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Determinación de aminoácidos terminales con grupo alfa amino libre. Método SECCIÓN II
de Sanger

Introducción: repetirse la maniobra, lo que permite


Método de Sanger el análisis sucesivo de 5-8
En 1945, el problema del estudio del aminoácidos en el extremo N de un
orden exacto de los aminoácidos en polipéptido.
una proteína era muy complejo, que Hemoglobina
muchos científicos de la época La hemoglobina tiene múltiples
pensaban que no llegarían a funciones:
conocerlo. El progreso técnico que Transporte de oxígeno desde los
permitió adquirir este conocimiento se pulmones a los tejidos, principalmente
debió a Frederick Sanger, quien para facilitar la fosforilación oxidativa
identificó el aminoácido del extremo de en la mitocondria.
las cadenas peptídicas marcando El transporte de dióxido de carbono
dicho extremo libre con un grupo desde los tejidos hasta los pulmones
dinitrofenilo (DNP). Después de en forma de carbaminohemoglobina.
hidrolizar la proteína, identificó por Los compuestos carbamino pueden
cromatografía de papel el derivado de formarse por una reacción entre el
DNP-aa. dióxido de carbono y la hemoglobina,
Cuya utilidad de dicha reacción en donde el primero se combina con
depende de la estabilidad del grupo cualquier grupo amino disponible en
DNP frente a la hidrólisis ácida Por las cadenas globina para formar
fortuna este enlace es estable en la carbamatos, sin embargo los grupos
mayor parte de derivados amino solo se encuentran dispònibles
dinitrofenilados con DNP. en el grupo alfa amino N-terminal de
El reactivo empleado para este fin fue cada cadena de globina y en las
el 1-fluor, 2,4-dinitrobenceno(FDNB), y cadenas laterales de los residuos de
desde que comenzó el estudio de este valina.
se han probado muchos otros La amortiguación de iones hidrógeno
reactivos entre las técnicas más formados en el eritrocito por la
prometedoras y provechosas, se conversión de dióxido de carbono en
encuentra el método creado en 1950 bicarbonato.
por Edman. en este caso se hace Aproximadamente un 89% de dióxido
reaccionar feniltiocianato con el de carbono en la sangre se encuentra
aminoácido del extremo N, alm tratar en forma de iones bicarbonato otra
con H+ el feniltiocarbamato que se parte es disuelta
obtiene, aparece un compuesto Metabolizaciòn de óxido nítrico. Ya
cíclico, formándose un derivado de que se une a este para desactivar la
tipo feniltiohidantoina del aminoácido molécula fisiológica vasoactiva(que
del extremo N. L a feniltiohidantoina tiene características vasoconstrictoras)
puede hidrolizarse e identificarse reaccionando rápidamente con el
posteriormente. grupo hemo y también puede
La gran ventaja de esta técnica con reaccionar con grupos sulfhidrilo de
respecto a Sanger es que puede residuos de cisteína en las cadenas β-
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Determinación de aminoácidos terminales con grupo alfa amino libre. Método SECCIÓN II
de Sanger

Globina. DNP-VAL 0.7286


Objetivo: Identificación de
DNFB 0.5429
aminoácidos con grupos amino alfa
terminal a partir de la hemoglobina MUESTRA 0.7289

bovina.
Análisis técnica Comparación entre reacción de
Se realiza el marcaje del aminoácido Sanger y Edman
terminal con DNFB observando un Reacción Sanger Reacción Edman
color amarillo. Se acidifica
No permite el análisis Permite el análisis
cuidadosamente con HCl 6 N. Se sucesivo (no puede sucesivo(puede repetirse)
repetirse)
extrae la solución acidificada con éter
sin peróxido (conservado en FeSO4) Empleo de ácido fuerte Se emplea un ácido débil
HCl TFA (Ácido
se añaden volúmenes pequeños y se trifluoroacético)
realiza la extracción con pipetas hasta
Aplicar Temperatura y
que el éter es incoloro, Presión
Tabla de resultados Se emplea el compuesto Se emplea
Rf = Movimiento de banda soluto / FDNB Fenilisotiocianato

movimiento del frente del solvente Derivado DNP Derivado PTH


sustituyendo valores para nuestra
muestra Rf = 28.5 / 39.1 = 0.7289 Discusión:
y de esa forma para los demás casos. La Valina es el aminoácido terminal de
las 4 cadenas de aminoácidos que
posee la hemoglobina, teóricamente el
aminoácido problema que debimos
observar en la cromatografía, debió
de haber sido la Valina pero
comparando el Rf de la primera franja
de nuestro problema no concuerda
con el Rf de la Valina patrón, esta
tiene una correlación mayor con el Rf
del DNFB lo cual nos dice que existe
contaminante del DNFB, esto podría
deberse a que la extracción con el
éter no fue tan satisfactoria, se
encuentra una segunda banda a un Rf
mayor al de los patrones esto podría
deberse a otro contaminante en el
Compuesto Rf problema.
El método de Sanger es tardado,
DNP-ASP 0.8213
laborioso y además solo podemos
DNP-AL 0.6467 determinar el aminoácido terminal.
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Determinación de aminoácidos terminales con grupo alfa amino libre. Método SECCIÓN II
de Sanger

Conclusión:
Consideramos los resultados
obtenidos de Rf similares entre
nuestra muestra y la valina por lo que
podemos decir que son iguales, de
acuerdo a la investigación realizada
los resultados fueron los esperados.
El método de sanger es un método
básico pero práctico para la
determinación de aminoácido de
cadena terminal N, ya que como
sabemos existen métodos mucho más
convenientes para realizar este tipo de
determinaciones, sin embargo no le
quita importancia y el mérito a
Frederick Sanger quien fue el que lo
desarrolló y a partir de su trabajo,
permitió mejorar nuestro
entendimiento de las proteínas como
estudiantes de la carrera de ingeniería
bioquímica.
Bibliografía:
Reginald H.G, Charles M.G
Biochemistry 2nd Edition Saunders
College 1999 USA .pp.132-134

Caroline Thomas, Continuing


Education in Anaesthesia Critical Care
& Pain, Volume 12, Issue 5, 1 October
2012, Pages 251–256, Physiology of
haemoglobin Consultado el 19 de
febrero 2019 en:
https://doi.org/10.1093/bjaceaccp/mks
025

Rendina, George Técnicas de


Bioquímica aplicada Nueva Editorial
Interamericana 1974 México pp. 74-79