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Unidad 2. Técnicas básicas de microbiología.

Práctica 2. Esterilización y preparación


de medios de cultivo

Objetivos
Explicar el concepto de esterilización y su utilidad en microbiología.
Preparar correctamente el material que se someterá a esterilización.
Aplicar algunas metodologías para esterilizar material y medios de cultivo.
Comprobar la efectividad del proceso de esterilización.
Explicar el concepto de medio de cultivo en microbiología.
Eliminar adecuadamente los desechos biológicos.

Introducción
Un medio de cultivo está constituido por una mezcla de agua y sustancias que en conjunto
proporcionan los requerimientos nutricionales para el desarrollo de los microorganismos. La
composición de los medios de cultivo varía en función del grupo microbiano que se
pretende estudiar, y la preparación del medio depende de la complejidad química
(composición), el estado físico y otras condiciones requeridas (pH, concentración, etc.).

Existen medios de cultivo comerciales empleados para el desarrollo de los microorganismos


más comunes, sin embargo en muchas ocasiones se requiere preparar el mismo mediante la
mezcla de sus componentes.

Para el estudio de los microorganismos es indispensable contar entre otras cosas con
material y medios de cultivo estériles. En Microbiología la esterilización se define como “el
proceso mediante el cual se eliminan todos los microorganismos (incluyendo formas de
resistencia) de un objeto, medio o superficie” y su aplicación garantiza la ausencia de
microorganismos en el material y medios de cultivo a ser empleados. Existen diversos
métodos de esterilización, entre ellos: calor (seco o húmedo), filtración (para sustancias
termolábiles y aire), radiaciones y aplicación de gas de oxido de etileno (para jeringas y
cajas de plástico).

1ª sesión
Preparación de medios de cultivo.

Materiales

Material por grupo


2 balanzas granatarias
Potenciómetro
Soluciones de referencia (pH 4 y 7)
3 espátulas
Tiras de papel de 2.5 cm de ancho (para envolver pipetas)
Tiras de papel de 20 cm de ancho (para envolver cajas)
4 cestos de metal
Agua destilada

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Material por equipo
1 tripie
1 charola metálica para tripié
2 matraces de 250 o 300mL
1 probeta de 250mL
1 matraz de 500mL
1 varilla de vidrio
1 gradilla
4 aplicadores de madera
2 hisopos
1 pipeta de 10mL
2 pipetas de 1.0mL
2 pipetas de 5mL
4 pipetas Pasteur
30 tubos de 16x150
4 tubos de 22x175
2 tubos de 13x100
4 cajas petri de vidrio
Un equipo Millipore

Cepas
Ampolletas con endosporas de Geobacillus stearothermophylus

Reactivos
Caldo Nutritivo
Agar-Agar
Agar Nutritivo
Solución de NaOH 1.0 N
Solución de HCl al 10 %
Indicador de azul de bromotimol 1%
Solución salina isotónica (garrafón)

Metodología

Preparación y esterilización de material de vidrio


1. Lavar material con detergente líquido, enjuagar con abundante agua de la llave y al
final con agua destilada.
2. Secar el material de vidrio de preferencia en horno, si no es posible secar al aire.
3. En las pipetas poner un filtro de algodón en la boquilla y envolver con papel Kraft.
4. Envolver las cajas de Petri y pipetas de acuerdo a las indicaciones del profesor.
5. Introducir los hisopos en un tubo y tapar con algodón.
6. Identificar con nombre y marcar el volumen en el papel de las pipetas.
7. Envolver el equipo Millipore para esterilizar según las instrucciones del profesor.
8. Introducir el material a un horno previamente calentado a 180°C, esperar a que la
temperatura se estabilice nuevamente y a partir de este momento dejar 1 hora.
9. De no ser posible emplear el horno, se puede esterilizar el material de vidrio en
autoclave.

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Preparación de medios de cultivo.
Esquema del ejemplo con base de caldo.

160mL agua

+ X g de medio deshidratado

Disolver

pH 6.5 a 7.2

10mL c/u 20mL 90mL

Medio Líquido
+ X g de agar + X g de agar

Fundir Fundir

7mL 10mL 20mL

*Medio semisólido

*Medio sólido

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Preparación de medios de cultivo (ejemplo de preparación con base en caldo)

1. Leer cuidadosamente el membrete del medio de cultivo.


2. Calcular la cantidad necesaria para preparar 160mL de caldo.
3. Pesar la cantidad calculada del medio deshidratado. Esta operación debe ser rápida
para evitar que la humedad del ambiente no afecte el resto del contenido del frasco.
4. Disolver el medio en 100mL de agua y una vez disuelto completar el volumen a 160mL.
5. Ajustar el pH entre 6.8 y 7.2.
6. Colocar 10mL en 5 tubos de 16x150.
7. Colocar 20mL del caldo en el matraz de 50mL y calcular la cantidad necesaria de
agar-agar para obtener un medio semisólido. (* a un litro de medio se agregan 2.0g de
agar-agar).
8. Tapar el matraz y calentar hasta disolver totalmente.
9. Colocar 10mL en 2 tubos de 16 x 150.
10. A partir del volumen excedente, calcular la cantidad necesaria para obtener un medio
sólido. (* a un litro de medio se agregan de 15g a 20g de agar-agar).
11. Tapar el matraz y calentar hasta disolución total.
12. Distribuir: 20mL en 2 tubos de 22x175, 10mL en 2 tubos de 16x150 y 7mL en 4 tubos de
16x150.
13. Tapar cada uno de los tubos con algodón y etiquetarlos.
14. Acomodar los tubos (incluyendo el que contiene el indicador biológico) de acuerdo a
su estado físico en tres cestos metálicos, (líquido, semisólido y sólido) y cubrir con papel
kraft.
15. Esterilizar este material en autoclave a temperatura de 121°C, y 15 libras de presión
durante 20 minutos.
16. Antes de abrir el autoclave, asegurarse que baje la temperatura y que la presión
interior sea igual a la del exterior.

Preparación de medios de cultivo (preparación por separado)

Medios líquidos
1. Leer cuidadosamente el membrete del medio de cultivo.
2. Calcular la cantidad necesaria para preparar 100mL de Caldo BHI (o el medio que se
requiera preparar).
3. Pesar la cantidad calculada del medio deshidratado. Esta operación debe ser rápida
para evitar que la humedad del ambiente no afecte el resto del contenido del frasco.
4. Disolver el medio en 60mL de agua destilada y una vez disuelto completar el volumen a
100mL.
5. Ajustar el pH entre 6.8 y 7.2.
6. Colocar 7mL en c/u de 6 tubos de 16x150 y el resto dejar en el matraz de 250mL.
7. Agregar una gota de solución de azul de bromotimol al 1% (indicador de pH) a cada
uno de 2 tubos con caldo BHI y comprobar el pH ajustado.
8. Tapar cada uno de los tubos con algodón y etiquetarlos.

1515-09-# de equipo
Caldo BHI
dd/mm/aa

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9. El matraz se tapa con tapón de algodón y con gorro de papel Kraft y etiquetar.
10. Acomodar los tubos en el cesto metálico que corresponda a los medios líquidos y cubrir
el cesto con papel kraft.
11. Esterilizar este material en autoclave a temperatura de 121°C, y 15 libras de presión
durante 20 minutos.
12. Antes de abrir el autoclave, asegurarse que baje la temperatura y que la presión
interior sea igual a la del exterior.

Medios semisólidos
1. Leer cuidadosamente el membrete del medio de cultivo.
2. Calcular la cantidad necesaria para preparar 20mL de Caldo BHI (o el medio que se
requiera preparar).
3. Pesar la cantidad calculada del medio deshidratado. Esta operación debe ser rápida
para evitar que la humedad del ambiente no afecte el resto del contenido del frasco.
4. Disolver el medio en 10mL de agua destilada y una vez disuelto completar el volumen a
100mL.
5. Ajustar el pH entre 6.8 y 7.2.
6. Calcular la cantidad necesaria de agar para obtener un medio semisólido. (a un litro
de medio se agregan 2.0g de agar).
7. Tapar el matraz y calentar con el mechero hasta disolver totalmente.
8. Distribuir 10mL de medio en cada uno de dos tubos de 16x150.
9. Tapar cada uno de los tubos con algodón y etiquetarlos.

1515-09-# de equipo
Medio semisólido
dd/mm/aa

10. Acomodar los tubos en el mismo cesto metálico que corresponde a los medios líquidos,
colocar una ampolleta con endosporas de Geobacillus stearothermophylus en la
parte central de los medios dentro de un tubo vacio y cubrir el cesto con papel kraft.
11. Esterilizar este material en autoclave a temperatura de 121°C, y 15 libras de presión
durante 20 minutos.
12. Antes de abrir el autoclave, asegurarse que baje la temperatura y que la presión
interior sea igual a la del exterior.

Medios sólidos
1. Leer cuidadosamente el membrete del medio de cultivo.
2. Calcular la cantidad necesaria para preparar 110mL de Agar BHI (o el medio que se
requiera preparar).
3. Pesar la cantidad calculada del medio deshidratado. Esta operación debe ser rápida
para evitar que la humedad del ambiente no afecte el resto del contenido del frasco.
4. Dispersar el medio en 70mL de agua destilada y una vez humectado completar el
volumen a 110mL.
5. Tapar el matraz y calentar con el mechero hasta fundir totalmente. Cuidar que el
medio no se pegue agitando suavemente de manera constante.
6. Una vez fundido dejar atemperar unos minutos y distribuir 7mL en c/u de 4 tubos de
16x150 y 20mL en c/u de 4 tubos de 22x175.
7. Tapar cada uno de los tubos con algodón y etiquetarlos.

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1515-09-# de equipo
Agar BHI
dd/mm/aa

8. Acomodar los tubos en el cesto metálico que corresponde a los medios sólidos,
colocar una ampolleta con endosporas de Geobacillus stearothermophylus en la
parte central de los medios dentro de un tubo vacio y cubrir el cesto con papel kraft.
9. Esterilizar este material en autoclave a temperatura de 121°C, y 15 libras de presión
durante 20 minutos.
10. Antes de abrir el autoclave, asegurarse que baje la temperatura y que la presión
interior sea igual a la del exterior.

Solución salina isotónica (SSI)


1. Preparar 170mL de solución salina isotónica (0.85%).
2. Distribuir 9mL exactos en 18 tubos de 16x150.
3. Tapar cada uno de los tubos con algodón y etiquetarlos.

1515-09-# de equipo
SSI
dd/mm/aa

4. Acomodar los tubos en el bote de metal y cubrir el bote con papel kraft o de estraza.
5. Esterilizar este material en autoclave a temperatura de 121°C, y 15 libras de presión
durante 20 minutos.
6. Antes de abrir el autoclave, asegurarse que baje la temperatura y que la presión
interior sea igual a la del exterior.

Disposición de desechos.
1. Colocar el medio de cultivo sólido sobrante sobre un papel y envolverlo, colocar el
paquete en una bolsa de plástico y desecharlo en el contenedor de RPBI.
2. Depositar el papel de envoltura en el bote de basura correspondiente.

2ª Sesión
Control de calidad de esterilización, zona y técnica aséptica, y esterilización por filtración.

Materiales

Medios por equipo


2 cajas Petri con TSA
1 caja con agar Endo

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Material por equipo
1 tripie
1 charola metálica para tripié
2 mecheros
2 gradillas
Manguera de equipo Millipore
Pinzas de pato para equipo Millipore
Pinzas de punta roma
1 vaso de pp de 125mL
1 membrana Millipore estéril

Material estéril
4 cajas Petri de vidrio
Un equipo Millipore (matraz Kitazato, vaso y filtro conector)

Metodología

Disposición de los medios de cultivo preparados.

Solución salina isotónica (SSI)


1. Revisar los tubos de solución salina y separar aquellos que tengan tapones de algodón
fuera de su sitio. Preparar nuevamente para sustituir los tubos abiertos y esterilizar. Estos
tubos de SSI deberán guardarse en un bote cerrado en la gaveta ya que serán
utilizados en prácticas posteriores.

Medios líquidos
1. Revisar los tubos de caldo BHI y separar aquellos que tengan los tapones de algodón
fuera de su sitio. En caso de que los tubos se encuentren abiertos y sin presencia de
turbidez, taparlos y esterilizarlos nuevamente. En caso de que el medio se encuentre
contaminado deberá prepararse y esterilizar un nuevo medio, deberán guardarse en
un bote cerrado en la gaveta ya que serán utilizados en la práctica de técnicas de
cultivo.
2. Revisar que el matraz con caldo no se encuentre destapado y/o contaminado.
Apartar para prueba de comprobación del crecimiento y filtración .

Medios semisólidos
3. Revisar los tubos de agar semisólido y separar aquellos que tengan tapones de
algodón fuera de su sitio y sin presencia de turbidez, taparlos y esterilizarlos
nuevamente. En caso de que el medio se encuentre contaminado deberá prepararse
y esterilizar un nuevo medio. Los dos tubos deberán guardarse en un bote cerrado en la
gaveta ya que serán utilizados en la práctica de técnicas de cultivo.

Medios sólidos
1. Revisar los tubos de agar BHI y separar aquellos que tengan tapones de algodón fuera
de su sitio. Revisar que no exista la presencia de colonias y tapar nuevamente. En caso
de existir contaminación sustituir por otros tubos no contaminados.
2. Colocar los cuatro tubos de 22x175 y los cuatro tubos de 16x150 en un bote y fundir a
baño María.
4. Ya fundidos los cuatro tubos de 16x150, colocarlos en posición inclinada y dejar

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solidificar. Los cuatro tubos ya solidificados y fríos deberán guardarse en un bote
cerrado en la gaveta ya que serán utilizados en la práctica de técnicas de cultivo.
3. Los cuatro tubos de 22x175 deberán dejarse en baño María hasta que se encuentren
fluidos. Cuando se encuentren totalmente fundidos y fluidos deberán permanecer en
el bote con agua a 50°C hasta su utilización .

Comprobación de esterilidad.

1. Extraer las ampolletas con endosporas Geobacillus stearothermophylus y etiquetar


cada una de ellas sobre una charola de plástico, colocar una ampolleta sin esterilizar,
e incubar a 55°C durante 48 horas.
2. Concluida la incubación comparar las ampolletas esterilizadas de las no estelizadas.

Comprobación del área aséptica

1. Lavar y desinfectar la mesa, delimitar el área de trabajo y encender el mechero para


crear una zona aséptica.
2. Etiquetar las dos cajas de Petri con TSA o Agar nutritivo con los siguientes datos:

1515-09-# de equipo 1515-09-# de equipo


Área aséptica 10cm Área aséptica 15cm
dd/mm/aa dd/mm/aa

3. Colocar las 2 cajas de Petri con TSA o Agar nutritivo a 10cm y a 15cm de distancia del
mechero y dejarlas destapadas durante 30 minutos mientras se realizan las actividades
de vaciado y siembra.
4. Después de los 30 minutos de exposición, sellar con dos tiras de masking tape e incubar
invertidas a 37°C durante 24 horas.
5. Al finalizar la incubación revisar y guardar en refrigeración.

Comprobación de técnica aséptica

1. En condiciones de asepsia vaciar el agar BHI contenido de los tubos de 22x175 en las
cuatro cajas Petri de vidrio que se esterilizaron previamente.
2. Dejar solidificar.
3. Separar dos de las cajas y etiquetar con los siguientes datos:

1515-09-# de equipo 1515-09-# de equipo


Control de vaciado 1 Control de vaciado 2
dd/mm/aa dd/mm/aa

4. Sellar con dos tiras de masking tape e incubar invertidas a 37°C durante 24 horas.
5. Al finalizar la incubación revisar y guardar en la gaveta.

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Comprobación del crecimiento

1. Inocular en condiciones de asepsia una asada de Escherichia coli el matraz con caldo
BHI .
2. A partir del matraz inoculado con E. coli inocular con hisopo la superficie la caja Petri
restante con agar BHI. Etiquetar la caja con los siguientes datos:

1515-09-# de equipo
Escherichia coli
dd/mm/aa

3. Sellar con dos tiras de masking tape la caja de Petri recién inoculada e incubar
invertida a 37°C durante 24 horas.
4. Al finalizar la incubación revisar y guardar en la gaveta.

Matraz con
E. coli caldo BHI

Filtración

1. Etiquetar la caja con agar ENDO con los siguientes datos:

1515-09-# de equipo
Filtración
dd/mm/aa

2. Colocar dos mecheros encendidos y crear entre ellos un área estéril. En condiciones de
asepsia instalar el equipo Millipore estéril. Antes de instalar el vaso y las pinzas de pato,
colocar una membrana de 0.45µm estéril sobre la base del filtro conector. Las pinzas
de punta roma se esterilizan con alcohol y a la flama antes de tomar la membrana.

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3. Retirar la tapa de aluminio del vaso y transferir el contenido del matraz con caldo BHI
inoculado con E. coli.

4. Abrir la llave de vacío y filtrar el medio a través de la membrana. Una vez que hubo
pasado todo el medio cerrar el vacío.
5. Retirar las pinzas de pato y el vaso, este último deberá ser envuelto inmediatamente
con mucho cuidado y colocado en un bote de metal para su esterilización en
autoclave.
6. Con ayuda de las pinzas de punta roma, retirar la membrana y colocarla en la caja de
Petri con agar ENDO. Presionar ligeramente la superficie para favorecer la adherencia
de la membrana.

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7. Sellar con dos tiras de masking tape la caja de Petri recién inoculada e incubar a 37°C
durante 24 horas.
8. Transcurrido el tiempo de incubación revisar los resultados y guardar en refrigeración.

Resultados esperados.
9. Transvasar el contenido (caldo BHI estéril) del matraz Millipore a un matraz estéril
preparado previamente.
10. Etiquetar el matraz con el filtrado con los siguientes datos:

1515-09-# de equipo
Filtración
dd/mm/aa

11. Incubar el matraz a 37°C durante 24 horas.


12. Al finalizar la incubación revisar y guardar en la gaveta.
13. Lavar el matraz Millipore y el filtro conector, y entregar inmediatamente.
14. Esterilizar en autoclave el vaso del equipo Millipore y el matraz que fue inoculado.

Registro de resultados

Durante el desarrollo de la práctica y después de las incubaciones registrar en la siguiente


tabla las observaciones realizadas.

Resultados
a) Disposición de los medios de cultivo Tubos con caldo BHI
preparados. Matraz con caldo BHI
Tubos con medio semisólido
Tubos de 16x150 con agar BHI
Tubos de 22x175 con agar BHI
b) Comprobación del área aséptica Área aséptica 10cm
Área aséptica 15cm
c) Comprobación de técnica aséptica Control de vaciado 1
Control de vaciado 2
d) Comprobación de esterilidad. Bioindicador No esterilizado
Bioindicador esterilizado
e) Comprobación del crecimiento Cultivo de E. coli
f) Filtración Desarrollo en agar ENDO
Desarrollo del filtrado en caldo BHI

+ = Desarrollo microbiano
- = Ausencia de desarrollo

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Disposición de desechos.
1. Separar el material en el que se haya registrado desarrollo microbiano y proceder a
prepararlo de la siguiente manera:
a) Cajas de Petri de plástico. Asegurarlas con masking tape y colocarlas en el contenedor
rojo ubicado en el laboratorio 1 A.
b) Recipientes de vidrio. Esterilizar en autoclave y posteriormente retirar el medio de
cultivo sólido, envolver en papel, colocar el paquete en una bolsa de plástico y
colocarla en el contenedor rojo ubicado en el laboratorio 1 B.
2. Depositar el papel de envoltura en el bote de basura correspondiente.

Bibliografía complementaria
Cappuccino, James G. and Sherman Natalie. 2005. Microbiology: a laboratory
manual. 7th edition. Pearson/Benjamin Cummings. USA. QR63 C36 2005
Leboffe Michael J. and Burton E. Pierce. 2006. Microbiology laboratory theory and
application. 2nd edition, Morton Publishing Co. USA. QR63 L43 2006.
Madigan, M. T. and J. M. Martinko. 2006. Brock Biology of microorganisms. 11th edition.
Pearson Prentice Hall. USA. QR41.2 B753 2006
Prescott Lansing M., Harley John P. and Klein Donald A. 2005. Microbiology. 6th edition.
McGraw-Hill. USA. QR41.2 P74 2005
Ramírez-Gama, R. M., B. Luna Millán, O. Velásquez Madrazo, L. Vierna García, A. Mejía
Chávez, G. Tsuzuki Reyes, L. Hernández Gómez, I. Müggenburg, A. Camacho Cruz y M
del C. Urzúa Hernández. 2006. Manual de Prácticas de Microbiología General. 5ª
edición. Facultad de Química, UNAM. México.
Tortora Gerard J., Funke Berdell R. and Case Christine L. 2007. Microbiology: an
introduction. 9th edition. Benjamin Cummings. USA. QR41.2 T67 2007

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