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MÉTODOS DE ANÁLISIS
PROFESOR:
Dra. Guillermina Rosas Sandoval
4IM2
SECCIÓN 2
1.5
1
Abs
0.5
0
0 20 40 60 80 100 120 140
-0.5
-1
V elución (mL)
Prolina Histidina
DISCUSIÓN
La cromatografía por intercambio iónico nos permitió separar aminoácidos de acuerdo a sus
cargas. La resina utilizada (Amberlita IRC-50) es un intercambiador catiónico débil que cuenta
con un grupo fijo carboxilo (-COO-) y uno móvil H+. El primer paso fue el empaquetamiento de
la resina en la columna del intercambiador que contaba previamente con citrato de sodio
(pH=5.25), en este paso el ion móvil de la resina fue intercambiado por el ion Na + del regulador
de citratos. Posteriormente, ya regulada la velocidad de elución se adicionó la mezcla que
contenía Prolina e Histidina y se comenzó con la separación en fracciones de 3mL c/u.
La histidina por su parte, al tener una carga neta de +1 a pH=5.25, interaccionó con el ion fijo
de la resina usada y permaneció sin eluir hasta que hubo un cambio de pH del regulador de
citratos, de 5.25 a pH=2. En estas condiciones la Histidina presenta una carga positiva, pero
la adición de sales incrementa así como la fuerza ionica del medio, y, por ende existe una
competencia entre los iones adicionados y la histidina, la concentración de la Histidina es
menor, por lo cual tiende a eluir.
Se determinaron las absorbancias de todas las fracciones a una longitud de onda de 341nm
y 568nm. El espectro de absorción de la prolina (se trabajó a 341nm) arrojó un pico en el
volumen 15mL (Fracción 5), lo cual indica que la mayor cantidad de Prolina fue separada en
una baja cantidad de fracciones; esto queda interpretado en el perfil de elución como un pico
con un ancho de banda pequeño y alta eficiencia.
La histidina (se trabajó a 568nm) no presenta una absorbancia considerable en las primeras
fracciones, lo cual implica que no estaba contenida en las mismas, su elución comenzó a partir
de la fracción 25 y se puede observar que sus valores más altos se encontraron entre las
fracciones 29 y la 31, en el cromatograma se pueden apreciar dos picos pequeños y separados
con un ancho de banda grande, lo que implica que la separación no se realizó correctamente
ya que pudieron ser alteradas variables como la velocidad del eluyente o la altura del mismo
en la columna de cromatografía.
El pH=2
El pH=5.25
Predomina la
Predomina la
forma protonada
forma protonada
+1 de la histidina,
+1 de la histidina,
la cual es
la cual desplaza al
desplazada por la
ion Na+ unido a la
alta
Amberlita y se
Na+ concentración de
une a ella. Na+
sales adicionada.
La prolina se
encuentra en
forma de Na+
Zwitterion y
eluye.
CONCLUSIONES
La prolina es un aminoácido que no tiene afinidad con la resina Amberlita IRC-50 a
pH=5.25
El perfil de elución generado demuestra que hubo una buena elución en la separación
de Prolina.
La elución de Histidina no se llevó a cabo eficientemente.
La elución de los componentes de una mezcla puede llevarse a cabo en función de sus
puntos isoeléctricos.
BIBLIOGRAFÍA
- Nelson, David. Cox, Michael. (2009). Principios de bioquímica. 5a Ed. New York: Editorial W.H.
Freeman and Company. Pp 153-160.
- Sanz, Medel. (2000). Química Analítica Básica. Valladolid, México: Ediciones Simancas. Pp 341-
344.
- Franson.M.A.H. (1992). APHA-AWWA-WPCF. Métodos normalizados para el análisis de aguas
potables y residuales. España. Ed. Díaz Santos, S.A. DE C.V. 5758, 67-71.