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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

SEPARACIÓN DE UNA MEZCA DE DOS AMINOÁCIDOS POR


CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IONICO

MÉTODOS DE ANÁLISIS
PROFESOR:
Dra. Guillermina Rosas Sandoval

4IM2
SECCIÓN 2

HERNÁNDEZ SOTO ARTEMISA DALIA


OBJETIVOS
 Separar una mezcla de aminoácidos en base a su carga y sus grupos ionizables
 Determinar si la cromatografía a realizar se llevó a cabo adecuadamente, mediante un
perfil de elución.

DATOS EXPERIMENTALES E INFORME


Complete la siguiente tabla
TABLA 1. SEPARACIÓN DE PROLINA E HISTIDINA
V Volumen de A341 A570 Volumen de A341 A570
elución elución
3 -0.016 -0.02 63 0.011 0.197
6 -0.48 -0.033 66 -0.01 0.048
9 0.098 -0.006 69 0.093 0.204
12 1.259 0.137 72 0.063 0.243
15 1.848 0.106 75 0.097 0.43
18 1.242 0.164 78 0.289 0.714
21 1.326 0.113 81 0.259 0.626
24 0.957 0.066 84 0.221 0.547
27 0.268 0.158 87 0.177 0.45
30 0.525 0.05 90 0.239 0.616
33 0.332 0.009 93 0.141 0.673
36 0.308 0.043 96 0.101 0.573
39 0.265 0.045 99 0.123 0.277
42 0.199 0.049 102 0.035 0.151
45 0.209 0.09 105 0.095 0.139
48 0.071 0.018 108 0.091 0.086
51 0.084 0.057 111 0.087 0.72
54 0.058 0.045 114 0.089 0.048
57 -0.041 0.012 117 0.032 0.07
60 0.142 0.12 120 -0.07 0.06

Concentración de Prolina: Concentración de Histidina:


𝑚𝑔 1000𝑔 1𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑔 1000𝑔 1𝑚𝑜𝑙
𝑃𝑟𝑜𝑙𝑖𝑛𝑎 = 2 | | | 𝐻𝑖𝑠𝑡𝑖𝑑𝑖𝑛𝑎 = 8 | | |
𝑚𝐿 1𝑚𝑔 115𝑔 𝑚𝐿 1𝑚𝑔 155𝑔
𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙
𝑃𝑟𝑜𝑙𝑖𝑛𝑎 = 17.39 𝐻𝑖𝑠𝑡𝑖𝑑𝑖𝑛𝑎 = 51.61
𝑚𝐿 𝑚𝐿
 Con los datos obtenidos, construya el perfil de elución colocando en el eje de las abscisas
el volumen de elución y en un doble eje de ordenadas el valor de absorbancia correspondiente.

Perfil de elución: separación de Prolina e Histidina


2

1.5

1
Abs

0.5

0
0 20 40 60 80 100 120 140

-0.5

-1
V elución (mL)

Prolina Histidina

DISCUSIÓN
La cromatografía por intercambio iónico nos permitió separar aminoácidos de acuerdo a sus
cargas. La resina utilizada (Amberlita IRC-50) es un intercambiador catiónico débil que cuenta
con un grupo fijo carboxilo (-COO-) y uno móvil H+. El primer paso fue el empaquetamiento de
la resina en la columna del intercambiador que contaba previamente con citrato de sodio
(pH=5.25), en este paso el ion móvil de la resina fue intercambiado por el ion Na + del regulador
de citratos. Posteriormente, ya regulada la velocidad de elución se adicionó la mezcla que
contenía Prolina e Histidina y se comenzó con la separación en fracciones de 3mL c/u.

El punto isoeléctrico es aquel pH en el cual la carga neta de la molécula proteica es igual a


cero, dicho de otra manera, su número de cargas positivas es igual al número de cargas
negativas. Un aminoácido suele tener una solubilidad muy baja cuando el pH de la solución
en a que se encuentra es igual a su punto isoeléctrico y por lo general tiende a precipitar.
En la cromatografía por intercambio ionico los aminoácidos presentes en la mezcla de interés,
suelen unirse competitivamente a los grupos cargados de la resina.
La prolina eluyó primero ya que su punto isoeléctrico es de 6.3, este valor es cercano al pH
del primer regulador de citratos usado (pH=5.25); por esta razón su afinidad con la resina
catiónica Amberlita IRC-50 fue prácticamente nula y eluyó.

La histidina por su parte, al tener una carga neta de +1 a pH=5.25, interaccionó con el ion fijo
de la resina usada y permaneció sin eluir hasta que hubo un cambio de pH del regulador de
citratos, de 5.25 a pH=2. En estas condiciones la Histidina presenta una carga positiva, pero
la adición de sales incrementa así como la fuerza ionica del medio, y, por ende existe una
competencia entre los iones adicionados y la histidina, la concentración de la Histidina es
menor, por lo cual tiende a eluir.

Recogidas las 40 fracciones, se procedió a revelarlas con la adición de Ninhidrina, compuesto


que reacciona con el grupo alfa amino libre de los aminoácidos, generando un compuesto
purpura. La prolina al no tener un grupo alfa amino libre, dio una prueba negativa que se
presentó como una coloración amarilla en las fracciones que contenían este compuesto. Por
otro lado, la histidina dio una prueba positiva, con la coloración violeta característica.

Se determinaron las absorbancias de todas las fracciones a una longitud de onda de 341nm
y 568nm. El espectro de absorción de la prolina (se trabajó a 341nm) arrojó un pico en el
volumen 15mL (Fracción 5), lo cual indica que la mayor cantidad de Prolina fue separada en
una baja cantidad de fracciones; esto queda interpretado en el perfil de elución como un pico
con un ancho de banda pequeño y alta eficiencia.

La histidina (se trabajó a 568nm) no presenta una absorbancia considerable en las primeras
fracciones, lo cual implica que no estaba contenida en las mismas, su elución comenzó a partir
de la fracción 25 y se puede observar que sus valores más altos se encontraron entre las
fracciones 29 y la 31, en el cromatograma se pueden apreciar dos picos pequeños y separados
con un ancho de banda grande, lo que implica que la separación no se realizó correctamente
ya que pudieron ser alteradas variables como la velocidad del eluyente o la altura del mismo
en la columna de cromatografía.

Si la velocidad de elución es constante, se podrán determinar parámetros como el tiempo


muerto (tiempo requerido para la elución de un componente no retenido) y el volumen de
retención (volumen de fase móvil requerido para la elución de un componente).
Cuando la velocidad de elución es demasiado alta o baja, los aminoácidos tienden a no eluir
adecuadamente, de igual manera el regular la velocidad de elución nos permitirá obtener una
buena separación de nuestros aminoácidos, es decir, se obtienen ensanchamientos de banda
más pequeños, con lo que aumenta la eficacia de la columna.
Reacción de Ninhidrina
con un grupo amino libre
(arriba) y su reacción con
Prolina (reacción inferior)

El pH=2
El pH=5.25
Predomina la
Predomina la
forma protonada
forma protonada
+1 de la histidina,
+1 de la histidina,
la cual es
la cual desplaza al
desplazada por la
ion Na+ unido a la
alta
Amberlita y se
Na+ concentración de
une a ella. Na+
sales adicionada.
La prolina se
encuentra en
forma de Na+
Zwitterion y
eluye.
CONCLUSIONES
 La prolina es un aminoácido que no tiene afinidad con la resina Amberlita IRC-50 a
pH=5.25
 El perfil de elución generado demuestra que hubo una buena elución en la separación
de Prolina.
 La elución de Histidina no se llevó a cabo eficientemente.
 La elución de los componentes de una mezcla puede llevarse a cabo en función de sus
puntos isoeléctricos.

BIBLIOGRAFÍA
- Nelson, David. Cox, Michael. (2009). Principios de bioquímica. 5a Ed. New York: Editorial W.H.
Freeman and Company. Pp 153-160.
- Sanz, Medel. (2000). Química Analítica Básica. Valladolid, México: Ediciones Simancas. Pp 341-
344.
- Franson.M.A.H. (1992). APHA-AWWA-WPCF. Métodos normalizados para el análisis de aguas
potables y residuales. España. Ed. Díaz Santos, S.A. DE C.V. 5758, 67-71.

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