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Clonación técnica para generar múltiples copias de

un fragmento de DNA

¿Para qué?

producir grandes cantidades de una proteína industrialmente

investigación básica:
función de la proteína
regulación de la expresión
análisis de complementación
aislamiento para estudios bioquímicos
mutagénesis in vitro
Estrategia general:
1.Generación del fragmento a clonar
2.Elección del vector
3.Ligación
4.Transferencia a la célula huesped
5.Selección de los recombinantes
1.Generación del fragmento a clonar

Extremos cohesivos

Extremos romos
2. Elección del vector de clonación

Tipos de vectores
Vector Cel. huesped Tamaño inserto

Plasmidos Bacteria Hasta 15 kb

Virus bacteriano
(fago λ) Bacteria Hasta 25 kb

Cosmid Bacteria 30-45 kb

BAC (bacterial
artificial Bacteria 100-500 kb
chromosome)
YAC (yeast
artificial Levadura 250-1000 kb
chromosome)
PLASMIDOS
Son DNA circular (excepciones) de doble cadena que
existen en bacterias y en el núcleo de algunas células
eucarióticas. Se pueden replicar independientemente
de la célula hospedera. El tamaño de un plásmido
oscila entre unas pocas kilobases hasta 100 kb.
Propiedades deseables de un plasmido:

 Pequeño

 Secuencia conocida

 Alto numero de copias

 Origen de replicación

 Con marcador de selección

 Segundo marcador de selección que


se inactive por la inserción del DNA
clonado

 Polilinker: sitios únicos para ER en uno


de los dos marcadores de selección
3. Ligación

formación de nuevos
puentes entre los extremos

5’-P y 3’-OH

Condiciones estándar:
vector 50 µg + fragmento 100-150 µg
FRAGMENTAR EL ADN
ADN con el gen de interés Vector

Sitio de corte
único

Sitio de corte Enzima


Enzima de restricción
de restricción
RESULTADO DE LA
LIGACIÓN

Moléculas
Fragmentos Moléculas del vector
de ADN del vector religado
no ligado no ligado

ADN recombinante que no ADN recombinante con


contiene el gen de interés el gen de interés
4. Transferencia a la célula huesped

transformación bacteriana
crear “huecos” en pared y membrana
celular para que entre el DNA exógeno

tratamiento con cloruro cálcico

electroporación
Transformación: CaCl2
Transformación: CaCl2

-- -- --
-- -- -- -- --
-- -- -- -- Ca Cl2
+ + +- -- + +
+
-- -- -- +
+ +
+ + -- -- --
+ + -- --
+ + -- -- --
Bacteria
+
-- -- -- +
+
-- -- + + --
-- -- -- + + -- --
+ + + + -- --
+ + + +
-- -- -- -- -- -- Plasmidos
-- --
-- -- --
Electroporación

Las células toman DNA


exógeno al estar expuestas
a una exposición
breve a electricidad
de alto voltaje
ELECTROPORACIÓN

DNA

PULSE

Sitio de
permeación
Transformación
Agrobacterium
por núcleo

Plásmido Ti
Agrobacterium inductor de tumores cromosom
contiene oncogenes
(genes onc)

A. tumefaciens causa
agallas en dicotile-
dóneas, presenta el
plásmido Ti, inserta cromosoma
parte de él en el
cromosoma de la célula
vegetal
célula huésped.

tumores
Ingeniero
genético natural Proliferación de
tras sutitución hormonas crecimiento.
de genes onc Se forman tumores en
por genes de las zonas de la lesión
interés
Biobalística

El DNA se suministra en
microproyectiles de tungsteno
que son disparados a las
células u organelos.
Microinyección directa de DNA

Inyección de DNA
directamente sobre
oocitos ó embriones
1
Transfección

Introducción de DNA mediante el uso de virus


2
3
5. Selección de los recombinantes
Análisis de restricción de los plásmidos recombinantes

Línea 1: plásmido pKT49 digerido con la enzima BamH1

Líneas 6, 7, 9 y 10: vectores no recombinantes

Líneas 2, 3, 4, 5, 8 y 11: plásmidos con insertos de ADN


Inactivación de la resistencia a algún antibiótico

ampicillin

ampicillin
Vectores de expresión
Vectores de clonación
especializados que:

•Aseguran la expresión del


gen clonado en la célula
hospedante

•Incluye secuencias
regulatorias que estimulen la
expresión del gen
(transcripción y traducción)

•Además promotores que


deben ser fuertes,
secuencias de término de
transcripción y secuencias de
término para la traducción.
Organismos usados para expresión

• Bacterias: plásmidos, fagos

• Levadura: plásmidos, YACs

• Células de Insecto: Baculovirus, plásmidos

• Mamíferos:
– Vectores de expresión viral (terapia génica):
• SV40
• Virus de vacunas
• Adenovirus
• Retrovirus
– Líneas celulares estables (CHO, HEK293)
Vectores de expresión
• Producen gran cantidad de proteína

• Permite estudiar estructura y función de proteínas


Problemas con vectores de expresión
• Bajo nivel de expresión

• Degradación severa de proteínas

• No hay modificaciones post-traduccionales

• Mal plegamiento
Proteínas producidas en cultivos
de células eucariotas
Proteína Condición

Factor IX y VIIIc Hemofílicos


Receptor CD4 SIDA
Eritropoyetina Cáncer
Interferones β y γ Cáncer
Interleucina-2 Cáncer
Hormona de crecimiento Enanismo
Activador de plasminógeno Ataques al
corazón/embolia
Antígeno de Hepatitis B Vacuna
Anticuerpos monoclonales Varios
Expresión de proteínas
Proteína verde fluorescente GFP
Expresión y purificación de la proteína
recombinante

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11.5 KDa