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Tabla de contenido
1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................... 3
2. MARCO TEÓRICO .................................................................................................................... 4
2.1 Nombres comunes ................................................................................................................... 4
2.2. Clasificación taxonómica ........................................................................................................ 4
2.3. Descripción botánica ............................................................................................................... 4
2.4. Distribución geográfica ........................................................................................................... 6
3. MATERIALES ........................................................................................................................... 6
3.1. Material vegetal: obtención de esquejes ................................................................................. 6
3.2. Medio de cultivo para esquejes de Citrus reshni var. “Cleopatra” ..................................... 7
4. METODOLOGIA ....................................................................................................................... 7
4.1. Protocolo de esterilización de esquejes ................................................................................... 7
4.1.1. Método 1: ............................................................................................................................ 7
4.1.2. Método 2: ............................................................................................................................ 8
4.1.3. Método 3 ............................................................................................................................. 9
4.1.4. Condiciones de incubación ................................................................................................. 9
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES .......................................................................................... 10
5.1 Determinación de la cantidad de esquejes contaminados ..................................................... 10
6. CONCLUSIONES .................................................................................................................... 18
7. RECOMENDACIONES ........................................................................................................... 19
8. BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................................... 20

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1. INTRODUCCIÓN

El género Citrus se cultiva en más de 100 países, por lo que es uno de los cultivos frutales
comerciales más importantes en términos de valor económico y nutrición humana (Barlass y
Skene, 1986). Las mandarinas son cultivadas por sus propiedades nutricionales y medicinales,
entre las que se destacan las siguientes, su mayor componente es el agua y, respecto a otras
frutas de su género aporta menos cantidad de azúcares y por tanto menos calorías, la cantidad
de fibra es apreciable y se encuentra sobre todo en la parte blanca entre la pulpa y la corteza y
su consumo favorece el tránsito intestinal. De su contenido vitamínico sobresale la vitamina C,
el ácido fólico y la provitamina A, más abundante que en cualquier otro cítrico, también
contiene cantidades destacables de ácido cítrico, potasio y magnesio. En menor proporción se
encuentran ciertas vitaminas del grupo B y minerales como el calcio, aunque de menor
aprovechamiento que el que procede de los lácteos u otros alimentos que son buena fuente de
dicho mineral. La provitamina A o betacaroteno se transforma en vitamina A en nuestro
organismo conforme este lo necesita. Dicha vitamina es esencial para la visión, el buen estado
de la piel, el cabello, las mucosas, los huesos y para el buen funcionamiento del sistema
inmunológico. La vitamina C interviene en la formación de colágeno, huesos y dientes,
glóbulos rojos y favorece la absorción del hierro de los alimentos y la resistencia a las
infecciones. (Robles, 2010).

El cultivo in vitro de cítricos ha sido una metodología de gran utilidad para complementar los
programas de mejoramiento genético de estas especies. Diversas estrategias de regeneración
han sido establecidas para estos propósitos. Estas se basan principalmente en el cultivo de
brotes apicales, microesquejes, epicotíleos y germinación de semillas. El desarrollo de técnicas
biotecnológicas ofrece nuevas alternativas para el mejoramiento de cítricos. Entre ellas, la
transformación genética tiene gran potencial y permite la introducción de genes que modifican
características de interés agronómico, manteniendo las características originales de una
variedad y evitando la transferencia de características negativa (Vargas, 2003).

Por lo tanto, de acuerdo al trabajo realizado y a la selección de esta especie vegetal, el presente
informe tiene como objetivo determinar un protocolo de esterilización eficiente de los esquejes
de mandarina cv. “Cleopatra” (Citrus reshni) que pueda ser implementado para su cultivo in
vitro, tomando en cuenta las posibles adversidades que pudieran derivarse del presente estudio.

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2. MARCO TEÓRICO

2.1 Nombres comunes


Mandarina, mandarino.

2.2. Clasificación taxonómica


Nombre científico : Citrus reshni var. “Cleopatra”

División : Espermatofita

Subdivisión : Angiosperma

Clase : Dicotiledónea

Subclase : Arquiclamídea

Orden : Sapindales

Familia : Rutáceae

Subfamilia : Aurantioideae

Género : Citrus

Especie : Citrus reshni var. “Cleopatra”

2.3. Descripción botánica


Árbol pequeño de 2-6 m de altura, con tronco con frecuencia torcido, generalmente sin espinas.
Ramillas angulosas. Hojas oblongoovales, elípticas o lanceoladas, de 3.5-8 cm de longitud y
1.5-4 cm de anchura, con la base y el ápice obtusos. Margen aserrado por encima de la base.
Son de color verde oscuro brillante en el haz y verde amarillento en el envés, fragantes cuando
se las tritura. Pecíolos con ala muy corta. Inflorescencias axilares o terminales con 1-4 flores
pentámeras, de color blanco, olorosas, de 1.5-2.5 cm de diámetro. 18-23 estambres, casi libres.
Frutos tipo cidra de 4-7 cm de longitud y 5-8 cm de diámetro, globoso-deprimidos. Su color
varía de amarillo verdoso al naranja y rojo anaranjado. La superficie es brillante y está llena de
glándulas oleosas hundidas. La cáscara es delgada, muy fragante, separándose fácilmente de la
pulpa. Pulpa jugosa y dulce, refrescante. Semillas oblongo – ovoides (Vargas, 2003).

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Figura 1: Estructura vegetativa de Citrus reshni var. “Cleopatra”, obsérvese las hojas
oblongoovales, la estructura floral, y los frutos tipo cidra.

Figura 2: Partes estructurales del fruto del género Citrus

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2.4. Distribución geográfica
Originario del sureste de Asia, es muy conocido y cultivado en todas las regiones tropicales
por el sabroso sabor de sus frutos. Se distribuye en las áreas subtropicales (30-40º latitud norte
sur) donde su producción es estacional y la calidad del fruto para el consumo en fresco es
excelente. La producción mundial de mandarinas muestra un ritmo de crecimiento más
dinámico que el de las naranjas (países comprendidos: Estados Unidos, México, España,
Portugal, Italia, China, Corea, Japón, Egipto, Israel, Turquía, Chile, Argentina, Australia)
(Robles, 2010).

3. MATERIALES

3.1. Material vegetal: obtención de esquejes


Los esquejes fueron obtenidos a partir de ramas jóvenes de un árbol de Citrus reshni var.
“Cleopatra” localizado en el Huerto de la Universidad Nacional Agraria La Molina., las cuales,
dependiendo del protocolo de desinfección a utilizar, fueron sometidas a diferentes
tratamientos, ver figura 3.

Figura 3: Árbol de Citrus reshni var.


“Cleopatra” situada cerca de la
estación meteorológica OVH (huerto
de la UNALM).

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3.2. Medio de cultivo para esquejes de Citrus reshni var. “Cleopatra”:
Se usó un medio de cultivo compuesto por medio básico (MS) (Murashige & Skoog, 1962).
Para la formulación del medio MS se adicionaron 30 g/L-1 de sacarosa; 7,5 g/L-1 de agar-agar.
El pH se ajustó a 5,6 con hidróxido de sodio (NaOH) y ácido clorhídrico (HCl), antes del
agregado del agar-agar. El medio de cultivo se vertió en frascos de vidrio que fueron tapados
con papel aluminio. Se realizó el proceso de autoclave por 30 minutos a 120º C, manteniendo
la presión entre 15 y 20 lb.

4. METODOLOGIA

El presente trabajo fue desarrollado en tres etapas: en la primera se realizó la obtención de


esquejes de Citrus reshni var. “Cleopatra”, en la segunda, después de la aplicación de los
protocolos de desinfección, se procedió a la siembra en los medios de germinación respectivos;
y en la tercera etapa, se desarrolló la evaluación de la contaminación para cada método
empleado.

4.1. Protocolo de esterilización de esquejes:


Fueron llevados a cabo tres protocolos de esterilización diferentes que se detallan a
continuación:

4.1.1. Método 1: (Realizado el 21/05/18)


1. Se retiraron las hojas de las ramas de mandarina y se observaron las yemas.
2. Se cortaron las ramas con el fin de que por cada trozo cortado hayan 4 yemas.
3. Luego, los trozos se lavaron con jabón carbólico con la ayuda de un cepillo y se
enjuagaron con abundante agua del caño (se repitió el proceso 5 veces).
4. Se colocaron los trozos en un frasco en el cual se vertió solución fungicida PREVICUR
2 ppm, se agitó por 20 minutos, se desechó la solución cuidadosamente y se enjuagó
con abundante de agua destilada.
5. En el mismo frasco se vertió alcohol de 70 °, se agitó por 1 minuto, se desechó el alcohol
cuidadosamente y se enjuagó con un poco de agua destilada.
6. Luego, se vertió solución de hipoclorito de sodio al 1.5 % y al 3 % con 3 gotas de Tween
en diferentes frascos y se agitaron por 25 y 35 minutos constantemente.

7
7. Se limpió y alistó la cámara de flujo laminar con los materiales necesarios para la
siembra (pinzas, cuchillas, placas Petri, alcohol 70°, mecheros, etc.).
8. Pasado los tiempos necesarios, se llevaron los frascos a la cámara de flujo laminar para
el enjuague con agua destilada estéril (se enjuagó 4 veces).
9. Se cortó el material vegetal con el fin de obtener esquejes que contengan solo 1 yema
o 2 en caso de que las yemas estén muy juntas.
10. Finalmente, se introdujeron en frascos que contenían medio MS preparado previamente
o medio MS reciclado.

Para este método se realizaron 2 repeticiones para cada tratamiento de concentración de


hipoclorito por tiempo, es decir, se usaron un total de 8 frascos.

La evaluación de la contaminación fue realizada en la primera semana después de la siembra.

4.1.2. Método 2: (Realizado el 28/05/18)


1. Se retiraron las hojas de las ramas de mandarina y se observaron las yemas.
2. Se cortaron las ramas con el fin de que por cada trozo cortado hayan 4 yemas.
3. Luego, los trozos se lavaron con jabón carbólico con la ayuda de un cepillo y se
enjuagaron con abundante agua del caño (se repitió el proceso 5 veces).
4. Se colocaron los trozos en un frasco en el cual se vertió solución fungicida PREVICUR
2 ppm, se agitó por 20 minutos, se desechó la solución cuidadosamente y se enjuagó
con abundante de agua destilada.
5. En el mismo frasco se vertió alcohol de 70 °, se agitó por 1 minuto, se desechó el alcohol
cuidadosamente y se enjuagó con un poco de agua destilada.
6. Luego, se vertió solución de hipoclorito de sodio al 2 % con 3 gotas de Tween en
diferentes frascos y se agitaron por 20, 25 y 30 minutos constantemente.
7. Se limpió y alistó la cámara de flujo laminar con los materiales necesarios para la
siembra (pinzas, cuchillas, placas Petri, alcohol 70°, mecheros, etc.).
8. Pasado los tiempos necesarios, se llevaron los frascos a la cámara de flujo laminar para
el enjuague con agua destilada estéril (se enjuagó 4 veces).
9. Se cortó el material vegetal con el fin de obtener esquejes que contengan solo 1 yema
o 2 en caso de que las yemas estén muy juntas.
10. Finalmente, se introdujeron en frascos que contenían medio MS preparado previamente
o medio MS reciclado.

8
Para este método se realizaron 2 repeticiones para cada tratamiento de concentración de
hipoclorito por tiempo, es decir, se usaron un total de 6 frascos.

4.1.3. Método 3: (Realizado el 04/06/18)


1. Se retiraron las hojas de las ramas de mandarina y se observaron las yemas.
2. Se cortaron las ramas con el fin de que por cada trozo cortado hayan 4 yemas.
3. Luego, los trozos se lavaron con jabón carbólico con la ayuda de un cepillo y se
enjuagaron con abundante agua del caño (se repitió el proceso 5 veces).
4. Se colocaron los trozos en un frasco en el cual se vertió solución fungicida PREVICUR
2 ppm, se agitó por 20 minutos, se desechó la solución cuidadosamente y se enjuagó
con abundante de agua destilada.
5. En el mismo frasco se vertió alcohol de 70 °, se agitó por 1 minuto, se desechó el alcohol
cuidadosamente y se enjuagó con un poco de agua destilada.
6. Luego, se vertió solución de hipoclorito de sodio al 2 % con 3 gotas de Tween en
diferentes frascos y se agitaron por 25 minutos constantemente.
7. Se limpió y alistó la cámara de flujo laminar con los materiales necesarios para la
siembra (pinzas, cuchillas, placas Petri, alcohol 70°, mecheros, etc.).
8. Pasado los tiempos necesarios, se llevaron los frascos a la cámara de flujo laminar para
el enjuague con agua destilada estéril (se enjuagó 4 veces).
9. Se cortó el material vegetal con el fin de obtener esquejes que contengan solo 1 yema
o 2 en caso de que las yemas estén muy juntas.
10. Finalmente, se introdujeron en frascos que contenían medio MS preparado previamente
o medio MS reciclado.

Para este método se realizaron 4 repeticiones para cada tratamiento de concentración de


hipoclorito por tiempo, es decir, se usaron un total de 4 frascos.

4.1.4. Condiciones de incubación

El material se incubó en un cuarto de incubación, aclimatado a una temperatura de 23 ± 2° C,


a una intensidad lumínica de 60 µmol/m-2/s-1 aproximadamente y un foto período de 12 horas
de luz y 12 de oscuridad.

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5. RESULTADOS Y DISCUSIONES

5.1 Determinación de la cantidad de esquejes contaminados

Posterior a la siembra de esquejes con sus respectivos métodos de esterilización, fueron


evaluados los frascos en base al número de esquejes contaminados por total de esquejes en
cada repetición.

A) Método 1:

Figura 4: Resultados obtenidos para los frascos sembrados con el método 1. Hubo un error al
momento de rotular los frascos.

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Pasada una semana, se observó contaminación en todos los frascos, aunque algunos esquejes
estaban rescatables, no se procedió a rescatarlos porque estaban dañados superficialmente por
acción de la lejía y/o podría ser que el hongo que contaminó el medio ya haya situado sus hifas
en el esqueje que aparentaba ser recuperable (Escalona y Contreras, 2011).

Número de Concentración de Número de Número de


Material frascos hipoclorito de Tiempo Repeticiones esquejes esquejes
sembrados sodio sembrados contaminados

25 R1 4 3
minutos R2 4 4
1.5 %
Siembra 35 R1 4 4
de minutos R2 4 2
esquejes 8
25 R1 4 4
del
minutos R2 4 4
método 1
3%
35 R1 4 3

minutos R2 4 4

Tabla 1: Cantidad de esquejes sembrados, contaminados y número de repeticiones por el


método 1.

Debido a los resultados obtenidos, para el próximo método se optó por usar una concentración
de hipoclorito de sodio promedio del método 1, es decir, se usó una concentración al 2 %.

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B) Método 2:

Figura 5: Resultados obtenidos para los frascos sembrados con el método 2.

Luego de una semana se observó lo siguiente:

Número de Concentración Número de Número de


Material frascos de hipoclorito Tiempo Repeticiones esquejes esquejes
sembrados de sodio sembrados contaminados

20 R1 – (A) 4 3
minutos R2 – (B) 4 2
Siembra
25 R1 – (C) 4 4
de
minutos
esquejes 6 2% R2 – (D) 4 0
del 30 R1 – (E) 4 4
método minutos R2 – (F) 4 4
2

Tabla 2: Cantidad de esquejes sembrados, contaminados y número de repeticiones por el


método 2.

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Pasada dicha semana, se procedió a rescatar los esquejes de los frascos A y B dentro de un
mismo frasco que contenía medio MS. Los esquejes del frasco D se traspasaron completamente
a otro frasco que también contenía medio MS.

Debido a los resultados obtenidos, para el próximo método se optó por usar una concentración
de hipoclorito de sodio al 2 % y con un único tiempo de 25 minutos, ya que al parecer fue el
más exitoso en el método 2.

C) Método 3:

Figura 6: Resultados obtenidos para los frascos sembrados con el método 3.

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Luego de una semana se observó lo siguiente:

Número de Concentración Número de Número de


Material frascos de hipoclorito Tiempo Repeticiones esquejes esquejes
sembrados de sodio sembrados contaminados

R1 – (G) 4 4

Siembra 4 3
R2 – (H)
de
esquejes 4 2% 25
del minutos 4 4
R3 – (I)
método
3
4 0
R4 – (J)

Tabla 3: Cantidad de esquejes sembrados, contaminados y número de repeticiones por el


método 3.

Pasada dicha semana, se procedió a rescatar el único esqueje del frasco H dentro de otro frasco
que contenía medio MS. El frasco J se dejó simplemente en el banco de germoplasma
incubando a las condiciones ya anteriormente mencionadas.

También se procedió a observar si hubo contaminación en los frascos resembrados


anteriormente, y se vio que los frascos A y B se contaminaron completamente. En el frasco D,
se pudieron rescatar 2 esquejes en un frasco que contenía medio MS, mientras que los otros 2
esquejes fueron contaminados por algún tipo de hongo.

D) Resiembras realizadas:

Luego de una semana, se observó si existió contaminación en las resiembras realizadas


anteriormente y se determinó contaminación en el frasco resembrado a partir de D (en ambos
esquejes).

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D H J

Figura 7: Resiembra de los frascos D, H y J.

En dicha semana transcurrida no se observó la presencia de contaminantes en la resiembra a


partir del frasco H ni en el frasco intacto J, por ende, se procedió a colocar todos los esquejes
que estaban dentro de ambos frascos, dentro un mismo frasco que contenía medio MS.

Luego de una semana más, se evidenció contaminación en dicho último frasco resembrado.

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Figura 8: Resiembra de los frascos H y J juntos en mismo frasco.

Finalmente, de acuerdo al último protocolo de esterilización ensayado, se observó que hubo


una considerable reducción de contaminación al alcanzar el 68.75 % de contaminación de
esquejes totales sembrados para este método (11 esquejes contaminados de 16 esquejes totales
sembrados), ver gráfico 1.

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Gráfico 1: Se observan los porcentajes de esquejes contaminados por método de
esterilización.

De acuerdo a lo expuesto por Becerra (2003), el procedimiento para la desinfección de las


esquejes debe permitir eliminar los microorganismos con el menor daño posible para la yema
axilar, empleando fungicidas, antibióticos o desinfectantes superficiales. Por lo que si no se
recurre a este procedimiento de manera adecuada, fuentes de contaminación como
microorganismos superficiales o endógenos que incluye a bacterias, levaduras y otros hongos,
el ambiente del laboratorio, la mala manipulación de las muestras y/o material de siembra,
áfidos microscópicos, etc., propiciarían la contaminación en los medios de cultivo empleados.

Uno de los patógenos más representativos de Citrus reshni var. “Cleopatra” es el hongo
Aspergillus sp. el cual podría haber infectado a los esquejes utilizados, ya que se observó en el
medio de cultivo para los métodos de esterilización 1, 2 y 3, colonias con características

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similares a las reportadas para este hongo, las cuales fueron de color blanco, textura frondosa
de bordes enteros y de superficie lisa rodeando a los esquejes (Escalona y Contreras, 2011).

Respecto al protocolo de desinfección empleando el método 3, la incidencia de contaminación


decreció parcialmente respecto a los dos métodos usados previamente. Por otro lado, algunas
de las características de las posibles colonias infectantes a nivel de este protocolo fue el
crecimiento por debajo de los esquejes en el medio de cultivo, la morfología difusa y
semitransparente, los cuales podrían deberse a microorganismos anaerobios facultativos
resistentes a tratamientos con PREVICUR por tiempos de exposición prolongados, los cuales
a su vez, serian especies diferentes al observado en el método 1 y 2, que probablemente sea
Aspergillus sp.

Rákosy-Tican y colaboradores (2011), mencionan que posibles contaminantes internos como


diferentes especies de bacterias, podrían colonizar espacios intercelulares o adherirse a
superficies o porciones presentes en los esquejes de manera perpetua, evitando una adecuada
esterilización con agentes químicos, lo cual requeriría intervalos de exposición largos que
podrían afectar la capacidad de éxito de micropropagación.

6. CONCLUSIONES
La contaminación bacteriana o por hongos, sigue siendo una continua amenaza para el cultivo
de tejidos y estructuras vegetales, es por ello que diferentes técnicas para reducir la
contaminación se encuentran disponibles. Se deben detectar las principales fuentes de
contaminación para estimar los cambios que permitan una adecuada y optimizada función de
los procesos sin sufrir estos inconvenientes, evadiendo o eliminando estas diferentes fuentes.

Principalmente, la correcta manipulación en la operación con técnicas de esterilización, el uso


de autoclave, cámaras de flujo laminar y áreas estériles por radiación ultravioleta y aditivos
químicos, serían los pasos más importantes para evadir contaminantes ambientales, que a su
vez favorecerían una menor incidencia de contaminación en el cultivo de tejidos.

Debe ser considerada la identificación de contaminantes, para pruebas con antibióticos para la
determinación de concentraciones efectivas como tratamientos, evitando la fitotoxicidad en el
hospedero.

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7. RECOMENDACIONES

1. Ensayar otros agentes desinfectantes diferentes al hipoclorito de sodio y emplear


soluciones bactericidas-fungicidas contra ciertos patógenos resistentes.

2. Utilizar cofias y mascarillas mientras se realiza la siembra y/o manipulaciones en las


cámaras de flujo laminar.

3. Evitar la penetración con materiales de siembra sobre el agar en el cual se dispondrán


los esquejes, y en todo caso esterilizarlos correctamente. Ejm: las pinzas.

4. Emplear luz ultravioleta sobre los medios de cultivo y materiales de siembra.

5. Identificar las fuentes de contaminantes, caracterizar bacterias u hongos para


determinar cómo eliminar o prevenir este tipo de fuentes.

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8. BIBLIOGRAFIA

Amaya Robles, J. E. 2010. “EL CULTIVO DE MANDARINA” Citrus sp. Gerencia


Regional Agraria La Libertad, Trujillo-Perú. p. 1-30.

Becerra Vargas, D. C. 2003. Efecto del origen del material vegetal y la edad sobre la
capacidad morfogénica de dos especies de cítricos cultivadas in vitro. p. 1-177.

Escalona, Yoleidy y Contreras, Nancy. 2011. Primer reporte de la mancha bacteriana en


parchita (Citrus reshni var. “Cleopatra”) en Venezuela. Bioagro 23 (1): 69-75.

Fischer, I. H., & Rezende, J. a. M. 2008. Diseases of Passion Flower. Pest Technology,
2(1), 1–19.

Manjarrez, E., & Perea, M. 2012. Establecimiento de un protocolo de propagación de


mandarina (Citrus reticulata) a partir de embriones cigoticos y yemas axilares. Agronomía
Colombiana, 20(2), 53–64.

Murashige, T. & Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue culture. Physiology Plant. 15:473-497.

Rákosy-Tican, E., Aurori, C. M., & Aurori, A. 2011. The effects of cefotaxime and silver
thiosulphate on in vitro culture. Romanian Biotechnological Letters, 16(4), 6369–6377.

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