ESPECTROFOTOMETRIA

MARCO TEORICO
En fotometría o en espectrofotometría se compara la transmitancia de la
luz a través de una solución que contiene materiales absorbentes con la
transmisión de la misma luz a través de otra solución que solo contiene
disolvente. Esta última se denomina solución de referencia o reactivo blanco o
simplemente blanco; debe ser idéntica a la primera excepto en que carece de
los materiales absorbentes de la luz que han de estudiarse. Ambas soluciones
deben medirse bajo idénticas condiciones de longitud de onda, intensidad de
luz incidente y anchura de cubeta (longitud de paso de luz).

1. ENERGIA RADIANTE
Las radiaciones electromagnéticas, conocidas corrientemente como luz,
están compuestas por paquetes de energía llamados fotones o cuantos. De
acuerdo a la longitud de onda, se conocen tres zonas: a) Ultravioleta (UV),
comprende radiaciones de 100 a 300 nm de longitud; b) Luz Visible (color), está
constituida por radiaciones electromagnéticas de 390 a 770 nm de longitud de
onda y c) El Infrarrojo, entre 2000 a 30000 nm.

Una onda de luz posee campos eléctricos y magnéticos oscilantes que

están en fase, pero son perpendiculares a la dirección de propagación. La
longitud de onda, de la luz, se da en cm y se relaciona con la velocidad de luz
en el vacío, en cm/seg, y con la frecuencia, en ciclos/seg:
𝑐
𝜆=
𝑣

Longitud de onda (), es la distancia entre los nudos de dos ondas de radiación
adyacente. Se mide en cm, nm, mm, mm, Å.

La velocidad (c), de propagación en el vacío es de 3 x 1010 cm/seg y algo menor

al atravesar sustancias transparentes.

La frecuencia (v), es el número de oscilaciones por segundo. Se expresa en

ciclos/seg.
La luz interacciona con la materia principalmente a través del campo eléctrico
oscilante. Para fines de absorción debe tenerse en cuenta que la luz es un
paquete de energía o fotón hv, donde h es la constante de Planck, 6.627 x 10-
27 ergios segundo, y v es la frecuencia. De aquí se desprende que la energía
de la luz es directamente proporcional a la frecuencia:

𝐸 = ℎ𝑣
y según la ecuación anterior inversamente proporcional a la longitud de onda.

Hay absorción de luz cuando la energía del fotón, hv, corresponde a la diferencia
entre los niveles de energía de la molécula.

2. LEYES DE ABSORCION
En Química Biológica se emplea la fotometría principalmente para regular
o controlar la concentración de diversas especies en mezclas de reacción. La
absorción de luz a una longitud de onda dada, está relacionada con la
concentración de especies absorbentes por medio de dos leyes.

2.1. Ley de Lambert. Lambert estudió la cantidad de luz monocromática

absorbida por un cuerpo y enunció la ley que dice: "la fracción de luz absorbida
es proporcional al espesor del absorbente x, e independiente e la intensidad de
luz", o en otros términos, "la proporción de luz incidente, absorbida por el medio,
es independiente de su intensidad y cada sucesiva capa unidad de medio,
absorbe una fracción igual de la luz que pasa a través de él". Por ejm., si la luz
incidente es 100% y cada capa unidad de espesor x, absorbe el 20% de la luz
incidente, la luz transmitida es el 80%. Para otras capas unidad de espesor x, la
luz transmitida disminuirá como sigue: 64%, 51.2%, etc. que es la secuencia
(0.8)0, (0.8)1, (0.8)2, (0.8)3, etc. Lo que conduce a la expresión matemática:

𝐼 = 𝐼0 𝑥 𝑒-αx
Donde:
I0 = Intensidad e la luz incidente
I = Intensidad de la luz transmitida
x = grosor de la capa en cm
α = coeficiente de absorción del medio

En forma logarítmica tenemos:

𝐼0
𝑙𝑛 = = 𝛼𝑥
𝐼

Al pasar al sistema logarítmico de base 10, el coeficiente de absorción c,

se convierte en coeficiente de extinción molar k
𝛼 = 2.303 𝑘
o sea
𝐼0
𝑙𝑜𝑔10 = 2.303 𝑘𝑥 = 𝐾𝑥
𝐼
por tanto
𝐼0
𝑙𝑜𝑔10 = 𝐾𝑥
𝐼

Donde: log I0/I es la densidad óptica (D.O.) o absorbancia (A). A es

directamente proporcional a x.

2.2. Ley de Beer. Beer estudió la influencia de la concentración de la solución

de una sustancia coloreada sobre la transmisión de la luz monocromática y halló
la misma relación entre la transmisión y el espesor de la capa atravesada.
Teniendo en cuenta que la luz se absorbe solamente cuando un fotón choca
con una molécula, la ley de Beer puede anunciarse como sigue: "cuando un
rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente, la cantidad
de luz absorbida o la probabilidad de absorción es proporcional al número de
moléculas c, contenidas en el haz de luz".

𝐼 = 𝐼0 𝑒-Kc

donde: c = concentración en mol/l.

Cuando en la ley anterior, la transmitancia disminuye exponencialmente

con el número de moléculas absorbentes. Por ejm., en el caso anterior se hizo
variar el espesor de la capa, ahora si hacemos que el espesor de la capa sea
constante, es decir que sea 1 cm y variamos la concentración de la solución de
la sustancia coloreada tenemos que: si consideramos la Io como 100% y la
absorbancia de cada una de las concentraciones c, es 50% de la luz incidente,
la luz transmitida es 50%. Para otras concentraciones c, la luz transmitida
disminuirá como sigue: 25%, 12.5%, 6.25%, 3.13%, etc.

La ley de Beer es exacta sólo para luz monocromática y en muchos casos

no se cumple sobre todo a concentraciones altas.

3. RANGOS ADECUADOS DE CONCENTRACION

Es muy difícil medir la concentración de las soluciones con exactitud por
espectrofotometría, ya que en algunos casos la intensidad de radiación
transmitida I, es muy pequeña, mientras en otras es muy alta. En la práctica, I
debe de estar entre el 10% y el 90% de Io (es decir, la absorbancia debe de
estar entre 1.0 y 0.05), pero las medidas más seguras se realizan cuando I »
50% de Io (es decir, absorbancia = 0.3). Estas condiciones pueden conseguirse
modificando la concentración del compuesto, el espesor de la célula o
cambiando la longitud de onda de la radiación (es decir, variando E). El primer
procedimiento es el que se realiza con más frecuencia.

4. CALCULO DE LA CONCENTRACION DE UNA MUESTRA PROBLEMA

Existen tres formas de cálculo.

4.1. Mediante el factor de calibracion (Fc). Resulta de dividir la concentración

del estándar entre la absorbancia del estándar:
𝐶𝑠𝑡
𝐹𝑐 =
𝐴𝑠𝑡

el factor obtenido se multiplica por la lectura o absorbancia del o de los tubos

que contienen la solución problema, obteniéndose así la concentración de la
muestra o muestras. Para expresar la concentración en porcentaje, se toma en
cuenta el volumen utilizado 100/V.

Según la Ley de Beer - Lambert tenemos que:

𝐴𝑠𝑡 = 𝐾𝑠𝑡 . 𝑋𝑠𝑡 . 𝐶𝑠𝑡

𝐴𝑚 = 𝐾𝑚 . 𝑋𝑚 . 𝐶𝑚
donde:
Ast = absorbancia del estándar o patrón
Am = absorbancia de la muestra problema
Cst = concentración del estándar o patrón

teniendo en cuenta que el espesor X es constante y que la tratarse de soluciones

de la misma sustancia el coeficiente de extinción K, será el mismo.
Relacionando las dos expresiones tenemos:
𝐴𝑠𝑡 𝐶𝑠𝑡
=
𝐴𝑚 𝐶𝑚
despejando:
𝐶𝑠𝑡
𝐶𝑚 = 𝐴𝑚 .
𝐴𝑠𝑡
Ya que tanto la lectura del problema como del patrón son equivalentes a
la absorbancia, se tiene:
𝐶𝑠𝑡
𝐶𝑚 = 𝑙𝑒𝑐𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑑𝑒 𝑚 .
𝑙𝑒𝑐𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑠𝑡

Nótese que Cst / Ast es un constante y puede usarse como un factor sobre
todo cuando se va a determinar la concentración de una serie de muestras. Por
tanto, la ecuación anterior se puede reducir a :

𝐶𝑚 = 𝐴𝑚 . 𝐹𝑐

donde: Fc = factor de calibración (Fc = Cst/Ast); esta expresión referida a

porcentaje se escribe:
𝐶𝑠𝑡 100
𝐶𝑚 = . . 𝐴𝑚
𝐴𝑠𝑡 𝑣

v = volumen de la muestra utilizada para la determinación.

4.2. Mediante curvas de calibración. En este caso se utilizan varios patrones

de concentraciones progresivas y un blanco (el blanco contiene todos los
componentes de la muestra menos la sustancia a determinar). Luego se realiza
la lectura (de absorbancia) usando el filtro o la longitud de onda para la cual la
sustancia tiene la máxima absorción. Se registra el valor de absorbancia en una
tabla.

Luego se construye una gráfica en un sistema de coordenadas, colocando

las lecturas correspondientes a los patrones en el eje de las "y" (eje de
ordenadas) y las concentraciones de los mismos en el eje de las "x" (eje de
abscisas), con lo cual se obtiene una recta, que pasa por cero si la sustancia
obedece la ley de Beer-Lambert.
 La muestra problema dará una lectura o absorbancia determinada que se
busca en el eje de las ordenadas de la gráfica anterior, luego por este punto se
traza una perpendicular a dicho eje hasta encontrar la curva (trazada con la
lectura y concentración de los patrones). En seguida, por este punto de
intersección se traza una paralela al eje de ordenadas hasta tocar el eje de
abscisas (eje de concentración). Por lo tanto, la concentración de la muestra
problema está dada directamente por este punto del eje de abscisas.

En la curva de calibración puede observarse que hay una parte de la curva

dentro de la que se cumple perfectamente la ley de Beer-Lambert, es la parte
recta que corresponde a una función lineal. Sin embargo, puede también
aplicarse a valores superiores por extrapolación siempre que las desviaciones
con respecto a la recta no sean muy grandes. Además el uso de la gráfica
elimina los errores que podrían aparecer como consecuencia del uso del cálculo
de proporcionalidad en una región donde no se cumple la ley de Beer-Lambert.
Esto último corrobora la norma general que preconiza el uso de soluciones
patrón para las comparaciones colorimétricas cuyas densidades ópticas sean lo
más cercanas posible al valor del problema.

4.3. Mediante la ecuación A = Ecx. Ecuación obtenida de la combinación de

las leyes de Beer-Lambert (en la que x es un valor constante por ser los tubos
uniformes, o por usarse una sola cubeta para hacer la lectura). Para esto se
calcula una E relativa mediante 𝐸 = 𝐴/𝑐, para los patrones, (los valores hallados
deben ser iguales si la sustancia cumple la ley de Beer).

El coeficiente de extinción debe mantenerse constante para un intervalo

de concentraciones de patrones y problemas. Una vez obtenido un valor E, la
concentración de la muestra se determina mediante la ecuación que sigue:
𝐴
𝑐=
𝐸
ESPECTROS DE ABSORCION. Se llama espectro de absorción a la gráfica que representa
la absorbancia en función de la longitud de onda. Muchos compuestos contienen espectros
característicos de absorción en la región visible y ultravioleta, lo cual hace posible la
identificación de dichos materiales en una mezcla.

Figura 1.
Espectros de Absorción del naftaleno, antraceno y tetraceno
 PARTE EXPERIMENTAL

EXPERIMENTO N° 1. ESPECTROS DE ABSORCION Y LONGITUD DE MAXIMA

ABSORBANCIA DE ALGUNAS MOLÉCULAS.

OBJETIVO:
 Realizar la curva espectral del rojo de fenol.

 Determinar la longitud de onda de máxima absorbancia del rojo de fenol.

FUNDAMENTO
Si se mantiene constante el espesor (x) y la concentración (c), la absorbancia (A)
dependerá de la longitud de onda (λ); esto permite hallar la curva espectral, así como la longitud
de onda de máxima absorción de las diferentes moléculas.

Puesto que los compuestos coloreados presentan espectros de absorción característicos,

la selección cuidadosa de las longitudes de onda de máxima absorción permitirá analizar los
componentes de las sustancias.

MATERIAL
Espectrofotómetro.
Tubos de ensayo
Gradillas
Pipetas
Solución de rojo de fenol 1 x 10-4 M
METODO DE TRABAJO

Calibrar el espectrofotómetro a cero utilizando agua destilada como blanco. Luego,

determinar la extinción de solución problema, usando todo el rango espectral del equipo.
Medir en un tubo de ensayo 1 ml de rojo de fenol adicionarle una gota de NaOH y mezclar.

Anote las absorbancias para cada longitud de onda y para la solución problema, teniendo
especial cuidado de anotar la longitud de onda de máxima absorbancia

DATOS EXPERIMENTALES