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ALTEZZA DEL PICCO

L’altezza del picco può essere utilizzata come un’indicazione della quantità di ciascun componente presente nel campione.

Vantaggi: semplicità e velocità di calcolo

Svantaggi: tendenza a variare l’altezza se le condizioni cromatografiche variano, e la perdita di informazioni che si ha quando picchi di grosse

dimensioni vanno fuori scala.

AREA del PICCO

L’area del picco viene più comunemente utilizzata per l’analisi quantitativa, attraverso l’uso di integratori è possibile seguire continuamente l’intensità del segnale in funzione del tempo, determinando in tal modo l’area sottesa dalla curva delineata dal cromatogramma.

Altezza vs Area

Altezza vs Area
Area vs altezza
Area vs altezza

Interpretazione quantitativa di un

cromatogramma

Un aspetto importante da considerare è che in genere i

composti non rispondono allo stesso modo al rivelatore (coefficiente di estinzione, assorbività), ciò significa che le altezze dei picchi, ma anche le aree, non possono essere usati in sé e per sé per una valutazione quantitativa, ma si devono impiegare dei mezzi per correggere o standardizzare questi valori.

Dopo aver

ottenuto l’area dei singoli picchi,

il passo

successivo è quello di stabilire la quantità o la

concentrazione di ciascun componente del campione

y n y i y 1 x 1 x i x n n n  x
y
n
y
i
y
1
x 1
x i
x n
n
n
x
y
i
i
i  1
i  1
x 
y 
n
n
a  y  b x

i=1 ,…, n

n = n° di punti sperimentali = n° di campioni standard

retta: y=a+ b x

y n y i y 0 y 1 x x 1 x i x n
y
n
y
i
y
0
y 1
x
x 1
x i
x n

0

CORRELAZIONE

COEFFICIENTE DI CORRELAZIONE

x

i

x



y

i

y

R

i

 

i

x

i

x

2

 

 

 

 

i

y

i

y

2

 

1/ 2

Il coefficiente di correlazione quantifica la bontà dell’adattamento dei

punti sperimentali alla retta di regressione:

tale adattamento è tanto migliore quanto più

R

è vicino a 1

Tale coefficiente NON DICE NULLA sulla linearità, cioè sul fatto che la

migliore curva fittante sia o meno una retta

Altezza per larghezza a metà altezza

Area = h. wh , l’area calcolata è 93.9% dell’area

teoreticamente vera

Triangolazione

Area del picco calcolata su triangolo costruito dalle

tangenti è 96.8% dell’area vera Area = h . Wb / 2 è pari al 79.8% dell’area vera.

Integrazione ponderale

Planimetro

INTEGRAZIONE PONDERALE

INTEGRAZIONE PONDERALE

PLANIMETRO

PLANIMETRO

CALIBRAZIONE E STANDARDIZZAZIONE Trasformare il segnale in concentrazione

Metodo dell’area percentuale

Normalizzazione interna

Metodo dello standard esterno

Metodo dello standard interno

Metodo delle aggiunte

Area percentuale
Area percentuale

Calcolare l’area totale di tutti i picchi presenti e assumere:

Ciascun componente produce un picco

concentrazione

La risposta del rivelatore non è dipendente dalla

Il picco del solvente, se presente, è ignorato

METODO DELL’AREA PERCENTUALE

Stima della composizione percentuale di miscele semplici

Ai Ci  100 At
Ai
Ci  100
At

C i = Concentrazione dell’i-esimo componente

A i = Area del picco dell’i-esimo componente

A T =

A i , i = 1, 2, …, i, …, n

IPOTESI FONDAMENTALE

L’uso del

metodo

dell’area

%

è limitato

a miscele

di

sostanze che hanno fattori di risposta uguali tra loro nella matrice in esame

Miscela di 3 componenti alle concentrazioni C 1 , C 2 e C 3

che determinano le aree A 1 , A 2 e A 3 .

I tre componenti hanno fattore di risposta, f R = A 1 / C 1 = A 2 / C 2 = A 3 / C 3

Se

A T =

A 1 + A 2 + A 3 = ( f R x C 1 ) + ( f R x C 2 ) + ( f R x C 3 ) = f R x ( C 1 + C 2 + C 3 )

allora

IPOTESI FONDAMENTALE L’uso del metodo dell’area % è limitato a miscele di sostanze che hanno fattori
IPOTESI FONDAMENTALE L’uso del metodo dell’area % è limitato a miscele di sostanze che hanno fattori

A 1 / A T = f R x C 1 / f R (

C 1 + C 2 + C 3 ) = C 1 / ( C 1 + C 2 + C 3 )

ossia

100 x ( A 1 / A T ) = C 1 %

METODO DELL’AREA PERCENTUALE

Vantaggi: semplicità e rapidità.

Limite: si fonda sull’ipotesi che il fattore di risposta di ciascun componente della miscela sia uguale.

Applicato nell’analisi di routine merceologica e di prodotti

industriali.

Pressoché inutilizzato nelle analisi chimico-tossicologiche.

Normalizzazione interna

Fattore di risposta Determina la reale risposta dei componenti del campione per unità di Concentrazione

Risposta del rivelatore f = concentrazione/area

Ci % = 100 Aifi / Σ (Ai fi)

Fattore di risposta: esempio

Un campione contiene X, Y e Z.

Lo standard contiene 200 mg di ciascun analita in 100 mL di

un appropriato solvente. Le concentrazioni corrispondenti ( C%) sono calcolate usando

la relazione

f1 A1 + f2 A2 + f3 A3 = Σ A f C % = 100 Axfx / Σ A f iniettando 5 μL di soluzione standard si ottengono i seguenti

valori in counts di area X = 238 Si assume Z come riferimento Y = 660

Z = 1190

il fattore di risposta per X fx = 1190 / 238 = 5.0

Fattore di risposta: esempio

Un campione incognito mostra i seguenti valori di aree X = 90 Y = 265 Z = 460 si moltiplica il valore di ciascuna area per il relativo f e si calcola

l’intera area corretta

X = 90 x 5.0 = 450

Y = 265 x 1.8 = 477

Z = 460 x 1.0 = 460 area totale = 1387

X% = 100 (450 / 1387) = 32.4 Y% = 100 (477 / 1387) = 34.4 X% = 100 (460 / 1387) = 33.2

METODO DELLO STANDARD ESTERNO

Si preparano soluzioni a concentrazioni scalari con il composto di riferimento per l’analisi (soluzioni standard)

Le soluzioni standard sono analizzate come il campione • Si calcola la concentrazione dell’analita nel campione

attraverso un’equazione lineare

Cc : Cs  Ac : As Cc  Ac  Cs As Cs  fattore
Cc
: Cs
Ac : As
Cc
Ac  Cs
As
Cs
 fattore di risposta
As

As

mCs

q

Cc

Ac q m

/

q=0

METODO DELLO STANDARD ESTERNO • Si preparano soluzioni a concentrazioni scalari con il composto di riferimento

Standard esterno

Standard esterno

OSSERVAZIONI

L’ipotesi su cui si fonda il metodo dello standard esterno è che l’analita dia la medesima risposta per unità di concentrazione

nel campione e nelle soluzioni standard

OSSERVAZIONI L’ipotesi su cui si fonda il metodo dello standard esterno è che l’analita dia la

Soluzioni standard che hanno concentrazioni vicine a quelle dei

campioni da analizzare

Si preparano soluzioni standard nella stessa matrice in cui si presenta il campione

L’intervallo di concentrazioni studiato contiene le concentrazioni dei

campioni

Il metodo di preparazione dei campioni non prevede la

trasformazione chimica della natura del campione

Anche l’uso di un solo punto di taratura può essere giustificato dal momento che nelle esecuzioni del controllo di qualità è improbabile trovare che il contenuto della formulazione vari

più di un ±10% rispetto al valore stabilito

Non si tiene conto del volume iniettato perché è identico

in tutte le analisi (loop)

Richiede che l’iniezione sia riproducibile

METODO DELLO STANDARD INTERNO

Si preparano soluzioni a concentrazioni scalari con il composto di riferimento per l’analisi (soluzioni standard)

Si aggiunge a queste soluzioni ed al campione la stessa quantità di standard interno

Le soluzioni standard sono analizzate come il campione • Si calcola la concentrazione dell’analita nel campione attraverso un’equazione lineare

As Cs  m  q Asi Csi   Ac   Cc  
As
Cs
m
 q
Asi
Csi
Ac
Cc 
 q
/
m
Csi
q=0
Asi
q=0
q=0
Cc : Csi  Ac : Asi Ac  Csi Cc  Asi
Cc
:
Csi
Ac
:
Asi
Ac
Csi
Cc 
Asi

La retta di taratura si costruisce riportando il rapporto tra il segnale (Sx) dell’analita e il segnale (Sz) dello standard in funzione del rapporto tra x e z.

S x S z
S
x
S
z

x

z

S

x

S

z

 

a

b

x

z

Standard interno

Standard interno

OSSERVAZIONI

L’ipotesi su cui si fonda il metodo dello standard interno è che l’analita NON dia la medesima risposta nel campione e nelle soluzioni standard

Lo standard interno è aggiunto per correggere tale errore

OSSERVAZIONI L’ipotesi su cui si fonda il metodo dello standard interno è che l’analita NON dia

L’uso del metodo dello standard interno è indicato in tutti i

casi in cui il metodo di preparazione del campione prevede la trasformazione chimica della natura del

campione o una complessa manipolazione dello stesso

Valgono per il metodo della standardizzazione interna tutte le osservazioni fatte nel caso del metodo dello standard esterno e cioè:

Soluzioni standard che hanno concentrazioni vicine a quelle dei campioni da analizzare

L’intervallo di concentrazioni studiato contiene le concentrazioni dei

campioni

LIMITI DEL METODO DELLO STANDARD INTERNO

Requisiti dello standard interno:

  • Molecola strutturalmente simile all’analita

  • Comportamento chimico simile all’analita

  • Risolto da tutti i composti nel tracciato cromatografico

  • Non presente nel campione

  • Stabile ed inerte nelle condizioni di analisi

  • Facilmente reperibile

METODO DELLE AGGIUNTE

Si

opera

come

nel

metodo

dello

standard

esterno

ma

aggiungendo quantità scalari di standard al campione in

esame.

 

Si trasla nell’origine la retta ottenuta, e si calcola la concentrazione iniziale dell’analita ponendo q=risposta della concentrazione iniziale dell’analita nel campione.

a x  E b S A S X 0 O E x O S C
a
x
E
b
S A
S X
0
O E
x
O S
C A
E

VERIFICA DELL’EFFETTO-MATRICE mediante metodo delle aggiunte standard

1: retta delle aggiunte standard 2: retta ottenuta col metodo della retta di taratura in caso
1: retta delle aggiunte standard
2: retta ottenuta col metodo della retta di taratura in caso
di
assenza di effetto matrice
3: retta ottenuta col metodo della retta di taratura in caso
1
di
presenza di effetto matrice
3
2

Si usa per escludere l’assegnazione di un picco

cromatografico ad una determinata sostanza

Al campione in cui si vuole escludere la presenza

della sostanza X si aggiunge una concentrazione nota

del composto X stesso

La presenza di X si esclude (al di sopra di una certa

concentrazione), se l’analisi cromatografica separa il

picco X dal picco incognito)