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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS


Ingeniería Bioquímica
Hidrolisis de una proteína y ensayos para proteínas y aminoácidos

Resumen
Se llevó acabo la hidrolisis de una proteína así como su identificación, para ello se prepararon cuatro soluciones la A que
fue a reflujo con grenetina, B que es la solución A neutralizada con NaOH, la C grenetina con agua destilada y la D la
albumina (clara de huevo) con agua, procediendo a la identificación de aminoácidos con: reacción Xantoproteica,
reacción de precipitación, reacción de Biuret, reacción de nihidrina, reacción de ácido nitroso, acción reguladora de
aminoácidos y cromatografía en placa fina.

Introducción
Las proteínas son biopolímeros de los α-aminoácido, péptido se le llama residuo. Un polipéptido es un péptido
llamados así debido a que el grupo amino esta enlazado al que contiene muchos residuos de aminoácidos pero por lo
átomo de carbono α adyacente al grupo carbonilo. Las general tiene una masa molecular de alrededor de 5000.
propiedades físicas y químicas de una proteína están Las proteínas contienen más unidades de aminoácidos, con
determinadas por los aminoácidos que la constituyen. Las masas moleculares que van de alrededor de 6000 a
subunidades individuales de los aminoácidos se unen por 40000000.
medio de enlaces de amida llamados enlaces peptídicos.
Niveles de estructura de la proteína:
El termino aminoácido podría significar cualquier molécula *estructura primaria: estructura enlazada de manera
que contenga un grupo amino y cualquier tipo de grupo covalente de la molécula, esta incluye la secuencia de los
acido; sin embargo, el termino casi siempre se usa para aminoácidos.
referirse a un ácido carboxílico α-amino. *estructura secundaria: tienden a formar arreglos
ordenados enlazados por puentes de hidrogeno.
Un péptido es un compuesto que contiene dos o más *estructura terciaria: incluye todas las estructuras
aminoácidos unidos por medio de enlaces de amida entre secundarias y todos los dobleces y plegados entre ellas.
el grupo amino de cada aminoácido y el grupo carboxilo del *estructura cuaternaria: a la asociación de dos o más
aminoácido vecino. A cada unidad de aminoácido en el cadenas de péptidos en la proteína completa.

Discusión de resultados

Se pudieron identificar distintos aminoácidos presentes en


las proteínas siguientes por medio de reacciones de
identificación:
Esquema 1. Hidrólisis de una proteína
1. Hidrolisis de una proteína (Solución A):
2. Solución neutralizada de hidrolizado de
En un matraz se colocaron 200mL, 1g de grenetina ,10mL Grenetina (Solución B):
de HCl concentrado y 10mL de agua destilada, se colocó a
reflujo y calentamos durante 35 minutos, obteniendo una Para la neutralización de la proteína, se colocaron 5mL de
solución por a la cual se le añadió un poco de carbón la grenetina hidrolizada y NaOH al 10%, hasta obtener un
activado para eliminar estas trazas de olor y color se pH de 7(neutro), lo cual se verifico con ayuda de papel pH,
calentó a ebullición por 2 minutos posteriormente se filtró la obteniendo nuestro compuesto llamado zwitterión que es un
solución, obteniendo la solución “A”, (grenetina hidrolizada). aminoácido estabilizado por una carga positiva y una
Posteriormente se realizaron las pruebas de identificaron negativa (Ver esquema 2).
para conocer los aminoácidos de nuestra solución A. La
reacción de hidrolisis de nuestra proteína fue la siguiente.

Esquema 2. Grenetina hidrolizada neutra


La reacción de Biuret es un método general para la
determinación de proteínas o péptidos, se basa en la
3. Solución de Grenetina sin Hidrolizar (Solución C): reacción del sulfato de cobre con compuestos que tengan 2
o más enlaces peptídicos, en un medio alcalino. El producto
En un vaso de precipitados añadimos 0.5g de grenetina y
es un complejo color violeta, cuya intensidad depende la
20mL de agua destilada y se agitamos vigorosamente,
cantidad de enlaces peptídicos presentes. Los di péptidos y
hasta disolución total. Con lo cual se obtuvo nuestra
grenetina desnaturalizada.

4. Solución de Albúmina (Solución D):

Se agito la clara de huevo por 10 segundos, se le agrego


50mL de agua, agitamos y filtramos la solución. aminoácidos dan esta prueba negativa.
(Desnaturalización). Posteriormente se realizaron las
pruebas de identificación de aminoácidos que poseían Esquema 3. Reacción Biuret
nuestras proteínas de grenetina y de albumina
En nuestro caso la prueba dio positiva en la solución C y D,
I. Reacción Xantoproteíca: solo en presencia de hidróxido de sodio, por lo tanto las
soluciones C y D tienen enlaces peptídicos.
Los aminoácidos aromáticos como la tirosina, el triptófano
y la fenilalanina presentes en las proteínas dan un IV. Reacción con ninhidrina
precipitado de color amarillo cuando son calentados con
HNO3 concentrado. Con adición de un medio alcalino, el Cuando la ninhidrina reacciona con un aminoácido uno de
precipitado se vuelve naranja debido a la nitración del anillo los productos es un anión violeta obscuro estabilizado por
aromático. La reacción solo dio positiva a la solución D ya resonancia llamado purpura de Ruhemann. La ninhidrina
que esta proteína (albumina de huevo) cuenta con tirosina, produce este mismo colorante purpura sin importan la
triptófano y fenilalanina en su estructura. Mientras que la estructura del aminoácido original, por lo tanto, va identificar
solución A (grenetina) solo tiene trazas de tirosina y aminoácidos libres primarios, como resultado nuestra
fenilalanina, pero carece de triptófano. solución B y patrón tomaron una tonalidad violeta.

II. Reacción de Precipitación: V. Reacción con ácido nitroso

El enlace disulfuro es un enlace covalente que se produce Esta reacción determino la cantidad de grupos aminos
cuando dos grupos sulfhidrílo (SH) reaccionan para formar libres de los péptidos y las proteínas midiendo la cantidad
un puente disulfuro (SS). Los residuos de cisteína pueden de nitrógeno liberado y esto se puso de manifiesto mediante
formar puentes disulfuro. Pueden unir 2 cadenas peptídicas un burbujeo.
o una sola para formar un anillo. Dicha prueba identifica los
Solución Reaccionó
enlaces disulfuro de las proteínas, en donde a mayor parte
“A”(Grenetina) Si
las proteínas que contengan un número mayor de puentes
“C” (Grenetina desnaturalizada) No
disulfuro,
“D” (Albúmina) No
Sustrato Observaciones H2O (sin proteína) No
Solución “A”(Grenetina)
FormacióFormación de precipitado blanco
Solución “D” (Albúmina)
FormacióFormación de precipitado café VI. Acción reguladora de aminoácidos

Los -aminoácidos son anfóteros. La zona de viraje del rojo


III. Reacción de Biuret congo es de 5.2, así que el empleo de gotas de HCl para
alcanzar una coloración azul en la solución B confirma que
se lleva a cabo una reacción ácido-base. La zona de viraje
de la fenoftaleina es en un pH de 8.6, de tal manera que la
adición de unas gotas de NaOH a la solución B demuestra patrones (Fenilalanina y glicina) tomando como base su
la propiedad anfótera. polaridad.

Solución Indicador Color Gotas Color Dependiendo de sus polaridades, los aminoácidos tienen
inicial final diferentes afinidades a la fase móvil y la estacionaria y en
Agua Rojo Congo Rojo 1 HCl Azul consecuencia ascienden en la placa con distinta rapidez.
Sol. B Rojo Congo Rojo 5 HCl Azul Los aminoácidos menos polares ascienden por la placa con
Agua Fenoftaleina Transparente 1 NaOHRosa una mayor rapidez por su afinidad a la placa obteniéndose
Sol. B Fenoftaleina Transparente 4 NaOHRosa los siguientes resultados:

VII. Cromatografía en Capa fina Sustancia Rf


Solución “B” No corrió
Por medio de la cromatografía en capa fina se separaron la Fenilalanina 0.75
Glicina 0.39
mezcla de aminoácidos de la solución B con 2 aminoácidos

Conclusión: enlaces peptídicos, la reacción con ninhidrina para


Existen varios métodos para identificar los aminoácidos identificar aminoácidos libres , la reacción con ácido
presentes en una proteína como es la reacción nitroso para identificar aminos libres de los péptidos, por
Xantoproteica para identificar aminoácidos aromáticos, la último en la cromatografía identificar los aminoácidos
reacción de precipitación para identificar enlaces disulfuro presentes en una proteína hidrolizada con base a su
en los aminoácidos, la reacción de biuret para identificar polaridad.

Bibliografía Química orgánica fundamental. Louis F.


Wade, Leroy. Química Orgánica, Volumen 2. Fieser, EDT. Reverte
Séptima. México: PEARSON EDUCACION,
2011. Paginas consultadas: 1153 Principios de química orgánica, T. A.
Geissman, EDT. Reverte
Mcmurry J. Química Orgánica. 6º Edición.
Editorial Thomson. México. 2005.

CUESTIONARIO EXPERIMENTAL si no hay coloración quiere decir que no


hubo reacción y por tanto no están
En la hidrólisis de grenetina, indicar: presentes enlaces peptídicos
1. ¿Cómo sabría si la hidrólisis fue
parcial o total?
2. Investiga y describe tres tipos de
Con el experimento numero 3 hidrólisis de proteínas.
demostramos enlaces peptídicos, estos
enlaces solo los encontramos (Durante I. Básica: se ocupan bases fuertes
esta práctica) en las proteínas en su (generalmente NaOH y NaOH) a
estado “normal”. Una vez hidrolizada en ebullición lenta y se destruyen
su totalidad la proteína estos enlaces no indiferenciadamente los enlaces
están presentes en la muestra. Con este peptídicos.
experimento se forma un complejo de
cobre que da una coloración a la muestra, II. Acida: se ocupan ácidos (generalmente
HCl y H2SO4) a ebullición lenta, destruye 7. Resumir las conclusiones obtenidas
completamente los enlaces peptídicos en la reacción con acetato de plomo.
indiferenciadamente.
La solución D (solución de albumina)
tiene azufre en su estructura.
III. Enzimática: es una reacción muy lenta
y muy selectiva así que no reacciona en 8. Indicar por medio de reacciones, el
cualquier sito activo y no destruye todos efecto regulador de aminoácidos.
los enlaces peptídicos.

3. ¿Qué tipo de aminoácidos o


proteínas dan positiva la reacción
xantoprotéica?

Los aminoácidos que tienen en su


estructura un anillo aromático como es
la fenilalanina, tirosina y triptófano

4. Escribe el mecanismo que se lleva


a cabo en la reacción xantoprotéica.
La reacción es específica para los grupos
fenilos sustituidos. En ella ocurre la
nitración del grupo fenilo, que contiene
una molécula orientadora hacia la 9. Explicar los resultados obtenidos
posición orto del anillo, cuando se ponga en la prueba del efecto regulador de
en contacto con el ácido nítrico. La los aminoácidos.
nitración del anillo determinará que el
producto de reacción tenga un color En la solución un ión dipolo de un
amarillo. aminoácido es una base que acepta un
protón proveniente del ácido clorhídrico
5. ¿Cuál es la razón de agregar para formar un catión.
hidróxido de sodio en la reacción
xantoprotéica? En la solución que se volvió básica al
adicionarle hidróxido de sodio, es un
Para llevar la solución a un pH alcalino. ácido que pierde un protón y da lugar a un
anión.
6. ¿Qué tipo de aminoácidos debe
contener una proteína, para dar 10. ¿En qué consiste la prueba de Van
positiva la reacción de precipitación Slyke?
con acetato de plomo?
Prueba química para la determinación
Un amino acido que contenga enlaces de aminoácidos primarios. Esta prueba
disulfuro (R-S-S-R). es producto de mezclar una solución de
nitrilo de sodio, ácido acético y agua,
con la solución problema, así produce Grenetina: prolina, lisina y glicina
se produce un desprendimiento de
Albúmina: fenilalanina, valina, triptófano,
nitrógeno gaseoso evidenciando
leucina.
aminoácidos primarios.
15. Investigar de qué proteína se
11. Escribe la fórmula de los
obtiene la grenetina.
aminoácidos que identificó por
Del colágeno hidrolizado.

cromatografía.
Glicina

12. Explicar el fundamento de la


cromatografía en capa fina y
mencionar cuál es la fase móvil y cuál
la estacionaria en el sistema utilizado
en esta práctica.

Se basa en el reparto de soluto entre


la fase móvil y la estacionaria, así los
compuestos más afines (por polaridad)
a la dase estacionaria tardan más en
eluir.

Fase móvil: Mezcla de Alcohol


terbutilico –agua 3:1

Fase estacionaria: Placa de silica

13. ¿A qué tipo de proteínas


pertenecen las que se emplearon en la
práctica?

Colágeno = Fibrosas
Ovoalbúmina=Fosfoproteína

14. Investigar algunos de los


aminoácidos que se encuentran
presentes en grenetina y albúmina.