y aplicación de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de
biotecnología en el sector agropecuario y agroindustrial. p 14

16
la pectina, que es un componente estructural de las frutas, pasa a la solución,
parte se satura con el jugo y parte permanece en las paredes celulares. Las
enzimas pécticas se usan para facilitar el prensado, la extracción del jugo y la
clarificación ayudando a la separación del precipitado floculante.

3.4.6 Fermentación Alcohólica25 El almidón proveniente de maíz, patatas,


cebada, yuca y otras fuentes debe someterse a un tratamiento previo con
hidrolasas, con objeto de producir su licuación y sacarificación, antes de hacerlo
fermentar mediante levaduras u otros organismos para obtener alcohol utilizable.
Estas enzimas son α y β amilasas y amiloglucosidasas, que pueden agregarse en
forma de malta (cebada germinada), aunque este proceso es caro. La malla no
sólo contiene α y β amilasas sino también enzimas que degradan los enlaces α-1-
6 de las dextrinas limite. Recientemente se han añadido enzimas bacterianas para
suplementar las enzimas endógenas asociadas con el almidón. Por ejemplo, en
los procesos discontinuos americanos para la producción de alcohol para bebidas,
la adición de a-amilasa bacteriana durante la cocción para hidrolizar parcialmente
el almidón gelatinizado representa una ventaja, puesto que reduce la viscosidad
de la mezcla facilitando su agitación y mezclado. Posteriormente, la mezcla se
enfría y después se añade a-amilasa bacteriana para continuar la hidrólisis, que se
completa mediante la adición de amiloglucosidasa. Después se inoculan en la
mezcla levaduras, de forma que continúe la sacarificación y fermentación
simultáneamente hasta el agotamiento de la dextrosa, y se destila el alcohol. La
producción comercial de alcohol industrial, destinado a usarse como carburante en
motores de combustión interna se ha incrementado rápidamente en las últimas
décadas, particularmente en Brasil, que lo obtiene de la fermentación de !a caña
de azúcar o de la yuca. También se ha propuesto el empleo de células
inmovilizadas. Se ha obtenido etanol a partir de melazas de caña diluidas, no
estériles, durante medio año.

25
WISEMAN, John. Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial acribia, Zaragoza – España. 1985. p.
335.

17
3.4.7 Industria Cervecera. La cebada se utiliza tradicionalmente para la
fabricación de bebidas alcohólicas como la cerveza. En su producción se deben
considerar dos operaciones distintas: la maltería y la cervecería. La preparación
de la malta se logra por germinación de la cebada, durante la cual se incrementa
el contenido de alfa-amilasa. Las enzimas alfa y beta amilasas naturalmente
presentes en el grano actúan sobre el almidón produciendo dextrinas y maltosa,
que sirven como sustratos para la fermentación posterior. La sacarosa es
hidrolizada por al enzima invertasa la cual queda divida en una molécula de
glucosa y una molécula de fructosa, ambas podrían ser asimiladas de forma
glucolitica. También las enzimas cumplen la función de transportar la maltosa y la
maltotriosa a las células de las levaduras para posteriormente ser convertidas en
glucosa por la maltasa26.

Otra aplicación patentada recientemente en industrias inglesas consiste en el uso


de la enzima α-acetolactato descarboxilasa, aislada de Enterobacter aerogenes.
Esta proteína es capaza de desintegrar o eliminar el α-acetolactato y α-
acetohidroxibutirato de la cerveza recién fermentada en 24 horas a 10 °C para de
este modo conseguir niveles de Diacetilo y 2,3-Pentanodiona por debajo de los
umbrales permitidos para productos de este tipo. Se consigue con ello grandes
ahorros.27

Hay muchas enzimas disponibles comercialmente para el proceso cervecero, pero


todas ellas caen en tres categorías: proteasas, amilasas y glucanasas. La acción
de estas enzimas durante las primeras etapas consiste en mejorar la licuefacción
del almidón, regular el contenido de azúcar y nitrógeno, mejorar la extracción,
facilitar la filtración y controlar la turbidez. En la filtración del mosto reducción de

26
CAMPBELL Sarah L.; The continuous brewering of beer [en línea] dsiponible en www.revistavirtualpro.com.
consultado 05 de noviembre de 2007.

27
CASTAÑE,F.X.; DAMM, S.A.. Los tanques cilindro.-conicos y el tiempo de guarda de la cervzeza. Industria
cervecera. [en linea]. Disponible en www.revistavirtualpro.com. Consultado el 7 de agosto de 2007.

18
las gomas y de la viscosidad. En la ebullición, control de la turbidez, eliminación
final del almidón. En esta etapa se inactivan las enzimas. Durante la fermentación
y maduración la adición de enzimas sirve para controlar la turbidez.

3.4.8 Procesamiento de Carne. Las enzimas importantes para ablandar carne


son proteasas de origen vegetal o de microorganismos (Bacillus subtilis y
Aspergillus oryzae). Las enzimas se inyectan antes del sacrificio al animal o se
trata la carne con las enzimas antes de cocerla, con lo que se logra un franco
ablandamiento sin provocar una proteólisis importante.

3.4.9 Industrias de Grasas y Aceites.28 El uso de enzimas en las industrias de


aceites y grasas es muy bajo, aunque se encuentran disponibles enzimas que
pueden resolver algunos problemas, por ejemplo minimizar los subproductos
indeseables. Las enzimas también se pueden usar para producir aceites y grasas
novedosas. Lipasas específicas, pueden seleccionar los ácidos grasos de algunas
posiciones del triglicérido, para incorporar determinados ácidos grasos, sin
cambiar los de otras posiciones. De tal manera que es posible modificar por
interesterificación el contenido de ácidos grasos, o por transesterificación lograr el
reordenamiento de algunos de ellos. Por ejemplo la mantequilla de cacao se
requiere en la producción de chocolate y con frecuencia la disponibilidad y el costo
fluctúan ampliamente. Sin embargo, aceites como el de palma son baratos y se
encuentra buen abastecimiento. Lo que se plantea es modificar el aceite de palma
por reacción con ácido esteárico mediante interesterificación enzimática. La grasa
resultante tiene propiedades similares a la mantequilla de cacao .

3.5 Producción y sustrato

Fuentes de enzimas. Las células microbianas son la fuente usual de enzimas


para uso industrial excepto para algunos enzimas provenientes de animales y
28
CARRERA, Jorge; producción y aplicación de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de
biotecnología en el sector agropecuario y agroindustrial. p 14

19
plantas utilizados tradicionalmente como las proteasas de la papaína, ficina y
bromelaina, que se utilizan para el ablandamiento de la carne, y la quimosina,
empleada en la manufactura del queso. La inmensa mayoría de los enzimas
microbianos se producen a partir de aproximadamente 25 organismos, incluyendo
una docena de hongos, pero se ha calculado que sólo aproximadamente el 2 ^o
de los microorganismos existentes en el mundo han sido estudiados como fuente
de enzimas29.

Tradicionalmente se han obtenido pocas enzimas de origen animal (lipasa


pancreática y tripsina) debido a que éstas pueden ser reemplazadas por otras
similares derivadas de microorganismos. Sin embargo, los sustitutos microbianos,
aunque catalíticamente eficaces, presentan sutiles diferencias en sus propiedades
que pueden ser cruciales en el proceso de su aplicación. Los recientes avances en
este campo han permitido la adaptación de las técnicas del ADN recombinante
para posibilitar que ciertos genes de mamíferos sean clonados en las bacterias o
levaduras idóneas, facilitando así la producción de enzimas originariamente de
animales por medio de la tecnología convencional de la fermentación.

Las plantas también han sido fuente tradicional de un cierto número de enzimas. A
partir del látex producido por la papaya, higuera, piña y, en menor grado, otras
especies se ha aislado sobre todo, cistein-proteinasas. Estas plantas tienen la
ventaja de que su látex es fácil de obtener, principalmente a partir de los frutos y
utilizando mano de obra no cualificada.

Las enzimas microbianas son más útiles que los derivados de las plantas o
animales por la gran variedad de actividades catalíticas de que disponen, y porque
usualmente pueden obtenerse en cantidades abundantes, baratos, de forma
regular y de calidad uniforme, ocasionalmente mediante cultivo de superficie o

29
WISEMAN, Alan. Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza - España. 1985.
p.281

20
usualmente mediante técnicas de fermentación aeróbica de cultivos profundos,
técnica muy utilizada en la producción de antibióticos. Además los enzimas
microbianos son en general más estables que los homólogos de las plantas o
animales, y su proceso de producción es más fácil y seguro que el seguido con
plantas y animales. La manipulación genética y ambiental para incrementar el
rendimiento, o la actividad enzimática de las células haciendo a éste de interés
constitutivo30. Estas técnicas son especialmente importantes en el caso de la
actividad o estabilidad del enzima que sea la etapa limitante en conversiones
multienzimas, cuando haya que eliminar los controles de regulación normales en
la síntesis de la enzima deseada, cuando se desea reducir o eliminar la inhibición
por el substrato o el producto, mecanismo este último para prevenir la
sobreproducción del producto de una vía metabólica, o para obtener algunas otras
características favorables31.

Generalmente el objetivo es maximizar la velocidad de formación del enzima y la


concentración de enzima en las células o en el caldo de fermentación para
minimizar los costos de producción de la enzima. El ideal es combinar de forma
óptima la cepa seleccionada de microorganismo, las condiciones de recuperación
y fermentación y el equipo más apropiado en buenas condiciones de traba jo.
Usualmente, las células crecen sumergidas, en fermentadores bien agitados y
aireados, aunque un número significativo de enzimas importantes industrialmente
se obtienen en fermentadores sólidos o semisólidos, entre los que se incluyen la
lactasa, la a-amilasa y una proteasa de A. oryzae, la pectinasa, una proteasa de
A. niger, la a-amilasa de Rhizopus, y el cuajo de Mucor pusiüus32.

Las plantas superiores no son generalmente fuentes satisfactorias de enzimas


para usos clínicos e industriales, y acumulan productos de desecho en las

30
GACESA, Peter; HUBBLE, John; Tecnología de las enzimas. Editorial acribia, Zaragoza – España. 1990. p.16.
31
WISEMAN, Alan; Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial acribia, Zaragoza – España. p.281
32
WISEMAN, John. Manual de biotecnologia de las enzimas. Editorial acribia, Zaragoza – España. 1985. p.282

21
vacuolas. Estos compuestos son frecuentemente inhibidores enzimáticos y/o to-
xinas, particularmente cuando se oxidan al contacto con el aire. Estos desechos,
muchos de los cuales son fenoles, se liberan al romperse la célula, contaminando
y frecuentemente inactivando cualquier enzima extraído.

Las hidrolasas son ampliamente utilizadas en los procesos industriales. Dentro de


ellas podemos encontrar las enzimas alfa-amilasa, beta-amilasa como las más
comunes para las síntesis del almidón produciendo productos de bajo peso
molécula. Estas enzimas son producidas, especialmente alfa-amilasa, por gran
diversidad de microorganismos, Producen amilasas muchos hongos del suelo así
como bacterias de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces entre otras.

El principal genero que esta siendo tratado para la producción de dicha enzima es
el bacillus. Las especies registradas como productoras de enzima en este genero
son el Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, y Bacillus
amyloliquefacien quienes son aplicados en procesos industriales para alimentos,
textiles, fermentación, papelería entre otros33.

También otros géneros han sido reportados en proyectos de investigación. La


especie Aspergillus produce una amplia variedad de enzimas extracelulares entre
las cuales además de estar las amilasas se puede identificar las proteasas.
Aspergillus rizhopus esta identificado como un gran productor de enzimas 34.

La inducción de amilasa tipo alfa requiere un sustrato que contenga enlaces alfa-
1,4 glucosídicos, además de maltosa, dextrina y almidón. La Glucosa, así como es
el producto final de la hidrolisis, tiene la posibilidad de reprimir la síntesis de
33
ZOE K, Maria. Coproduction of Alfa- amylase and beta-galatosidase by bacillus subtitulis in complex organic
substrates.20 de diciembre de 2005. Bioresource Technology..p 150.
34
SALAS H, Mabel; RODRIGUEZ R, Marilu; PEREZ G., Manuel; PEREZ R, Renato. Amylase production by
Aspergillus niger in submerged cultivation on two wastes from food industries. 05 de marzo de 2005. Journal of
Food Engineering. p 94.

22
enzima como un mecanismo conocido como represión catabolitica. Sin embargo,
se ha encontrado que algunos microorganismos en distintos sustratos que tienen
como fuente de carbono a los carbohidratos no inducen la producción de
amilasas35. Este hecho contrasta con los registrados en artículos de investigación
y compañías dedicadas a la producción de enzimas donde la fuente de producción
de las proteínas son microorganismos.

La producción industrial ha desarrollado técnicas de aprovechamiento de recursos


o residuos de producción de diversas industrias con el objeto de adquirir enzimas
utilizando sustratos de bajo costo, así como los desechos agrícolas. En años
recientes, se ha presentado un incremento en el esfuerzo y la aplicación eficiente
del bagazo de caña de azúcar como medio de producción. Este es un subproducto
agroindustrial de extensa cadenas celulósicas. Esta es una importante fuente de
carbono que ha sido empleada en los últimos años para la producción de enzimas
y a su ves la fermentación de azucares para la elaboración de etanol. Se ha
identificado que el microorganismo optimo para reproducirse en este medio y
sintetizar alfa-amilasa es el Bacillus subtilis36.

Los medios de cultivo han facilitado para los microorganismos el desarrollo de


enzimas con propiedades físico-químicas muy deseables. La producción de alfa-
amilasa puede darse en medio sumergido o en estado solido o por procedimientos
de fermentación. La concentración de metabolitos para el crecimiento de los
agentes microbiales es importante. Influye directamente la composición del medio

35
NAHAS Ely, WALDEMARIN Mirela M.; Control of amylase production and growth characteristics of
Aspergillus ochraceus . revista latinoamericana de microbiologia. Vol #1. Enero de 2002. p.5
36
RAJAGOPALAN Gobinath, KRISHNAN Chandraraj; a-Amylase production from catabolite derepressed
Bacillus subtilis KCC103 utilizing sugarcane bagasse hydrolysate 01 de junio de 2007. Bioresource
Techonology. p.2

23
así como las fuentes de carbono, de nitrógeno y el contenido de sales
inorgánicas37.

En cuanto a términos de aplicabilidad industrial, es necesario estudiar la


producción de enzimas y analizar el factor de termoestabilidad, ya que se ha
demostrado que la temperatura esta ligada directamente a la velocidad de
reacción de la enzima, menor viscosidad en el sustrato y disminución de la
contaminación microbiana. Los microorganismos apropiados para la producción de
enzimas deben tener ciertas propiedades como rapidez de crecimiento,
adaptación a nutrientes relativamente baratos y sin necesidad de inductores.
Además, se debe obtener un alto rendimiento de enzima, de forma que sea fácil
aislarlo, purificarlo y concentrarlo sin que se produzca la formación concomitante
de metabolitos tóxicos o inmunogénicos38.

También puede ser una estrategia útil la de seleccionar cepas que hiperproduzcan
enzimas a partir de organismos genéticamente modificados OMG que no tengan
necesidad de inductores debido a que sus centros represores están inactivos, a
que tienen una baja represión por los catabolitos, a que sufren retroinhibición o a
que tienen enzimas relativamente resistentes a la inhibición por el producto final.
De hecho, a pesar de los enormes avances obtenidos recientemente en el campo
de la ingeniería genética, las técnicas clásicas de selección de enzimas son
todavía muy productivas, particularmente cuando se estudian ambientes nuevos
y/o exóticos, para buscar células microbianas que desarrollen enzimas con
propiedades exepcionales. Entre ellos destacan los enzimas clorantes obtenidos a
partir de microorganismos marinos, y un enzima que produce un nuevo azúcar, la
isomatulosa, de forma muy productiva a partir de una bacteria patógena del
37
DJEKRIF-DAKHMOUCHE S.; GHERIBI-AOULMI Z; MERAIHI Z. BENNAMOUN L..Application of a
statistical design to the optimization of culture medium for a-amylase production by Aspergillus niger ATCC
16404 grown on orange waste power. 11 de marzo de 2005. Journal of Food Engineering. p 191

38
WISEMAN, Alan; Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial Acribia S.A. Zaragoza- España. 1985.
P.271

24
ruibarbo. Muy recientemente se han hecho descubrimientos más excepcionales si
cabe, por ejemplo, los microorganismos que crecen a unos 250 ºC en fuentes
volcánicas en aguas marinas profundas que poseen enzimas extremadamente
estables al calor, o un microorganismo del intestino de un gusano que perfora la
madera, que es capaz de degradar la celulosa y de fijar el nitrógeno 39.

En resumen, la mayoría de los enzimas empleados comúnmente en la industria


son de origen microbiano y se producen por fermentación sumergida aerobia
convencional, que permite un mayor control de las condiciones de crecimiento que
la fermentación en estado sólido. Se sabe mucho acerca de la selección de cepas
de organismos y condiciones de cultivo, aunque menos sobre la regulación de la
síntesis, degradación y secreción de la enzima por el organismo productor. Estas
enzimas son con frecuencia extracelulares, lo que facilita su aislamiento y
purificación.

4. Objetivos

4.1 General

Obtener amilasa microbiana por fermentación líquido para aplicación en procesos


agroindustriales de alcohol carburante a base de almidones.

4.2 Específicos

 Identificar microorganismos productores de enzimas amilasa mediante técnicas


de aislamiento microbiológicas

 Determinar la cinética del crecimiento de los microorganismos aislados


mediante fermentación en estado líquido.
39
WISEMAN, Alan; Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial Acribia S.A. Zaragoza- España. 1985.
P.272

25
 Comparar la actividad del complejo enzimático obtenido con respecto a la
actividad de una enzima comercial STARGEN 001.

5. Metodología Propuesta:

5.1 Aislamiento e identificación de los microorganismos

Los microorganismos serán obtenidos de chips de yuca expuestos a la intemperie


a contaminación ambiental, por un tiempo de entre 10 a 15 días. Para ello se
realizaran chip con grosores comprendido entre 1 y 15 mm. Y se dispondrán en
bandejas. Una vez obtenido el o los microorganismos que estén ejerciendo un
proceso degradativo de los chips, se pasaran a una solución con 10% de harina
de yuca, con agitación constante a 120 rpm, durante 5 días, al cabo del cual se
realizaran pruebas de azucares reductores, para determinar el o los
microorganismos con mayor capacidad de degradación, y se sembraran en medio
solido de YPS, para su purificación e identificación.

5.2.1 Medio Sólido de YPS (Yeast Peptone Soluble starch) . 40. De acuerdo con
distintos microorganismos presentes en la solución de yuca, se aislarán cada uno
de ellos de manera independiente y se colocaran en cajas de petri esterilizadas
sobre las que se servirá medio microbiológico YPS. Para descartar contaminación
ambiental, se sembraran 2 blancos con 1 ml de agua destilada estéril sobre medio
el mismo cultivo.

5.2.2 Medio para fermentación. Se preparan 700 ml, en un erlenmeyer de 1


Litro, de medio de cultivo YPS líquido. Conteniendo en (g/l): 0.5 de extracto de
levadura; KH2PO4, 10; (NH4)2SO4, 10.5; MgSO4 7H2O, 0.3; CaCl2, 0.5; FeSO4
7H2O, 0.013; MnSO4 7H2O, 0.004; ZnSO4 H2O, 0.004, CoCl 6H2O, 0.0067 y

40
ABU ,E.A. 1. ADO, S.A. JAMES, D. B.; Raw starch degrading amylase production by mixed culture of
Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisae grown on sorghum pomace. En: African Journal of
Biotechnology. Vol. 4 (8), pp. 785-790, August 2005.

26
harina de yuca al 1 10% como fuente de carbono, se Esterilizarán a 110°C durante
15 minutos y se colocarán en agitación orbital a 120 r.p.m por un periodo de 5
días.

El medio de cultivo para fomentación será inoculado con un complejo de dos


microorganismos aislados, utilizando 5 ml de solución del complejo microbial.

5.2.3 Cuantificación de Biomasa del complejo 41. Se hará determinación por el


método de peso seco y el método de proteínas.

 Peso Seco. Se tomaran una muestra de 3 ml cada 3 horas durante 5 días.


Las muestra de llevaran hasta peso seco constante en una estufa a 105
grados.

 Determinación de proteínas42. Se tomara 3 ml de medio cada 3 horas. El


proceso se llevará a cabo realizando choque térmico y centrifugado de las
muestras durante 10 minutos a 5000 rpm. El sobrenadante obtenido se le
determinara proteínas totales por el método de Biuret. Las muestras se
leerán a una longitud de onda de 550 nm. Los datos obtenidos se
compararan con una curva patrón de BSA, para determinar la
concentración de proteínas presentes en la muestra.

5.2.4 Medición de producto43. Se tomarán 3 ml del medio de cultivo, cada 3


horas durante 5 días y se realizará prueba de azucares reductores con 3,5 acido
dinitrosalicílico, las lecturas se harán a 540 nm, para glucosa y a 520 nm para

41
KONSOULA Zoe, LIAKOPOULOU-KYRIAKIDES Maria. Co-production of a-amylase and b-galactosidase by
Bacillus subtilis in complex organic substrates. Bioresource Technology. 20 de diciembre de 2005. p. 152
42
SHEWALE Satish D.; PANDIT Aniruddha B. Hydrolysis of soluble starch using Bacillus licheniformis a-
amylase immobilized on superporous CELBEADS. 28 de febrero de 2007. p. 998
43
ASGHER M., JAVAID M. A thermostable a-amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain
for starch processing. Jornal Of Food Engineering. 29 de marzo de 2006. p.951

27
maltosa, los datos obtenidos se comparan con curvas patrones de glucosa y
maltosa respectivamente.

5.2.5 Medición de sustrato44. Se tomaran 3 ml de muestra de la fermentación


cada 3 horas, a las cuales se le se agregan del reactivo yoduro-yodato y se
realizaran lecturas de absorbancia a una longitud de onda de 620 nm. Los datos
se compararan con la curva estándar preparada con harina de yuca para
determinar la concentración presente de sustrato en la muestra.

5.2.6 Curva de Calibración para proteína. Se harán determinaciones de


proteínas partiendo de una proteína conocida (Albúmina del suero Bovino o BSA
de Sigma). Para ello se preparara una solución estándar de BSA al 0,5 % y se
diluirán como se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3. Diluciones para la construcción de la curva de calibración para Biuret.


Se Tubos
1 2 3 4 5 6
Solución (ml)
Biuret 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0
Solución Estándar BSA 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0
H2O 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
mezcla bien, y se deja reposar por 30 minutos, para leer en el a una λ. = 550 nm

5.2.7 Curva de Calibración para Maltosa y Glucosa. Se establecerá una curva


con D-Maltosa y otra con D-glucosa, para convertir las lecturas de absorbancia de
las muestras de fermentación a unidades de actividad enzimática de la amilasa,
es decir, la liberación de un micromoles de azúcar reductor, calculado como
maltosa o glucosa por minuto bajo las condiciones del ensayo (ver Tabla 4).

Tabla 4. Diluciones para la construcción de la curva de calibración para Maltosa.

44
CHERRY H.M.; HOSSAIN Towhid; ANWAR M.N. Extracellular Glucoamylase from the Isolate Aspergillus fumigates.
Pakistan Journal of Biological Sciences. 2004. p. 1989.

28
Tubos
1 2 3 4 5 6
Solución (ml)
DNS 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Solución Estándar Maltosa o Glucosa al 0,5% 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
H2O 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0

A las solución de D-maltosa y D-glucosa se les adicionara DNS y se pondrán en


agua hirviendo por 5 minutos, se deja reposar, y se le agrega agua hasta
completar 10 ml según la tabla, las lecturas se realizaran a λ = 520 nm para
maltosa y a 540 nm para glucosa

El complejo enzimáticos obtenido en cada muestra en los diferentes días, se


leerán a la misma longitud de onda que las curvas de calibración. Para ello se
realizaran 3 repeticiones para cada muestra, tanto para determinar maltosas,
glucosas y proteínas.

5.2.8 Cinética del complejo enzimático. El comportamiento enzimático del


complejo obtenido por la fermentación líquida se comparara con el complejo
comercial de amilasa (stargen 001), determinando los factores que afectan la
acción catalítica del complejo de amilasas, analizándolos bajo un modelo
superficie de respuesta, con diseño compuesto central: 2^3 + principal, de
acuerdo con los niveles y factores mostrados en la tabla 5. Los datos obtenidos se
analizaran con el software estadístico Statgraphics versión 5.1

Tabla 5. Factores y niveles para evaluar la actividad enzimática

Niveles
Factores Unidades
Inferior Superior
Dosis ml de caldo enzimático/g de pulpa base seca 0.5 1.0
pH Adimensional 4 5.5
Temperatura ºC 30.0 50

6. Resultados Esperados

29
La base del estudio, análisis, desarrollo y aplicación de este proyecto es producir
un complejo de enzimas amilasas a partir de hongos, con el objeto de determinar
la aplicabilidad de dichas proteínas en los procesos agroindustriales del
departamento. Este complejo servirá como base para la planeación de muchos
procedimientos industriales como la hidrólisis del almidón, el cual presenta
elevados costos en las empresas del departamento de Córdoba, especialmente
plantas de biocarburantes.

7. Estrategia Comunicación:

Los resultados de este proyecto serán editados mediante formatos de informes o


trabajos de investigación en revistas y ponencias en encuentros de investigacion.
Además,

8. Estrategias con el medio

A través de conferencias, foros y/o ponencias institucionales internas y/o externas,


es un medio apto para la promulgación del objeto, método, resultados y alcance
del estudio de este proyecto. Bajo este concepto, se desea divulgar el propósito de
llevar a cabo este proyecto y a su vez demostrar la realidad de los efectos que
traería consigo aplicarlo en escala industrial.

9. Cronograma de actividades

Tiempo Meses
Actividad
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Recopilación de bibliografía
Tajado de chips de yuca y selección
de lugar para contaminación
microbial
Aislamiento e Identificación de
microorganismos

30
Preparación de los medios de
cultivo solido y liquido
Muestreo y análisis del medio
Estudio de la cinética
Comparación de cinética con
STARGEN 001
Interpretación de los resultados
Publicación de informe final

31
10. Bibliografía

 ABU, E.A. 1. ADO, S.A. JAMES, D. B.; Raw starch degrading amylase
production by mixed culture of Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisae
grown on sorghum pomace. En: African Journal of Biotechnology. Vol. 4 (8),
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amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for starch
processing. 29 de marzo de 2006. Journal of Food Engineering.

 CAMPBELL Sarah L.; The continuous brewering of beer [en línea] dsiponible
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 CARRERA, Jorge; producción y aplicación de las enzimas industriales. 28 de


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Bioresource Technology

11. Usuarios Directos e Indirectos

Entre los interesados en los resultados de este proyecto se encuentran:


 Plantas de alcohol carburante
 Grupos y centros de investigaciones

12. Posibles Pares Evaluadores

Nombres y Cargo Institución Teléfono


Apellidos

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D. Presupuesto

Tabla 1. PRESUPUESTO GLOBAL DE LA PROPUESTA POR FUENTES DE FINANCIACION

FUENTES
RUBROS Facultad de Ingeniería Patrocinador TOTAL
Agroindustrial
PERSONAL $ 12.398.400 $ 12.398.400
EQUIPO $ 1.480.000 $ 30.864.040 $ 32.344.040
MATERIALES $ 2.453.841 $ 2.453.841
VIAJES
BIBLIOGRAFIA *
SOFTWARE
PUBLICACIONES*
SERVICIOS TECNICOS
CONSTRUCCIONES
MANTENIMIENTO
ADMINISTRACION
OTROS*
TOTAL $ 47.196.281

Tabla 2. PRESUPUESTO GLOBAL DE LA PROPUESTA POR VIGENCIAS

RUBROS AÑO 1 AÑO 2 AÑO 3 TOTAL


PERSONAL $ 12.398.400 $ 12.398.400
EQUIPO $ 32.344.040 $ 32.344.040
MATERIALES $ 2.453.841 $ 2.453.841
VIAJES
BIBLIOGRAFIA
SOFTWARE
PUBLICACIONES
SERVICIOS TECNICOS
CONSTRUCCIONES
MANTENIMIENTO
ADMINISTRACION
OTROS
TOTAL $ 47.196.281

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Tabla 3. DESCRIPCION DE LOS GASTOS DE PERSONAL

Participante DEDICACION DEDICACION RECURSOS(en pesos colombianos)


FORMACION FUNCION TOTAL
Nombre HORAS No. MESES FUENTE 1
Eder Durango
Ballesteros
MsC. Biotecnología Investigador Principal 4. 12 Fac.de Ing. Agroindustrial $ 4.665.600
Alfonso Bautista
Jiménez
MsC. Microbiología Coinvestigador 2. 5 Fac. de Ing. Agroindustrial $ 972.000
Esp, Ing. De
Ibeth Cepeda Jiménez
alimentos.
Coinvestigador 2. 5 Fac. de Ing. Agroindustrial $ 972.000
Héctor Tobón Guzmán Ing. Agroindustrial Auxiliar 6. 12 Fac. de Ing. Agroindustrial $ 5.788.800
TOTAL $ 12.398.400

Tabla 4. DESCRIPCION DE LOS EQUIPOS QUE PLANEA ADQUIRIR

RECURSOS
EQUIPO JUSTIFICACION TOTAL
Patrocinador
Plancha de calentamiento marca schott - modelo slk2- con X
Preparación de muestras y pruebas de análisis
placa en cerámica $ 620.000
Termómetro digital Censar temperatura de las muestras X $ 863.040
Espectrofotómetro Análisis y determinación de compuestos en muestra X $ 25.000.000
Nevera-congelador de 9 pies Conservación de muestras X $ 700.000
Cronometro digital. Cassio modelo hs-3 Control de tiempo en las pruebas X $ 81.000
Agitador magnetico Homogenización y preparación de medios X $ 2.100.000
Refractómetro digital portátil Medición de alcohol X $ 1.500.000
TOTAL $ 30.864.040

Tabla 5. DESCRIPCION DE LOS EQUIPOS QUE PLANEA UTILIZAR

UNIDAD(ES) A LA Horas de
Valor
EQUIPO JUSTIFICACION CUAL PERTENECE asignación al Valor total
hora
EL EQUIPO proyecto
Agitador orbital Agitación de los medios de cultivo Lab. De biotecnología 8 $ 800.000
Centrífuga eba20 Separación de sólidos Lab. De biotecnología 2 $ 280.000
pHmetro Medición de ph de las muestras y soluciones Lab. De biotecnología 1 $ 150.000
Balanza analitica Pesaje de reactivos para soluciones Lab. De biotecnología 2 $ 250.000
TOTAL $ 1.480.000
Tabla 6. DESCRIPCIONDE LOS MATERIALES A UTILIZAR

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RECURSOS
TOTAL
MATERIAL JUSTIFICACION Unidades
Patrocinador
Académicas
Erlenmeyer 250 ml Recipiente para cultivos $ 2.900,00 $ 2.900,00
Erlenmeyer 600 ml Recipiente para cultivos $ 4.060,00 $ 4.060,00
Erlenmeyer 1000 ml Recipiente para cultivos $ 348,00 $ 348,00
Transferpipetas de 100 a 1000 Control de muestras tomadas $ 2.320,00 $ 2.320,00
Preparación de estándares para curvas
$ 389.760 $ 389.760
glucosa anhidra (500g) de calibración
Preparación de estándares para curvas
$ 121.800 $ 121.800
maltosa (100g) de calibración
Preparación de estándares para curvas
$ 136.787 $ 136.787
BSA (500G) de calibración
Multiplicación y aislamiento de
$ 206.480 $ 206.480
agar pda microorganismos
extracto de levadura (500g) Suplemento para el medio de cultivo $ 215.667 $ 215.667
sulfato acido de potasio(250g) Suplemento para el medio de cultivo $ 275.500 $ 275.500
sulfato de magnesio heptahidratado(500g) Suplemento para el medio de cultivo $ 313.200 $ 313.200
sulfato de manganeso tetrahidratado(100g) Suplemento para el medio de cultivo $ 53.522 $ 53.522
sulfato de zinc monohidratado(500g) Suplemento para el medio de cultivo $ 266.800 $ 266.800
sulfato de hierro heptahidratado(500g) Suplemento para el medio de cultivo $ 232.000 $ 232.000
cloruro de cobalto hexahidratado(125g) Suplemento para el medio de cultivo $ 143.376 $ 143.376
sulfato de amonio(1kg) Suplemento para el medio de cultivo $ 89.320 $ 89.320
TOTAL $ 2.453.841

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